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1.2.1 微生物的基本培养技术
[基础达标]
题组一　培养基的种类、成分及用途
1．(2024·广东茂名期末)不同的生物适应不同的环境，筛选它们需要配制特殊培养基，下列叙述正确的是(　　)
A．培养固氮菌的培养基不需要加入碳源
B．培养细菌的培养基需将pH调至中性或弱酸性
C．培养霉菌的培养基可以加入一定的抗生素
D．筛选所需菌种常用平板划线法纯化分离并计数
2．(2024·广东清远期末)LB培养基是一种应用广泛的细菌基础培养基，配方如表。下列叙述正确的是(　　)
养分 含量
胰蛋白胨 10 g
酵母粉 5 g
NaCl 10 g
琼脂 15 g
蒸馏水 1 000 mL
A．琼脂是一种海藻多糖，可为细菌生长提供大量的碳源和能源
B．若用该培养基对霉菌进行纯化培养，需将pH调至中性或弱碱性
C．该培养基中缺少纤维素，不能用来筛选分解纤维素的细菌
D．该培养基属于固体培养基，可用来对菌种进行扩大培养
3．据报道，在某餐馆就餐的多位客人均在餐后半小时出现恶心、呕吐、腹泻等症状。食品卫生监督管理局的工作人员接到群众举报后立即出动，在该餐馆采集样本，并对样本进行培养，检测鉴定，最终发现该餐馆使用的筷子未经严格消毒，大肠杆菌等多种细菌数量严重超标。据此判断，工作人员选用的培养基按功能分，应属于(　　)
A．选择培养基　　　　 B．液体培养基　
C．固体培养基　　　　 D．鉴别培养基
题组二　无菌技术
4．消毒和灭菌是微生物培养中常用的操作方法。下列说法正确的是(　　)
A．在100 ℃煮沸5～6 mim属于灭菌方法，可杀死微生物的营养细胞和一部分芽孢
B．无菌技术中，若处理对象为液体，则只能消毒，不能灭菌
C．实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围物品相接触
D．高压蒸汽灭菌锅只有当压力表的压力降到一个标准大气压时，才能打开盖子
5．微生物培养过程中，要十分重视无菌操作，请分析下列操作，正确的项数是(　　)
①培养基、锥形瓶都要进行干热灭菌　②加入培养基中的指示剂和染料不需要灭菌　③家庭制作葡萄酒时要将容器和葡萄进行灭菌　④干热灭菌可以杀死微生物的营养细胞和部分芽孢　⑤涂布平板时所用的涂布器需酒精浸泡后灼烧灭菌　⑥家庭制作泡菜并无刻意的灭菌环节，发酵初期乳酸菌产生的乳酸可以抑制其他微生物的生长
A．一项　　　　 B．二项　　　　
C．三项　　　　 D．四项
题组三　微生物的纯培养
6．下列关于倒平板及对菌种纯化的说法，正确的是(　　)
A．倒平板时左手将灭过菌的培养皿盖完全打开，右手将锥形瓶中培养基倒入培养皿(10～20 mL)，左手立即盖上培养皿盖
B．使用已灭菌的接种环及培养基之后不需要再灭菌
C．平板冷凝后要将平板倒置，以防皿盖上的冷凝水流入培养基
D．平板划线法是首先进行梯度稀释，然后将稀释的菌种通过接种环在固体培养基上连续划线，从而将聚集的菌种逐渐分散形成单个菌落
7．下列有关微生物的分离与培养的叙述中，不正确的是(　　)
A．获得纯净培养物的关键是防止杂菌污染
B．倒置平板可防止培养皿盖上的冷凝水滴落造成污染
C．倒平板时将培养皿的盖拿开，以便于将锥形瓶中的培养基倒入培养皿
D．检验培养基是否被杂菌污染的最有效方法是将未接种的培养基放在恒温箱中培养
8．有关纯化酵母菌实验操作的叙述，错误的是(　　)
A．在第二区域内划线时，接种环上的菌种直接来源于菌液
B．第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物
C．每次划线前，灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种
