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第二节　发酵工程的无菌技术
第1课时　发酵工程的灭菌方法、灭菌设备、无菌操作器具 及微生物接种和传代的无菌技术
[学习目标]　1.掌握不同物品的灭菌方法。2.概述发酵工程的灭菌设备和无菌操作器具并掌握其正确使用方法。3.概述微生物接种的方法和传代的无菌技术。
一、发酵工程的灭菌方法
1．无菌技术：指在操作过程中，保持物品与操作区域的______状态并不被______污染的技术，其核心是______。
2．灭菌方法
灭菌方法 灭菌原理 应用
化学方法 化学试剂灭菌法 一些化学试剂如______、氯、__________，能破坏微生物的______或细胞结构，具有杀菌作用 一般不用于______的灭菌
物理方法 射线灭菌法 利用______等产生的__________等进行灭菌 一般用于____________的灭菌
干热灭菌法(包括________灭菌法和________法等) 高温干热使微生物的结构被破坏、蛋白质、核酸变性 主要用于要求________的实验器具(如培养皿、______和移液管)的灭菌；火焰灼烧法常用于______等操作过程
湿热灭菌法(一般在温度为______、气压约 ____ kPa的条件下维持15～20 min) 吸收了蒸汽水分和热量的菌体蛋白质易______ 适用于耐高温、耐湿热的物品，如对培养基的灭菌，在相同温度下湿热灭菌比干热灭菌______
过滤除菌法 通过______阻留微生物从而达到除菌目的 制备________；在产品提取过程中处理料液，获得无菌产品
判断正误
(1)灭菌相比消毒对微生物的杀灭更彻底(　　)
(2)无菌操作的对象只要是没有生物活性的材料(如培养基、接种环等)都可采用湿热灭菌法进行灭菌(　　)
(3)培养基最常用的灭菌方法是湿热灭菌法(　　)
任务一：无菌技术的分析
1．无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么作用？
________________________________________________________________________
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________________________________________________________________________
2．请判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。
(1)培养细菌用的培养基与培养皿。
(2)玻璃棒、试管、锥形瓶和移液管。
(3)实验操作者的双手。
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　消毒与灭菌的比较
比较项目 消毒 灭菌
作用强度 较为温和 强烈的物理或化学方法
作用对象 操作空间、操作者双手等 接种环、移液管、培养基等
作用结果 不能杀死所有微生物(如细菌芽孢) 能杀死物体内外的所有微生物，包括芽孢和孢子
常用方法 煮沸消毒法、巴氏消毒法等 干热灭菌法、湿热灭菌法等
1．下列关于无菌技术的叙述，错误的是(　　)
A．甲醛、高锰酸钾等能破坏微生物的蛋白质或细胞结构，具有杀菌作用
B．工业生产中制备无菌空气常用过滤除菌法
C．紫外线穿透力强能杀死一定空间中所有微生物
D．对培养基灭菌，常采用湿热灭菌法
2．消毒和灭菌是微生物培养中常用的操作方法。下列说法正确的是(　　)
A．发酵工程的生产过程只有在没有杂菌污染的情况下才能正常进行
B．在100 ℃条件下煮沸5～6分钟属于灭菌方法，该方法可杀死微生物细胞和一部分芽孢
C．无菌技术中，若处理对象为液体，则只能消毒，不能灭菌
D．消毒和灭菌的原理是完全不同的
二、发酵工程的灭菌设备及无菌操作器具
1．发酵工程的灭菌设备
(1)电热鼓风干燥箱
①用途：常用于__________的玻璃器皿(如________、离心管、移液管)、______用具(如镊子、手术刀)和其他耐高温的物品(如菌种保藏采用的沙土管、石蜡油、碳酸钙)的灭菌。带有______或________的物品、液体及______培养基一般不能采用电热鼓风干燥箱干热灭菌。
②优点：使灭菌器皿保持______。
③灭菌的温度
a．细菌、酵母菌及霉菌的营养细胞含水量______，需在________条件下，加热10 min即可使其蛋白质变性而达到杀菌效果。
b．放线菌及霉菌孢子含水量____________，在80～90 ℃条件下，加热30 min方可杀菌。
c．细菌芽孢含水量______，蛋白质变性温度较______。
④彻底灭菌的标准及灭菌条件
标准：一般以能否杀死____________作为彻底灭菌的标准。
灭菌条件：温度提高到约______ ℃，加热2～3 h。
⑤注意事项
a．不得将易腐、______、易爆物品放入箱内干燥灭菌；
b．干燥箱在工作时，必须将__________开关打开；
c．箱内应经常保持______。
(2)高压蒸汽灭菌锅
①灭菌原理：在一个密闭的锅内，水的__________随蒸汽压力的增高而______，加压的同时提高蒸汽的__________，使锅内的待灭菌物品在一定压力和温度等条件下，杀死其中________微生物的营养体及其________。
②注意事项：操作人员必须在现场规范操作，严格控制______维持灭菌时的______。锅内压力过高，不仅培养基的营养________会被破坏，而且高压锅超过耐压范围后可能会发生______，造成伤人事故等。
③使用步骤
(3)空气除菌设备
①空气除菌方法：常采用____________的方法，即让含菌空气通过无菌干燥的过滤介质，以________空气中所含微生物。
②各种不同的发酵过程，对空气__________的要求也不同。例如，酵母菌繁殖得快，对空气的无菌要求相对______；而制备氨基酸、抗生素等的发酵过程，所需的微生物对空气无菌的要求______。
2．发酵工程的无菌操作器具
(1)接种器具
①常用的接种器具：玻璃涂布器、________、接种环等。
②用途：玻璃涂布器常用于______________接种，接种针用于__________接种，接种环用于______接种或在平板培养基上______接种。
(2)转移器具
①移液管
使用要点：
a．以拇指及中指捏住管颈标线______的地方，将移液管插入待取溶液液面下约1 cm。
b．移液管不应伸入太多，以免管尖外壁粘有过多溶液；也不应伸入太少，以免液面下降后而______。
操作步骤：
②微量取液器
a．用途：取液量______时(如0.1 mL)使用。
b．类型：分为固定容量的和__________容量的两种。
(3)超净工作台
①净化原理：利用工作台内______________的杀菌作用，并通过________________过滤确保工作台内空气的无菌、无污染。
②注意事项：超净工作台开机杀菌30 min后，需先关掉____________，约__________后方可使用。
判断正误
(1)菌体蛋白质的变性温度与含水量相关，一般来说含水量越低，变性温度越高(　　)
(2)使用高压蒸汽灭菌锅时，为充分利用空间，装得越满越好(　　)
(3)当高压蒸汽灭菌锅的压力表指针降至“0”点时，即可出锅(　　)
(4)制备氨基酸、抗生素等的发酵过程，所需的微生物对空气无菌的要求较低(　　)
(5)将移液管移入准备接受溶液的容器时，为避免污染，移液管不能接触器壁(　　)
任务二：无菌操作器具的使用分析
1．培养基灭菌为什么采用高压蒸汽灭菌而不采用干热灭菌？
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2．如何制备一瓶无菌水？
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3.某同学在使用高压蒸汽灭菌锅时，若压力达到设定要求，而锅内并没有达到相应温度，最可能的原因是什么？
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4．某同学从高压蒸汽灭菌锅内拿出培养基后发现，培养基已经溅满了锥形瓶的瓶壁，最可能的原因是什么？
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　高压蒸汽灭菌锅的使用及注意事项
(1)首先将内层灭菌桶取出，再向外层锅内加入适量的水，水量达到水位标记线即可。
(2)放回灭菌桶，并装入待灭菌物品。注意不要装得太挤，以免妨碍蒸汽流通而影响灭菌效果。锥形瓶与试管口不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包裹瓶口的纸而透入棉塞。
(3)加盖，并将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的排气槽内。拧紧固定螺栓，注意要对称地旋紧锅盖四周的固定螺栓，使固定螺栓松紧一致，不漏气。
(4)加热灭菌锅，打开排气阀，使水沸腾，排出锅内的冷空气。等冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐步上升。当锅内压力升到所需压力时，控制热源，按照灭菌所要求的时间，维持压力。
(5)到灭菌时间后，切断热源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降到“0”点时，打开排气阀，旋开固定螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。如果提前打开排气阀，锅内压力突然下降，灭菌容器内的液体会冲出容器，造成污染。
3．(多选)下列关于无菌操作器具的使用，错误的是(　　)
A．用玻璃涂布器进行涂布平板接种
B．用接种针进行穿刺接种
C．用移液管移取溶液时，当溶液液面上升到刻度标线时，立即堵住管口
D．超净工作台开机杀菌30 min后，关闭紫外线灯即可使用超净工作台
4．(多选)如图是灭菌锅及其局部剖面示意图，下列相关叙述正确的是(　　)
A．甲、乙、丙分别是排气阀、安全阀和压力表
B．使用时应在锅内水煮沸并排除全部冷空气后再关闭乙
C．灭菌结束后应立即打开乙，放出锅内热蒸汽
D．将器皿放入灭菌锅之前通常用牛皮纸或报纸包扎，避免灭菌后的再次污染
三、微生物接种和传代的无菌技术
1．菌种传代和保存的目的和条件
(1)目的：尽量让菌种在人工创造的条件下，________细胞的代谢水平，使细胞基本处于________状态，即微生物的生长繁殖受到抑制但又不至于________。
(2)条件：__________________。
2．菌种传代和保存的接种方法
(1)厌氧微生物接触氧气会受到抑制、损伤甚至死亡，常采用______接种。
(2)__________是常用的菌种传代和低温下保存菌种的方法。
3．菌种保存方法
(1)步骤：挑选典型菌落→接种在斜面培养基上→培养使其__________生长→试管用牛皮纸包扎→置于__________左右的冰箱中保藏(目的：减缓培养基的____________，延长__________)。
(2)通常每隔2～3个月______接种一次，再继续保存。
判断正误
(1)低温、干燥、高氧是菌种保存的重要条件(　　)
(2)厌氧微生物常采用穿刺接种的方法将其保护在培养基中(　　)
(3)将装有新鲜菌种的试管放在－4 ℃的冰箱中保藏，有利于延长保存时间(　　)
任务三：微生物接种方法分析
1．如图所示的接种方法分别是什么？
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2．在斜面接种和培养酵母菌的过程中有哪些无菌操作的步骤？
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　斜面接种和培养酵母菌的操作步骤及其目的或分析说明
顺序 接种操作步骤 目的或分析说明
① 将接种环的环端和接种时可能进入试管的部分放在酒精灯火焰上，来回灼烧多次 将接种环灭菌，避免污染菌种
② 迅速将试管口通过火焰2～3次 灼烧灭菌，防止试管口上的微生物污染培养基
③ 将灭过菌的接种环伸入菌种管，先将环部接触培养基斜面顶端或其他无菌体的培养基部位 使接种环冷却，避免杀死菌种
④ 抽出接种环时，带菌部位不要触及管壁或通过火焰 防止菌种沾于管壁；防止菌种被杀死
⑤ 在培养基斜面上由底部向上轻轻划“Z”型折线，但不要将培养基的表面划破 初步接种。划破培养基不利于后续的继续划线，长出的菌落不标准
⑥ 将试管口与试管塞分别通过火焰2～3次，迅速塞紧试管 防止杂菌污染
⑦ 将接种过菌种的试管，放在恒温箱(28 ℃)中培养24 h 培养酵母菌，观察接种和培养的结果
5．下列关于斜面接种和培养酵母菌的叙述，错误的是(　　)
A．接种环灭菌时，只需将其环端进行灭菌
B．接种时，应在培养基斜面上由底部向上轻轻划“Z”型折线
C．挑取菌体时应先将接种环的环部接触培养基斜面顶端或其他无菌体的培养基部位使其冷却
D．将菌种置于4 ℃左右的冰箱中保藏既有利于减缓培养基的水分蒸发，又有利于延长保存时间
6．(多选)穿刺接种是指用接种针挑取少量的菌种，自培养基的中心垂直地刺入半固体培养基中，然后沿原穿刺线将针拔出的微生物接种方法。下列有关叙述错误的是(　　)
