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(共28张PPT)
第2节 微生物的培养技术与应用
（二）微生物的选择培养和计数（第2课时）
① 从土壤中分离出能够分解尿素的细菌
② 统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌
绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成_____的微生物才能分解尿素，利用 的 培养基，可以从土壤中分离出 的细菌。
脲酶
以尿素作为唯一氮源
选择
分解尿素
CO(NH2)2 + H2O 2NH3 + CO2
脲酶
探究实践---土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
1 实验目的
2 实验原理
土壤取样
制备培养基
土壤稀释
涂布平板
观察培养
菌落计数
①取样地点：酸碱度接近中性，潮湿，肥沃。
（目的细菌适宜在该环境中生长）
②取样过程：铲去3cm左右表层土,再取土样
（细菌绝大部分分布在距地表3～8cm的土壤层）
③注意事项：
取土样时用的铁铲和取样袋使用前都需要灭菌。操作完成后，要洗手。
3 实验步骤
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
①选择培养基：
②牛肉膏蛋白胨培养基：
作为对照组，来判断选择培养基是否具有选择作用。
以尿素为唯一氮源。
土壤取样
制备培养基
土壤稀释
涂布平板
观察培养
菌落计数
1×10
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1×102
1×103
1×104
1×105
1×106
1×107
9 mL
无菌水
90mL无菌水
分离微生物：保证获得菌落数在30～300之间适于计数的平板。在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，可选用稀释范围更大的稀释液进行平板培养。例如：将1×103～1×107倍稀释的稀释液分别涂布到平板上培养。
土壤取样
制备培养基
土壤稀释
涂布平板
观察培养
菌落计数
选择培养基
（实验组：平行重复）
牛肉膏蛋白胨培养基(作为对照)
（用以判断选择培养基是否具有选择作用）
测细菌时，一般选用104、105、106倍稀释的稀释液进行平板培养。
土壤取样
制备培养基
土壤稀释
涂布平板
观察培养
菌落计数
组别 具体组别 具体操作 作用
实验组 实验组1 涂布接种的选择培养基 三次重复排除偶然因素对实验
结果的影响，用以分离并计数
能分解尿素的细菌。
实验组2 涂布接种的选择培养基 实验组3 涂布接种的选择培养基 对照组1 涂布接种的牛肉膏蛋白胨培养基
对照组 对照组2 不涂布接种的选择培养基
对照组3 不涂布接种的牛肉膏蛋白胨培养基
实验现象
实验组1、2、3分离得到尿素分解菌的单菌落；
对照组1：得到多种菌落且菌落数明显多于实验组；对照组2、3 组正常情况下无菌落。
检验选择培养基是否具有选择作用。
检验选择培养基中是否有杂菌污染。
检验牛肉膏蛋白胨培养基中是否有杂菌污染。
① 培养条件：细菌一般在30～37℃的温度下培养1～2d。
② 观察：每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。
③ 一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等。
注意事项：本实验使用的平板和试管较多，为了避免混淆，最好在使用前做好标记。例如，在标记培养皿（皿底）时应该注明组别、培养日期和平板上培养样品的稀释度等。
土壤取样
制备培养基
土壤稀释
涂布平板
观察培养
菌落计数
102
103
104
105
106
需要的平板，要做好标记
当菌落数目稳定时，选取菌落数在30~300的平板进行计数，同一稀释度下至少计数3个平板，求出平均值，并根据所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。设计如下表格记录并计数。
稀释度 104 105 106 1 2 3 平均值 1 2 3 平均值 1 2 3 平均值
每个平板的菌落数
土壤取样
制备培养基
土壤稀释
涂布平板
观察培养
菌落计数
102
103
104
105
106
已接种的稀释不同倍数的的选择培养基培养结果
4 结果评价与分析
空白对照
稀释106倍
菌落数 52
菌落数 63
菌落数 77
思考：你能计算出每克土样中分解尿素的细菌数吗？
每g样品中的菌落数＝
(64÷0.1)×106
=6.4×108个
-----如果没有接种的培养基上没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。
------如果接种后的完全培养基上的菌落数明显多于选择培养基上的菌落数，说明选择培养基筛选出了一些尿素分解菌。
(1)结合对照组，分析培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出一些菌落。
(2)你是否获得了某一稀释度下菌落数为30~300的平板？在这一稀释度下，是否至少有2个平板的菌落数接近？
------如果得到了两个或多个菌落数为30～300的平板，说明稀释度合适，操作比较成功，能够进行菌落的计数。
------如果是用同一土样进行的操作，数据应该比较接近。如果差异很大，就需要从操作是否规范、培养基配制是否合理等方面查找原因。
(3)你统计的每克土样中能分解尿素的细菌的菌落数是多少？与其他同学统计的结果接近吗？如果差异很大,可能是什么原因引起的？
① 各操作细节要保证“无菌”。如移液管要经过灭菌，
梯度稀释时，试管口和移液管在离火焰1~2cm处，涂布器要经过灼烧灭菌等。
② 将涂布器浸在盛有质量分数为70%的酒精的烧杯中。取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后将沾有少量酒精的涂布器在火焰上灼烧。
