资源简介

(共32张PPT)
3 微生物的数量测定
2 微生物的选择培养
1 选择培养基
任务：举例说明通过调整培养基的配方可有目的地选择微生物
任务：阐明选择培养微生物的思路与原理
任务：概述稀释涂布平板法和显微镜计数法是测定微生物数量常用的方法
微生物的选择培养和计数
第2节 微生物的培养技术及应用
自然界中微生物数量繁多，种类庞杂，要想从中分离出需要的特定微生物并不容易，尤其当要分离的微生物在混合菌群中不是优势种群时，更难实现，仅通过一般的平板划线法或稀释涂布平板法很难实现。该怎么办？
1.获得纯净的微生物培养物的关键是什么？
防止杂菌污染
2.微生物的纯培养过程包括哪些步骤？
配制培养基、灭菌、接种、分离和培养
1973年，科学家从美国黄石国家公园的热泉中筛选出水生栖热菌( Thermus aquaticus)，进而从这种菌中提取出耐高温的DNA聚合酶。这种酶目前已被广泛用于体外扩增DNA片段的聚合酶链式反应(PCR)。
（1）.为什么水生栖热菌能更容易在热泉中找到并被筛选出来呢？
这是因为水生栖热菌适应热泉的环境，能在 70~80 ℃的高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。
（2）.在自然界中，想进行微生物筛选的原则是什么？
耐热微生物
耐寒微生物
石油分解菌
根据微生物对生存环境的要求，到相应环境中去寻找。
一、选择培养基
1.科学实例：寻找耐高温的DNA聚合酶
2.筛选原则：
美国黄石公园
实验室中目的 菌株怎么筛选？
一 选择培养基
启示：根据微生物对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。
耐寒微生物
耐热微生物
石油分解菌
纤维素分解菌
人为提供有利于目的菌生长的条件（包括营养、温度和pH）等，同时抑制或阻止其他微生物生长。
实验室中微生物筛选的原理
选择培养基
一 选择培养基
2.选择培养基的类型
类型 条件 分离得到的菌种
改变培养条件 高温环境 耐高温微生物
高盐环境 金黄色葡萄球菌等耐盐菌
添加某种化学物质 加入青霉素 酵母菌、霉菌等真菌
特殊碳源、氮源 尿素是唯一氮源 能分解尿素的微生物
石油是唯一碳源 能消除石油污染的微生物
营养缺陷 不加碳源 自养型微生物
不加氮源 固氮菌
在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基称为选择培养基。
一 选择培养基
1、概念
尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化学性质稳定，是一种重要的农业氮肥。尿素施入土壤后，被某些细菌分解成NH3，NH3再转化成NO3-、NH4+等才能被植物吸收。而这些细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶，来催化尿素分解成NH3,NH3可作为细菌生长的氮源。
尿素分子模型
1.如果让你配制一种培养基，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？
讨论
在选择培养基中，以尿素作为唯一氮源，可以将分解尿素的细菌分离出来。
2.该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？
葡萄糖 10.0g
尿素 1.0g
KH2PO4 1.4g
Na2HPO4 2.1g
MgSO4·7H2O 0.2g
琼脂 15.0g
蒸馏水 1000ml
该培养基与普通培养基相比，区别只是用尿素作为唯一氮源，培养基的其他营养成分基本相同。
一 选择培养基
3、选择培养基的配方设计
3.选择培养基的配方设计
如果让你配制一种培养基，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？
牛肉膏 5.0g
蛋白胨 10.0g
NaCl 5.0g
琼脂 20.0g
蒸馏水 定容到1000ml
培养基一
KH2PO4 1.4g
NaH2PO4 2.1g
MgSO4·7H2O 0.2g
葡萄糖 10.0g
尿素 1.0g
琼脂 15.0g
蒸馏水 定容到1000ml
培养基二
选择哪种培养基更合适？

可作为完全培养基
（起对照作用）
一 选择培养基
02
1g土壤中有多少能分解尿素的细菌？
分离：获得分解尿素的细菌的纯培养物
计数：测定分解尿素的细菌的数量
概念：将菌液进行一系列梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到固体培养基的表面，进行培养。
主要过程:
A、梯度稀释菌液 B、涂布平板
稀释度足够高时，能在培养基表面形成单个菌落。
稀释涂布平板法
二、微生物的选择培养
02
1×10
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1×102
1×103
1×104
1×105
1×106
1×107
9 mL 无菌水
90mL无菌水
10g
微量
移液器
①铲取土样，将样品装入纸袋中
注意：取土样用的小铁铲和盛土样的的纸袋在使用前都要灭菌。
取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。
②将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀，制成菌液。
A 梯度稀释
稀释涂布平板法
