资源简介

(共26张PPT)
第1节 基因工程及其技术
第2课时
基于PCR技术，运用结构与功能观等观念理解PCR技术的过程、原理、条件等内容，并能够归纳出PCR和DNA复制的异同点。
掌握琼脂糖凝胶电泳法的原理和操作步骤，并能够利用电泳法对PCR扩增产物进行鉴定和产物数量的计算。
01
02
5'
3'
3'
5'
DNA解旋酶
DNA聚合酶
5'
3'
RNA引物
游离的dNTP
DNA连接酶
细胞内DNA复制：
一、聚合酶链式反应（PCR)技术
1.提出者：
Kary Banks Mullis
1944.12-2019.8
PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器
美国科学家穆里斯获1993年诺贝尔化学奖
2.含义：
PCR技术是目的DNA片段(目的基因)的体外扩增技术，整个过程是在体外进行，故又叫做体外DNA扩增技术。
DNA半保留复制、DNA热变性
3.原理：
4.条件：
模板（目的基因）、2种引物、4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶、缓冲溶液（含Mg2+ )
待扩增的DNA片段（模板）
引物
耐高温的DNA聚合酶(Taq酶）
4种脱氧核苷酸（dNTP）
5'
3'
3'
5'
5'
3'
3'
5'
3'
5'
5'
3'
DNA引物
3'
5'
5'
3'
DNA引物
3'
5'
5'
3'
5'
3'
3'
5'
变性（94℃）
退火
（55℃-65℃）
延伸（72℃）
Taq聚合酶
游离的dNTP
5.过程：
小组讨论1：
思考PCR过程中利用的模板、2种引物、4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶、缓冲溶液（含Mg2+ )分别有什么作用？
耐高温的 DNA 聚合酶/Taq酶（作用：催化子链的合成）
4 种脱氧核糖核苷酸/dNTP（作用：合成DNA的原料）
模板 DNA（作用：合成子链的模板）
2种引物（作用：使DNA聚合酶从引物的3'端开始合成子链）
Mg2+缓冲液（作用：激活 DNA 聚合酶/维持适宜的pH、离子浓度等）
3’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
5’
3’
3’
5’
目的基因
5’
引物
6.PCR产物的计算问题:
在第3轮扩增时能得到完整的目的基因
经过n轮扩增后共有目的基因2n-2n个
经过n轮扩增，共消耗引物1 2n-1个
第n轮扩增，需要消耗引物1 2n-1个
6.PCR产物的计算问题:
PCR技术 DNA复制
相同点 原则
原料
条件
不同点 解旋方式
场所
酶
结果
碱基互补配对
四种脱氧核苷酸
模板、能量、酶
DNA在高温下变性解旋
解旋酶催化
体外复制
细胞内（主要在细胞核内）
耐高温的DNA聚合酶
解旋酶、DNA聚合酶
大量的DNA片段
形成整个DNA分子
小组讨论2: PCR技术与DNA复制过程比较？
二、利用PCR技术扩增DNA片段并完成电泳鉴定
（1）尝试运用PCR仪扩增DNA片段
（2）关注PCR技术的应用
（3）学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段的方法和技术
1.实验目的：
2.实验原理：
通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合，PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器，一次PCR一般要经历30次循环。
PCR仪
3.实验试剂：
材料 用量
10倍浓缩的扩增缓冲液（含Mg2+） 5μL
2.5mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液（实为dNTP） 4μL
10μmol/L的引物Ⅰ 2μL
10μmol/L的引物Ⅱ 2μL
H2O 35μL
1-5U/μL的Taq DNA聚合酶（即耐高温的DNA聚合酶） 1U
模板DNA （用量为1pg-1μg） 1μL
4.实验过程：
移液——离心——扩增
移液
离心
扩增
用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分
待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率）
参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。
循环程序 变性 复性 延伸
预变性
94℃,5min
30次
94℃,30s
55℃,30s
72℃,1min
最后一次
94℃,1min
55℃,30s
72℃,10min
/
/
可根据目的片段长度适当调整延伸时间
预变性：使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合。
注意事项
为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
在进行操作时，一定要戴好一次性手套。
PCR扩增不能随意加大试剂用量。
①DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动。
②在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。电泳时，DNA分子的相对分子质量越大，受到的阻力越大，迁移速率越慢；反之，越快。
③通过凝胶成像仪或紫外透射仪观察和记录电泳结果。
5.电泳鉴定原理：
微量离心管
电泳装置
微量移液器
实际上是进行PCR反应的场所
用于向微量离心管转移PCR配方中的液体
包括电泳仪、电泳槽等
6.电泳所需器材：
（1）无菌水、琼脂糖；
（2）电泳缓冲液（TAE或TBE），维持电泳过程中合适的PH；
（3）凝胶载样缓冲液（内含指示剂——溴酚蓝），又叫上样缓冲液；
目的：1.增加样品密度，保证DNA均匀的沉入加样孔，2.加溴酚蓝可监测
电泳进程）
（4）核酸染料（常用核酸染料为EB即溴化乙锭），可在300nm的紫外灯下观察到。
7.电泳所需试剂
8.电泳具体步骤
配置凝胶溶液—制备凝胶—加样—电泳—观察记录
配制琼脂糖溶液
根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀
制备凝胶
将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜
加样
将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物
电泳
接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳
观察记录
取出凝胶置于紫外灯下观察和照相
结果分析与评价
1.你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？
可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。进行电泳鉴定的结果应该是一条条带，该片段大小约为750bp。
2.没扩增出条带，可能的原因有：
3.如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：
漏加了PCR的反应成分（引物、酶、模板、原料等），PCR程序设置不当等。
1.引物设过短与非目的序列有同源性;2.引物之间形成了引物二聚体；3.退火温度过低，非特异性片段多；DNA聚合酶的质量不好等。
1．PCR技术
变性
退火
延伸
在约94℃高温下，作为模板的双链DNA解旋（变性）为两条单链DNA。
反应体系的温度降至约55℃，2条引物分别与对应单链DNA上的特定部位配对。
温度回升到约72℃，4种dNTP根据碱基互补配对原则，在Taq酶的作用下连接到引物3'端，引物链延伸，形成互补的DNA双链。
2．利用PCR技术扩增DNA片段并完成电泳鉴定
配制PCR反应体系
设置程序进行扩增
配制琼脂糖凝胶液
制备凝胶加样缓冲液
加PCR产物
电泳
凝胶成像仪记录电泳结果
对比分析
1．下列有关PCR过程的叙述，不正确的是（ ）
A．变性过程中破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键
B．复制过程中引物与DNA模板链的结合依靠碱基互补配对原则完成
C．延伸过程中需要DNA聚合酶、四种核糖核苷酸
D．PCR技术与细胞内DNA复制相比所需要的酶的最适温度较高
C
2．PCR是一种体外扩增DNA的技术，模拟了体内的DNA复制过程。下图为PCR技术的原理示意图，对于图中物质和过程的说明，错误的是（ ）
A．物质a：游离的dNTP
B．过程①：氢键断裂
C．过程②：边解旋边复制
D．过程③：遵循碱基互补配对原则
C

展开更多......

收起↑