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第3章 第2节
人教版 选择性必修3
第二步：基因表达载体的构建
二/
第一步：目的基因的筛选与获取
一/
目录
CONTENTS
第三步：将目的基因导入受体细胞
三/
第四步：目的基因的检测与鉴定
四/
DNA 片段的扩增及电泳鉴定
五/
02
第二步：基因表达载体的构建
二
第二步：基因表达载体的构建
cDNA文库
5‘
3‘
3‘
5‘
Bt基因
（目的基因）
PCR（设计引物加上酶切位点）
Bt基因
EcoRⅠ酶切位点
EcoRⅠ酶切位点
二
第二步：基因表达载体的构建
Bt基因！
EcoRⅠ酶切位点
EcoRⅠ酶切位点
（目的基因）
Bt基因
二
第二步：基因表达载体的构建
Bt基因
（目的基因）
重组DNA分子
刚才模拟的是什么过程？
二
第二步：基因表达载体的构建
基因表达载体构建的过程：
质粒
载体
限制酶
目的基因
限制酶切割位点
限制酶切割位点
限制酶
在构建抗虫棉的基因表达载体时，首先会用一定的限制酶切割载体，使它出现一个切口
用同种限制酶或
能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段
DNA连接酶
重组
DNA分子
基因表达载体
（核心工作）
二
第二步：基因表达载体的构建
基因表达载体构建的过程：
目的基因
限制酶切割位点
限制酶
用同种限制酶或
能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段
DNA连接酶
重组
DNA分子
基因表达载体
目的基因
（核心工作）
为什么要构建基因表达载体？
使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。
基因表达载体应该具备什么结构才能到达以上目的？
二
第二步：基因表达载体的构建
Bt基因
（目的基因）
基因表达载体
如果目的基因需要复制需要什么结构？
复制原点
如果目的基因需要表达需要什么条件？
需要启动子和终止子
启动子和终止子应该加在哪？
启动子
终止子
位于基因首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA。
二
第二步：基因表达载体的构建
启动子类型：
诱导型启动子
组成型启动子
组织特异性启动子
二
第二步：基因表达载体的构建
位于基因首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA。
启动子类型：
诱导型启动子
即在某些特定的物理或化学信号刺激后，基因转录水平在该类启动子的调控下大幅度地提升或降低。
诱导物
作用
诱导型启动子
激活或抑制
目的基因表达
如：光诱导表达基因启动子、热诱导表达基因启动子、创伤诱导表达基因启动子、真菌诱导表达基因启动子和共生细菌诱导表达基因启动子等。
二
第二步：基因表达载体的构建
位于基因首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA。
启动子类型：
组成型启动子
能够调控基因表达，使其基本恒定在一定程度上，从而使基因在不同部位或组织中的表达水平不存在明显差异。这类启动子一般来自于管家基因，可连续不断地启动基因的表达。
如：使Bt基因表达的启动子
可能存在问题：
如外源基因在整株植物中表达，产生大量异源蛋白质或代谢产物在植物体内积累，打破了植物原有的代谢平衡，有些产物对植物并非必需甚至有毒，因而阻碍了植物的正常生长，甚至导致死亡；
二
第二步：基因表达载体的构建
位于基因首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA。
启动子类型：
组织特异性启动子
其调控作用使得基因往往只在某些特定器官或组织中表达，且表现出发育调节的特性。
优点：
启动的外源基因在受体中仅在需要的部位特异表达，克服了组成型启动子启动的外源基因在受体植物中非特异、持续、高效表达所造成的浪费，增加转基因的效果。
P54
P90
二
第二步：基因表达载体的构建
Bt基因
（目的基因）
基因表达载体
复制原点
基因表达载体还应具有什么结构？
启动子
终止子
位于基因首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA。
终止子相当于一盏红色信号灯，使转录在所需要的地方停下来，它位于基因的下游，也是一段有特殊序列结构的DNA片段。
标记基因
为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的重组DNA分子细胞筛选出来。
抗生素抗性基因、荧光蛋白基因等。
标记基因作用：
标记基因常见类型：
为什么构建的基因表达载体要筛选？如何筛选？
左
右
右
左
目的基因自身环化
质粒自连
单个片段
两个片段之间会出现什么问题？
正向连接
反向连接
正向连接
反向连接
转录方向
转录方向
模板链
模板链
正向连接
反向连接
转录方向
转录方向
模板链
模板链
转录
CCA……UCCCUAA
mRNA1
转录
UUAGGGA……UGG
mRNA2
反向连接将导致最终表达产物不相同！
正向连接
反向连接
两种片段连接还有其他情况吗？
+
目的基因与目的基因连接
+
质粒与质粒连接
如何避免此类问题？
使用双酶切法分别对目的基因两侧和质粒进行切割，使之产生不同的黏性末端！
+
不能环化！
①可以防止质粒、目的基因的自身环化连接；
②还可以防止目的基因与载体的反向连接。
双酶切法作用：
如何使用标记基因筛选？