A．该接种方法可用于厌氧菌种的接种
B．培养基的配制、分装及微生物的接种过程都需要进行无菌操作
C．在火焰上灼烧接种针后要立即接种，防止空气中杂菌污染接种针
D．接种过程中为杀灭试管口上沾染的微生物要对试管口进行灭菌
答案精析
一、
梳理教材新知
1．无菌　微生物　灭菌　
2．甲醛　高锰酸钾　蛋白质　培养基　紫外线　高能粒子　表面和空气　干热空气　火焰灼烧　保持干燥　接种针　接种　121 ℃　100　变性　更有效　过滤　无菌空气　
判断正误
(1)√　(2)×　(3)√
提示　(2)湿热灭菌适用于耐高温、耐湿热的物品，如培养基；接种环适合用火焰灼烧法灭菌。
探究核心知识
1．无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。
2．(1)培养基要湿热灭菌，培养皿要干热灭菌。(2)玻璃器皿要干热灭菌。(3)双手要酒精消毒。
落实思维方法
1．C　[紫外线的穿透力弱，一般用于表面和空气的灭菌。]
2．A　[在100 ℃条件下煮沸5～6分钟属于消毒，B错误；无菌技术中，若处理对象为液体，可以用湿热灭菌法灭菌，C错误。]
二、
梳理教材新知
1．(1)①空　培养皿　金属　胶皮　塑料　固体　②干燥　③a.较高　50～60 ℃　b．较少　c．低　高　④细菌的芽孢　160　⑤a.易燃　b．风机　c．清洁　(2)①沸点　上升　温度　所有　芽孢　②热源　压力　成分　爆炸　③水位标记线　1/3　排气阀　冷空气　103　121　15～20　“0”
温度　(3)①空气过滤除菌　阻截　②无菌程度　较低　较高
2．(1)①接种针　②平板稀释涂布　穿刺　斜面　划线　(2)①a.以上　b．吸空　液面　1 cm　下端外壁　垂直　缓缓　下端　顺壁　②a.很少　b．可调　(3)①紫外线灯　空气过滤器　②紫外线灯　10 min　
判断正误
(1)√　(2)×　(3)×　(4)×　(5)×
提示　(2)装锅时，灭菌桶不要装得过满，至少留1/3空间。(4)制备氨基酸、抗生素等的发酵过程，所需的微生物对空气无菌的要求较高。(5)将移液管移入准备接受溶液的容器中时，使其出口尖端接触器壁。
探究核心知识
1．干热灭菌箱内的高温会导致培养基的水分散失，而高压蒸汽灭菌锅内的湿度较大，不会导致培养基的水分散失。
2．对一瓶有菌水进行高压蒸汽灭菌处理。
3.原因可能是未将锅内冷空气排尽。
4．高压蒸汽灭菌锅的压力表指针还未降至“0”点，就提前打开了高压蒸汽灭菌锅。
落实思维方法
3．CD　[用移液管移取溶液时，当溶液液面上升到刻度标线以上约1 cm处时，立即堵住管口，C错误；紫外线灯的开启可激发超净工作台内空气中的氧分子形成臭氧分子，臭氧分子有很强的杀菌作用，但也对操作人员的健康有害，因此，超净工作台开机杀菌30 min后，需先关掉紫外线灯，约10 min后方可使用超净工作台，D错误。]
4．BD　[甲、乙、丙分别是安全阀、排气阀和压力表，A错误；灭菌结束后，应切断热源，等灭菌锅内温度自然下降，当压力表指针降至“0”点时，再打开排气阀，以防止提前打开排气阀，锅内压力突然下降，导致灭菌容器内的液体冲出容器，造成污染，C错误。]
三、
梳理教材新知
1．(1)降低　休眠　死亡　(2)低温、干燥、真空　
2．(1)穿刺　(2)斜面接种　
3．(1)充分　4 ℃　水分蒸发　保存时间　(2)重新　
判断正误
(1)×　(2)√　(3)×
提示　(1)低温、干燥、真空是菌种保存的重要条件。(3)将装有新鲜菌种的试管用牛皮纸包扎好后放在4 ℃左右的冰箱中保藏，延长保存时间。
探究核心知识
1．图1是穿刺接种；图2是斜面接种。
2．(1)将接种环的环端和接种时可能进入试管的部分放在酒精灯火焰上，来回灼烧多次。(2)将试管口通过火焰2～3次。(3)在抽出接种环时，带菌部位不要触及管壁或通过火焰。(4)将试管口与试管塞分别通过火焰2～3次，迅速塞紧试管。
落实思维方法
5．A
6．BC　[培养基的配制、分装不需要无菌操作，需要保持环境卫生，待培养基配制、分装完成会进行高压蒸汽灭菌操作，微生物的接种过程需要进行无菌操作，B错误；在火焰上灼烧接种针后要待接种针冷却后才能进行接种，防止接种针温度过高杀死菌种，C错误。](共73张PPT)
第1课时
发酵工程的灭菌方法、灭菌设备、无菌操作器具 及微生物接种和传代的无菌技术
第一章 发酵工程
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学习目标
1.掌握不同物品的灭菌方法。
2.概述发酵工程的灭菌设备和无菌操作器具并掌握其正确使用方法。
3.概述微生物接种的方法和传代的无菌技术。
内容索引
一、发酵工程的灭菌方法
三、微生物接种和传代的无菌技术
二、发酵工程的灭菌设备及无菌操作器具
课时对点练
发酵工程的灭菌方法
一
梳理　教材新知
1.无菌技术：指在操作过程中，保持物品与操作区域的 状态并不被
污染的技术，其核心是 。
2.灭菌方法
无菌
微生物
灭菌
灭菌方法 灭菌原理 应用
化学方法 化学试剂灭菌法 一些化学试剂如 、氯、____ ，能破坏微生物的_______或细胞结构，具有杀菌作用 一般不用于______的灭菌
甲醛
高锰
酸钾
蛋白质
培养基
灭菌方法 灭菌原理 应用
物理方法 射线灭菌法 利用 等产生的 等进行灭菌 一般用于 的
灭菌
干热灭菌法(包括 灭菌法和_______ ____法等) 高温干热使微生物的结构被破坏、蛋白质、核酸变性 主要用于要求 的实验器具(如培养皿、____
___和移液管)的灭菌；火焰灼烧法常用于 等操作过程
紫外线
高能粒子
表面和空气
干热空气
火焰灼
烧
保持干燥
接种
针
接种
灭菌方法 灭菌原理 应用
物理方法 湿热灭菌法(一般在温度为 、气压约 kPa的条件下维持15～20 min) 吸收了蒸汽水分和热量的菌体蛋白质易_____ 适用于耐高温、耐湿热的物品，如对培养基的灭菌，在相同温度下湿热灭菌比干热灭菌_______
过滤除菌法 通过 阻留微生物从而达到除菌目的 制备 ；在产品提取过程中处理料液，获得无菌产品
121 ℃
100
变性
更有效
过滤
无菌空气
(1)灭菌相比消毒对微生物的杀灭更彻底(　　)
(2)无菌操作的对象只要是没有生物活性的材料(如培养基、接种环等)都可采用湿热灭菌法进行灭菌(　　)
√
提示　湿热灭菌适用于耐高温、耐湿热的物品，如培养基；接种环适合用火焰灼烧法灭菌。
(3)培养基最常用的灭菌方法是湿热灭菌法(　　)
×
√
任务一：无菌技术的分析
1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么作用？
探究　核心知识
提示　无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。
2.请判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。
(1)培养细菌用的培养基与培养皿。
提示　培养基要湿热灭菌，培养皿要干热灭菌。
(2)玻璃棒、试管、锥形瓶和移液管。
提示　玻璃器皿要干热灭菌。
(3)实验操作者的双手。
提示　双手要酒精消毒。
消毒与灭菌的比较
核心归纳
比较项目 消毒 灭菌
作用强度 较为温和 强烈的物理或化学方法
作用对象 操作空间、操作者双手等 接种环、移液管、培养基等
作用结果 不能杀死所有微生物(如细菌芽孢) 能杀死物体内外的所有微生物，包括芽孢和孢子
常用方法 煮沸消毒法、巴氏消毒法等 干热灭菌法、湿热灭菌法等
1.下列关于无菌技术的叙述，错误的是
A.甲醛、高锰酸钾等能破坏微生物的蛋白质或细胞结构，具有杀菌作用
B.工业生产中制备无菌空气常用过滤除菌法
C.紫外线穿透力强能杀死一定空间中所有微生物
D.对培养基灭菌，常采用湿热灭菌法
√
落实　思维方法
紫外线的穿透力弱，一般用于表面和空气的灭菌。
2.消毒和灭菌是微生物培养中常用的操作方法。下列说法正确的是
A.发酵工程的生产过程只有在没有杂菌污染的情况下才能正常进行
B.在100 ℃条件下煮沸5～6分钟属于灭菌方法，该方法可杀死微生物细
胞和一部分芽孢
C.无菌技术中，若处理对象为液体，则只能消毒，不能灭菌
D.消毒和灭菌的原理是完全不同的
√
在100 ℃条件下煮沸5～6分钟属于消毒，B错误；
无菌技术中，若处理对象为液体，可以用湿热灭菌法灭菌，C错误。
发酵工程的灭菌设备及无菌操作器具
二
1.发酵工程的灭菌设备
(1)电热鼓风干燥箱
①用途：常用于 的玻璃器皿(如 、离心管、移液管)、 用具(如镊子、手术刀)和其他耐高温的物品(如菌种保藏采用的沙土管、石蜡油、碳酸钙)的灭菌。带有 或 的物品、液体及 培养基一般不能采用电热鼓风干燥箱干热灭菌。
②优点：使灭菌器皿保持 。
梳理　教材新知
空
培养皿
金属
胶皮
塑料
固体
干燥
③灭菌的温度
a.细菌、酵母菌及霉菌的营养细胞含水量 ，需在 条件下，加热10 min即可使其蛋白质变性而达到杀菌效果。
b.放线菌及霉菌孢子含水量 ，在80～90 ℃条件下，加热30 min方可杀菌。
c.细菌芽孢含水量 ，蛋白质变性温度较 。
④彻底灭菌的标准及灭菌条件
标准：一般以能否杀死 作为彻底灭菌的标准。
灭菌条件：温度提高到约 ℃，加热2～3 h。
较高
50～60 ℃
较少
低
高
细菌的芽孢
160
⑤注意事项
a.不得将易腐、 、易爆物品放入箱内干燥灭菌；
b.干燥箱在工作时，必须将 开关打开；
c.箱内应经常保持 。
(2)高压蒸汽灭菌锅
①灭菌原理：在一个密闭的锅内，水的 随蒸汽压力的增高而 ，加压的同时提高蒸汽的 ，使锅内的待灭菌物品在一定压力和温度等条件下，杀死其中 微生物的营养体及其 。
易燃
风机
清洁
沸点
上升
温度
所有
芽孢
②注意事项：操作人员必须在现场规范操作，严格控制 维持灭菌时的 。锅内压力过高，不仅培养基的营养 会被破坏，而且高压锅超过耐压范围后可能会发生 ，造成伤人事故等。
热源
压力
成分
爆炸
③使用步骤
水位标记线
1/3
排气阀
冷空气
103
121
15~20
“0”
温度
(3)空气除菌设备
①空气除菌方法：常采用 的方法，即让含菌空气通过无菌干燥的过滤介质，以 空气中所含微生物。
②各种不同的发酵过程，对空气 的要求也不同。例如，酵母菌繁殖得快，对空气的无菌要求相对 ；而制备氨基酸、抗生素等的发酵过程，所需的微生物对空气无菌的要求 。
空气过滤除菌
阻截
无菌程度
较低
较高
2.发酵工程的无菌操作器具
(1)接种器具
①常用的接种器具：玻璃涂布器、 、接种环等。
②用途：玻璃涂布器常用于 接种，接种针用于 接种，接种环用于 接种或在平板培养基上 接种。
接种针
平板稀释涂布
穿刺
斜面
划线
(2)转移器具
①移液管
使用要点：
a.以拇指及中指捏住管颈标线 的地方，将移液管插入待取溶液液面下约1 cm。
b.移液管不应伸入太多，以免管尖外壁粘有过多溶液；也不应伸入太少，以免液面下降后而 。
以上
吸空
操作步骤：
液面
1 cm
下端外壁
垂直
缓缓
下端
顺壁
②微量取液器
a.用途：取液量 时(如0.1 mL)使用。
b.类型：分为固定容量的和 容量的两种。
(3)超净工作台
①净化原理：利用工作台内 的杀菌作用，并通过 过滤确保工作台内空气的无菌、无污染。
②注意事项：超净工作台开机杀菌30 min后，需先关掉 ，约_______后方可使用。
很少
可调
紫外线灯
空气过滤器
紫外线灯
10 min
(1)菌体蛋白质的变性温度与含水量相关，一般来说含水量越低，变性温度越高(　　)
(2)使用高压蒸汽灭菌锅时，为充分利用空间，装得越满越好(　　)
√
×
提示　装锅时，灭菌桶不要装得过满，至少留1/3空间。
(3)当高压蒸汽灭菌锅的压力表指针降至“0”点时，即可出锅(　　)
×
(4)制备氨基酸、抗生素等的发酵过程，所需的微生物对空气无菌的要求较低(　　)
提示　制备氨基酸、抗生素等的发酵过程，所需的微生物对空气无菌的要求较高。
(5)将移液管移入准备接受溶液的容器时，为避免污染，移液管不能接触器壁(　　)
提示　将移液管移入准备接受溶液的容器中时，使其出口尖端接触器壁。
×
×
任务二：无菌操作器具的使用分析
1.培养基灭菌为什么采用高压蒸汽灭菌而不采用干热灭菌？
探究　核心知识
提示　干热灭菌箱内的高温会导致培养基的水分散失，而高压蒸汽灭菌锅内的湿度较大，不会导致培养基的水分散失。
2.如何制备一瓶无菌水？
提示　对一瓶有菌水进行高压蒸汽灭菌处理。
3.某同学在使用高压蒸汽灭菌锅时，若压力达到设定要求，而锅内并没有达到相应温度，最可能的原因是什么？
提示　原因可能是未将锅内冷空气排尽。
4.某同学从高压蒸汽灭菌锅内拿出培养基后发现，培养基已经溅满了锥形瓶的瓶壁，最可能的原因是什么？
提示　高压蒸汽灭菌锅的压力表指针还未降至“0”点，就提前打开了高压蒸汽灭菌锅。
高压蒸汽灭菌锅的使用及注意事项
核心归纳
(1)首先将内层灭菌桶取出，再向外层锅内加入适量的水，水量达到水位标记线即可。
(2)放回灭菌桶，并装入待灭菌物品。注意不要装得太挤，以免妨碍蒸汽流通而影响灭菌效果。锥形瓶与试管口不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包裹瓶口的纸而透入棉塞。
