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第2章 细胞工程
第1节 植物细胞工程
照片中两只可爱的小猴，分别叫“中中”和“华华”，它们诞生于2017年，一出生就轰动了全世界，这是我国科学家的研究成果。你知道它们是如何培育出来的吗？
在这之前，科学家培育了胚胎细胞克降猴，你知道两者有什么不同吗？其实，自1996年首个体细胞克隆动物多莉羊（Dolly）诞生以来，人类已经成功克隆了马、牛和猪等大型家畜，但为什么体细胞克隆猴的诞生能轰动世界呢？
第2章 细胞工程
1902年，哈伯兰特，提出细胞全能性的理论。
1958年，斯图尔德，发现胡萝卜的体细胞可分化为胚，为细胞全能性理论提供了强有力的支持。
1960年，科金，用真菌的纤维素酶分解番茄根的细胞壁，成功获得了原生质体。
1964年，古哈，在培养毛曼陀罗的花药时，首次得到了由花药中的花粉粒发育而来的胚。
1971年，卡尔森，诱导烟草种间原生质体融合，获得了第一株体细胞种间杂种植株。
1974年，土壤农杆菌的Ti质粒发现。之后，该质粒应用于植物分子生物学领域，促进了植物细胞工程与分子生物学技术的紧密结合。
【科技探索之路 · 植物细胞工程的发展历程】
1975年，米尔斯坦和科勒，创立单克隆抗体技术
1890年，希普，世界上首例胚胎移植成功
1907年，哈里森，
首创了动物组织体外培养法
1951年，张明觉，
发现哺乳动物精子获能现象
1958年，格登，体细胞核移植成功
1959年，试管家兔诞生
1978年，胚胎分割移植工程
1981年，埃文斯，
分离和培养小鼠胚胎干细胞
1996年，克隆羊诞生
2006年，山中伸弥，
获得诱导多能干细胞
2014年，单细胞基因组测序进行遗传病筛查的试管婴儿诞生
2017年，我国科学家首次培育了体细胞克隆猴
【科技探索之路·动物细胞工程的发展历程】
“其茅葺，其叶青青，犹绿衣郎，挺节独立，可敬可慕。迨（dài）夫开也，凝情瀼（ráng）露，万态千妍，薰风自来，四坐芬郁，岂非入兰室乎！岂非有国香乎”这是我国历史上第一部兰谱——《金漳兰谱》（宋·赵时庚）中对兰花的一段描述。
从古至今，我国人民都把兰花看作高洁、典雅的象征，很多人喜欢养兰花。但是，兰花种子通常发育不全，在自然条件下萌发率极低；传统分株繁殖的方法又存在繁殖周期长、繁殖率低等问题，如果靠自然繁殖，兰花的价格可想而知了。如何能让名贵的兰花大量、快速地繁殖，从而走入寻常百姓家呢？
从社会中来
利用植物组织培养技术可以大量、快速地培育兰花。
第1课时 植物细胞工程的基本技术
一、细胞工程与细胞全能性的概念
1. 细胞工程的概念：是指应用细胞生物学、分子生物学和发育生物学等多学科的原理和方法，通过细胞器、细胞或组织水平上的操作，有目的地获得细胞、组织、器官、个体或其产品的一门综合性的生物工程。
动物细胞工程
植物细胞工程
植物组织培养
植物体细胞杂交
细胞工程
2. 细胞全能性
（1）概念：细胞经过分裂和分化后，仍然具有产生完整生物体或分化成其他各种细胞的潜能。
实例：
胡萝卜韧皮部细胞发育成完整植株
受精卵发育成个体（动植物）
蜜蜂受精卵发育成工蜂，卵细胞发育成雄峰
用一片叶子、一片花瓣、一粒花粉繁殖出新的植株
韧皮部细胞
细胞团块
根或芽
幼苗
胡萝卜植株
叶子
花粉
花瓣
细胞
2. 细胞全能性
（2）体现细胞全能性的原因：生物体的每个细胞中都含有发育成为完整个体所需的全部遗传物质。
（3）生物体生长发育过程中并不是所有细胞都表现出全能性