请结合下图，回答问题：
（1）构建基因表达载体时，能否用SmaⅠ限制酶切割质粒？为什么？
不能
因为SmaⅠ切割会破坏质粒的抗生素抗性基因。
质粒上的抗性基因是标记基因，便于重组DNA分子的筛选，若被破坏，无法进一步筛选。
二
第二步：基因表达载体的构建
-GGGCCC-
-CCCGGG-
（2）只使用EcoRⅠ分别切割质粒和外源DNA，能否构建基因表达载体？
如果能有何弊端？
能
①质粒、目的基因发生自身环化；
②质粒与目的基因会发生反向连接。
二
第二步：基因表达载体的构建
-GGGCCC-
-CCCGGG-
（3）与只使用EcoRⅠ相比较，使用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点是什么？
①可以防止质粒、目的基因的自身环化连接；
②还可以防止目的基因与载体的反向连接。
二
第二步：基因表达载体的构建
-GGGCCC-
-CCCGGG-
科学家利用基因工程生产人胰岛素过程中所使用的质粒和目的基因的部分结构如下图所示。请回答下列问题：
经典题
(1)基因工程的核心是基因表达载体的构建，图中质粒上的____________可作为标记基因将含有目的基因的细胞筛选出来。
LacZ（β-半乳糖苷酶基因）和AmpR（氨苄青霉素抗性基因）
经典题
(2)科学家从胰岛B细胞中获取总RNA，为得到大量的人胰岛素基因，需要用到____________酶，获得的人胰岛素基因序列中___________（填“含有”或“不含有”）启动子。
逆转录酶和耐高温的DNA聚合酶
不含有
经典题
(3)为了使人胰岛素基因和质粒正确连接，应选择___________（填限制酶）切割质粒，在通过PCR技术扩增人胰岛素基因时，可在引物1和引物2的5'端分别添加___________和____________（填限制酶）的识别序列，以使目的基因和质粒具有相同的黏性末端。
氨苄青霉素和X-gal
XhoI
EcoRⅠ
经典题
(4)β-半乳糖苷酶可分解无色的X-gal并产生蓝色的产物，使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。将大肠杆菌与基因表达载体混合培养一段时间后，将大肠杆菌接种到添加___________的培养基上培养，待长出菌落后，应挑选___________的菌落作为工程菌生产人胰岛素。
氨苄青霉素和X-gal
白色
03
第三步：将目的基因导入受体细胞
三
第三步：将目的基因导入受体细胞
受体细胞类型
植物细胞
动物细胞
微生物细胞
农杆菌转化法
花粉管通道法
我国科学家独创
常用
显微注射法
Ca2+处理法
三
第三步：将目的基因导入受体细胞
植物细胞
花粉管通道法
方法一：用微量注射器将含目的基因的DNA 溶液直接注入子房中
含目的基因的DNA 溶液
（我国科学家独创）
（我国科学家独创）
三
第三步：将目的基因导入受体细胞
植物细胞
花粉管通道法
方法二：在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。
三
第三步：将目的基因导入受体细胞
植物细胞
农杆菌转化法
转化：
目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。实质是基因重组。
农杆菌
农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。
三
第三步：将目的基因导入受体细胞
农杆菌转化法
农杆菌
农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。
Ti质粒
T-DNA
（可转移的DNA）
三
第三步：将目的基因导入受体细胞
Ti质粒
T-DNA
（可转移的DNA）
目的基因
构建表达载体
含目的基因的
重组 Ti 质粒
转入农杆菌
含重组 Ti 质粒的农杆菌
第三步：将目的基因导入受体细胞
含重组 Ti 质粒的农杆菌
导入植物细胞
将目的基因插入
染色体 DNA 中
第三步：将目的基因导入受体细胞
将目的基因插入
染色体 DNA 中
表现出新性状的植株
三
第三步：将目的基因导入受体细胞
Ti质粒
T-DNA
（可转移的DNA）
目的基因
构建表达载体
含目的基因的
重组 Ti 质粒
转入农杆菌
含重组 Ti 质粒的农杆菌
导入植物细胞
将目的基因插入
染色体 DNA 中
第一次拼接
第二次拼接
第一次导入
第二次导入
该过程涉及两次拼接和两次导入，你能总结吗？
两次拼接：第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上；第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上。
两次导入：第一次导入是将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌；第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA导入受体细胞（非人工操作）。
三
第三步：将目的基因导入受体细胞
根据受体植物的不同，所用的具体转化方法有所区别。
例如，可以将新鲜的从叶片上取下的圆形小片与农杆菌共培养，然后筛选转化细胞，并再生成植株；
可以将花序直接浸没在含有农杆菌的溶液中一段时间，然后培养植株并获得种子，再进行筛选、鉴定等。随着转化方法的突破，用农杆菌侵染水稻、玉米等多种单子叶植物也取得了成功。

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