(3)加盖，并将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的排气槽内。拧紧固定螺栓，注意要对称地旋紧锅盖四周的固定螺栓，使固定螺栓松紧一致，不漏气。
核心归纳
(4)加热灭菌锅，打开排气阀，使水沸腾，排出锅内的冷空气。等冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐步上升。当锅内压力升到所需压力时，控制热源，按照灭菌所要求的时间，维持压力。
(5)到灭菌时间后，切断热源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降到“0”点时，打开排气阀，旋开固定螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。如果提前打开排气阀，锅内压力突然下降，灭菌容器内的液体会冲出容器，造成污染。
3.(多选)下列关于无菌操作器具的使用，错误的是
A.用玻璃涂布器进行涂布平板接种
B.用接种针进行穿刺接种
C.用移液管移取溶液时，当溶液液面上升到刻度标线时，立即堵住管口
D.超净工作台开机杀菌30 min后，关闭紫外线灯即可使用超净工作台
√
落实　思维方法
√
用移液管移取溶液时，当溶液液面上升到刻度标线以上约1 cm处时，立即堵住管口，C错误；
紫外线灯的开启可激发超净工作台内空气中的氧分子形成臭氧分子，臭氧分子有很强的杀菌作用，但也对操作人员的健康有害，因此，超净工作台开机杀菌30 min后，需先关掉紫外线灯，约10 min后方可使用超净工作台，D错误。
4.(多选)如图是灭菌锅及其局部剖面示意图，下列相关叙述正确的是
A.甲、乙、丙分别是排气阀、安全阀和压力表
B.使用时应在锅内水煮沸并排除全部冷空气后
　再关闭乙
C.灭菌结束后应立即打开乙，放出锅内热蒸汽
D.将器皿放入灭菌锅之前通常用牛皮纸或报纸
　包扎，避免灭菌后的再次污染
√
√
甲、乙、丙分别是安全阀、排气阀和压力表，
A错误；
灭菌结束后，应切断热源，等灭菌锅内温度
自然下降，当压力表指针降至“0”点时，再
打开排气阀，以防止提前打开排气阀，锅内
压力突然下降，导致灭菌容器内的液体冲出容器，造成污染，C错误。
微生物接种和传代的无菌技术
三
1.菌种传代和保存的目的和条件
(1)目的：尽量让菌种在人工创造的条件下， 细胞的代谢水平，使细胞基本处于 状态，即微生物的生长繁殖受到抑制但又不至于 。
(2)条件： 。
2.菌种传代和保存的接种方法
(1)厌氧微生物接触氧气会受到抑制、损伤甚至死亡，常采用 接种。
(2) 是常用的菌种传代和低温下保存菌种的方法。
梳理　教材新知
降低
休眠
死亡
低温、干燥、真空
穿刺
斜面接种
3.菌种保存方法
(1)步骤：挑选典型菌落→接种在斜面培养基上→培养使其 生长→试管用牛皮纸包扎→置于 左右的冰箱中保藏(目的：减缓培养基的____
，延长 )。
(2)通常每隔2～3个月 接种一次，再继续保存。
充分
4 ℃
水分
蒸发
保存时间
重新
(1)低温、干燥、高氧是菌种保存的重要条件(　　)
×
提示　低温、干燥、真空是菌种保存的重要条件。
(2)厌氧微生物常采用穿刺接种的方法将其保护在培养基中(　　)
(3)将装有新鲜菌种的试管放在－4 ℃的冰箱中保藏，有利于延长保存时间(　　)
提示　将装有新鲜菌种的试管用牛皮纸包扎好后放在4 ℃左右的冰箱中保藏，延长保存时间。
√
×
任务三：微生物接种方法分析
1.如图所示的接种方法分别是什么？
探究　核心知识
提示　图1是穿刺接种；图2是斜面接种。
2.在斜面接种和培养酵母菌的过程中有哪些无菌操作的步骤？
提示　(1)将接种环的环端和接种时可能进入试管的部分放在酒精灯火焰上，来回灼烧多次。
(2)将试管口通过火焰2～3次。
(3)在抽出接种环时，带菌部位不要触及管壁或通过火焰。
(4)将试管口与试管塞分别通过火焰2～3次，迅速塞紧试管。
斜面接种和培养酵母菌的操作步骤及其目的或分析说明
核心归纳
顺序 接种操作步骤 目的或分析说明
① 将接种环的环端和接种时可能进入试管的部分放在酒精灯火焰上，来回灼烧多次 将接种环灭菌，避免污染菌种
② 迅速将试管口通过火焰2～3次 灼烧灭菌，防止试管口上的微生物污染培养基
③ 将灭过菌的接种环伸入菌种管，先将环部接触培养基斜面顶端或其他无菌体的培养基部位 使接种环冷却，避免杀死菌种
核心归纳
顺序 接种操作步骤 目的或分析说明
④ 抽出接种环时，带菌部位不要触及管壁或通过火焰 防止菌种沾于管壁；防止菌种被杀死
⑤ 在培养基斜面上由底部向上轻轻划“Z”型折线，但不要将培养基的表面划破 初步接种。划破培养基不利于后续的继续划线，长出的菌落不标准
⑥ 将试管口与试管塞分别通过火焰2～3次，迅速塞紧试管 防止杂菌污染
⑦ 将接种过菌种的试管，放在恒温箱(28 ℃)中培养24 h 培养酵母菌，观察接种和培养的结果
5.下列关于斜面接种和培养酵母菌的叙述，错误的是
A.接种环灭菌时，只需将其环端进行灭菌
B.接种时，应在培养基斜面上由底部向上轻轻划“Z”型折线
C.挑取菌体时应先将接种环的环部接触培养基斜面顶端或其他无菌体的
培养基部位使其冷却
D.将菌种置于4 ℃左右的冰箱中保藏既有利于减缓培养基的水分蒸发，
又有利于延长保存时间
√
落实　思维方法
6.(多选)穿刺接种是指用接种针挑取少量的菌种，自培养基的中心垂直地刺入半固体培养基中，然后沿原穿刺线将针拔出的微生物接种方法。下列有关叙述错误的是
A.该接种方法可用于厌氧菌种的接种
B.培养基的配制、分装及微生物的接种过程都需要进行无菌操作
C.在火焰上灼烧接种针后要立即接种，防止空气中杂菌污染接种针
D.接种过程中为杀灭试管口上沾染的微生物要对试管口进行灭菌
√
√
培养基的配制、分装不需要无菌操作，需要保持环境卫生，待培养基配制、分装完成会进行高压蒸汽灭菌操作，微生物的接种过程需要进行无菌操作，B错误；
在火焰上灼烧接种针后要待接种针冷却后才能进行接种，防止接种针温度过高杀死菌种，C错误。
网络构建
课时对点练
四
题组一　发酵工程的灭菌方法
1.(2024·徐州高二检测)无菌技术是发酵工程的重要技术。使用的接种针、接种环，最好采用的灭菌方法是
A.紫外线等射线灭菌法 B.干热空气灭菌法
C.湿热灭菌法 D.火焰灼烧法
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火焰灼烧法常用于接种等操作过程，如涂布器、接种环、接种针等，直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧，可以迅速彻底地灭菌。
2.下列关于无菌技术的说法，错误的是
A.培养皿可用干热灭菌法灭菌
B.牛奶、熟啤酒、葡萄酒都可用巴氏消毒法消毒
C.射线灭菌法一般用于接种室或超净工作台等的灭菌
D.实验过程中所有器皿、培养基及生物材料均需进行灭菌处理
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牛奶、熟啤酒、葡萄酒都可用巴氏消毒法消毒，该方法可以减少牛奶和酒类中的营养流失，B正确；
微生物培养的器皿、接种用具和培养基等均需要灭菌，生物材料依据情况消毒或灭菌，D错误。
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3.下列常用的无菌操作中，错误的是
A.化学试剂灭菌法可以用于培养基的灭菌
B.灭菌所使用的物理、化学方法比较强烈
C.消毒所使用的物理、化学方法比较温和
D.湿热灭菌法和干热灭菌法有不同的适用条件
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由于灭菌剂可能会与培养基中的一些成分发生作用，因此化学试剂灭菌法一般不用于培养基的灭菌，A错误；
灭菌是指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子，B正确；
消毒是指使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物，C正确；
常用的灭菌方法有干热灭菌法和湿热灭菌法等，依据灭菌对象的不同各有其适用范围，D正确。
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题组二　发酵工程的灭菌设备和无菌操作器具
4.(2024·无锡高二调研)高压蒸汽灭菌锅是一种常用的灭菌设备，其灭菌原理是利用高温高压条件导致
A.菌体和芽孢都存活
B.菌体死亡但芽孢存活
C.菌体和芽孢都死亡
D.菌体存活但芽孢死亡
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5.下列有关使用高压蒸汽灭菌锅的操作，错误的是
A.加水时，水量达到标记线即可
B.加盖时，将排气软管插入内层灭菌桶的排气槽内
C.加热时，待冷空气完全排尽后关上排气阀
D.切断电源后，打开排气阀使压力表降到零后开盖
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切断电源后，应该等压力表指针降至“0”点，待温度下降后，打开排气阀，旋开固定螺栓，开盖，D错误。
6.下列关于灭菌设备的使用，错误的是
A.不得将易腐、易燃、易爆物品放入电热鼓风干燥箱内干燥灭菌
B.使用高压蒸汽灭菌锅时，操作人员应严格控制热源维持灭菌时的压力
C.高压蒸汽灭菌锅内的物品太多，摆放太挤，会降低灭菌效果
D.在使用高压蒸汽灭菌锅时，一旦加热就不能打开排气阀
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加热后，随着锅内压力逐渐增加，须打开排气阀，排出锅内残留的冷空气。
题组三　微生物接种和传代的无菌技术
7.(2024·常州高二期中)斜面培养基常用于菌种的保存，如图所示，试管中的培养基倾斜，菌种接种于斜面上。下列对于斜面培养基接种细菌的操作叙述错误的是
A.培养基配制时需添加琼脂
B.接种时需将试管置于酒精灯火焰旁
C.接种针灼烧后，在斜面上划线
D.培养基倒入试管后，需倾斜放置试管
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接种针灼烧并冷却后，在斜面上划线，C错误。
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8.下列关于微生物接种和传代的叙述，错误的是
A.抽出接种环时，其带菌部位不要触及管壁或通过火焰，以免被杂菌污
染或被杀死
B.用斜面培养基保存菌种通常每隔2～3个月重新接种一次
C.休眠状态即微生物的生长繁殖受抑制但又不至于死亡
D.穿刺接种用到的接种器具是接种环
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穿刺接种用到的接种器具是接种针，D错误。
9.下列关于“斜面接种和培养酵母菌”实验操作的叙述，错误的是
A.将接种环的环端和可能伸入试管的部分在火焰上来回灼烧多次，以达
到彻底灭菌的目的
B.灼烧的接种环在酒精灯火焰旁冷却后，伸入菌种管轻挑少许菌体
C.从菌种管抽出接种环时，不能让其带菌部位触及管壁
D.接种环在斜面接种后，需多次灼烧以保证无菌，冷却后放回原处
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将灭过菌的接种环伸入菌种管，先将环部接触培养基斜面顶端或其他无菌体的培养基部位使其冷却，再轻轻挑取少许菌体，在抽出接种环时，注意其带菌部位不要触及管壁或通过火焰，B错误，C正确。
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10.在斜面培养基上接种时，其正确的操作顺序是
①用一只手的拇指和其他四指夹住菌种试管和待接种的斜面试管，管口并齐，使斜面向上保持水平状态　②在火焰附近用握有接种环的手的小拇指、无名指、中指和掌心拔去两支试管上的试管塞，并迅速将试管口通过火焰2～3次　③将接种环伸入菌种管内，让环先接触培养基上未长菌的部位，使环冷却，然后轻轻挑取少许菌体，立即将接种环抽出　④手拿接种环，在酒精灯火焰上来回灼烧多次　⑤在火焰旁迅速将沾有菌体的接种环伸到斜面培养基的底部然后向上轻轻划“Z”型折线　⑥抽出接种环，将试管口与试管塞分别通过火焰2～3次，迅速塞紧试管
A.①②③④⑤⑥ 　B.①④②③⑤⑥　　C.①②③④⑥⑤ D.②①③④⑤⑥
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11.无菌技术是发酵工程的重要技术之一。实验室通常使用电热鼓风干燥箱作为干热灭菌设备，下列关于其用法和原理的叙述，错误的是
A.对于空的玻璃器皿和其他耐高温的物品可以采用此法来保持干燥
B.不同菌体由于含水量不同，灭菌温度、时间都不同
C.使用干燥箱时必须将风机开关打开，否则会导致电机或传感器烧坏
D.由于放线菌及霉菌孢子含水量较低，在80～90 ℃条件下，加热10 min
即可杀菌
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由于放线菌及霉菌孢子含水量较低，在80～90 ℃条件下，加热30 min方可杀菌。
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12.(多选)发酵工程中的培养基含丰富的营养物质，对于液体培养物一般选用移液管转移液体，下列对于移液管的使用，错误的是
