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(共42张PPT)
自然界中微生物数量繁多，种类庞杂，要想从中分离出需要的特定微生物并不容易，尤其当要分离的微生物在混合的菌群中不是优势种群时，仅通过一般的平板划线法或稀释涂布平板法很难实现。该怎么办呢？
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1.2
微生物的培养技术及应用
（二）微生物的选择培养和计数
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1973年，科学家从美国黄石国家公园的热泉中筛选出水生栖热菌
水生栖热菌
耐高温的DNA聚合酶
耐高温的DNA聚合酶
耐高温的DNA聚合酶
这种酶目前已被广泛用于体外扩增DNA片段的聚合酶链式反应（PCR）
水生栖热菌
根据这个原理，我们能不能从许多微生物中筛选出我们需要的一种呢？
实验室中微生物的筛选，也可以应用同样的原理，即人为提供有利于目的菌生长的条件（包括营养、温度和pH等），同时抑制或阻止其他微生物的生长。
一、选择培养基（P16）
1.概念
在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。
2.原理
人为提供有利于目的菌生长的条件（包括营养、温度和PH等），同时抑制或阻止其他微生物的生长。
一、选择培养基（P16）
3.类型
类型 条件 分离得到的菌种
改变培养条件 70～80℃的高温 水生栖热菌
添加某种化学物质 加入青霉素 酵母菌、霉菌等真菌
高浓度食盐 金黄色葡萄球菌
特殊碳、氮源 石油是唯一碳源 能消除石油污染的微生物
尿素是唯一氮源 能够分解尿素的微生物
改变培养基的营养成分 不加碳源 自养型微生物
不加氮源 固氮菌
选择培养基 vs 鉴别培养基
项目 选择培养基 鉴别培养基
特殊成分 加入某种化学物质 加入某种指示剂或化学药品
目的 抑制或阻止其他微生物生长，促进目的微生物生长 与微生物的代谢物或培养基中的成分发生特定反应
用途 培养、分离出特定微生物 鉴别不同的微生物
举例 培养酵母菌和霉菌，可在培养基中加入青霉素，抑制细菌生长；用以尿素作为唯一氮源的培养基来培养尿素分解菌 可用伊红美蓝培养基鉴定饮用水或乳制品中是否有大肠杆菌（若有，菌落呈黑色）
CO（NH2）2+H2O CO2+2NH3
脲酶
NO3-、NH4＋
被植物吸收
1. 如果让你配制一种培养基，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？
用尿素作为唯一氮源,可以将分解尿素的细菌分离出来。
2. 该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？
只是用尿素作为唯一氮源，培养基的其他营养成分基本相同。
二、微生物的选择培养（P17）
1.稀释涂布平板法
（1）概念：
将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到固体培养基表面，进行培养。
在稀释度足够高的菌液里，
聚集在一起的微生物将被分散
成单个细胞，从而能在培养基
表面形成单个菌落。
二、微生物的选择培养（P17）
1×10
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1×102
1×103
1×104
1×105
1×106
1×107
9 mL 无菌水
90mL无菌水
10g
②将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。
①铲取土样，将样品装入纸袋中。
1.稀释涂布平板法
（2）操作过程：
二、微生物的选择培养（P17）
1.稀释涂布平板法
（2）操作过程：
1×10
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1×102
1×103
1×104
1×105
1×106
1×107
微量移液枪
③取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。
二、微生物的选择培养（P17）
1.稀释涂布平板法
（2）操作过程：
④将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。
⑤将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。
⑥用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。
二、微生物的选择培养（P17）
1.稀释涂布平板法
（2）操作过程：
恒温培养箱
待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30 37 ℃的恒温培养箱中培养1 2 d。
①等比稀释操作→②涂布平板操作→③培养
联系
【注意事项】
①各操作细节要保证“无菌”。如移液管要经过灭菌，梯度稀释时，试管口和移液管在离火焰1~2cm处，涂布器要经过灼烧灭菌等。
②将涂布器浸在盛有质量分数为70%的酒精的烧杯中。取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后将沾有少量酒精的涂布器在火焰上灼烧。
③操作中要注意防火。不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃其中的酒精。
④涂布结束后，应将一个未接种的培养基和已接种的培养基放在一起培养，以检测培养基是否灭菌彻底。
联系
平板划线法（分区）
稀释涂布平板法
平板划线法 稀释涂布平板法
主要步骤
接种工具
单菌落的获得
用途
培养结果
相同点 接种环在固体培养基表面连续划线
系列梯度稀释操作
和涂布平板操作
接种环
涂布器
从最后划线的区域挑取
稀释度合适
