资源简介 (共38张PPT)3.2基因工程的基本操作程序你知道转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗？培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤呢？培育转基因抗虫棉的四个步骤：与载体拼接普通棉花（无抗虫特性）棉花细胞抗虫棉（有抗虫特性）导入抗虫基因重组DNA分子1.目的基因的筛选与获取2.基因表达载体的构建3.将目的基因导入受体细胞4.目的基因的 检测与鉴定一、第一步：目的基因的筛选与获取（P76）1.目的基因⑴概念：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因就是目的基因。如：与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关基因。主要是编码特定蛋白质的基因，也可以是具有调控作用的因子。Bt抗虫蛋白基因，简称Bt基因Bt抗虫蛋白使棉花抗虫一、第一步：目的基因的筛选与获取（P76）1.目的基因⑵实例：培育转基因抗虫棉用到的Bt抗虫蛋白基因，简称Bt基因。苏云金芽孢杆菌产生Bt 基因伴胞晶体蛋白（Bt抗虫蛋白）表达破坏鳞翅目昆虫的消化系统杀死棉铃虫导入抗虫棉培育棉花细胞一、第一步：目的基因的筛选与获取（P76）2.筛选合适的目的基因①从相关已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。②利用序列数据库和序列比对工具进行筛选。苏云金杆菌的杀虫作用与Bt基因有关掌握了Bt基因的序列信息。Bt蛋白分解为多肽后，与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，造成害虫死亡。Bt蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才表现出毒性，人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体。Q：筛选出来的目的基因如何获取？一、第一步：目的基因的筛选与获取（P76）3.获取目的基因的方法人工合成从基因文库中获取利用PCR获取和扩增目的基因一、第一步：目的基因的筛选与获取（P76）3.获取目的基因的方法⑴人工合成目的基因①前提：基因比较小、核苷酸序列已知②方法：通过DNA合成仪用化学方法直接合成⑵从基因文库中获取将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列基因的核苷酸序列目的基因推测推测化学合成DNA合成仪基因组文库部分基因文库（如cDNA文库）生物材料人工合成获取目的基因DNAcDNA一定大小范围的DNAPCRmRNA基因组文库 cDNA文库基因文库包括限制酶酶切逆转录导入受体菌中保存一、第一步：目的基因的筛选与获取（P76）3.获取目的基因的方法⑶利用PCR获取和扩增目的基因①概念：PCR是聚合酶链式反应的缩写。是一项根据DNA半保留复制的原理，通过在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。（穆里斯）Q：PCR需要什么条件呢？先回顾DNA的复制过程！PCR扩增仪/PCR仪参与的组分 在DNA复制中的作用解旋酶 打开DNA双链DNA母链 提供DNA复制的模板4种脱氧核苷酸 合成DNA子链的原料DNA聚合酶 催化合成DNA子链ATP 为合成DNA子链供能引物 使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸体内DNA复制所需的基本条件Q：体外复制怎么改进？参与的组分 在DNA复制中的作用解旋酶 打开DNA双链DNA母链 提供DNA复制的模板4种脱氧核苷酸 合成DNA子链的原料DNA聚合酶 催化合成DNA子链ATP 为合成DNA子链供能引物 使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸体内DNA复制所需的基本条件体外用高温代替体外用耐高温的DNA聚合酶一般为DNA单链引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物长度通常为20 30个核苷酸。3′5′DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有链的3′-端，即子链的延伸方向是5 ′→3 ′。由于DNA聚合酶不能将单个的核苷酸链连接成链，因此子链合成需要引物（最初的已有链）。DNA聚合酶3′5′模板链DNA复制 参与的组分 PCR技术 参与的组分 在DNA复制中的作用DNA母链 模板：2条DNA母链 提供DNA复制的模板4种脱氧核苷酸 原料：dNTP（4种脱氧核苷酸） 合成DNA子链的原料能量：ATP 能量：dNTP 为合成DNA子链供能解旋酶 解旋酶：体外用高温代替 打开DNA双链DNA聚合酶 DNA聚合酶：耐高温（Taq酶） 催化合成DNA子链引物：2种小分子单链核酸片段 使DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸一定的缓冲液（Mg2＋） 真核细胞和细菌的DNA聚合酶需要Mg2＋激活PCR技术所需的基本条件：在PCR过程中实际加入的为dNTP（实质加入的是4种脱氧核苷三磷酸，即dATP、dGTP、dTTP、dCTP），既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。