D．划线结束后，灼烧接种环能及时杀死接种环上的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者
9．(2024·山西长治期末)如图为两种纯化微生物的接种方法。下列相关描述正确的是(　　)
A．①为平板划线法，所用接种工具为接种环
B．②为稀释涂布平板法，所用接种工具为接种针
C．①②方法均可进行微生物的分离与计数
D．②方法计数的微生物数量往往比实际数目多
[能力提升]
10．大肠杆菌是人和动物肠道寄生菌，在一定条件下会引起胃肠道等局部组织感染。检验水样中大肠杆菌数目是否符合生活饮用水卫生标准，常用滤膜法测定，其操作流程如下图所示。大肠杆菌的代谢物能与伊红亚甲蓝(EMB培养基的指示剂)反应，菌落呈深紫色。下列对该实验操作的分析，错误的是(　　)
A．测定前，滤杯、滤膜和滤瓶均可用干热灭菌法灭菌处理
B．注意避免已灭菌处理的材料用具与周围用品接触
C．将过滤完的滤膜紧贴在EMB培养基上，完成大肠杆菌的接种操作
D．EMB培养基属于选择培养基，只有大肠杆菌能正常生长并形成深紫色菌落
11．(2024·江苏泰州期末)2023年4月我国新版《生活饮用水卫生标准》(GB5749－2022)正式实施，其中对微生物的检出要求如下表。兴趣小组的同学们对某蓄水池进行细菌总数测定，以了解池水是否符合饮用水卫生标准。结合下表分析，下列说法错误的是(　　)
序号 指　标 限值
1 总大肠杆菌/(MPN/100 mL或CFU/100 mL) 不应检出
2 大肠埃希氏菌/(MPN/100 mL或CFU/100 mL) 不应检出
3 菌落总数/(MPN/100 mL或CFU/100 mL) 100
MPN表示最可能数，CFU表示菌落形成单位
A．可采用高压蒸汽灭菌法或干热灭菌法对取水样的三角瓶灭菌
B．培养基中应加入伊红—亚甲蓝以区分大肠杆菌和其他细菌菌落
C．应将0.1 mL稀释水样滴加到培养基表面并用涂布器涂抹均匀
D．应将平板倒置后在适宜条件下培养，以减少培养基污染的概率
12．请回答下列与大肠杆菌有关的问题。
(1)下表是某公司研发的一种培养大肠杆菌菌群的培养基配方。
成分 蛋白胨 乳糖 蔗糖 K2HPO4 显色剂 琼脂
含量/g 10.0 5.0 5.0 2.0 0.2 12.0
将上述物质溶解后，用蒸馏水定容至1 000 mL
该培养基属于______(填“固体”或“液体”)培养基，该培养基中的氮源是________________________________________________________________________。
(2)在微生物培养操作过程中，为防止杂菌污染，需对培养基和培养皿进行________(填“消毒”或“灭菌”)；操作者的双手需要进行清洗和________。
(3)将配制好的培养基分装到试管中，加棉塞后若干支试管扎成一捆，包上牛皮纸并用皮筋勒紧放入________________中灭菌，温度为121 ℃，时间为15～30 min。灭菌完毕拔掉电源，待锅内压力自然降到零，同时温度到达70 ℃以下时，再慢慢打开排气阀以排除余气，将试管取出。
(4)从一支试管向另一支试管接种时应注意，接种环要在酒精灯________________(填“火焰的不充分燃烧层”或“火焰的充分燃烧层”)灭菌，并且待接种环________后蘸取菌种。
13．(2024·山西吕梁期末)乳链菌肽(Nisin)是由某些乳酸链球菌产生的天然生物活性抗菌肽。Nisin能有效杀死或抑制引起食品腐败的革兰氏阳性菌，现已作为一种高效、无毒的绿色食品防腐剂。研究人员从新鲜牛奶中获得了多株乳酸链球菌并进行了筛选和纯化培养，请回答下列问题。
(1)筛选菌株：选用质地均匀的滤纸，用打孔机打成直径相同的圆片，灭菌后烘干，浸泡于备选菌株培养液中，然后置于涂布了革兰氏阳性菌的平板中，培养一段时间后，通过测定____________(填文字)的大小，选取抑菌作用最强的菌株。若①内出现一个菌落，则该菌落出现的原因可能是____________________________________________。