二、微生物的选择培养
02
③取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。
⑤将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。
⑥用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。
注意：多余的酒精在烧杯中滴尽，然后再放在火焰上灼烧。
④将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。
B、涂布平板
稀释涂布平板法
二、微生物的选择培养
恒温培养箱
待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30-37℃的恒温培养箱中，培养1-2d。
在涂布有合适浓度菌液的平板上就可以观察到分离的单菌落。
同样是分离得到单菌落，平板划线法和稀释涂布平板法有何不同？
二、微生物的选择培养
稀释103倍
稀释104倍
稀释105倍
空白对照
平板划线法 稀释涂布平板法
纯化原理
接种工具
单菌落的获得
用途
接种效果图
相同点 通过连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散
将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释程度的菌液分别涂布到固体培养基的表面，进行培养，以得到单菌落
接种环
涂布器
从最后划线的区域挑取
稀释度合适，整个平板上都可找到单菌落
分离纯化菌种，获得单菌落
①分离纯化菌种，获得单菌落②用于计数
①都能分离纯化菌种；②都是在固体培养基上进行的。
2.平板划线法和稀释涂布平板法的比较：
二、微生物的选择培养
03
当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过计数平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
1.稀释涂布平板法
1.稀释涂布平板法
2.显微镜直接计数法
——间接计数法
——直接计数法
计数原则:
为了保证结果准确，选择30-300个菌落的平板进行计数；
每个稀释度至少取3个平板取其平均值；
分析实验结果时，要考虑重复组结果是否接近，如果相差太大，意味着操作有误，需重新实验。
三. 微生物的数量测定
统计的菌落往往比活菌的实际数目低；
统计的结果一般用菌落数而不是活菌数来表示；
恰当的稀释度、涂布是否均匀是成功统计菌落数目的关键。
结果分析:
当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
03
1.稀释涂布平板法
三. 微生物的数量测定
03
计算公式:
每g样品中的菌落数＝
(C÷V)×M
M代表稀释倍数
C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数
V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)
例：某同学在稀释倍数为106 的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每g样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1mL) ( )
A. 2.34×108 B. 2.34×109 C. 234 D. 23.4
（234÷0.1）×106=2.34×109
答
B
例：甲同学做此实验在稀释倍数105获得3个平板，菌落数分别是80、90、100，涂布平板时均使用0.1ml菌液，试计算每克土壤中可以分离尿素的细菌数目？
（80+90+100）/3
0.1
× 105 =9 ×107个
1.稀释涂布平板法
三. 微生物的数量测定
1、请计算：4号试管的结果表明每克土壤中的活菌数约为 个。
1.1×108
2、通过稀释涂布平板法统计的细菌的数目与它的实际数目相同吗？
提示　统计的细菌数往往比活菌实际数目低。因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
练一练
2.显微镜直接计数：——直接计数法
（1）方法：
利用特定的细菌计数板或血细胞计数板在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积的样品中微生物的数量。
相关信息
细菌计数板可对细菌等较小的细胞进行观察和计数，血细胞计数板常用于相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的观察和计数。
（2）优点：
快速直观
（3）缺点：
②个体小的细菌在显微镜下难以观察。
每毫升原液所含细菌数＝
①统计的结果一般是活菌数和死菌数的总和，不能区分死菌与活菌。
每小格平均细菌数×400×10000×稀释倍数
血细胞计数板
三. 微生物的数量测定
微生物的计数方法比较
内容 直接计数法 间接计数法
主要用具 显微镜、细菌计数板或血细胞计数板 涂布器
计数依据 细菌个数 培养基上菌落数
优点 计数方便、操作简单 计数的是活菌
缺点 不能区分死菌与活菌 当两个或多个菌体连在一起时,平板上观察到的只是一个菌落
计算公式 每毫升原液含菌株数＝每小格平均菌株数×400×1 0000×稀释倍数 每克样品中的菌株数：(C ÷ V）× M