ATP结构中的五碳糖为核糖，而dATP结构中的五碳糖为脱氧核糖。 ATP转移掉两个磷酸基团后剩下的结构就是腺嘌呤核糖核苷酸，所以ATP是转录的底物。同理，dATP转移掉两个磷酸基团后剩下的结构就是腺嘌呤脱氧核糖核苷酸，所以dATP可以用作DNA复制的底物。一、第一步：目的基因的筛选与获取（P76）3.获取目的基因的方法⑶利用PCR获取和扩增目的基因②条件：微量离心管缓冲液（Mg2＋）DNA模板4种脱氧核苷酸（dNTP）2种引物耐高温的DNA聚合酶一、第一步：目的基因的筛选与获取（P76）3.获取目的基因的方法⑶利用PCR获取和扩增目的基因②条件：微量离心管离心处理后一、第一步：目的基因的筛选与获取（P76）3.获取目的基因的方法⑶利用PCR获取和扩增目的基因②条件：一、第一步：目的基因的筛选与获取（P76）3.获取目的基因的方法⑶利用PCR获取和扩增目的基因③反应过程：变性→复性→延伸905072℃延伸905072℃变性905072℃复性PCR反应过程：3’5’3’5’3’5’3’5’A.变性当温度超过90℃时，双链DNA解聚为单链。B.复性当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。C.延伸当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’PCR反应过程：第一轮循环的产物作为第二轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环的产物。第二轮循环的产物作为第三轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮的产物。第二轮循环的产物第三轮循环的产物第一轮循环第二轮循环第三轮循环3’5’5’3’3’5’5’3’5’3’3’5’5’3’5’3’5’3’3’5’5’3’5’3’5’3’5’3’Q1：n次循环后，DNA分子数为 。（或DNA链有 条。Q2：n代后，共消耗引物个。（或 对）2n2n+12n+1-22n-1非目的基因序列目的基因序列引物Q3：在第几次循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段（即完整的目的基因）？5’3’5’5’第一次循环第二次循环3’5’第三次循环3’3’目的基因目的基因在第三次循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段（即完整的目的基因）。n代后，等长目的基因有 个。2n-2n一、第一步：目的基因的筛选与获取（P76）3.获取目的基因的方法⑶利用PCR获取和扩增目的基因④结果：1个模板DNA分子经过n轮PCR，以指数方式扩增，可以扩增出2n个DNA片段。⑤PCR产物的鉴定：琼脂糖凝胶电泳 变性90℃以上延伸72℃左右复性50℃左右基本过程100bp200bp300bp400bp500bp600bp700bp800bp1,200bp1,000bp900bp标准样品1样品2样品3Q4.利用PCR可以扩增mRNA吗？mRNA不可以直接扩增，需逆转录成cDNA再进行扩增，称为逆转录PCR，简称RT-PCR。1.3 传统发酵技术思考·讨论：目的基因的筛选与获取（P79）单链RNADNA-RNA杂交分子单链DNA双链DNA逆转录酶核酸酶H降解RNA链DNA聚合酶思考·讨论：基因表达载体的构建（P79）Q.获得了足量的Bt基因后，是否能直接将Bt基因导入棉花细胞呢？就算可以进行转录和翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂进行复制，导致子代细胞不再含有目的基因游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解不能原因那怎样才能让基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代呢？培育转基因抗虫棉的四个步骤：与载体拼接普通棉花（无抗虫特性）棉花细胞抗虫棉（有抗虫特性）导入抗虫基因重组DNA分子1.目的基因的筛选与获取2.基因表达载体的构建3.将目的基因导入受体细胞4.目的基因的 检测与鉴定二、第二步：基因表达载体的构建（P80）1.构建目的⑴使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代。⑵使目的基因能够在受体细胞中表达和发挥作用。2.基因表达载体的组成基因工程的核心工作位置：基因的上游（一段有特殊结构的DNA片段）功能：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA目的基因必须插入到启动子与终止子之间位置：基因的下游（一段特殊的DNA片断）功能：终止转录鉴别和筛选出受体细胞中是否含有目的基因DNA复制的起始位点，DNA聚合酶识别和结合位点拓展延伸启动子的类型：①组成型启动子：每种组织器官中均发挥作用。②组织特异性启动子：特定组织器官中才能发挥作用。③诱导型启动子：特定条件下（光、温度、化学物质等）刺激才能发挥作用。