图Ⅰ 图Ⅱ
(2)培养基常用的灭菌方法是__________。在接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先培养一段时间，这样做的目的是________________________________。
(3)图Ⅱ所用的接种方法______(填“能”或“不能”)对活菌进行计数；甲、乙、丙为划线的三个区域，为正确完成整个接种过程，接种环要进行______次灼烧灭菌，其中灭菌目的相同的是第________次。
(4)Nisin作为绿色食品防腐剂，不会改变人体肠道中的正常菌群，也不会进入内环境，推测可能的原因是____________________________________________。
参考答案
【基础达标】
1．【答案】C　【解析】固氮菌属于异养型生物，自身无法合成有机物，需要碳源，A错误；细菌的培养基需将 pH调至中性或弱碱性，B错误；抗生素能杀死细菌，培养霉菌加入一定的抗生素可以防止细菌污染，C正确；平板划线法能用于微生物的纯化分离，但无法计数，D错误。
2.【答案】C　【解析】琼脂是一种多糖，但不能为微生物生长提供碳源，通常作为凝固剂用于制作固体培养基，A错误；霉菌属于真菌，若用该培养基对霉菌进行纯化培养，需将pH调至酸性，B错误；欲筛选分解纤维素的细菌，培养基中必须以纤维素为唯一碳源，同时要加入氮源，该培养基中缺少纤维素，不能用来筛选分解纤维素的细菌，C正确；该培养基含有凝固剂琼脂，属于固体培养基，对菌种进行扩大培养通常需要液体培养基，D错误。
3.【答案】D　【解析】由题干信息分析可知，食品卫生监督管理局的工作人员通过培养样本，发现样本中含有多种细菌，最后确定其中含有大肠杆菌等菌种，故该培养基按功能分，属于鉴别培养基。
4.【答案】C　【解析】在100 ℃煮沸5～6分钟属于煮沸消毒法，可杀死微生物的营养细胞和一部分芽孢，A错误；无菌技术中，若处理对象为液体，可以采用高压蒸汽灭菌法灭菌，B错误；实验操作时应避免已灭菌处理的材料用具与周围物品接触，以防止杂菌污染，C正确；高压蒸汽灭菌后需要待压力降至零位时，打开放气阀，待蒸汽完全放出后，打开容器，取出灭菌物品，D错误。
5.【答案】B　【解析】培养基应进行高压蒸汽灭菌，①错误；加入培养基中的指示剂和染料需要灭菌，否则会感染杂菌，影响微生物的培养，②错误；家庭制作葡萄酒时将容器进行消毒，葡萄清水冲洗，保留天然菌种，不需要灭菌，③错误；煮沸消毒可以杀死微生物的营养细胞和部分芽孢，而灭菌(例如干热灭菌)能杀死环境中一切微生物，包括孢子和芽孢，④错误；涂布平板时所用的涂布器需用70%酒精浸泡后在酒精灯火焰上进行灼烧灭菌，⑤正确；家庭制作泡菜时需要将容器进行清洗消毒，但不需要刻意灭菌，⑥正确。
6.【答案】C　【解析】倒平板时用左手的拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，而不是直接将盖完全打开，A错误；使用灭过菌的接种环及培养基之后仍需进行灭菌处理，以免污染环境或感染操作者，B错误；平板冷凝后要倒置放置，防止皿盖上的冷凝水珠落入培养基，C正确；平板划线法不需要梯度稀释，直接通过接种环在固体培养基上连续划线，从而将聚集的菌种逐渐稀释、分散，形成单个菌落，D错误。
7.【答案】C　【解析】微生物培养中获得纯净培养物的关键是防止杂菌污染，A正确；倒平板后需要将培养皿倒置，目的是防止培养皿盖上的冷凝水滴落，造成污染，B正确；倒平板时用食指和拇指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，经培养基倒入培养皿，C错误；检验培养基是否被杂菌污染的最有效方法是将未接种的培养基放在恒温箱中培养，一段时间后若有菌落，说明培养基被污染，若无菌落，说明培养基没有被污染，D正确。