①不体现全能性的实例：
②不体现全能性的原因：基因在特定时间、空间条件下选择性表达
芽原基的细胞只能发育为芽
叶原基的细胞只能发育为叶
生长点
叶原基
芽轴
芽原基
枝芽结构示意图
叶原基的细胞只能发育为叶
芽原基的细胞只能发育为芽
在特定的时间和空间条件下，细胞中的基因会选择性表达
（4）植物细胞表现出全能性的条件
①离体
②一定的营养物质、植物激素
③适宜的温度、pH、光照、无菌等外界条件
（3）生物体生长发育过程中并不是所有细胞都表现出全能性
分化程度低的＞分化程度高的
分裂能力强的＞分裂能力弱的
受精卵＞生殖细胞＞体细胞
受精卵＞干细胞＞体细胞
植物细胞＞动物细胞
（5）细胞全能性大小比较：
④不同生物细胞的全能性：
①体细胞全能性与细胞分化程度：
②体细胞全能性与细胞分裂能力：
③不同类型细胞的全能性:
2. 细胞全能性
二、植物组织培养技术
1. 植物组织培养
（1）概念：是指将离体的植物器官、组织或细胞等，培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其形成完整植株的技术。
（2）生殖方式：
无性生殖
（3）分裂方式：
有丝分裂
1958年，美国科学家斯图尔德（F.C.Steward）将胡萝卜韧皮部的一些细胞进行培养获得了完整的胡萝卜新植株。
二、植物组织培养技术
2. 原理：
植物细胞一般具有全能性
3. 过程：
外植体
脱分化
愈伤组织
再分化
芽、根
试管苗
移栽
完整植株
接种外植体
诱导愈伤组织
诱导生芽
诱导生根
脱分化
再分化
移栽成活
（2）脱分化：在一定的激素和营养条件的诱导下，使已经分化的细胞失去其特有的结构和功能，转变为未分化的细胞。
（1）外植体：离体培养的植物器官、组织或细胞。
接种外植体
诱导愈伤组织
诱导生芽
诱导生根
移栽成活
脱分化
再分化
再分化
3. 过程：
（3）愈伤组织：通过脱分化后的细胞，形成不定形的薄壁组织团块。
接种外植体
诱导愈伤组织
诱导生芽
诱导生根
移栽成活
脱分化
再分化
再分化
3. 过程：
接种外植体
诱导愈伤组织
诱导生芽
诱导生根
移栽成活
脱分化
再分化
再分化
3. 过程：
（4）再分化：愈伤组织在培养过程中重新分化成芽、根等器官的过程。
4. 探究 · 实践：菊花的组织培养
（1）实验原理
①植物细胞一般具有 ；
全能性
②在一定的激素和营养等条件的诱导下，已经分化的细胞可以经过脱分化和再分化，形成胚状体，长出芽和根，进而发育成完整的植株；
外植体
脱分化
愈伤组织
再分化
根、芽等
试管苗
完整植株
移栽
胚状体
胚状体（体细胞胚）：离体培养条件下，体细胞培养或生殖细胞培养，没有经过受精过程，但是形成与经过受精后胚胎发育过程所形成的胚胎类似的胚状类似物结构。
植物组织培养的两种途径
直接途径
间接途径
外植体
胚状体
幼苗
外植体
胚状体
幼苗
愈伤组织
胡萝卜根韧皮部的细胞
愈伤组织
胚状体
幼苗
胡萝卜
胚状体：离体培养条件下，没有经过受精过程，但是经过了胚胎发育过程所形成的胚状类似物，因而统称为体细胞胚或胚状体。
胚状体途径
4. 探究 · 实践：菊花的组织培养
细胞分裂素
生长素
芽分化
愈伤组织
根分化
生长分裂定方向
高根低芽中愈伤
（1）实验原理
③植物激素中生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键激素，它们的浓度、比例等都会影响植物细胞的发育方向。