③ 操作中要注意防火。不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃其中的酒精。
④ 涂布结束后，应将一个未接种的培养基和已接种的培养基放在一起培养，以检测培养基是否有杂菌污染。
注意事项
(1)在以尿素作为唯一氮源的培养基中分离出的微生物都是能分解尿素的吗？
-----不一定。
-----如固氮菌或利用尿素分解菌的代谢物进行生长繁殖的微生物，
5 进一步探究
因此能在选择培养基上生长的微生物不一定都是所需的微生物，还需要进一步的验证。
在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。
培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。
脲酶催化尿素分解成氨→培养基碱性增强→ 酚红变红
酚红培养基——鉴定分解尿素的细菌
原 理
(2)鉴定
鉴别培养基
伊红和美蓝培养基鉴别大肠杆菌
刚果红培养基鉴别纤维素分解菌
在基础培养基中，加入某种特殊的化学物质，这种物质会与某种微生物的代谢物发生反应，产生明显的特征性变化，根据这种特征性变化，就可将该种微生物与其他微生物区分开来。
项目 选择培养基 鉴别培养基
原理 加入不影响甚至促进目标微生物生长，而抑制或阻止其他种类微生物生长的化学物质 加入某种指示剂或化学药品(不影响微生物正常生长)，使微生物的某种代谢产物与培养基中的特定指示剂或化学药品发生反应
用途 培养、分离出目标微生物 鉴别目标微生物
举例 培养酵母菌和霉菌时，可在培养基中加入青霉素，抑制细菌的生长；利用以尿素为唯一氮源的培养基来培养可分解尿素的细菌 可用伊红美蓝培养基鉴定饮用水或乳制品中是否含有大肠杆菌(若有，则菌落呈黑色)
大肠杆菌
尿素分解菌
随堂练习
1．下列关于“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”实验操作的叙述，不正确的是(　　)
A．利用稀释涂布平板法估算菌落数目的关键是有恰当的稀释度
B．若要判断选择培养基是否起到了选择作用，需要设置未接种的牛肉膏蛋白胨培养基作为对照
C．该实验应采用稀释涂布平板法
D．用以尿素为唯一氮源且添加了酸碱缓冲剂的培养基来培养该细菌后不会使酚红指示剂变红
B
小资料
在实际应用中，有时需要配制兼具选择作用和鉴别作用的培养基。例如，金黄色葡萄球菌可耐高浓度的NaCl，且能利用甘露糖醇产酸，可以根据这些特点来设计培养基，选择并鉴别金黄色葡萄球菌：在培养基中加入浓度为7.5%的NaCl、甘露糖醇和酸碱指示剂，金黄色葡萄球菌能够在这种培养基中生长，如果观察到有些菌落周围培养基颜色发生变化，可以推断这些菌落是金黄色葡萄球菌，之后再进行进一步鉴定。如果在以尿素为唯一氮源的选择培养基中加入酚红指示剂，可以初步鉴定尿素分解菌，这种培养基也是一种既有选择作用又有鉴别作用的培养基。
微生物的数量测定
选择培养基的作用
微生物选择培养获取纯培养物的方法-稀释涂布平板法
微
生
物
的
选
择
培
养
和
计
数
选择培养基
微生物的选择培养
科学实例
筛选原则
选择培养基的概念及举例
稀释涂布平板法的操作过程
间接计数法 — 稀释涂布平板法
直接计数 —计数板计数法
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
培养基的制备
实验设计
（1）土壤取样
（2）样品的稀释
（3）稀释涂布平板法接种
（4）微生物的培养与观察
结果分析
【课堂小结】
一概念测验
1研究人员用无机盐、琼脂和石油配制的培养基从被石油污染的土壤中筛选出了一种石油降解菌。判断下列相关表述是否正确。
① 这种培养基是一种选择培养基。（ ）
② 利用这种石油降解菌可以降解石油。修复土壤。（ ）
③ 相对于未被污染的土壤,从被石油污染的土壤中更容易分离到石油降解菌。（ ）
2用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数时，通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中的活菌数,原因是（ ）
A. 菌落中的细菌数目是固定的
B. 平板上的一个菌落就是一个细菌
C. 通过此方法统计的菌落数与活菌的实际数目相同
D. 平板上的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌
√
√
√
D
练习与应用
二 拓展应用
1反刍（chú）动物，如牛和羊具有特殊的器官一瘤胃。在瘤胃中生活着多种微生物，其中许多微生物能分解尿素。请你设计一个实验从瘤胃中分离出能够分解尿素的微生物。
提示：反刍动物的瘤胃中有大量的微生物，其中就有分解尿素的微生物。由于瘤胃中的微生物多为厌氧菌，接触空气后会死亡，因此分离其中能分解尿素的微生物除了需要准备选择培养基，还应该参照厌氧菌的培养方法进行实验设计。
2 地球上的植物每年产生的纤维素超过70亿吨，其中 40% ~ 60% 能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。对这些微生物的研究与应用，使人们能够利用精杆等生产酒精，用纤维索酶处理服装面料等。已知刚果红是一种染料，它可以与纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红与纤维素形成红色复合物；而当纤维索被纤维素分解菌分解后，复合物就无法形成，培养基中会出现以这些菌为中心的透明圈
（1）现在要从土壤中分离纤维素分解菌，请你给出详细的实验方案。
提示：可以参考本节“探究 实践”中的设计思路进行设计。
土壤取样
制备培养基
土壤稀释
涂布平板
观察培养
菌落计数
（2)你打算到什么环境中去寻找纤维素分解菌？为什么？
提示：纤维素分解菌大多分布在富含纤维素的环境中，采集土样时，可以选择纤维素丰富的环境，如树林中多年落叶形成的腐殖土等。
（3)有同学说，可以把滤纸埋在土壤中，经过一段时间后，再从已腐烂的滤纸上筛选纤维素分解菌。请你评价这一做法。
提示：这是人工设置适合纤维素分解菌生存的环境,腐烂的滤纸上很可能有纤维素分解菌。

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