诱导型启动子诱导物作用激活或抑制目的基因表达诱导型启动子：拓展延伸启动子与终止子：位于DNA分子中，作用：起始和终止转录过程。起始密码子与终止密码子：位于mRNA分子中，作用：起始和终止翻译过程。“启动子与终止子”VS“起始密码子与终止密码子”二、第二步：基因表达载体的构建（P80）3.构建过程① 用一定的限制酶切割载体，使其出现一个切口。② 用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。③ 将切下的Bt基因片段拼接到载体的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成了一个重组DNA分子。Q1.“载体”＝“基因表达载体”？思考·讨论：目的基因的筛选与获取（P79）载体 ≠ 基因表达载体二者都有：标记基因和复制原点两部分DNA片段。基因表达载体：在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子。Q2.构建基因表达载体时目的基因插入的位置应该在哪里？为什么？思考·讨论：目的基因的筛选与获取（P79）启动子下游和终止子上游。因为只有插入在启动子和终止子之间，目的基因才可以正常表达。标记基因启动子插入目的基因终止子复制原点限制酶切割位点Q3.使用一种DNA限制酶切割，有几种连接情况？如何解决？思考·讨论：目的基因的筛选与获取（P79）载体目的基因自连片段间的连接目的基因自连质粒自连目的基因与质粒连接目的基因与目的基因连接质粒与质粒连接正向连接 反向连接11’22’122’1’21’1双酶切：①可以防止目的基因与载体的反向连接②还可以防止质粒、目的基因的自身环化连接二、第二步：基因表达载体的构建（P80）4.限制酶的选择原则①不破坏目的基因原则②保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则③确保出现相同黏性末端原则（善用“双酶切”，注意方向性，巧用“同尾酶”）拓展延伸1.原核基因的结构和表达翻 译转 录mRNA蛋白质拓展延伸加 工转 录mRNA前体成熟mRNA外显子内含子翻 译蛋白质2.真核基因的结构和表达外显子： 能够编码蛋白质的序列内含子： 不能够编码蛋白质的序列(共53张PPT)3.2基因工程的基本操作程序培育转基因抗虫棉的四个步骤：与载体拼接普通棉花（无抗虫特性）棉花细胞抗虫棉（有抗虫特性）导入抗虫基因重组DNA分子1.目的基因的筛选与获取2.基因表达载体的构建3.将目的基因导入受体细胞4.目的基因的 检测与鉴定受体细胞类型植物细胞动物细胞微生物细胞农杆菌转化法花粉管通道法我国科学家独创常用显微注射法Ca2+处理法三、第三步：将目的基因导入受体细胞（P80）1.目的基因导入植物细胞⑴花粉管通道法①操作方式：Ⅰ.用微量注射器将含目的基因的DNA 溶液直接注入子房中含目的基因的DNA 溶液三、第三步：将目的基因导入受体细胞（P80）1.目的基因导入植物细胞⑴花粉管通道法①操作方式：Ⅱ.在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。1.目的基因导入植物细胞⑴花粉管通道法②原理：利用植物授粉后形成的天然花粉管通道，将外源基因携带进入胚囊，此时的受精卵未形成细胞壁，且正在进行活跃的DNA复制，容易将外源DNA片段整合到受体基因组中。③优点：操作简单、技术成本低，免去了组织培养及诱导再生植株的全套人工培养过程。三、第三步：将目的基因导入受体细胞（P80）转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。实质是基因重组。农杆菌：是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。农杆菌挑食三、第三步：将目的基因导入受体细胞（P80）1.目的基因导入植物细胞⑵农杆菌转化法①原理：农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞、并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。双子叶、裸子植物受损伤口分泌酚类物质和糖类物质吸引农杆菌向受伤组织集中将Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞中，并且将其整合到该细胞染色体DNA上激活Vir区基因，导致T-DNA加工和转移三、第三步：将目的基因导入受体细胞（P80）1.目的基因导入植物细胞⑵农杆菌转化法②过程：构建表达载体导入目的基因插入植物细胞染色体DNA上表达新性状转入农杆菌Ti质粒目的基因植物细胞拓展延伸构建表达载体导入目的基因插入植物细胞染色体DNA上表达新性状转入农杆菌Ti质粒目的基因植物细胞⑴两次拼接第一次：目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上第二次（非人工操作）：被插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上⑵两次导入第一次：将含目的基因的重组Ti质粒导入农杆菌（Ca2＋处理法）第二次（非人工操作）：含目的基因的T-DNA导入受体细胞三、第三步：将目的基因导入受体细胞（P80）1.目的基因导入植物细胞⑵农杆菌转化法③受体细胞：体细胞或受精卵④具体转化方法：a.