适中：利于愈伤组织的形成
低：利于芽的分化
高：利于根的分化
生长素
细胞分裂素
① 了解植物组织培养的基本原理。
② 了解生长素和细胞分裂素的浓度、用量的比例对菊花愈伤组织形成和分化的影响。
③ 尝试进行植物组织培养。
（2）实验目的
4. 探究 · 实践：菊花的组织培养
（3）材料用具
①外植体：
幼嫩的菊花茎段
（容易诱导形成愈伤组织）
②体积分数为70%的酒精：
对手、超净工作台、外植体进行消毒
③质量分数为5%左右的次氯酸钠溶液：
对外植体进行消毒
④无菌水：
清洗外植体
⑤培养基（参见本书116页附录1）
包括无机营养成分（水和无机盐）、有机营养成分（蔗糖、氨基酸、维生素等）、特定浓度和比例的激素（主要是生长素和细胞分裂素）
蔗糖的作用：
提供能量，调节渗透压
灭菌方法为：
湿热灭菌法
4. 探究 · 实践：菊花的组织培养
①培养基名称： ；
②物理性质： ；
③碳源： 。
植物组织培养常用的培养基配方（P116）
MS培养基
固体培养基
有机碳源（蔗糖）
（4）方法步骤
Ⅰ. 用酒精擦拭双手和超净工作台台面
Ⅱ. 外植体的消毒
4. 探究 · 实践：菊花的组织培养
①消毒
流水冲洗
→酒精消毒30s
→无菌水清洗2～3次
→次氯酸钠溶液处理30min
→无菌水清洗2～3次
将消过毒的外植体置于无菌培养皿中
→用无菌滤纸吸去表面的水分
→用解剖刀将外植体切成0.5～1cm长的小段。
（4）方法步骤
4. 探究 · 实践：菊花的组织培养
②外植体的切段
防止杂菌生长：
①杂菌与培养物竞争（种间竞争）营养；
②产生有害物质危害培养物。
在酒精灯火焰旁，将外植体的1/3～1/2插入诱导愈伤组织的培养基中。用封口膜或瓶盖封盖瓶口，并在培养瓶上作好标记。
注意：接种时注意外植体的方向，不要倒插。
（形态学上端朝上，下端朝下）
③接种外植体
（4）方法步骤
4. 探究 · 实践：菊花的组织培养
注意：该过程一般不需要光照。
有光易形成维管组织，不易形成愈伤组织。
④诱导愈伤组织
将接种了外植体的锥形瓶或植物组织培养瓶置于18～22℃的培养箱中培养。在培养过程中，定期观察和记录愈伤组织的生长情况。（脱分化）
（4）方法步骤
4. 探究 · 实践：菊花的组织培养
培养15～20d后，将生长良好的愈伤组织转接到诱导生芽的培养基上。长出芽后，再将其转接到诱导生根的培养基上，进一步诱导形成试管苗。 （再分化）
注意：每日需要给予适当时间和强度的光照。
（光照培养，促进叶绿素合成）
（4）方法步骤
4. 探究 · 实践：菊花的组织培养
⑤诱导生芽生根
适中
高
低
生长素
细胞分裂素
愈伤组织
再分化
芽
根
外植体
脱分化
再分化
移栽前先打开封口膜或瓶盖，让试管苗在培养箱内生长几日。用流水清洗掉根部的培养基后，将幼苗移植到消过毒的蛭石或珍珠岩等环境中，待其长壮后再移栽入土。每天观察并记录幼苗的生长情况，适时浇水、施肥，直至开花。
⑥移栽
（4）方法步骤
4. 探究 · 实践：菊花的组织培养
（5）注意事项
①实验中使用的培养基和所有器械都要灭菌，接种操作必须在酒精灯火焰旁进行，并且每次使用后的器械都要灭菌。
②接种时注意外植体的方向（形态学上下端），不要倒插。
③诱导愈伤组织期间一般不需要光照，在后续的培养过程中，每日需要给予适当时间和强度的光照。
4. 探究 · 实践：菊花的组织培养
1. A、B过程分别为 。A过程一般 光照，该过程细胞分裂方式是 ，B过程细胞分裂方式是 ，同时也进行 ，该过程 光照，因为 。C是 。