A.使用移液管时，拇指和中指捏住管颈标线以上的地方
B.移液管插入待取溶液液面时不应伸入太多也不应伸入太少
C.吸取液体时，当液面上升到刻度标线以上约1 cm处时迅速用另一只手
的拇指堵住管口
D.将移液管移入准备接受溶液的容器中时，将移液管倾斜，使其尖端接
触器壁
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移液管插入待取溶液液面时不应伸入太多，以免管尖外壁粘有过多溶液，也不应伸入太少，以免液面下降后而吸空，B正确；
吸取液体时，当液面上升到刻度标线以上约1 cm处时，迅速用另一只手的食指堵住管口，C错误；
将移液管移入准备接受溶液的容器中时，使其出口尖端接触器壁，将容器倾斜，而使移液管直立，D错误。
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13.(多选)(2024·南京高二检测)含硫蛋白质在某些微生物作用下产生的硫化氢会导致生活污水发臭。为探究发臭水体中甲、乙菌是否产生硫化氢及两种菌的运动能力，某小组用穿刺接种的方法分别将两种菌接种在含有硫酸亚铁铵的培养基上进行培养(硫化氢可以与硫酸亚铁铵结合形成黑色沉淀)，如图所示。若两种菌繁殖速度相等，下列有关叙述正确的是
A.据实验结果可知，乙菌的运动能力比甲菌强
B.甲、乙菌在培养基内部生长，一定属于厌氧菌
C.该实验结果说明甲、乙两种菌都能产生硫化氢
D.穿刺接种等接种技术的关键是防止杂菌的污染
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从图中可以看出甲菌在试管中分布范围小于乙菌，说
明了乙菌的运动能力比甲菌强，A正确；
甲、乙菌在培养基内部生长，不一定属于厌氧菌，也
可能是兼性厌氧菌，B错误；
根据题意，硫化氢可以与硫酸亚铁铵结合形成黑色沉淀，图中都产生了黑色沉淀，表示二者都能产生硫化氢，C正确；
微生物接种技术的核心是防止杂菌的污染，D正确。
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14.(多选)(2024·盐城中学高二期中)可采用高压蒸汽灭菌锅对物品进行湿热灭菌。下列关于高压蒸汽灭菌锅使用及灭菌原理的说法，错误的是
A.灭菌物品放入灭菌桶后，盖好锅盖，依次旋紧锅盖四周的固定螺栓
B.加热时，须打开排气阀，排除锅内残留的冷空气，当压力表指针回“0”
时，再关闭继续加热
C.灭菌后，打开排气阀排气，等压力表指针降至“0”时，打开锅盖，取
出灭菌物品
D.高压蒸汽灭菌锅利用高温的热空气，在一定条件下能杀死所有微生物
的营养体及芽孢
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旋紧锅盖时应按对称方向旋紧四周固定螺栓，A错误；
灭菌后，等压力表指针降至“0”时，待温度下降后打开排气阀排气，旋开固定螺栓，打开锅盖，取出灭菌物品，C错误；
高压蒸汽灭菌锅利用高温高压的蒸汽，在一定条件下能杀死所有微生物的营养体及芽孢，D错误。
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15.某学校打算开辟一块食用菌栽培基地，以丰富学生的劳动技术课内容。首先对食用菌实验室进行清扫和消毒处理，准备食用菌栽培所需的各种原料和用具，然后从菌种站购来各种食用菌菌种。请回答下列问题：
(1)牛肉膏蛋白胨固体培养基配方如表：
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牛肉膏 蛋白胨 NaCl 琼脂 蒸馏水
3.0 g 10.0 g 5.0 g 20.0 g 定容至1 000 mL
其中提供氮源的是________________；提供碳源的主要物质是________。
牛肉膏、蛋白胨
牛肉膏
(2)微生物在生长过程中对各种成分所需量不同，配制培养基时各成分要有合适的______，在烧杯中加入琼脂后要不停地______，防止____________
____________。
(3)将配制好的培养基分装到试管中，加棉塞后若干个试管一捆，包上牛皮纸并用皮筋勒紧放入高压蒸汽灭菌锅中灭菌，灭菌完毕拔掉电源，待锅内压力自然降到“0”点时，将试管取出。如果棉塞上沾有培养基，此试管应______。
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比例
搅拌
起烧杯破裂
琼脂糊底引
废弃
(4)使用高压蒸汽灭菌锅时注意，先向外层锅内倒入________。把锅内水加热煮沸并将其中原有冷空气彻底排出后将锅密闭。
(5)从一支试管向另一支试管接种时应注意，接种环要在酒精灯_____(填“内”或“外”)焰灭菌，并且待接种环______后再挑取菌体，试管口不能离开酒精灯火焰附近，将接种的试管在适温下培养，长成菌落后放入____℃冰箱中保藏。
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适量水
外
冷却
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16.在生产、生活和科研实践中，经常通过消毒和灭菌来避免杂菌的污染。请回答下列问题：
(1)在实验室中，玻璃和金属材质的实验器具_______(填“可以”或“不可以”)放入密闭容器如电热鼓风干燥箱中进行干热灭菌。
(2)牛奶的消毒常采用巴氏消毒法或高温瞬时消毒法，与煮沸消毒法相比，这两种方法的优点是_________________________________________。
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可以
在达到消毒目的的同时，营养物质损失较少
(3)密闭空间内的空气可采用紫外线照射消毒，其原因是紫外线能______
___________。工业生产上一般利用__________法大量地制备无菌空气。
(4)水厂供应的自来水通常是经过______(填“氯气”“乙醇”或“高锰酸钾”)消毒的。
(5)某同学在使用高压蒸汽灭菌锅时，若压力达到设定要求，而锅内并没有达到相应温度，最可能的原因是____________________。
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DNA的结构
破坏
过滤除菌
氯气
未将锅内冷空气排尽第2课时　微生物分离、纯化和培养的无菌技术
[学习目标]　1.概述平板划线法分离和纯化微生物的过程。2.概述稀释涂布平板法分离和纯化微生物的过程。3.进行土壤中分解尿素的细菌的分离和计数。
一、平板划线法分离和纯化微生物
1．平板划线法
(1)概念：是指把含有多种微生物的______样品，通过在特定的琼脂平板表面____________，从而获得__________的方法。
(2)操作步骤
2．通过平板划线法获得纯化的酵母菌菌落
(1)实验目的
尝试通过平板划线法获得纯化的酵母菌菌落。
(2)实验原理
①__________________培养基能满足酵母菌生长、繁殖的营养需要。
②采用____________及____________能够获得纯化的酵母菌菌落。
(3)实验器材和试剂
酵母菌样本(菌种)，接种环、酒精灯、恒温培养箱、高压蒸汽灭菌锅，马铃薯葡萄糖琼脂培养基。
(4)实验步骤
(5)结果与分析
①酵母菌被纯化的标准：培养24 h后，在划线的______出现__________的单个菌落。
②纯化失败的原因
a．接种环灭菌后未________直接在斜面上挑取菌体，菌体可能因为接触高温接种环而______。
b．第一次划线前挑取的菌体____________，则也有可能无法获得由一个酵母菌形成的单个菌落。
判断正误
(1)若皿盖和皿底之间溅上培养基，这个培养基不可再用(　　)
(2)倒平板操作后再进行高压蒸汽灭菌(　　)
(3)平板划线法接种时，每一次划线前都要挑取菌体(　　)
(4)培养微生物的温度因菌种不同而稍有差异(　　)
任务一：平板划线法与微生物纯化过程的分析
1．平板冷凝后，为什么要将平板倒置？
________________________________________________________________________
2．下列接种过程正确的顺序是_____________________________________________。
3．第一次以及每次划线之前、划线操作结束都要灼烧接种环，请完善下方的表格，分析灼烧接种环的目的。
灼烧时期 目的
取菌种前 杀死接种环上____________
每次划线前 杀死上次划线时残留的菌种，使下一次划线的菌种直接来源于______，从而使________________________，直至得到__________
接种结束后 杀死接种环上残留的菌种，避免污染环境和感染操作者
4.若要按照如图d进行划线，那么在接种划线的操作过程中，共灼烧了几次接种环？
________________________________________________________________________
5．为什么最后一次的划线与第一次的划线不能相连？
________________________________________________________________________
6．设置未接种平板组的意义是什么？
________________________________________________________________________
1．培养基灭菌及倒平板的注意事项
(1)如果需要调节培养基的pH，应该在定容完成之后、灭菌之前进行操作。
(2)培养基灭菌后要冷却到50 ℃左右时开始倒平板，原因是琼脂是一种多糖，在98 ℃以上熔化，在44 ℃以下凝固，倒平板时温度过高会烫手，太低时琼脂会凝固。
(3)倒平板时，要使锥形瓶的瓶口迅速通过火焰进行灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。
2．实验结果的分析
(1)在接种酵母菌的培养基上可观察到独立的菌落，这些菌落在颜色、形状和大小上相似，酵母菌菌落一般表面光滑，多呈乳白色。
(2)若在培养基中观察到不同形态的菌落，原因可能是菌液不纯，混入了其他杂菌，或在实验操作过程中被杂菌污染。
1．(2024·南京高二期中)如图为实验室培养和纯化大肠杆菌过程中的部分操作步骤，下列说法正确的是(　　)
A．制备①步骤使用的培养基的过程是先灭菌再调pH
B．②③④步骤操作时不需要在酒精灯火焰附近进行
C．操作②到④的过程中，接种环共灼烧处理了5次
D．接种结束后，将④倒置培养，皿底上标注菌种及接种日期等信息
2．(多选)(2020·江苏，19改编)为纯化菌种，在鉴别培养基上划线接种纤维素降解细菌，培养结果如图所示。下列叙述正确的是(　　)
A．倒平板后需间歇晃动，以保证表面平整
B．图中Ⅰ、Ⅱ区的细菌数量均太多，应从Ⅲ区挑取单菌落
C．该实验因单菌落太多，不能达到菌种纯化的目的
D．应对微生物培养物进行灭菌处理后再进行回收
二、稀释涂布平板法分离和纯化微生物
1．稀释涂布平板法
(1)过程和用途
①过程：将待分离的材料做一系列的______________，再取一定量的某一稀释度的菌液__________，然后用无菌的__________将菌液均匀地涂布在整个平板表面，使其中的微生物______分散，培养后在平板培养基表面形成多个单菌落。
②用途：既可用于菌种的______________，还可以用于____________。
(2)混合平板法：将稀释的少量菌悬液与______左右的培养基混合均匀后倒入无菌培养皿中，再将培养皿置于合适温度下培养，这样在培养基表面和内部均可长出__________。
(3)计数原理：如果经稀释涂布平板法培养出的都是__________增殖形成的菌落，那么统计这些______数目，即可计算出单位体积样品中的微生物数量。
2．分离土壤中分解尿素的细菌并进行计数
(1)实验目的
①学会配制选择培养基，以分离出能分解尿素的细菌。
②学会采用__________________分离和培养分解尿素的细菌，并进行计数。
(2)实验原理
①由于不同微生物对__________________等的要求不同，利用______培养基可以筛选和分离某种微生物。
②在__________的条件下，于固体培养基上培养该微生物，形成______菌落。单个菌落即为____________，通过对菌落数量的统计，可以计算出样品中的含菌数。
(3)实验器材和试剂
①土壤样品。
②灭菌处理过的各种工具。
③配制以______为氮源的1 000 mL选择培养基的试剂以及调节pH的相关试剂。
(4)实验步骤
(5)结果与分析：菌落数目在30～300的一组平板上一般可以获得单个分解尿素的细菌菌落。
判断正误
(1)稀释涂布平板法能分离微生物，也能计数，而平板划线法只能分离微生物，不能计数(　　)
(2)采用稀释涂布平板法培养和计算得到的微生物的数量一般比稀释液中实际微生物的数量要少(　　)
(3)稀释涂布平板法中所用的涂布器、移液管、锥形瓶等器材都需要进行湿热灭菌，而培养基则需要干热灭菌(　　)