整个平板上都可找到单菌落
分离纯化菌种，获得单菌落
①分离纯化菌种，获单菌落
②用于计数
都能分离菌种；都在固体培养基上进行；都能观察菌落
两种纯培养方法的比较
两种纯培养方法的比较
平板划线法
不能达到对细菌进行计数的目的，因为平板划线法最开始的划线很可能菌类会长成一片，导致无法计数，此外灼烧接种环的时候也会杀死一部分菌类。
稀释涂布平板法
进行等比稀释，在合适的稀释倍数下，均匀涂布得到的菌落互不接触，可以确定菌类的密度，再通过计算可以得知原液的菌落数。
三、微生物的数量测定（P18）
1.稀释涂布平板法（间接计数法）
除可以用于分离微生物外，也常用来统计样品中活菌的数目。
102
103
104
105
106
已接种的稀释不同倍数的的选择培养基
三、微生物的数量测定（P18）
1.稀释涂布平板法（间接计数法）
（1）计数原则：
选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数为30 300、适于计数的平板。
在同一稀释度下，应至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值。（减少实验误差,保证实验结果更准确）
未接种的牛肉膏蛋白胨培养基平板一个
未接种的选择培养基平板一个
102
103
104
105
106
不同稀释倍数的已接种的牛肉膏蛋白胨培养基各一个
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103
104
105
106
不同稀释倍数的已接种的选择培养基每种稀释倍数至少3个
一组对照
一组对照
三、微生物的数量测定（P18）
1.稀释涂布平板法（间接计数法）
（2）计算公式：
每g样品中的菌落数＝（C÷V）×M
C：代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数
V：代表涂布平板时所用的稀释液的体积（mL）
M：代表稀释倍数
4号试管的结果表明每g土壤中的活菌数约为__________个
1.1×108
三、微生物的数量测定（P18）
1.稀释涂布平板法（间接计数法）
（3）缺点：
统计的菌落数往往比活菌的实际数目少。
原因：当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，因此，统计结果一般用菌落数而不是用活菌数表示。
102
103
104
105
106
当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
三、微生物的数量测定（P18）
2.显微镜直接计数法（直接计数法）
（1）原理：
利用细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。
（2）优点：
快速、直观
（3）缺点：
不能区分死菌与活菌
不适于对运动细菌的计数
个体小的细菌在显微镜下难以观察
→偏大
两者计数原理相同
对细菌等较小的细胞进行观察和计数
用于相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数
计数
①计数工具：血细胞计数板
②计数步骤：
计数一个小方格分的酵母菌数量
先将盖玻片放在血细胞计数板的计数上
01
02
用吸管吸取培养液，滴于盖玻片边缘，让培养液自行渗入
03
多余的培养液用滤纸吸去，稍待片刻
04
待酵母菌全部沉降到计数室底部，将计数板放在载物台的中央
05
两种不同计数室的取样方法不同
规格一（25×16）：
1 mL培养液中细胞个数＝中方格中酵母菌数量的平均值×25×104 ×稀释倍数
规格二（16×25）：
1 mL培养液中细胞个数＝中方格中酵母菌数量的平均值×16×104 ×稀释倍数
计数
③计算公式：
（1）提出问题：
1.3 传统发酵技术
探究·实践：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数（P18）
（2）基础知识：
1.3 传统发酵技术
探究·实践：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
选择培养基配方
组分 含量
KH2PO4 1.4g
NaH2PO4 2.1g
MgSO4·7H2O 0.2g
葡萄糖 10.0g
尿素CO(NH2)2 1.0g
琼脂 15.0g
蒸馏水 定容到1000ml
牛肉膏 5.0g
蛋白胨 10.0g
NaCl 5.0g
琼脂 20.0g
蒸馏水 定容到1000ml
固体、天然培养基
通用培养基
（能分解尿素的细菌可存活）
（能分解尿素的细菌+不能分解尿素的细菌都能存活）
固体、
合成培养基
Q：如何确定该选择培养基具有选择作用呢？
配一种起对照作用的培养基（牛肉膏蛋白胨培养基）
（2）基础知识：
1.3 传统发酵技术
探究·实践：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
通用培养基
选择培养基
灭菌
（高压蒸汽灭菌）
倒平板
（3）实验设计：
1.土壤取样
1.3 传统发酵技术
探究·实践：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数（P18）
取样地点要求：
细菌适宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长。
取样过程：
铲去表层土（一般3cm左右）。
细菌绝大部分分布在距地表3～8cm的土壤层。
注意事项：
取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。
操作完成后一定要洗手。
（3）实验设计：
2.样品的稀释与涂布平板
1.3 传统发酵技术
探究·实践：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数（P18）
测细菌时，一般选用1×104、1×105、1×106倍稀释的稀释液进行平板培养。