2. 影响A、B过程的关键因素是 ，主要是 和 ，二者添加的 会影响A过程和B过程。
3. 植物组织培养是一个 （无性繁殖或有性繁殖）过程。
有丝分裂
细胞分化
植物激素
细胞分裂素
生长素
无性繁殖
有丝分裂
浓度和比例
【即时练习】下列是植物组织培养流程图，请回答：
植物体
根、芽或胚状体
外植体
A B
C
脱分化、再分化
愈伤组织
不需要
叶绿素的合成需要光照
需要
欲培育地上长番茄和地下结马铃薯的“超级作物”。你有什么妙招？
【思考·讨论】
×
土豆
西红柿
1. 通过有性杂交能实现吗？为什么？
不能，不同物种之间存在生殖隔离。
植物体细胞杂交技术。
2. 有没有方法可以打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，获得“番茄-马铃薯杂种植株”呢？
【思考·讨论】
1. 概念：将不同来源的植物体细胞，在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成新植物体的技术。
三、植物体细胞杂交技术
2. 技术流程
去除细胞壁
去除细胞壁
脱分化
再分化
A细胞
B细胞
杂种细胞AB
脱分化
再分化
杂种植株
愈伤组织
A原生质体
B原生质体
再生细胞壁
2. 技术流程
AB原生质体
原生质体融合
去除细胞壁
三、植物体细胞杂交技术
原生质体：脱去细胞壁的细胞
植物细胞 = 细胞壁 + 原生质体
④酶解法原理：植物细胞的细胞壁主要由纤维素和果胶构成；酶具有专一性
（1）去除细胞壁
①去壁原因：细胞壁阻碍着细胞间的杂交（阻碍了原生质体间的融合）
②方法：酶解法
③相关酶：纤维素酶和果胶酶
2. 技术流程
原生质体
细胞壁
细胞膜
细胞质
液泡
细胞核
概念辨析：原生质体和原生质层
原生质体：脱去细胞壁的细胞，
包括细胞膜、细胞质、细胞核。
原生质层：成熟植物细胞的细胞膜、液泡膜和介于这两层膜之间的细胞质。
【注意】质壁分离的“质”指的是原生质层。
原生质层
2. 技术流程
②方法：
物理法：电融合法、离心法等
化学法：聚乙二醇（PEG）融合法、高Ca2+-高pH融合法等
①原理：细胞膜具有一定的的流动性
（2）原生质体间的融合
注意：去除细胞壁和诱导原生质体融合时，不能在低渗溶液中进行。将细胞放在等渗或略大于的溶液中，防止原生质体吸水而涨破，保持原生质体正常。
刚刚开始融合（上）和已经融合（下）的原生质体
除去了细胞壁的植物（烟草）原生质体
烟草不同物种之间的体细胞杂交
（3）杂种细胞培育成杂种植株
2. 技术流程
①技术：植物组织培养技术
②原理：植物细胞的全能性
③根据植株性状对杂种植株进行筛选
2. 技术流程
②植物体细胞杂交完成的标志：
（4）两个标志
①植物细胞融合完成的标志：
再生出新的细胞壁，形成杂种细胞（在此过程中高尔基体参与、线粒体供能）
培育出杂种植株
（5）体细胞融合成功后，培养基中主要有5种类型的细胞（A、B、AA、BB、AB），其中两两融合细胞类型有3种（AA、BB、AB），而真正符合要求的是AB，因此要对融合细胞进行筛选。
A
B
2. 技术流程
A
A
A
A
番茄
B
B
B
B
马铃薯
A
B
AB
A
AA
A
BB
B
（6）杂种细胞中染色体数、染色体组数，都采用直接相加的方法。
A细胞基因型为Aabb，B细胞基因型为ccDd
2. 技术流程
①假设用于体细胞杂交的双方细胞都有2个染色体组，则杂种细胞有4个染色体组，由杂种细胞发育而来的杂种植株被称为异源四倍体。该杂种植株联会正常，表现为可育。
