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第2节 微生物的培养技术与应用（一)微生物的基本培养技术（2）
(1)培养物：
(3)纯培养：
(2)纯培养物：
在微生物学中，将接种于培养基内，在合适条件下形成的含特定种类微生物的群体。
由单一个体繁殖所获得的微生物群体。
获得纯培养物的过程就是纯培养。
（1）配制培养基
（2）灭菌(培养基和器具）
（3）接种
（4）分离
（5）培养(恒温箱）
（三）微生物的纯培养
1 有关概念
2纯培养步骤：
【探究 实践】酵母菌的纯培养
分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体，这就是菌落。
(1)菌落：
1. 原理：
微生物群
分散或稀释
单个细胞
单个菌落
繁殖
念珠菌显色培养基
大肠杆菌培养基
酵母菌培养基
金黄色葡萄球菌和
枯草杆菌培养基
(2)单菌落：
一般是由单个微生物繁殖形成的纯培养物。
鉴别菌种：菌落的大小、形状、颜色、透明度、光泽度等是鉴定菌种的重要依据。
(3)获得单菌落的方法：
平板划线法和稀释涂布平板法
稀释涂布平板法
平板划线法
2. 实验目的
① 学会配制培养酵母菌的培养基并倒平板
② 学会进行无菌操作
③ 尝试通过平板划线操作来获得纯化的酵母菌菌落
3. 材料用具
①酵母菌培养液、马铃薯、葡萄糖(或蔗糖)、琼脂、蒸馏水
②天平，小刀，纱布，烧杯，锥形瓶，棉塞、牛皮纸（或报纸）
③皮筋，培养皿，接种环，酒精灯，超净工作台
④高压蒸汽灭菌锅，干热灭菌箱和恒温培养箱等
4.方法步骤
（1）制备培养基
① 配制培养基
去皮马铃薯200g，切成小块，加水1000mL，加热煮沸至马铃薯软烂，用纱布过滤。向滤液中加入20g葡萄糖、15-20g琼脂，用蒸馏水定容至1000mL。
② 灭菌：
培养基——高压蒸汽灭菌
高压蒸汽灭菌锅
转移
灭菌15~30min
皮筋勒紧
包牛皮纸
放入高压蒸汽灭菌锅中（100kPa、121℃）
酵母菌培养基
锥形瓶
加棉塞
② 灭菌：
培养皿——干热灭菌
干热灭菌箱
将5-8套培养皿包成一包，用几层牛皮纸包紧，放入干热灭菌箱内，在160～170℃灭菌2h。
培养基冷却到50℃左右，在酒精灯火焰附近倒平板。
1
拔出锥形瓶的棉塞。
3
用拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，将培养基倒入培养皿（10～20mL），立即盖上皿盖。
4
等待培养基冷却凝固后，将培养皿倒过来放置。
2
将瓶口迅速通过火焰。
通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基
不能完全打开，以免杂菌污染培养基
防止皿盖上冷凝水落入培养基
；避免培养基的水分过快挥发。
③倒平板
配制培养基
灭菌
倒平板
（1）制备培养基
应该在定容完成后，灭菌之前进行调pH
1. 培养基pH要适宜，调pH是在灭菌前还是灭菌后？
问题思考与分析：
4. 怎样检测培养基灭菌是否合格(或培养基是否被杂菌污染）？
将所倒平板放入37℃的恒温箱中培养12h～24h，观察是否有菌落产生
3. 在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？
最好不要用。空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生
2.培养基灭菌后，需要冷却到50℃左右时，才能用来倒平板。用什么办法来估计培养基的温度？
用手触摸锥形瓶，刚刚不烫手即可
【例】倒平板是制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的重要环节，如图为倒平板的操作示意图。
（1）请用文字和箭头写出正确的倒平板操作流程： 。
（2）甲、乙、丙中的灭菌方法是 。
（3）丁中的操作需要等待 才能进行。
丙→乙→甲→丁
灼烧灭菌
平板冷却凝固
（2）接种和分离酵母菌
——平板划线法
通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。经过数次划线后培养，可以分离得到单菌落。
连续划线法
分区划线法
平板划线法
1
将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环的金属丝烧红。
2
在火焰旁冷却接种环。同时，拔出装有酵母菌培养液的试管的棉塞。
将试管口通过火焰。
3
4
在火焰附近用接种环蘸取一环菌液。
5
将试管口通过火焰，并塞上棉塞。
在火焰附近将皿盖打开一条缝隙，用接种环在培养基表面基表面迅速划三至五条平行线，盖上皿盖。
6
灼烧接种环，待其冷却后，从第一次划线的末端开始作第二次划线。重复以上操作，作第三、四、五次划线。注意不要将最后一次的划线与第一次的划线相连。
7
平板划线法
第1次划线
灼烧接种环灭菌
第2次划线
灼烧接种环灭菌
第3次划线
灼烧接种环灭菌
灼烧接种环灭菌
1
2
3
4
5
①接种环只蘸一次菌液，但要在培养基不同位置连续划线多次；
②划线首尾不能相接；
③每次划线前灼烧接种环进行灭菌；
④划线操作结束后，仍需灼烧接种环，培养皿倒置培养。
分区划线法
【平板划线法注意事项】
灼烧时期 目的
取菌种前
每次划线前
接种结束后
【问题探究1】为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？