(4)所有稀释倍数的稀释菌液涂布成的培养基都能观察到和分离出单菌落(　　)
任务二：稀释涂布平板法与微生物筛选计数的分析
1．微生物的选择培养和计数
图A和图B为接种培养结果，判断哪个为稀释涂布平板法接种培养？为什么稀释涂布平板法可以用于细菌计数而平板划线法不能进行计数？
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
2．在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时，A同学从对应的106倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌落，但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约50个菌落。其他同学认为A同学的培养基被污染了或混入了其他的含氮物质，而A同学认为自己所选土样不同。你能否通过设置对照，帮助A同学排除上述两个可以影响实验结果的因素？
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
3．据如图所示信息，计算4号试管每克土样中分解尿素细菌的数目，思考为什么统计的活菌数目往往比实际数目低？
　纯化方法的比较
方法 平板划线法 稀释涂布平板法 混合平板法
主要步骤 接种环在固体培养基表面连续划线 系列梯度稀释操作和涂布平板操作 取稀释的少量菌悬液与50 ℃左右的培养基混合均匀倒入无菌培养皿中
接种工具 接种环 涂布器 －
能否用于计数 不能计数 可以计数，但是操作复杂，需涂布多个平板 －
培养结果 菌落仅在平板表面 菌落出现在平板表面和内部
共同点 都能将微生物分散到固体培养基表面，以获得单细胞菌落，达到分离纯化微生物的目的，也可用于观察菌落特征
3．(多选)稀释涂布平板法是微生物培养中的一种常用的接种方法。下列相关叙述错误的是(　　)
A．操作中需要将菌液进行一系列的梯度稀释
B．需将不同稀释度的菌液分别涂布到液体培养基表面
C．不同浓度的菌液均可在培养基表面形成单个的菌落
D．操作过程中对培养基和涂布器等均需进行严格灭菌处理
4．将微生物接种到平板培养基上的方法主要有平板划线法和稀释涂布平板法等。下列相关叙述正确的是(　　)
A．平板划线法只能用于微生物的分离纯化，稀释涂布平板法只能用于微生物的计数
B．平板划线法使用无菌接种针接种，稀释涂布平板法使用无菌涂布器涂布
C．采用两种方法接种后，通常需要在皿盖上注明相关信息
D．采用两种方法接种后，都需要将平板倒置放入恒温培养箱中培养
答案精析
一、
梳理教材新知
1．(1)杂菌　划线稀释　单个菌落　(2)皿底　第1　第2　过火灭菌　由点到线　倒置　菌落
2．(2)①马铃薯葡萄糖琼脂　②无菌操作技术　平板划线法　(4)高压蒸汽灭菌锅　50 ℃　灭菌　倒置　恒温箱
(5)①末端　不连续　②a.冷却　死亡　b．过多　
判断正误
(1)√　(2)×　(3)×　(4)√
提示　(2)培养基应先高压蒸汽灭菌后再倒平板。(3)平板划线法接种时，只在第一次划线前挑取菌体，其余划线前从上次划线的末端开始划线。
探究核心知识
1．防止水分过快挥发，防止皿盖上的水珠落入培养基。
2．b、a、e、f、c、g、d
3．原有的微生物　上次划线的末端　每次划线时菌种数目逐渐减少　单个菌落　
4．图d中共划了5个区域，在每次划线前后均需要对接种环灼烧灭菌，因此共需要灼烧接种环6次。
5．最后一次的划线已经将微生物稀释成单个的细胞，如果与第一次的划线相连则增加了微生物的数目，达不到纯化的效果。
6．通过观察未接种平板是否有菌落存在以确定培养基是否被污染或灭菌是否彻底。
落实思维方法
1．D　[①步骤表示倒平板，该过程使用的培养基的配制需要先调节pH后灭菌，A错误；接种环在每次接种前和接种结束后都要通过灼烧来灭菌，步骤④中5次划线操作前都要灼烧灭菌，接种结束后还需灼烧灭菌1次，防止造成污染，由此可见，操作②到④的过程中共需灼烧接种环6次，C错误。]
2．BD　[倒平板后不需要间歇晃动，A错误；图中Ⅰ、Ⅱ区的细菌数量太多，Ⅲ区中存在单菌落，该实验结果能达到菌种纯化的目的，C错误；应对微生物培养物进行灭菌处理后再进行回收，以免造成污染，D正确。]
二、
梳理教材新知
1．(1)①梯度稀释　涂布平板　涂布器　充分　②分离和纯化　微生物计数　(2)50 ℃　单个菌落　(3)单个细胞　菌落
2．(1)②稀释涂布平板法　(2)①营养成分、氧、pH　选择　②高度稀释　单个　纯化培养物　(3)③尿素　(4)3～5　无菌水　氮源　无菌水　污染　最低　3　倒置　24　30～300
稀释　体积
判断正误
(1)√　(2)√　(3)×　(4)×
提示　(3)稀释涂布平板法中所用的涂布器、移液管、锥形瓶等器材都需要进行干热灭菌，而培养基则需要湿热灭菌。(4)稀释倍数较低的稀释菌液涂布成的培养基上菌落相互连接，难以观察到和分离出单菌落。
探究核心知识
1．图B为稀释涂布平板法接种培养。稀释涂布平板法会进行等比稀释，在合适的稀释倍数下，均匀涂布得到的菌落互不接触，可以确定菌类的密度，再通过计算可以得知原液的菌落数；而平板划线法最开始的划线很可能菌类会长成一片，导致无法计数，此外灼烧接种环时也会杀死一部分菌类。
2．方案一：其他同学用与A同学相同的土样进行实验。若结果与A同学一致，则证明A同学无误；若结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制不当等问题。
方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染或灭菌不彻底。
3．1.1×108个。当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
落实思维方法
3．BC　[操作中需要将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到固体培养基表面，进行培养；在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落；操作过程中培养基和涂布器等均需进行严格灭菌处理。]
4．D　[平板划线法和稀释涂布平板法均可用于微生物的分离纯化，但只有稀释涂布平板法能用于微生物的计数，A错误；平板划线法使用无菌接种环接种，稀释涂布平板法使用无菌涂布器涂布，B错误；采用两种方法接种后，通常需要在皿底上注明相关信息，C错误。](共82张PPT)
第2课时
微生物分离、纯化和培养的无菌技术
第一章 发酵工程
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学习目标
1.概述平板划线法分离和纯化微生物的过程。
2.概述稀释涂布平板法分离和纯化微生物的过程。
3.进行土壤中分解尿素的细菌的分离和计数。
内容索引
一、平板划线法分离和纯化微生物
二、稀释涂布平板法分离和纯化微生物
课时对点练
平板划线法分离和纯化微生物
一
梳理　教材新知
1.平板划线法
(1)概念：是指把含有多种微生物的 样品，通过在特定的琼脂平板表面 ，从而获得 的方法。
杂菌
划线稀释
单个菌落
(2)操作步骤
皿
底
第1
第2
过火灭菌
点到线
由
倒置
菌落
2.通过平板划线法获得纯化的酵母菌菌落
(1)实验目的
尝试通过平板划线法获得纯化的酵母菌菌落。
(2)实验原理
① 培养基能满足酵母菌生长、繁殖的营养需要。
②采用 及 能够获得纯化的酵母菌菌落。
(3)实验器材和试剂
酵母菌样本(菌种)，接种环、酒精灯、恒温培养箱、高压蒸汽灭菌锅，马铃薯葡萄糖琼脂培养基。
马铃薯葡萄糖琼脂
无菌操作技术
平板划线法
(4)实验步骤
高压蒸汽灭菌锅
50 ℃
灭菌
倒置
恒温箱
(5)结果与分析
①酵母菌被纯化的标准：培养24 h后，在划线的 出现 的单个菌落。
②纯化失败的原因
a.接种环灭菌后未 直接在斜面上挑取菌体，菌体可能因为接触高温接种环而 。
b.第一次划线前挑取的菌体 ，则也有可能无法获得由一个酵母菌形成的单个菌落。
末端
不连续
冷却
死亡
过多
(1)若皿盖和皿底之间溅上培养基，这个培养基不可再用(　　)
(2)倒平板操作后再进行高压蒸汽灭菌(　　)
√
提示　培养基应先高压蒸汽灭菌后再倒平板。
(3)平板划线法接种时，每一次划线前都要挑取菌体(　　)
×
√
提示　平板划线法接种时，只在第一次划线前挑取菌体，其余划线前从上次划线的末端开始划线。
(4)培养微生物的温度因菌种不同而稍有差异(　　)
×
任务一：平板划线法与微生物纯化过程的分析
1.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？
探究　核心知识
提示　防止水分过快挥发，防止皿盖上的水珠落入培养基。
2.下列接种过程正确的顺序是 。
b、a、e、f、c、g、d
3.第一次以及每次划线之前、划线操作结束都要灼烧接种环，请完善下方的表格，分析灼烧接种环的目的。
灼烧时期 目的
取菌种前 杀死接种环上_____________
每次划线前 杀死上次划线时残留的菌种，使下一次划线的菌种直接来源于_______________，从而使_______________________
_____，直至得到__________
束后 杀死接种环上残留的菌种，避免污染环境和感染操作者
原有的微生物
上次划线的末端
每次划线时菌种数目逐渐
减少
单个菌落
4.若接种结要按照如图d进行划线，那么在接种划线的操作过程中，共灼烧了几次接种环？
提示　图d中共划了5个区域，在每次划线前后均需要对接种环灼烧灭菌，因此共需要灼烧接种环6次。
5.为什么最后一次的划线与第一次的划线不能相连？
提示　最后一次的划线已经将微生物稀释成单个的细胞，如果与第一次的划线相连则增加了微生物的数目，达不到纯化的效果。
6.设置未接种平板组的意义是什么？
提示　通过观察未接种平板是否有菌落存在以确定培养基是否被污染或灭菌是否彻底。
核心归纳
1.培养基灭菌及倒平板的注意事项
(1)如果需要调节培养基的pH，应该在定容完成之后、灭菌之前进行操作。
(2)培养基灭菌后要冷却到50 ℃左右时开始倒平板，原因是琼脂是一种多糖，在98 ℃以上熔化，在44 ℃以下凝固，倒平板时温度过高会烫手，太低时琼脂会凝固。
(3)倒平板时，要使锥形瓶的瓶口迅速通过火焰进行灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。
核心归纳
2.实验结果的分析
(1)在接种酵母菌的培养基上可观察到独立的菌落，这些菌落在颜色、形状和大小上相似，酵母菌菌落一般表面光滑，多呈乳白色。
(2)若在培养基中观察到不同形态的菌落，原因可能是菌液不纯，混入了其他杂菌，或在实验操作过程中被杂菌污染。
1.(2024·南京高二期中)如图为实验室培养和纯化大肠杆菌过程中的部分操作步骤，下列说法正确的是
A.制备①步骤使用的培养基的过程是先灭菌再调pH
B.②③④步骤操作时不需要在酒精灯火焰附近进行
C.操作②到④的过程中，接种环共灼烧处理了5次
D.接种结束后，将④倒置培养，皿底上标注菌种及接种日期等信息
√
落实　思维方法
①步骤表示倒平板，该过程使用的培养基的配制需要先调节pH后灭菌，A错误；
接种环在每次接种前和接种结束后都要通过灼烧来灭菌，步骤④中5次划线操作前都要灼烧灭菌，接种结束后还需灼烧灭菌1次，防止造成污染，由此可见，操作②到④的过程中共需灼烧接种环6次，C错误。
2.(多选)(2020·江苏，19改编)为纯化菌种，在鉴别培养基上划线接种纤维素降解细菌，培养结果如图所示。下列叙述正确的是
A.倒平板后需间歇晃动，以保证表面平整
B.图中Ⅰ、Ⅱ区的细菌数量均太多，应从Ⅲ区挑取
单菌落
C.该实验因单菌落太多，不能达到菌种纯化的目的
D.应对微生物培养物进行灭菌处理后再进行回收
√
√
倒平板后不需要间歇晃动，A错误；
图中Ⅰ、Ⅱ区的细菌数量太多，Ⅲ区中存在单菌
落，该实验结果能达到菌种纯化的目的，C错误；
应对微生物培养物进行灭菌处理后再进行回收，
以免造成污染，D正确。
稀释涂布平板法分离和纯化微生物
二
1.稀释涂布平板法
(1)过程和用途
①过程：将待分离的材料做一系列的 ，再取一定量的某一稀释度的菌液 ，然后用无菌的 将菌液均匀地涂布在整个平板表面，使其中的微生物 分散，培养后在平板培养基表面形成多个单菌落。
②用途：既可用于菌种的 ，还可以用于 。
梳理　教材新知
梯度稀释
涂布平板
涂布器
充分
分离和纯化
微生物计数
(2)混合平板法：将稀释的少量菌悬液与 左右的培养基混合均匀后倒入无菌培养皿中，再将培养皿置于合适温度下培养，这样在培养基表面和内部均可长出 。
(3)计数原理：如果经稀释涂布平板法培养出的都是 增殖形成的菌落，那么统计这些 数目，即可计算出单位体积样品中的微生物数量。
50 ℃
单个菌落
单个细胞
菌落
2.分离土壤中分解尿素的细菌并进行计数
(1)实验目的
①学会配制选择培养基，以分离出能分解尿素的细菌。
②学会采用 分离和培养分解尿素的细菌，并进行计数。
(2)实验原理
①由于不同微生物对 等的要求不同，利用 培养基可以筛选和分离某种微生物。
稀释涂布平板法
营养成分、氧、pH
选择
②在 的条件下，于固体培养基上培养该微生物，形成 菌落。单个菌落即为 ，通过对菌落数量的统计，可以计算出样品中的含菌数。