1. 杂种细胞AB染色体数为？
2. 杂种细胞AB染色体组数为？
8条染色体
4个染色体组（异源四倍体）
3. 杂种细胞AB基因型为？
AabbccDd
3. 变异类型：
染色体数目变异
打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育植物新品种。
5. 意义：
三、植物体细胞杂交技术
属于无性生殖，不遵循孟德尔遗传定律
4. 生殖方式：
6. 植物体细胞杂交技术的实例
①培育出了白菜—甘蓝、普通小麦—长穗偃麦草等杂种植株。
②在木本植物的体细胞杂交方面，培育出了多种柑橘属不同种间的杂种植株。
白菜
甘蓝
白菜—甘蓝
×
为什么“番茄—马铃薯”超级杂种植株没有如科学家所想象的那样，地上长番茄、地下结马铃薯？（拓展应用P38）
原因是：生物体内基因的表达不是孤立的，它们之间是相互调控、相互影响的，所以"番茄—马铃薯"杂种植株的细胞中虽然具备两个物种的遗传物质，但这些遗传物质的表达相互干扰，它们不能再像马铃薯或番茄植株中的遗传物质一样有序表达，杂种植株自然就不能地上结番茄、地下长马铃薯了。
7. 未解决的问题：
有些杂种植株未按照人们的意愿表现出亲代的优良性状
三、植物体细胞杂交技术
归纳总结：植物组织培养和植物体细胞杂交的比较
植物组织培养 植物体细胞杂交技术
生殖方式
原理
步骤
意义
联系 植物体细胞杂交技术包括 和 两个过程，植物组织培养是植物体细胞杂交的一个环节，融合的体细胞只有通过植物组织培养才能发育成完整的个体。 无性繁殖
细胞全能性
①脱分化
②再分化
保持优良性状，繁殖速度快
打破生殖隔离，实现远缘杂交育种
①去除细胞壁
②融合形成杂种细胞
③组织培养（脱分化、再分化）
细胞膜具有一定的流动性、植物细胞的全能性
无性繁殖
植物细胞融合
植物组织培养
练习与应用
1. 下图是利用甲、乙两种植物的各自优势，通过植物细胞工程技术培育高产、耐盐的杂种植株的实验流程图。下列相关叙述错误的是（ ）
A. 进行a处理时能用胰蛋白酶 B. b是诱导融合后得到的杂种细胞
C. c是培养后得到的具有耐盐性状的幼芽 D. 进行d选择时要将植株种在高盐环境中
A
一、概念检测
2. 科学家在制备原生质体时，有时使用蜗牛消化道提取液来降解植物细胞的细胞壁。据此分析，蜗牛消化道提取液中可能含有什么成分
纤维素酶和果胶酶
练习与应用
一、概念检测
2.1.2 植物细胞工程的应用
一、植物繁殖的新途径
1、快速繁殖：
运用组织培养的途径，一个单株一年可以繁殖几万到几百万个植株，而且均来自单一的个体，可以保持优良品种的遗传特性。例如一株葡萄一年繁殖到3万多株，一株兰花一年繁殖到400万株。
1960年，荷兰科学家通过对兰花茎尖进行培养，获得了快速繁殖的脱毒兰花，随后在国内外进行了“兰花试管苗产业化”。
培养
无籽西瓜
接种
优点：
①繁殖率高，可大批量生产
②保持亲本的优良性状（无性繁殖 ）
③不受自然生长季节的限制
④培养周期短
实际应用：
快速繁殖经济苗木、名贵花卉、珍稀濒危植物等自然繁殖速度缓慢，繁殖效率低下或优良性状不易保持的植物。
石斛
百年牡丹树
连翘
生姜是药食两用的经济作物，在生产上长期采用无性繁殖，容易感染多种病毒病，使生姜品质变差，叶子皱缩，生长缓慢，一般减产30%-50%。
病毒引起的植物病害有500多种。受害植物包括粮食作物、蔬菜、果树和花卉等。而且没有有效的防治办法，只能拔除，造成经济损失。病毒多集中在种子、老叶等器官中，在幼嫩的器官和未成熟的组织中较少，在分生区几乎不含病毒。