8.【答案】A　【解析】在第二区域内划线时，接种环上的菌种直接来源于第一区域的划线末端，A错误；为避免杂菌的污染，第一步操作时需要灼烧接种环，B正确；每次划线前，灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种，C正确；为避免细菌污染环境和感染操作者，划线结束后，灼烧接种环能及时杀死接种环上的菌种，D正确。
9.【答案】A　【解析】图①纯化微生物的接种方法为平板划线法，所用接种工具为接种环或接种针，A正确；图②纯化微生物的接种方法为稀释涂布平板法，所用接种工具为涂布器，B错误；稀释涂布平板法可进行微生物的分离与计数，而平板划线法不能用于微生物的计数，C错误；稀释涂布平板法计数的微生物数量往往比实际数目少，因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的是一个菌落，D错误。
【能力提升】
10.【答案】D　【解析】干热灭菌法适用于滤杯、滤膜和滤瓶的灭菌，防止杂菌的污染，A正确；已灭菌处理的材料用具需要避免与周围用品接触，否则会被重新感染，导致灭菌失败，B正确；由于过滤完后细菌黏附在滤膜上，将滤膜紧贴在EMB培养基上可以将黏附在滤膜上的菌种接种在培养基上，C正确；EMB培养基属于鉴别培养基，D错误。
11.【答案】C　【解析】用三角瓶取水样前，为了防止外来杂菌污染，三角瓶(玻璃制品)可采用高压蒸汽灭菌法或干热灭菌法进行灭菌，A正确；大肠杆菌的代谢产物能与培养基中的染料伊红—亚甲蓝反应，使菌落呈黑色，所以可根据培养基上的菌落是否呈现黑色来区分大肠杆菌和其他细菌菌落，B正确；对某蓄水池进行细菌总数测定，不应对所取的水样进行稀释，C错误；为了减少培养基污染的概率，在平板上接种菌液后，应将平板倒置在培养箱里培养，并提供适宜的培养条件，D正确。
12.【答案】(1)固体　蛋白胨　(2)灭菌　消毒
(3)高压蒸汽灭菌锅　(4)火焰的充分燃烧层　冷却
13.【答案】(1)抑菌圈　实验时混入其他杂菌或该菌落为抗性突变菌落　(2)高压蒸汽灭菌
检测培养基灭菌是否合格
(3)不能　4　二、三
(4)Nisin可能被消化道中的蛋白酶(或肽酶)所降解
【解析】(1)要筛选并扩大培养抑菌作用最强的菌株，应将革兰氏阳性菌涂布于平板上，将灭菌的大小相同的滤纸片均匀地摆放在培养基表面，在其上分别滴加等量备选菌株培养液的上清液，培养后对比观察测定抑菌圈的大小，选取抑制作用最强的菌株。经过培养，杀菌物质杀死细菌后会在滤纸片周围形成抑菌圈，抑菌圈越大，说明杀菌物质的杀菌能力越大。若透明圈中出现了一个菌落，出现该现象的原因可能是实验时混入其他杂菌或该菌落为抗性突变菌落。(2)常用的灭菌方式有灼烧灭菌、干热灭菌和高压蒸汽灭菌，对培养基进行灭菌常用高压蒸汽灭菌法(湿热灭菌)。为检测培养基平板灭菌是否合格，在接种前需随机取若干灭菌后的空白平板先培养一段时间，观察有无菌落形成，若无菌落形成，则说明培养基平板灭菌合格。(3)图Ⅱ所用的接种方法为平板划线法，不能用于微生物的计数，甲、乙、丙为划线的三个区域，为正确完成接种过程，在每次接种前和接种后均需要灼烧灭菌，因此接种环至少进行4次灼烧灭菌。灭菌目的相同的是第二、三次，都是为了杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种。(4)乳链菌肽可能被消化道中的蛋白酶(或肽酶)所降解，故乳链菌肽作为天然防腐剂，不会改变人体肠道中的正常菌群，也不会进入内环境。

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