C：某稀释度下平板上生长的平均菌落数；V：涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)；M：稀释倍数
结果 比实际值偏大 比实际值偏小
实例.土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
（1）原理：绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。利用以尿素作唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。
常见的分解尿素的微生物：芽孢杆菌、小球菌、棒状杆菌等细菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。
葡萄糖 10.0g
尿素 1.0g
KH2PO4 1.4g
Na2HPO4 2.1g
MgSO4·7H2O 0.2g
琼脂 15.0g
蒸馏水 1000ml
①从物理性质看该培养基属于什么培养基？
②从功能分析该培养基属于什么培养基？
固体培养基
选择培养基
三. 微生物的数量测定
（2）.实验步骤：
1）土壤取样
①取样地点要求：酸碱度接近中性的潮湿土壤。
②取样过程：
3）样品稀释与取样涂布
2）制备培养基
①细菌：一般用104、105、106稀释液。
②真菌：一般用102、103、104稀释液。
以保证获得菌落数在30～300之间适于计数的平板。
选择一个比较宽的范围，将1×103～1×107倍稀释的稀释液分别涂布到平板上培养，以保证能从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数。
在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，怎样做才能保证从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数？
相当于做预实验。
铲去表层土（一般3cm左右）。细菌绝大部分分布 在距地表3～8cm的土壤层。
思考
三. 微生物的数量测定
（2）.实验步骤：
4）微生物的培养与观察
①培养条件：不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌一般在30～37℃的温度下培养1～2d。
②观察：每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。
③一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等。（鉴别指示剂）
得到的菌落一定是分解尿素的细菌吗？
不一定，还需要进一步的鉴定
三. 微生物的数量测定
实践 探究 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
三. 微生物的数量测定
组 具体组别 具体操作 作用
接种组 实验组1 选择培养基 三次重复排除偶然因素对实验结果的影响，用以分离并计数能分解尿素的细菌。
实验组2 选择培养基 实验组3 选择培养基 实验组4 牛肉膏蛋白胨培养基 实验组4与实验组1 、2、3组对比用以验证选择培养基是否具有选择作用。
不接种组 对照组1 选择培养基 对照组1与实验组1 、2、3组对比用以验证选择培养基中是否含有杂菌。
对照组2 牛肉膏蛋白胨培养基 对照组2与实验组4 对比用以验证牛肉膏蛋白胨培养基中是否含有杂菌。
结果 实验组1、2、3分离得到尿素分解菌的单菌落； 实验4组得到多种菌落；对照组1、2组正常情况下无菌落。 ①结合对照组，分析培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出一些菌落。
②你是否获得了某一稀释度下菌落数为30～300的平板 在这一稀释度下，是否至少有2个平板的菌落数接近
③你统计的每克土样中能分解尿素的细菌的菌落数是多少 与其他同学统计的结果接近吗 如果差异很大，可能是什么原因引起的
如果没有接种的培养基上没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。如果接种后的完全培养基上的菌落数明显多于选择培养基上的菌落数，说明选择培养基筛选出了一些尿素分解菌。
如果得到了两个或多个菌落数为30～300的平板，说明稀释度合适，操作比较成功，能够进行菌落的计数。
如果是用同一土样进行的操作，数据应该比较接近。如果差异很大，就需要从操作是否规范、培养基配制是否合理等方面查找原因。
三. 微生物的数量测定
土壤中分解尿素的细菌的鉴定
在以尿素作为唯一氮源的培养基中分离出的微生物都是能分解尿素的吗？
因为有些微生物可以利用其他微生物的代谢产物进行生长繁殖。
不一定。
对分离的菌种进行鉴定还需要借助生物化学的方法。
CO(NH2)2
脲酶
+ H2O
+ CO2
2NH3
原理：脲酶催化尿素分解成氨→培养基碱性增强→ 酚红变红→脲酶阳性
操作：在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。
①液体培养基可以直接看液体的变色情况；
②固体培养基上可以观察菌落周围是否出现红色环带，红色环带直径与菌落直径比值越大，说明分解能力越强。
在培养基中加入某种指示剂或化学药品(不影响微生物正常生长)，使微生物的某种代谢产物与培养基中的特定指示剂或化学药品发生反应。从而达到鉴定的作用。