(3)实验器材和试剂
①土壤样品。
②灭菌处理过的各种工具。
③配制以 为氮源的1 000 mL选择培养基的试剂以及调节pH的相关试剂。
高度稀释
单个
纯化培养物
尿素
(4)实验步骤
3~5
无菌水
氮源
无菌水
污染
最低
3
倒置
24
30~300
稀释
体积
③使用步骤
水位标记线
1/3
排气阀
冷空气
103
121
15~20
“0”
温度
(5)结果与分析：菌落数目在30～300的一组平板上一般可以获得单个分解尿素的细菌菌落。
(1)稀释涂布平板法能分离微生物，也能计数，而平板划线法只能分离微生物，不能计数(　　)
(2)采用稀释涂布平板法培养和计算得到的微生物的数量一般比稀释液中实际微生物的数量要少(　　)
(3)稀释涂布平板法中所用的涂布器、移液管、锥形瓶等器材都需要进行湿热灭菌，而培养基则需要干热灭菌(　　)
√
√
提示　稀释涂布平板法中所用的涂布器、移液管、锥形瓶等器材都需要进行干热灭菌，而培养基则需要湿热灭菌。
×
(4)所有稀释倍数的稀释菌液涂布成的培养基都能观察到和分离出单菌落(　　)
提示　稀释倍数较低的稀释菌液涂布成的培养基上菌落相互连接，难以观察到和分离出单菌落。
×
任务二：稀释涂布平板法与微生物筛选计数的分析
1.微生物的选择培养和计数
图A和图B为接种培养结果，判断哪个为稀释涂布平板法接种培养？为什么稀释涂布平板法可以用于细菌计数而平板划线法不能进行计数？
探究　核心知识
提示　图B为稀释涂布平板法接种培养。稀释涂布平板法会进行等比稀释，在合适的稀释倍数下，均匀涂布得到的菌落互不接触，可以确定菌类的密度，再通过计算可以得知原液的菌落数；而平板划线法最开始的划线很可能菌类会长成一片，导致无法计数，此外灼烧接种环时也会杀死一部分菌类。
2.在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时，A同学从对应的106倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌落，但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约50个菌落。其他同学认为A同学的培养基被污染了或混入了其他的含氮物质，而A同学认为自己所选土样不同。你能否通过设置对照，帮助A同学排除上述两个可以影响实验结果的因素？
提示　方案一：其他同学用与A同学相同的土样进行实验。若结果与A同学一致，则证明A同学无误；若结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制不当等问题。
方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染或灭菌不彻底。
3.据如图所示信息，计算4号试管每克土样中分解尿素细菌的数目，思考为什么统计的活菌数目往往比实际数目低？
提示　1.1×108个。当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
纯化方法的比较
核心归纳
方法 平板划线法 稀释涂布平板法 混合平板法
主要步骤 接种环在固体培养基表面连续划线 系列梯度稀释操作和涂布平板操作 取稀释的少量菌悬液与50 ℃左右的培养基混合均匀倒入无菌培养皿中
接种工具 接种环 涂布器 －
能否用于计数 不能计数 可以计数，但是操作复杂，需涂布多个平板 －
核心归纳
方法 平板划线法 稀释涂布平板法 混合平板法
培养 结果 菌落仅在平板表面 菌落出现在平板表面和内部
共同点 都能将微生物分散到固体培养基表面，以获得单细胞菌落，达到分离纯化微生物的目的，也可用于观察菌落特征
3.(多选)稀释涂布平板法是微生物培养中的一种常用的接种方法。下列相关叙述错误的是
A.操作中需要将菌液进行一系列的梯度稀释
B.需将不同稀释度的菌液分别涂布到液体培养基表面
C.不同浓度的菌液均可在培养基表面形成单个的菌落
D.操作过程中对培养基和涂布器等均需进行严格灭菌处理
√
落实　思维方法
√
操作中需要将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到固体培养基表面，进行培养；在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落；操作过程中培养基和涂布器等均需进行严格灭菌处理。
4.将微生物接种到平板培养基上的方法主要有平板划线法和稀释涂布平板法等。下列相关叙述正确的是
A.平板划线法只能用于微生物的分离纯化，稀释涂布平板法只能用于微
　生物的计数
B.平板划线法使用无菌接种针接种，稀释涂布平板法使用无菌涂布器涂布
C.采用两种方法接种后，通常需要在皿盖上注明相关信息
D.采用两种方法接种后，都需要将平板倒置放入恒温培养箱中培养
√
平板划线法和稀释涂布平板法均可用于微生物的分离纯化，但只有稀释涂布平板法能用于微生物的计数，A错误；
平板划线法使用无菌接种环接种，稀释涂布平板法使用无菌涂布器涂布，B错误；
采用两种方法接种后，通常需要在皿底上注明相关信息，C错误。
网络构建
课时对点练
三
题组一　平板划线法分离和纯化微生物
1.下列有关用平板划线法接种的操作，错误的是
A.将接种环放在火焰上灼烧
B.用已冷却的接种环挑取菌体
C.挑取菌体和划线都要在火焰旁进行
D.接种环划线要将最后一区的划线与第一区的划线相连
√
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6
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13
14
划线时，不能将最后一区的划线与第一区的划线相连，D错误。
2.下列有关倒平板的操作，错误的是
A.将灭过菌的培养皿放在火焰旁的桌面上
B.使打开的锥形瓶瓶口迅速通过火焰
C.将培养皿打开，培养皿盖倒放在桌面上
D.待培养基冷却到50 ℃左右时进行倒平板操作
√
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2
3
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5
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13
14
倒平板时，培养皿的盖不能完全打开。
3.在酵母菌的纯化实验中，划线接种(图甲)、培养结果(图乙)如图，且图甲、乙的对应位置不变。下列有关叙述错误的是
A.配制培养基时需进行湿热灭菌
B.连续划线的目的是获得单个酵母菌形成的菌落
C.图示接种过程中接种环至少灼烧了5次
D.图甲中a区域为划线的起始位置
√
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2
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14
由于每次使用接种环前后都要灼烧灭菌，从图甲中4次划线接种就可推断出，接种过程中接种环至少灼烧了5次，C正确；
起始划线的区域长出的菌落多且密，根据甲、乙对应区域的对应位置对比，图甲中a区域为划线的结束位置，D错误。
1
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14
题组二　稀释涂布平板法分离和纯化微生物
4.如图是从土壤中筛选具有较强降解磷能力菌株过程中的一些操作。下列相关叙述错误的是
A.倒平板后的培养皿需进行灭菌
B.培养时培养皿的放置应如图乙中a
所示
C.在火焰旁操作，可以防止杂菌污染
D.进行菌落计数时，一般选择菌落数在30～300的平板
√
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14
培养基灭菌后再倒平板，倒平板后的培养皿不再进行灭菌，A错误；
等待平板冷却凝固后，应将平板倒过来放置，如图乙中a所示，B正确。
5.用平板划线法或稀释涂布平板法都可以纯化大肠杆菌，二者的共同点有
A.都需要使用接种环进行接种
B.接种后都需要进行湿热灭菌
C.都需要在酒精灯火焰旁进行接种
D.都可以用来计数活菌数
√
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1
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14
平板划线法采用接种环进行操作，而稀释涂布平板法采用涂布器进行操作，A错误；
接种后不能再灭菌，B错误；
接种时，要进行无菌操作，需要在酒精灯火焰旁接种，避免空气中的微生物混入培养基，C正确；
稀释涂布平板法可以用来进行微生物的计数，而平板划线法不能，D错误。
6.研究小组利用稀释涂布平板法来探究某河流中大肠杆菌的数量。每一个浓度涂布四个平板，并且设置空白对照组。下列关于操作步骤的叙述，正确的是
A.涂布前，将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，燃尽后还要冷却
B.涂布完成后，将培养皿倒置于室温培养1～2 d
C.计算平板上的菌落数时，四个培养皿上的菌落数无论多少，都要全部平均
D.若空白对照组上有5个菌落，则实验组数据基础上减去5，以获得最准
确数据
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涂布完成后，将培养皿倒置于37 ℃恒温箱中培养1～2 d，B错误；
计算平板上的菌落数时，应选择菌落数在30～300的平板进行计数，并取其平均值，C错误；
若空白对照组上有5个菌落，说明培养基灭菌不彻底，需要重新进行实验，D错误。
题组三　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
7.下列与土壤中尿素分解菌的分离与计数实验相关的叙述，正确的是
A.可以通过设置空白对照组来检验培养基是否受到了杂菌的污染
B.对样品中的尿素分解菌进行计数时可采用平板划线法进行接种
C.统计尿素分解菌的数目时应该选择菌落数多的培养基进行计数
D.空白对照组的培养基制备时不需要倒置
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该实验可设置空白对照组，以检验培养基是否受到杂菌污染，同时也能确定培养基是否符合要求；对样品中的尿素分解菌进行计数时可采用稀释涂布平板法进行接种；统计尿素分解菌的数目时，选取菌落数为30～300的平板进行计数，求其平均值。
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8.(2024·盐城高二期中)如图为能分解尿素的微生物的获取过程，下列有关叙述错误的是
A.①②③的目的是选择能够分解尿素
的微生物并且增加该微生物的数量
B.过程④需在酒精灯火焰旁进行，其中接种环一共需要灼烧6次
C.通过选择培养得到的不一定都是能够分解尿素的微生物，所以还需做
进一步的鉴定
D.通过④获得纯种微生物后，再利用涂布平板法接种至试管斜面培养基
上进行保存
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过程④需在酒精灯火焰旁进行，以
免造成污染，接种前后接种环均要
进行灼烧灭菌，共接种5次，需要灼
烧6次，B正确；
通过选择培养得到的不一定都是能够分解尿素的微生物，比如有些微生物能利用尿素分解菌的代谢产物进行生长繁殖，所以还需根据菌落特征等做进一步的鉴定，C正确；
斜面接种是常用的菌种传代和低温下保存菌种的方法，D错误。
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9.(2022·江苏，3)下列是某同学分离高产脲酶菌的实验设计，不合理的是
A.选择农田或公园土壤作为样品分离目的菌株
B.在选择培养基中需添加尿素作为唯一氮源
C.适当稀释样品是为了在平板上形成单菌落
D.可分解酚红指示剂使其褪色的菌株是产脲酶菌
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农田或公园土壤中含有较多的产脲酶的微生物，A不符合题意；
为了筛选可分解尿素的细菌，配制的培养基应选择尿素作为唯一氮源，能合成脲酶的微生物在该培养基上能生长，B不符合题意；
当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，C不符合题意；
在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将尿素分解成氨，氨会使培养基的pH升高，酚红指示剂将变红，因此在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，能对分离的菌种做进一步鉴定，D符合题意。
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10.(2024·镇江高二检测)幽门螺杆菌具有活性很高的脲酶，调查幽门螺杆菌感染可采用尿素呼气试验，用幽门螺杆菌的数量表示感染情况。现从待测人员体内采集样本并制成菌液后，按如下步骤进行分离培养，下列叙述正确的是