可以将从新鲜的叶片上取下的圆形小片与农杆菌共培养，然后筛选转化细胞，并再生成植株。b.可以将花序直接浸没在含有农杆菌的溶液中一段时间，然后培养植株并获得种子，再进行筛选、鉴定等。三、第三步：将目的基因导入受体细胞（P80）2.目的基因导入动物细胞⑴方法：显微注射法⑵受体细胞：受精卵⑶过程：构建基因表达载体并提纯利用显微注射将基因表达载体注入动物的受精卵中早期胚胎培养胚胎移植获得具有新性状的动物Q：为什么选受精卵作为受体细胞？①体积大，易操作②易表现出全能性3.目的基因导入微生物细胞⑴方法：Ca2+处理法⑵受体细胞：原核细胞（常选择大肠杆菌）三、第三步：将目的基因导入受体细胞（P80）Ca2+的作用：增加细胞壁的通透性，可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态（感受态细胞）。优点：繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少，易于培养。Ca2+感受态细胞吸收3.目的基因导入微生物细胞⑶实例：利用转基因大肠杆菌生产药物三、第三步：将目的基因导入受体细胞（P80）Q：为何导入的不是胰岛素基因而是cDNA？大肠杆菌生产出的胰岛素具有生物活性？①原核生物细胞里没有相应的酶来去除内含子②原核生物没有真核的蛋白质加工系统（如内质网、高尔基体等）ps：在生产需要加工和分泌的蛋白质时，酵母菌比大肠杆菌更有优势。拓展延伸1.原核基因的结构和表达翻 译转 录mRNA蛋白质拓展延伸加 工转 录mRNA前体成熟mRNA外显子内含子翻 译蛋白质2.真核基因的结构和表达外显子： 能够编码蛋白质的序列内含子： 不能够编码蛋白质的序列受体细胞 植物细胞 动物细胞 微生物细胞常用方法受体细胞转化过程 以农杆菌转化法为例： 将目的基因插入Ti质粒的T-DNA上 ↓ 转入农杆菌中 ↓ 导入植物细胞 ↓ 整合到受体细胞的DNA上 提纯含目的基 因的表达载体 ↓ 显微注射 ↓ 受精卵发育 ↓ 具有新性 状的个体 Ca2＋处理细胞↓感受态细胞↓基因表达载体与感受态细胞混合↓感受态细胞吸收DNA分子花粉管通道法、农杆菌转化法、基因枪法体细胞或受精卵显微注射技术受精卵Ca2＋处理法原核细胞按前面三个步骤进行了操作，是否可以确定Bt基因进入了受体细胞并能维持稳定？是否表达出Bt蛋白？表达出的Bt蛋白是否具有杀虫的功效？如何判断？培育转基因抗虫棉的四个步骤：与载体拼接普通棉花（无抗虫特性）棉花细胞抗虫棉（有抗虫特性）导入抗虫基因重组DNA分子1.目的基因的筛选与获取2.基因表达载体的构建3.将目的基因导入受体细胞4.目的基因的 检测与鉴定之前我们使用过标记基因检测目的基因是否插入，还记得吗？拓展延伸β-半乳糖苷酶可分解无色的X-gal并产生蓝色的产物，使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。将大肠杆菌与基因表达载体混合培养一段时间后，将大肠杆菌接种到添加____________________的培养基上培养，待长出菌落后，应挑选______的菌落作为工程菌生产人胰岛素。氨苄青霉素和X-gal白色目的基因插入位点标记基因目的基因插入位点导入重组质粒导入原质粒导入目的基因未导入成功在加入氨苄青霉素和X-gal 的培养基中白色活菌蓝色活菌死亡死亡白色Q1.基因表达载体中已经具备标记基因（如抗生素抗性基因），对受体细胞进行了筛选，为什么基因工程的第四步还要对目的基因进行检测和鉴定？在含抗生素的选择培养基上能生长的是导入了载体的细胞，载体可能是基因表达载体，也可能是未插入目的基因的空载体。因此，需要对目的基因是否导入进行进一步的检测。此外，即便在选择培养基上能生长的细胞中导入的是基因表达载体，但是仍然不知道目的基因插入的位置、方向等是否正确，能否正确表达，因此也需要在转录和翻译以及个体水平上进行检测和鉴定。思考·讨论：目的基因的检测与鉴定（P82）1.检测目的检测目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性。2.检测内容及方法四、第四步：目的基因的检测与鉴定（P82）类型 检测内容 方法分子水平的检测 受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因目的基因是否转录出了mRNA 目的基因是否翻译成蛋白质个体生物学水平的鉴定 个体是否具有相应性状PCR等技术、DNA分子杂交技术抗原-抗体杂交技术抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等2.检测内容及方法——分子水平⑴检测目的基因是否导入（稳定遗传的关键）检测方法：①PCR扩增四、第四步：目的基因的检测与鉴定（P82）转基因生物提取DNA根据目的基因的序列设计PCR引物PCR操作是否扩增出目的基因电泳能否扩增出不含目的基因的DNA？为什么？什么是电泳？电泳：在电场的作用下，DNA、RNA、蛋白质等这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。正极负极电场力正极负极电场力正极负极琼脂糖凝胶：是以琼脂糖为支持介质制备的凝胶。琼脂糖的熔点在62 65℃之间，融化后在37℃下可维持液态数小时，30℃时凝固成胶。DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。