杀死接种环上残留的菌种，避免污染环境和感染操作者
杀死上次划线后接种环上残留菌种，使下一次划线的菌种直接来源上次划线的末端，从而使每次划线时菌种数目逐渐减少，直至得到单个细胞
杀死接种环可能存在的微生物，避免污染培养物
接种环共需灼烧几次？
6次
灼烧次数=划线次数+1
【问题探究2】在第二次以及其后的划线操作时，总是从上一次划线的末端开始划线的原因是？
划线后，线条末端酵母菌的数目最少，从末端划，能使酵母菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个酵母菌繁殖而来的菌落。
【问题探究3】为什么最后一次划线与第一次的划线不能相连？
最后一次划线已经将酵母菌稀释成单个的细胞，如果与第一次划线相连则增加了酵母菌的数目，达不到纯化的效果。
待菌液被培养基吸收，
将接种后的平板和一个未接种的平板倒置，
放入28℃左右的恒温培养箱中培养24-28h。
划3个平板（重复实验）1个不划线（空白对照）
若该培养基无菌落，说明培养基没有污染；若有菌落生长，则说明培养基被污染或者灭菌不彻底。
（3）培养酵母菌
在实验室中，切不可吃东西、喝水，离开实验室时一定要洗手，以防止被微生物感染。使用后的培养基在丢弃前一定要进行灭菌处理，以免污染环境。
警示
（1）倒平板后，待平板冷凝之后需将其倒置 （　 　）
（2）倒平板时，应将打开的皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上 （　 　）
（3）若皿盖和皿底之间溅上培养基，这个培养基不可再用 （ 　　）
（4）为了防止污染，接种环经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落 （ 　 ）
（5）平板划线法中每一次划线后要将接种环灼烧 （　 　）
（6）培养微生物的温度因菌种不同而稍有差异 （　 　）
1.易错辨析
课堂巩固
2.下列关于平板划线的操作，正确的是（ ）
A. 每次划线前都要蘸取菌液
B. 灼烧接种环后，要立即用接种环接种
C. 平板划线操作时划出了五个区域菌落数逐渐增多
D. 接种前，要将菌种试管口通过火焰
D
酵母菌的纯培养
2.接种和分离酵母菌
1.制备培养基
3.培养酵母菌
①配制培养基（马铃薯、葡萄糖、琼脂、水）
②灭菌
③倒平板（在酒精灯火焰附近操作）
培养基：湿热灭菌（高压蒸汽灭菌锅）
培养皿：干热灭菌（干热灭菌锅）
用接种环在固体培养基上用平板划线法接种
平板倒置，放入28℃左右的恒温培养箱培养
酵母菌纯培养小结
有一段时间，水果“酵素”风靡各地。水果“酵素”制作的大致过程是：将洗净、切成块状的水果放入洁净的容器，再加入糖和水，密封，置于阴凉处发酵一至两周。有人说，吃水果“酵素”可以美容、减肥、促进消化和提高免疫力。请评估这一论点是否可信。追问以下问题可以帮助你分析。
酶的另一种说法。
其制作是利用微生物进行无氧呼吸的原理，进行像制作泡菜一样的发酵。
其中可能有糖类（包括一些简单的糖和膳食纤维等）、蛋白质（包括多种酶）、有机酸等成分。
不存在它独有的、特殊的营养物质。
其中甚至可能含有微生物发酵产生的有毒物质，食用后可能会危害人体健康。
评估论点的可信程度
水果“酵素”是什么？
其制作原理是什么？
其中可能含有哪些成分？
其是否含有人们无法从其他食品中获取但又是维护健康所必需的成分？
其中的所有成分都有益于人体健康吗？
思维训练
练习与应用
一、概念检测
1.判断下列相关表述是否正确。
（1）培养基中的营养物质浓度越高，对微生物的生长越有利。（ ）
（2）消毒和灭菌的杀菌程度存在差异。 （ ）
（3）微生物的纯培养物就是不含有代谢废物的微生物培养物。（ ）
×
√
×
①干制：降低食品的含水量；
②腌制：食盐、糖等制造高渗环境，抑制微生物的生长和繁殖；
③低温储存：降低微生物的代谢速率从而抑制微生物的生长和繁殖。
2.日常生活中保存食品的方法有哪些？这些方法是如何阻止或抑制微生物生长的？
1.某同学将5个手指尖在贴有“洗手前”标签的培养基上轻轻按一下。然后用肥皂将该手洗干净，再将5个指尖在贴有“洗手后”标签的同种培养基上轻轻按一下。将这两个培养皿放入37℃恒温培养箱中培养24h后，发现贴有“洗手后”标签的培养皿中菌落较少。请回答：
（1）这个实验中需要进行灭菌处理的材料用具有________________。
（2）“将指尖在培养基上轻轻按一下”相当于哪一步操作？
（3）洗手后我们就能进行无菌操作了吗？
操作时，我们可以采用什么方法来避免手上微生物的污染？
培养皿和培养基
接种
洗手后手上还有一些微生物
通过用酒精棉球擦拭双手，或戴消过毒的手套等方法来避免手上微生物的污染。
二、拓展应用
2. 将野生酵母菌分别接种于3个盛有等量同种液体培养基的锥形瓶中，并放置在摇床上培养，摇床转速分别为 210 r/min， 230 r/min和250 r/min。培养时间与酵母菌种群密度的关系如图。请分析：
（1）摇床转速不同，意味着培养条件有什么不同？
培养液中02含量不同。
（2）从图中数据你可以得出什么结论 其原因是什么
培养液中02含量越高，酵母菌种群密度越大。
（3）为什么培养8h后，其中2个锥形瓶中酵母菌的种群密度基本达到稳定
这时候已经达到了环境容纳量。

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