在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，应选择一个比较宽的范围，将1×103～1×107倍稀释的稀释液分别涂布到平板上培养，以保证能从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数。
（3）实验设计：
2.样品的稀释与涂布平板
1.3 传统发酵技术
探究·实践：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数（P18）
①每个浓度至少设置4个平板，1、2、3平板是选择培养基（实验组，三个重复），4为牛肉膏蛋白胨培养基。
（用以判断选择培养基是否具有选择作用）
②如何验证培养基中是否含有杂菌？
设置2个平板作为对照：
不涂布稀释液的选择培养基和牛肉膏蛋白胨培养基。
若对照的培养基中无菌落生长，则说明未被杂菌污染。
若牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目大于选择培养基上的数目，则说明选择培养基具有筛选作用。
（3）实验设计：
3.微生物的培养与观察
1.3 传统发酵技术
探究·实践：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数（P18）
培养条件：
不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。
观察：
每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作 为结果。
（一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等）
（4）操作提示：
①无菌操作：
取土样的用具在使用前都需要灭菌。
②做好标记：
本实验使用的平板和试管较多，为避免混淆，最好在使用前做好标记。
③规划时间：
对于耗时较长的生物实验，需要事先规划时间，以便提高实验效率，在操作时有条不紊。
1.3 传统发酵技术
探究·实践：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数（P18）
如
在标记培养皿时应该注明组别、培养日期和平板上培养样品的稀释度等。
案例：两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。
1.甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。
2.乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。
你认为这两位同学的做法正确吗？ 如果有问题，错在哪？ 如何改进？
练习与应用
甲：没有重复实验（至少涂布3个平板）。为增加实验的说服力与准确性，应设置重复实验，在同一稀释度下至少涂布3个平板，统计结果后计算平均值。
乙：其中一个平板计数结果与其他两个相差太大，操作过程可能出现了错误。微生物计数时，如果实验中出现重复实验的结果差别很大的情况，应分析实验过程中可能的影响因素，找出差异的原因，而不能简单地将结果舍弃后进行计数。
利用尿素作为唯一氮源的培养基分离出的微生物不一定都是能分解尿素的微生物，因为有些微生物可以利用能分解尿素的细菌的代谢物进行生长繁殖。对分离的菌种进行鉴定还需要借助生物化学的方法。你可以查阅相关资料,进一步设计实验来鉴定自己分离的菌种。
练习与应用
CO(NH2)2+H2O
脲酶
2NH3+CO2
呈碱性，遇酚红指示剂呈 红 色。
方法：在培养基中加入酚红指示剂——鉴别培养基
①液体培养基可以直接看液体的变色情况；
②固体培养基上可以观察菌落周围是否出现红色环带。
课堂总结
一、概念检测
1. 研究人员用无机盐、琼脂和石油配制的培养基从被石油污染的土壤中筛选出了一种石油降解菌，判断下列相关表述是否正确。
（1）这种培养基是一种选择培养基。 （ ）
（2）利用这种石油降解菌可以降解石油，修复土壤。
（ ）
（3）相对于未被污染的土壤，从被石油污染的土壤中更容易分离到石油降解菌。 （ ）
练习与应用



一、概念检测
2.用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数时，通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中的活菌数，原因是 （ ）
A. 菌落中的细菌数目是固定的
B. 平板上的一个菌落就是一个细菌
C. 通过此方法统计的菌落数与活菌的实际数目相同
D. 平板上的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌
练习与应用
D
二、拓展应用
2. 地球上的植物每年产生的纤维素超过70 亿吨，其中40%～60%能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。对这些微生物的研究与应用，使人们能够利用秸秆等生产酒精，用纤维素酶处理服装面料等。已知刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红与纤维素形成红色复合物；而当纤维素被纤维素分解菌分解后，复合物就无法形成，培养基中会出现以这些菌为中心的透明圈（如下图所示）。请回答下列问题。
练习与应用
二、拓展应用
（1）你打算到什么环境中去寻找纤维素分解菌？为什么？
可以选择纤维素丰富的环境，如树林中多年落叶形成的腐殖土等。
（2）有同学说，可以把滤纸埋在土壤中，经过一段时间后，再从已腐烂的滤纸上筛选纤维素分解菌。请你评价这一做法。
可行，这是人工设置适合纤维素分解菌生存的环境，腐烂的滤纸上很可能有纤维素分解菌。
练习与应用

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