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(共22张PPT)
第1节 基因工程及其技术
第4课时
利用大肠杆菌生产人类胰岛素，我们已经获取了胰岛素基因，接下来该如何使其在大肠杆菌中稳定存在呢？
第二步：基因表达载体的构建
二、基因表达载体的构建——核心
1、目 的：
确保基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代， 使目的基因能够有效表达。
思考1：若要干扰素基因在大肠杆菌中稳定存在，并能够表达和发挥作用，载体还需要哪些结构？(阅读课本97页内容)
a、复制原点
b、目的基因
c、启动子
d、终止子
位于基因的上游,是RNA聚合酶结合位点，驱动基因转录出mRNA
位于基因的下游,终止转录
e、标记基因
DNA复制起点
思考2：各个元件有什么作用？(阅读课本97页内容)
能控制表达所需要的特殊性状
初步筛选接受了目的基因受体细胞
①用一定的限制酶切割载体，使其出现一个切口，露出黏性末端。
②用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。
③将切下的目的基因片段拼接到载体的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成了一个重组DNA分子。
2、过 程：
补充1：单酶切体系总结：
①质粒、目的基因会发生自身环化连接
②质粒与目的基因会发生反向连接
缺点：
补充2：双酶切体系总结：
思考：双酶切有什么优点？
（1）不破坏目的基因：切点应位于目的基因两端，如图甲中可选择PstⅠ，而
不选择SmaⅠ。
（2）保留标记基因、启动子、终止子、复制原点：所选择的限制酶尽量不
要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。
补充3：限制酶的选择原则
1.结合基因表达载体模式图分析以下问题：
(1)图中a、b、c分别代表什么结构？
a为启动子、b为终止子、c为复制原点。
(2)启动子和终止子与起始密码子和终止密码子是一回事吗？
不是，启动子和终止子位于DNA上，是基因表达载体必需的部分。而起始密码子和终止密码子位于mRNA上，决定翻译的开始和结束。
(3)为什么目的基因要插入启动子和终止子之间？
启动子位于目的基因的首端使转录开始，终止子位于目的基因的尾端，使转录终止；只有顺序正确，目的基因才能正常转录。
主要是农杆菌转化法
①农杆菌特点：
三、将目的基因导入受体细胞
易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力
②原理：农杆菌含有Ti质粒，其上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。
1. 将目的基因导入植物细胞的方法
③转化过程:
Ti质粒
目的基因
构建
表达载体
导入
植物细胞
插入
植物细胞染色DNA
表达
新性状
转入
农杆菌
小组讨论：
农杆菌转化法中两次拼接、两次导入的目的：
(1)两次拼接：第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T－DNA上；第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基因的T－DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上。
(2)两次导入：第一次导入是将含目的基因的重组Ti质粒导入农杆菌；第二次导入(非人工操作)是将含目的基因的T－DNA导入受体细胞。
2. 将目的基因导入动物细胞
①常用方法：
显微注射技术
②常用受体细胞：
受精卵
③基本操作程序：
将含有目的基因
的表达载体提纯
受精卵
显微
注射
早期胚
胎培养
胚胎移植
发育成为具有
新性状的动物
注意：对于动物来说，受体细胞一般是受精卵，受精卵具有体积大、易操作、经培养可直接表达性状的优点。
繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等。
3.将目的基因导入微生物细胞
①原核生物的特点：
②常用方法：
Ca2+处理法（感受态细胞法）
首先用 Ca2+ 处理大肠杆菌细胞 → 感受态细胞 → 将重组表达载体 DNA分子与感受态细胞混合 → 感受态细胞吸收 DNA 分子。
③基本操作程序：
Ca2+的作用：增加细胞壁的通透性
1.检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因
① 首先取出转基因生物的基因组DNA；
A 方法:
DNA分子杂交
B 过程:
② 将人工合成的目的基因的DNA片段用放射性同位素标记或荧光标记,以此做探针；（单链）
③ 使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明目的基因已插入染色体DNA中。
四、目的基因及其表达产物的检测鉴定
2.检测目的基因是否转录出了mRNA
①方法:
分子杂交法
②过程:用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA。
3.检测目的基因是否翻译成蛋白质
方法：抗原-抗体杂交法
4.个体生物学水平的鉴定
转基因生物 鉴定方法 成功标志
抗虫植物
抗病毒（菌）植物
抗盐植物
抗除草剂植物
获取目的基因产物的转基因生物
饲喂害虫（抗虫接种实验）
害虫死亡
病毒（菌）感染（抗病接种实验）
未出现病斑
盐水浇灌
正常生长
喷洒除草剂
正常生长
提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较
功能、活性正常
1.研究表明，将豌豆早枯病毒(PEBV)的复制酶C端编码序列转入烟草后，转基因烟草会对PEBV表现出抗性。下列说法正确的是
A.该过程需要用到限制酶和DNA聚合酶来构建基因表达载体
B.将豌豆早枯病毒(PEBV)的复制酶C端编码序列导入烟草细胞最常用的
方法是Ca2＋处理法
C.只要在转基因烟草细胞内检测出豌豆早枯病毒(PEBV)的复制酶C端编
码序列就代表成功了
D.检测转基因生物DNA上是否插入了目的基因，可以用DNA分子杂交法
√
2.在检测抗虫基因是否成功转入棉花基因组的方法中，不属于分子水平的是
A.观察害虫吃棉叶是否死亡
B.检测目的基因片段与DNA探针能否形成杂交带
C.检测目的基因转录形成的mRNA与DNA探针能否形成杂交带
D.检测目的基因表达产物蛋白质能否与特定抗体形成杂交带
√
1.目的基因的筛选与获取
4.目的基因的检测与鉴定
2.基因表达载体的构建
3.将目的基因导入受体细胞
基因工程的基本操作程序

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