背景资料
2、作物脱毒
无性繁殖的作物，容易将病毒传染给后代。病毒积累，导致作物产量降低、品质变差。
植物分生区病毒极少，切取茎尖进行组织培养，可获得脱毒苗。
脱毒苗不等于抗毒苗，与微型繁殖相比较，二者无本质区别，只是取材部位不同。
脱毒草莓
普通草莓
1、原因：
2、方法：
选择
亲本
有性
杂交
F1代
花粉离
体培养
单倍体
植 株
诱 变
染色体加倍
可 育
纯合子
选择所
需类型
二、作物新品种的培育
1、单倍体育种
后代都是纯合子，能稳定遗传
明显缩短育种年限，加速育种进程
(1)方法:
花药的离体培养获得单倍体植株，染色体加倍,选择稳定遗传优良品种
(3)优点:
(2)过程:
配子：
DT
Dt
dT
dt
单倍体幼苗：
DT
Dt
dT
dt
花药离体培养
秋水 仙素
第2年
DDtt
ddTT
ddtt
纯合体:
DDTT
矮抗
P
高杆抗病
DDTT
×
矮杆感病
ddtt
F1
高杆抗病
DdTt
单倍体育种
第1年
选择矮秆抗病即为新品种
(4)、应 用
水稻
小麦
烟草
柏树
2.突变体的利用
对植物组织培养过程中得愈伤组织进行诱变处理，促其发生突变，诱导分化成植株，筛选对人们有利突变体,进而培育新品种
外植体
新
品种
筛选
培育
愈伤组织
脱分化
多种
突变体　
诱导分化
诱变处理
白三叶草
优点：
提高变异的频率，加速育种进程。大幅度地改良某些性状。
难以控制突变方向，有利性状比较少，需要大量处理实验材料。
缺点：
(三)、细胞产物的工厂化生产
2、一般组织培养到愈伤组织即可，因为此时细胞分裂能力旺盛，代谢快，有利于产物生成。
1、细胞产物种类：
蛋白质，脂肪，糖类，药物，香料，生物碱等
紫杉醇
紫草宁
人参皂苷
总结：植物细胞工程的实际应用
（一）、植物繁殖的新途径
（二）、作物新品种的培育
（三）、细胞产物的工厂化生产
1.单倍体育种
2.突变体的利用
药物，香料，蛋白质等
2.作物脱毒
1.微型繁殖
小结：
植物组织培养的过程
外植体
愈伤组织
根、芽
植物体
脱分化
再分化
（离体的,已分化组织或细胞）
（未分化）
（分化）
条件？
优点？
特点？
繁殖速度快
不受季节限制
工厂化生产
幼苗无毒
保持优良性状
①适宜温度、光照、 pH和无菌环境。
②无机物、有机物和植物激素（生长素，细胞分裂素等）
无定形状态
薄壁细胞
高度液泡化
排列疏松、无规则
无叶绿体,不进行光合作用
1. √ ×
2.D
拓展应用
1.F2中的紫色甜玉米的基因型可能为 Aasusu或 AAsusu。如果运用常规育种方法，将F2中的紫色甜玉米与白色甜玉米( aasusu)进行测交，可以选择出基因型为 AAsusu的纯种紫色甜玉米。但这种方法比较烦琐，耗时也较长，需要至少三年的选种和育种时间。其实在F1产生的花粉中就可能有Asu的组合，如果利用花药培养的技术获得单倍体植株，再经过诱导染色体加倍，就可以直接得到紫色甜玉米的纯合体。这种方法可以大大缩短育种周期。
2.积极探索其他的繁育途径。例如，研究如何利用植物组织培养技术繁育甜叶菊，研究内容涉及植物组织培养材料的选择，培养基配方的优化，提高试管苗移栽成活率的方法等，最终目的是建立一套利用植物组织培养技术繁育甜叶菊的标准技术体系，实现甜叶菊种苗的产业化生产。
练习与应用

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