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A.灭菌之前应先将培养基的pH调节至中性或弱酸性
B.图中X步骤可以使用平板划线法或稀释涂布平板法
C.目的菌接种到培养基后应立即将倒置的平板放入30～37 ℃恒温箱中
D.培养基中加入的酚红指示剂使平板上有的菌落周围出现红色透明圈
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幽门螺杆菌生活在人体胃液中，胃液为酸性环境(pH为1.5左右)，因此灭菌之前应先将培养基的pH调节至酸性，A错误；
根据题意可知，用幽门螺杆菌的数量表示感染情况，因此图示接种方法应能统计幽门螺杆菌的数量，图中X步骤为接种，需用稀释涂布平板法才能计数，B错误；
目的菌接种到培养基后，待涂布的菌液被培养基吸收后，才能将平板倒置，C错误；
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幽门螺杆菌含有脲酶，脲酶将尿素分解成氨，氨会使培养基的pH升高，因此如果在培养基中加入酚红指示剂，若有幽门螺杆菌，则菌落周围会出现红色透明圈，D正确。
11.(多选)(2021·江苏，18)为提高一株石油降解菌的净化能力，将菌涂布于石油为唯一碳源的固体培养基上，以致死率为90%的辐照剂量诱变处理。下列叙述不合理的是
A.将培养基分装于培养皿中后灭菌，可降低培养基污染的概率
B.涂布用的菌浓度应控制在30～300个/mL
C.需通过预实验考察辐射时间对存活率的影响，以确定最佳诱变时间
D.挑取培养基上长出的较大单菌落，纯化后进行降解效率分析
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培养基应先灭菌再分装于培养皿中，A不合理；
涂布时所用菌液一般为0.1 mL，平板上的菌落数目应介于30～300个，涂布用的菌浓度应控制在300～3 000个/mL，B不合理；
需通过预实验考察辐射时间对存活率的影响，再进行正式实验，以确定最佳诱变时间，C合理；
石油降解菌能分解石油获得碳源，形成菌落，挑取培养基上长出的较大单菌落，纯化后进行降解效率分析，以获得能高效降解石油的菌种，D合理。
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12.(多选)酵母菌的纯化培养过程中，完成稀释涂布平板后，将接种后的平板和一个未接种的平板倒置，放入28 ℃左右的恒温箱中培养。下列相关叙述正确的是
A.用未接种的平板共同培养，其目的是检验培养过程中是否有杂菌污染
B.完成稀释涂布平板接种后，需将平板倒置后放入恒温箱中
C.倒置培养有利于减少水分蒸发，避免杂菌污染，方便观察计数
D.上述培养结束后若出现了不同形态、大小的菌落，可能的原因是接种
环未灼烧
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用未接种的平板共同培养，可以检验培养过程中是否有杂菌污染，若有污染，则平板上会有微生物生长，A正确；
将培养皿倒置培养有利于减少水分蒸发，防止冷凝水滴落冲散单菌落，避免杂菌污染，方便观察计数，C正确；
稀释涂布平板法中用不到接种环，D错误。
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13.酵母的蛋白质含量可达自身干重的一半，可作为饲料蛋白的来源。有些酵母可以利用工业废甲醇作为碳源进行培养，这样既可减少污染又可降低生产成本。研究人员拟从土壤样品中分离该类酵母，并进行大量培养。如图所示为操作流程，请回答下列问题：
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(1)配制培养基时，按照培养基配方准确称量各组分，将其溶解、定容后，调节培养基的_____，及时对培养基进行分装，并进行________________灭菌。
pH
湿热(高压蒸汽)
配制培养基时，按照培养基配方准确称取各组分之后，溶解定容，再调节培养基的pH，一般情况下，采用湿热灭菌法对培养基进行灭菌。
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(2)取步骤②中不同梯度的稀释液加入标记好的无菌培养皿中，在步骤③中将温度约_______(填“25 ℃”“50 ℃”或“80 ℃”)的培养基倒入培养皿混匀，冷凝后倒置培养。
50 ℃
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(3)挑取分离平板中长出的单菌落，按步骤④所示进行划线。下列叙述合理的有_________(多选)。
a.为保证无菌操作，接种针、接种环使用前都必须灭菌
b.划线时应避免划破培养基表面，以免不能形成正常菌落
c.挑取菌落时，应挑取多个菌落，分别测定酵母细胞中甲醇的含量
d.可以通过逐步提高培养基中甲醇的浓度，获得甲醇高耐受株
a、b、d
在对酵母菌进行划线纯化时，为保证无菌操作，接种针、接种环使用前都必须灭菌；且在划线时应避免划破培养基表面，以免不能形成正常菌落；本实验是为了获得能以工业废甲醇作为碳源的酵母，故在实验过程中可以通过逐步提高培养基中甲醇的浓度，获得甲醇高耐受株。
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(4)步骤⑤中，为使酵母数量迅速增加，培养过程中需保证充足的营养和_______供应。为监测酵母的活细胞密度，将发酵液稀释1 000倍后，经等体积台盼蓝染液染色，用25×16型血球计数板计数5个中格中的细胞数，理论上_____色细胞的个数应不少于_____个，才能达到每毫升3×109个活细胞的预期密度。
氧气
无
30
酵母菌是兼性厌氧型真菌，在有氧条件下大量繁殖。酵母菌扩大培养时，需保证充足的营养和氧气供应。“用等体积台盼蓝染液染色”，即计数室中培养液体积实际只有0.1÷2＝0.05 mm3，设5个中方格中无色(活细胞不被台盼蓝染色)细胞数目为x个，则3×109＝x/5×25×1 000
×1 000÷0.05，解得x＝30。
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14.(2024·南通高二调研)饲养动物常用的植物饲料中含有难溶的植酸钙等物质，很难被动物吸收利用，还影响对其他营养物质的利用。若在饲料中添加植酸酶，则能催化植酸钙水解成为动物可以吸收利用的磷酸盐等。以下是科研人员从作物根部土壤中分离、计数产植酸酶菌株的过程示意图。请回答下列问题：
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(1)图示培养基中除了添加______________以外，应含有碳源、氮源、水、其他无机盐等基本营养物质。
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植酸钙、琼脂
科研人员要从作物根部土壤中分离产植酸酶的菌株，所以培养基要添加植酸钙，按照图示，选用培养基应为固体培养基，应该加入琼脂。
(2)图1所示操作称为________，该操作之前，培养基应该先______。
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倒平板
图1所示操作称为倒平板，该操作之前，培养基应该先进行灭菌。
灭菌
(3)图2所示接种方法是________________，在操作过程中要利用的接种器具是________。接种后，待菌液被培养基吸收后，再将培养皿_____，并在______(填“皿底”或“皿盖”)做好标记。
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稀释涂布平板法
涂布器
倒置
皿底
图2所示接种方法是稀释涂布平板法，在操作过程中要利用的接种器具是涂布器。接种后，待菌液被培养基吸收后，再将培养皿倒置，并在皿底做好标记。
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(4)在3个平板上分别接入0.1 mL稀释液，经适当培养后，3个平板上菌落数分别是38、42、40，则1 g土壤中的活菌数约为_________个。统计菌落获得的菌落数比实际活菌数_____(填“多”或“少”)，原因是_________________________________________________________。
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4×108
少
当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落
将1 g土壤加入999 mL的无菌水中，再经过3次10倍的稀释，最后取0.1 mL进行涂布，则培养基上的活菌数已经进行106倍稀释，3个平板上菌落数分别是38、42、40，平均值为40，则1 g土壤中的活菌数约为40/0.1×106＝4×108(个)。该方法统计获得的菌落数比实际的活菌数低，因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
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(5)图3是科研人员利用不同于图2方法分离产植酸酶菌株的示意图。下列对其操作及结果的叙述错误的是______(多选)。
A.每次划线前均需在酒精灯火焰旁
蘸取菌液
B.划线时带有菌种的接种环不能插
入培养基中
C.只有在5区域中才能得到所需菌落
D.整个过程需要对接种环进行6次灼烧
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AC
除第一次划线前需在酒精灯火焰旁蘸取菌液外，第二次划线从第一次划线的末端开始(即第二次之后的划线都从上次划线的末端开始)，A错误；
在5个区域中，只要有单个活细菌，通过培养即可获得所需菌落，C错误。
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14作业2　发酵工程的灭菌方法、灭菌设备、无菌操作器具及微生物接种和传代的无菌技术
(分值：100分)
第1～2题，每题4分；第3～14题，每题5分，共68分。
题组一　发酵工程的灭菌方法
1．(2024·徐州高二检测)无菌技术是发酵工程的重要技术。使用的接种针、接种环，最好采用的灭菌方法是(　　)
A．紫外线等射线灭菌法
B．干热空气灭菌法
C．湿热灭菌法
D．火焰灼烧法
2．下列关于无菌技术的说法，错误的是(　　)
A．培养皿可用干热灭菌法灭菌
B．牛奶、熟啤酒、葡萄酒都可用巴氏消毒法消毒
C．射线灭菌法一般用于接种室或超净工作台等的灭菌
D．实验过程中所有器皿、培养基及生物材料均需进行灭菌处理
3．下列常用的无菌操作中，错误的是(　　)
A．化学试剂灭菌法可以用于培养基的灭菌
B．灭菌所使用的物理、化学方法比较强烈
C．消毒所使用的物理、化学方法比较温和
D．湿热灭菌法和干热灭菌法有不同的适用条件
题组二　发酵工程的灭菌设备和无菌操作器具
4．(2024·无锡高二调研)高压蒸汽灭菌锅是一种常用的灭菌设备，其灭菌原理是利用高温高压条件导致(　　)
A．菌体和芽孢都存活
B．菌体死亡但芽孢存活
C．菌体和芽孢都死亡
D．菌体存活但芽孢死亡
5．下列有关使用高压蒸汽灭菌锅的操作，错误的是(　　)
A．加水时，水量达到标记线即可
B．加盖时，将排气软管插入内层灭菌桶的排气槽内
C．加热时，待冷空气完全排尽后关上排气阀
D．切断电源后，打开排气阀使压力表降到零后开盖
6．下列关于灭菌设备的使用，错误的是(　　)
A．不得将易腐、易燃、易爆物品放入电热鼓风干燥箱内干燥灭菌
B．使用高压蒸汽灭菌锅时，操作人员应严格控制热源维持灭菌时的压力
C．高压蒸汽灭菌锅内的物品太多，摆放太挤，会降低灭菌效果
D．在使用高压蒸汽灭菌锅时，一旦加热就不能打开排气阀
题组三　微生物接种和传代的无菌技术
7．(2024·常州高二期中)斜面培养基常用于菌种的保存，如图所示，试管中的培养基倾斜，菌种接种于斜面上。下列对于斜面培养基接种细菌的操作叙述错误的是(　　)
A．培养基配制时需添加琼脂
B．接种时需将试管置于酒精灯火焰旁
C．接种针灼烧后，在斜面上划线
D．培养基倒入试管后，需倾斜放置试管
8．下列关于微生物接种和传代的叙述，错误的是(　　)
A．抽出接种环时，其带菌部位不要触及管壁或通过火焰，以免被杂菌污染或被杀死
B．用斜面培养基保存菌种通常每隔2～3个月重新接种一次
C．休眠状态即微生物的生长繁殖受抑制但又不至于死亡
D．穿刺接种用到的接种器具是接种环
9．下列关于“斜面接种和培养酵母菌”实验操作的叙述，错误的是(　　)
A．将接种环的环端和可能伸入试管的部分在火焰上来回灼烧多次，以达到彻底灭菌的目的
B．灼烧的接种环在酒精灯火焰旁冷却后，伸入菌种管轻挑少许菌体
C．从菌种管抽出接种环时，不能让其带菌部位触及管壁
D．接种环在斜面接种后，需多次灼烧以保证无菌，冷却后放回原处
10．在斜面培养基上接种时，其正确的操作顺序是(　　)
①用一只手的拇指和其他四指夹住菌种试管和待接种的斜面试管，管口并齐，使斜面向上保持水平状态