电泳常用缓冲液pH8.0～8.3，DNA分子在此pH条件下带负电荷！正极负极电场力若此时电场里没有任何障碍物，所有DNA片段会以同样的速度向正极移动，怎么让它们移动速度不相同呢？电泳：正极负极电场力琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶是以琼脂糖为支持介质制备的凝胶。琼脂糖的熔点在62 65°C之间，融化后在37°C下可维持液态数小时，30°C时凝固成胶。加样孔（加入待测DNA样本）电泳：正极负极电场力琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶是以琼脂糖为支持介质制备的凝胶。琼脂糖的熔点在62 65°C之间，融化后在37°C下可维持液态数小时，30°C时凝固成胶。片段短，迁移速率快片段长，迁移速率慢在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关凝胶的浓度越大，迁移速率越慢DNA分子越大，迁移速率越慢DNA分子构像有环状、链状等怎么知道这些DNA片段的大小呢？2.检测内容及方法——分子水平⑴检测目的基因是否导入（稳定遗传的关键）检测方法：②DNA分子杂交技术Ⅰ.检测工具：基因探针是指带有标记（放射性同位素标记、荧光标记等）的目的基因片段——单链。Ⅱ.检测原理：将转基因生物的基因组DNA提取出来，用标记了的目的基因作为基因探针，使探针与基因组DNA杂交，如果显示出杂交带，就表明目的基因已插入染色体DNA中。四、第四步：目的基因的检测与鉴定（P82）2.检测内容及方法——分子水平⑴检测目的基因是否导入（稳定遗传的关键）检测方法：②DNA分子杂交技术四、第四步：目的基因的检测与鉴定（P82）硝酸纤维素膜含目的基因的DNA片段基因探针硝酸纤维素膜含目的基因的DNA片段洗去未结合的探针显影装置出现杂交带2.检测内容及方法——分子水平⑵检测目的基因是否转录出了mRNA检测方法：①PCR扩增②分子杂交技术四、第四步：目的基因的检测与鉴定（P82）转基因生物PCR操作是否扩增出目的基因逆转录cDNA（互补DNA）提取RNAmRNA作为模板转基因生物2.检测内容及方法——分子水平⑶检测目的基因是否翻译出相应蛋白质检测方法：抗原— 抗体杂交检测原理：抗原与抗体的特异性结合四、第四步：目的基因的检测与鉴定（P82）苏云金芽孢杆菌提取Bt毒蛋白注射小鼠体内抗体标记抗体提取蛋白电泳分离抗原抗体杂交2.检测内容及方法——个体水平抗性鉴定、活性鉴定等四、第四步：目的基因的检测与鉴定（P82）转基因生物 鉴定方法 成功标志抗虫植物抗病毒（菌）植物抗盐植物抗除草剂植物获取目的基因产物的转基因生物饲喂害虫（抗虫接种实验）害虫死亡病毒（菌）接种实验未染病盐水浇灌正常生长喷洒除草剂正常生长提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较功能、活性正常总结用限制酶切割载体和含有目的基因的DNA片段，然后用DNA连接酶连接，构建基因表达载体将含有目的基因的表达载体导入受体细胞检测和鉴定目的基因是否稳定维持和表达其遗传特性获取质粒、噬菌体等载体筛选和获取目的基因基因工程的基本操作程序课堂小结练习与应用一、概念检测1.研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因afp整合到土壤农杆菌的Ti质粒上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。判断下列相关表述是否正确。（1）afp基因是培育抗冻番茄用到的目的基因。（ ）（2）构建含有afp基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶和核酸酶。 （ ）（3）只要检测出番茄细胞中含有afp基因，就代表抗冻番茄培育成功。 （ ） 练习与应用一、概念检测2.利用PCR既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。下列有关PCR的叙述错误的是（ ）A. PCR用的DNA聚合酶是一种耐高温酶B. 变性过程中双链DNA的解开不需要解旋酶C. 复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则D. 延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP和 4种核糖核苷酸D（一）实验原理1.利用PCR在体外进行DNA片段扩增的原理：①PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合，PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器。②PCR扩增DNA片段还利用了DNA半保留复制的原理。一次PCR一般要经历30次循环。探究·实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定（P84）变性90℃以上延伸72℃左右复性50℃左右基本过程（一）实验原理2.DNA片段电泳鉴定的原理：①DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。②PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。③凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。探究·实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定（P84）100bp200bp300bp400bp500bp600bp700bp800bp1,200bp1,000bp900bp标准样品1样品2样品3（二）目的要求1.了解PCR和电泳鉴定的基本原理。2.尝试进行PCR的基本操作并用电泳鉴定PCR的产物。（三）材料用具探究·实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定（P84）PCR仪（自动控温，实现DNA的扩增）微量离心管（进行PCR反应的场所）微量移液器（用于向微量离心管转移PCR配方中的液体）离心机（使反应液集中在管的底部）电泳仪电泳槽梳子（四）方法步骤1.PCR步骤①移液：用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分。探究·实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定（P84）（四）方法步骤1.PCR步骤②离心：待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率）。探究·实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定（P84）（四）方法步骤1.PCR步骤③反应：参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。探究·实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定（P84）预变性：使DNA充分变性，利于引物更好地和模板结合。（四）方法步骤2.电泳步骤①配制琼脂糖溶液：根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料（溴化乙锭：EB）混匀。探究·实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定（P84）（四）方法步骤2.电泳步骤②制备凝胶：Ⅰ.将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。（梳子孔为加样孔，加样孔侧连电极负极）Ⅱ.待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。Ⅲ.将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。（电泳缓冲液：维持PH值，使DNA带负电荷）探究·实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定（P84）（四）方法步骤2.电泳步骤③加样：将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。④电泳：接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。⑤观察记录：取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。探究·实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定（P84）（五）注意1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。4.在进行操作时，一定要戴好一次性手套。5.PCR扩增不能随意加大试剂用量。探究·实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定（P84）（六）结果分析与评价1.你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。探究·实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定（P84）①条带的有无：（无：无DNA模板或引物设计不合适）②条带的位置：常代表DNA的大小③条带的亮度：代表DNA扩增的数量（六）结果分析与评价2.你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。①扩增不成功，原因：漏加了PCR的反应成分；各反应成分的用量不当；PCR程序设置不当等。②扩增结果不止一条条带：引物设计不合理；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好。探究·实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定（P84） 展开更多...... 收起↑ 资源列表 3.2基因工程的基本操作程序（1）.pptx 3.2基因工程的基本操作程序（2）.pptx
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