鉴别培养基：
拓展应用
纤维素分解菌的鉴定
（1）筛选纤维素分解菌的方法____________。该方法可以通过____反应直接筛选。
刚果红染色法
颜色
（2）原理：
刚果红是一种染料，它可以与纤维素形成红色复合物，但并不和纤维二糖、葡萄糖发生这种反应。在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红与纤维素形成红色复合物。当纤维素被纤维素酶分解后刚果红—纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。这样我们可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。
可根据是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌
是将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到 伊红-美蓝 培养基上培养，大肠杆菌菌落呈现黑色，通过计算得出水样中大肠杆菌的数量。
到生活中去
测定饮水中大肠杆菌数量的方法：
鉴别培养基
微生物的数量测定
选择培养基的作用
微生物选择培养获取纯培养物的方法-稀释涂布平板法
微
生
物
的
选
择
培
养
和
计
数
选择培养基
微生物的选择培养
科学实例
筛选原则
选择培养基的概念及举例
稀释涂布平板法的操作过程
间接计数法 — 稀释涂布平板法
直接计数 —计数板计数法
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
培养基的制备
实验设计
（1）土壤取样
（2）样品的稀释
（3）稀释涂布平板法接种
（4）微生物的培养与观察
实验结果
练习与应用
一、概念检测
1. 研究人员用无机盐、琼脂和石油配制的培养基从被石油污染的土壤中筛选出了一种石油降解菌，判断下列相关表述是否正确。
（1）这种培养基是一种选择培养基。（ ）
（2）利用这种石油降解菌可以降解石油，修复土壤。（ ）
（3）相对于未被污染的土壤，从被石油污染的土壤中更容易分离到石油降解菌。（ ）
2. 用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数时，通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中的活菌数，原因是（ ）
A. 菌落中的细菌数目是固定的
B. 平板上的一个菌落就是一个细菌
C. 通过此方法统计的菌落数与活菌的实际数目相同
D. 平板上的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌
√
√
√
D
练习与应用
二、拓展应用
1.反刍（chú）动物，如牛和羊具有特殊的器官一瘤胃。在瘤胃中生活着多种微生物，其中许多微生物能分解尿素。请你设计一个实验从瘤胃中分离出能够分解尿素的微生物。
由于瘤胃中的微生物多为厌氧菌，接触空气后会死亡，因此分离其中能分解尿素的微生物除了需要准备选择培养基，还应该参照厌氧菌的培养方法进行实验设计。
拓展应用
2.地球上的植物每年产生的纤维素超过70亿吨，其中40%~60%能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。对这些微生物的研究与应用，
使人们能够利用秸秆等生产酒精，用纤维素酶处理服装面料等。已知刚
果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，
但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种反应。当我们在含有纤
维素的培养基中加入刚果红时，刚果红与纤维素形成红色复合物；而当
纤维素被纤维素分解菌分解后，复合物就无法形成，培养基中会出现以
这些菌为中心的透明圈（如下图所示）。请回答下列问题。
(1)现在要从土壤中分离纤维素分解菌，请你给出详细的实验方案。
提示：制备土壤浸出液，接种到以纤维素为唯一碳源的培养基中培养。在稀释涂布到含刚果红的以纤维素为唯一碳源的培养基中培养。菌落周围出现透明圈的菌落即为能分解纤维素的微生物。
以纤维素为唯一碳源的培养基是____________。
加有刚果红的培养基是_____________。
选择培养基
鉴别培养基
4. 地球上的植物每年产生的纤维素超过70 亿吨，其中40%～ 60%能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。对这些微生物的研究与应用，使人们能够利用秸秆等生产酒精，用纤维素酶处理服装面料等。已知刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红与纤维素形成红色复合物；而当纤维素被纤维素分解菌分解后，复合物就无法形成，培养基中会出现以这些菌为中心的透明圈（如下图所示）。请回答下列问题。
（3）有同学说，可以把滤纸埋在土壤中，经过一段时间后，再从已腐烂的滤纸上筛选纤维素分解菌。请你评价这一做法。
可以选择纤维素丰富的环境，如树林中多年落叶形成的腐殖土等。
可行，这是人工设置适合纤维素分解菌生存的环境,腐烂的滤纸上很可能有纤维素分解菌。
（2）你打算到什么环境中去寻找纤维素分解菌？为什么？

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