②在火焰附近用握有接种环的手的小拇指、无名指、中指和掌心拔去两支试管上的试管塞，并迅速将试管口通过火焰2～3次
③将接种环伸入菌种管内，让环先接触培养基上未长菌的部位，使环冷却，然后轻轻挑取少许菌体，立即将接种环抽出
④手拿接种环，在酒精灯火焰上来回灼烧多次
⑤在火焰旁迅速将沾有菌体的接种环伸到斜面培养基的底部然后向上轻轻划“Z”型折线
⑥抽出接种环，将试管口与试管塞分别通过火焰2～3次，迅速塞紧试管
A．①②③④⑤⑥ B．①④②③⑤⑥
C．①②③④⑥⑤ D．②①③④⑤⑥
11．无菌技术是发酵工程的重要技术之一。实验室通常使用电热鼓风干燥箱作为干热灭菌设备，下列关于其用法和原理的叙述，错误的是(　　)
A．对于空的玻璃器皿和其他耐高温的物品可以采用此法来保持干燥
B．不同菌体由于含水量不同，灭菌温度、时间都不同
C．使用干燥箱时必须将风机开关打开，否则会导致电机或传感器烧坏
D．由于放线菌及霉菌孢子含水量较低，在80～90 ℃条件下，加热10 min即可杀菌
12．(多选)发酵工程中的培养基含丰富的营养物质，对于液体培养物一般选用移液管转移液体，下列对于移液管的使用，错误的是(　　　　)
A．使用移液管时，拇指和中指捏住管颈标线以上的地方
B．移液管插入待取溶液液面时不应伸入太多也不应伸入太少
C．吸取液体时，当液面上升到刻度标线以上约1 cm处时迅速用另一只手的拇指堵住管口
D．将移液管移入准备接受溶液的容器中时，将移液管倾斜，使其尖端接触器壁
13．(多选)(2024·南京高二检测)含硫蛋白质在某些微生物作用下产生的硫化氢会导致生活污水发臭。为探究发臭水体中甲、乙菌是否产生硫化氢及两种菌的运动能力，某小组用穿刺接种的方法分别将两种菌接种在含有硫酸亚铁铵的培养基上进行培养(硫化氢可以与硫酸亚铁铵结合形成黑色沉淀)，如图所示。若两种菌繁殖速度相等，下列有关叙述正确的是(　　　　)
A．据实验结果可知，乙菌的运动能力比甲菌强
B．甲、乙菌在培养基内部生长，一定属于厌氧菌
C．该实验结果说明甲、乙两种菌都能产生硫化氢
D．穿刺接种等接种技术的关键是防止杂菌的污染
14．(多选)(2024·盐城中学高二期中)可采用高压蒸汽灭菌锅对物品进行湿热灭菌。下列关于高压蒸汽灭菌锅使用及灭菌原理的说法，错误的是(　　　　)
A．灭菌物品放入灭菌桶后，盖好锅盖，依次旋紧锅盖四周的固定螺栓
B．加热时，须打开排气阀，排除锅内残留的冷空气，当压力表指针回“0”时，再关闭继续加热
C．灭菌后，打开排气阀排气，等压力表指针降至“0”时，打开锅盖，取出灭菌物品
D．高压蒸汽灭菌锅利用高温的热空气，在一定条件下能杀死所有微生物的营养体及芽孢
温馨提示：此系列题卡，非选择题每空2分，分值不同题空另行标注
15．(20分)某学校打算开辟一块食用菌栽培基地，以丰富学生的劳动技术课内容。首先对食用菌实验室进行清扫和消毒处理，准备食用菌栽培所需的各种原料和用具，然后从菌种站购来各种食用菌菌种。请回答下列问题：
牛肉膏 蛋白胨 NaCl 琼脂 蒸馏水
3.0 g 10.0 g 5.0 g 20.0 g 定容至1 000 mL
其中提供氮源的是________________；提供碳源的主要物质是__________。
(2)微生物在生长过程中对各种成分所需量不同，配制培养基时各成分要有合适的____________，在烧杯中加入琼脂后要不停地_______________，防止__________________。
(3)将配制好的培养基分装到试管中，加棉塞后若干个试管一捆，包上牛皮纸并用皮筋勒紧放入高压蒸汽灭菌锅中灭菌，灭菌完毕拔掉电源，待锅内压力自然降到“0”点时，将试管取出。如果棉塞上沾有培养基，此试管应________。
(4)使用高压蒸汽灭菌锅时注意，先向外层锅内倒入____________。把锅内水加热煮沸并将其中原有冷空气彻底排出后将锅密闭。
(5)从一支试管向另一支试管接种时应注意，接种环要在酒精灯________(填“内”或“外”)焰灭菌，并且待接种环________后再挑取菌体，试管口不能离开酒精灯火焰附近，将接种的试管在适温下培养，长成菌落后放入______℃冰箱中保藏。
16．(12分)在生产、生活和科研实践中，经常通过消毒和灭菌来避免杂菌的污染。请回答下列问题：
(1)在实验室中，玻璃和金属材质的实验器具________(填“可以”或“不可以”)放入密闭容器如电热鼓风干燥箱中进行干热灭菌。
(2)牛奶的消毒常采用巴氏消毒法或高温瞬时消毒法，与煮沸消毒法相比，这两种方法的优点是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)密闭空间内的空气可采用紫外线照射消毒，其原因是紫外线能__________________。工业生产上一般利用________________法大量地制备无菌空气。
(4)水厂供应的自来水通常是经过____________(填“氯气”“乙醇”或“高锰酸钾”)消毒的。
(5)某同学在使用高压蒸汽灭菌锅时，若压力达到设定要求，而锅内并没有达到相应温度，最可能的原因是_______________________________________________________________。
答案精析
1．D　[火焰灼烧法常用于接种等操作过程，如涂布器、接种环、接种针等，直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧，可以迅速彻底地灭菌。]
2．D　[牛奶、熟啤酒、葡萄酒都可用巴氏消毒法消毒，该方法可以减少牛奶和酒类中的营养流失，B正确；微生物培养的器皿、接种用具和培养基等均需要灭菌，生物材料依据情况消毒或灭菌，D错误。]
3．A　[由于灭菌剂可能会与培养基中的一些成分发生作用，因此化学试剂灭菌法一般不用于培养基的灭菌，A错误；灭菌是指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子，B正确；消毒是指使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物，C正确；常用的灭菌方法有干热灭菌法和湿热灭菌法等，依据灭菌对象的不同各有其适用范围，D正确。]
4．C
5．D　[切断电源后，应该等压力表指针降至“0”点，待温度下降后，打开排气阀，旋开固定螺栓，开盖，D错误。]
6．D　[加热后，随着锅内压力逐渐增加，须打开排气阀，排出锅内残留的冷空气。]
7．C　[接种针灼烧并冷却后，在斜面上划线，C错误。]
8．D　[穿刺接种用到的接种器具是接种针，D错误。]
9．B　[将灭过菌的接种环伸入菌种管，先将环部接触培养基斜面顶端或其他无菌体的培养基部位使其冷却，再轻轻挑取少许菌体，在抽出接种环时，注意其带菌部位不要触及管壁或通过火焰，B错误，C正确。]
10．B
11．D　[由于放线菌及霉菌孢子含水量较低，在80～90 ℃条件下，加热30 min方可杀菌。]
12．CD　[移液管插入待取溶液液面时不应伸入太多，以免管尖外壁粘有过多溶液，也不应伸入太少，以免液面下降后而吸空，B正确；吸取液体时，当液面上升到刻度标线以上约1 cm处时，迅速用另一只手的食指堵住管口，C错误；将移液管移入准备接受溶液的容器中时，使其出口尖端接触器壁，将容器倾斜，而使移液管直立，D错误。]
13．ACD　[从图中可以看出甲菌在试管中分布范围小于乙菌，说明了乙菌的运动能力比甲菌强，A正确；甲、乙菌在培养基内部生长，不一定属于厌氧菌，也可能是兼性厌氧菌，B错误；根据题意，硫化氢可以与硫酸亚铁铵结合形成黑色沉淀，图中都产生了黑色沉淀，表示二者都能产生硫化氢，C正确；微生物接种技术的核心是防止杂菌的污染，D正确。]
14．ACD　[旋紧锅盖时应按对称方向旋紧四周固定螺栓，A错误；灭菌后，等压力表指针降至“0”时，待温度下降后打开排气阀排气，旋开固定螺栓，打开锅盖，取出灭菌物品，C错误；高压蒸汽灭菌锅利用高温高压的蒸汽，在一定条件下能杀死所有微生物的营养体及芽孢，D错误。]
15．(1)牛肉膏、蛋白胨　牛肉膏　(2)比例　搅拌　琼脂糊底引起烧杯破裂　(3)废弃　(4)适量水　(5)外　冷却　4
16．(1)可以　(2)在达到消毒目的的同时，营养物质损失较少　(3)破坏DNA的结构　过滤除菌　(4)氯气　(5)未将锅内冷空气排尽作业3　微生物分离、纯化和培养的无菌技术
(分值：100分)
第1～8题，每题5分；第9～12题，每题6分，共64分。
题组一　平板划线法分离和纯化微生物
1．下列有关用平板划线法接种的操作，错误的是(　　)
A．将接种环放在火焰上灼烧
B．用已冷却的接种环挑取菌体
C．挑取菌体和划线都要在火焰旁进行
D．接种环划线要将最后一区的划线与第一区的划线相连
2．下列有关倒平板的操作，错误的是(　　)
A．将灭过菌的培养皿放在火焰旁的桌面上
B．使打开的锥形瓶瓶口迅速通过火焰
C．将培养皿打开，培养皿盖倒放在桌面上
D．待培养基冷却到50 ℃左右时进行倒平板操作
3．在酵母菌的纯化实验中，划线接种(图甲)、培养结果(图乙)如图，且图甲、乙的对应位置不变。下列有关叙述错误的是(　　)
A．配制培养基时需进行湿热灭菌
B．连续划线的目的是获得单个酵母菌形成的菌落
C．图示接种过程中接种环至少灼烧了5次
D．图甲中a区域为划线的起始位置
题组二　稀释涂布平板法分离和纯化微生物
4．如图是从土壤中筛选具有较强降解磷能力菌株过程中的一些操作。下列相关叙述错误的是(　　)
A．倒平板后的培养皿需进行灭菌
B．培养时培养皿的放置应如图乙中a所示
C．在火焰旁操作，可以防止杂菌污染
D．进行菌落计数时，一般选择菌落数在30～300的平板
5．用平板划线法或稀释涂布平板法都可以纯化大肠杆菌，二者的共同点有(　　)
A．都需要使用接种环进行接种
B．接种后都需要进行湿热灭菌
C．都需要在酒精灯火焰旁进行接种
D．都可以用来计数活菌数
6．研究小组利用稀释涂布平板法来探究某河流中大肠杆菌的数量。每一个浓度涂布四个平板，并且设置空白对照组。下列关于操作步骤的叙述，正确的是(　　)
A．涂布前，将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，燃尽后还要冷却
B．涂布完成后，将培养皿倒置于室温培养1～2 d
C．计算平板上的菌落数时，四个培养皿上的菌落数无论多少，都要全部平均
D．若空白对照组上有5个菌落，则实验组数据基础上减去5，以获得最准确数据
题组三　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
7．下列与土壤中尿素分解菌的分离与计数实验相关的叙述，正确的是(　　)
A．可以通过设置空白对照组来检验培养基是否受到了杂菌的污染
B．对样品中的尿素分解菌进行计数时可采用平板划线法进行接种
C．统计尿素分解菌的数目时应该选择菌落数多的培养基进行计数
D．空白对照组的培养基制备时不需要倒置
8．(2024·盐城高二期中)如图为能分解尿素的微生物的获取过程，下列有关叙述错误的是(　　)
A．①②③的目的是选择能够分解尿素的微生物并且增加该微生物的数量
B．过程④需在酒精灯火焰旁进行，其中接种环一共需要灼烧6次
C．通过选择培养得到的不一定都是能够分解尿素的微生物，所以还需做进一步的鉴定
D．通过④获得纯种微生物后，再利用涂布平板法接种至试管斜面培养基上进行保存
9．(2022·江苏，3)下列是某同学分离高产脲酶菌的实验设计，不合理的是(　　)
A．选择农田或公园土壤作为样品分离目的菌株
B．在选择培养基中需添加尿素作为唯一氮源
C．适当稀释样品是为了在平板上形成单菌落
D．可分解酚红指示剂使其褪色的菌株是产脲酶菌
10．(2024·镇江高二检测)幽门螺杆菌具有活性很高的脲酶，调查幽门螺杆菌感染可采用尿素呼气试验，用幽门螺杆菌的数量表示感染情况。现从待测人员体内采集样本并制成菌液后，按如下步骤进行分离培养，下列叙述正确的是(　　)
―→―→―→―→
A．灭菌之前应先将培养基的pH调节至中性或弱酸性
B．图中X步骤可以使用平板划线法或稀释涂布平板法
C．目的菌接种到培养基后应立即将倒置的平板放入30～37 ℃恒温箱中
D．培养基中加入的酚红指示剂使平板上有的菌落周围出现红色透明圈
11．(多选)(2021·江苏，18)为提高一株石油降解菌的净化能力，将菌涂布于石油为唯一碳源的固体培养基上，以致死率为90%的辐照剂量诱变处理。下列叙述不合理的是(　　　　)
A．将培养基分装于培养皿中后灭菌，可降低培养基污染的概率
B．涂布用的菌浓度应控制在30～300个/mL
C．需通过预实验考察辐射时间对存活率的影响，以确定最佳诱变时间
D．挑取培养基上长出的较大单菌落，纯化后进行降解效率分析
12．(多选)酵母菌的纯化培养过程中，完成稀释涂布平板后，将接种后的平板和一个未接种的平板倒置，放入28 ℃左右的恒温箱中培养。下列相关叙述正确的是(　　　　)
A．用未接种的平板共同培养，其目的是检验培养过程中是否有杂菌污染
B．完成稀释涂布平板接种后，需将平板倒置后放入恒温箱中
C．倒置培养有利于减少水分蒸发，避免杂菌污染，方便观察计数
D．上述培养结束后若出现了不同形态、大小的菌落，可能的原因是接种环未灼烧
温馨提示：此系列题卡，非选择题每空2分，分值不同题空另行标注
13．(14分)酵母的蛋白质含量可达自身干重的一半，可作为饲料蛋白的来源。有些酵母可以利用工业废甲醇作为碳源进行培养，这样既可减少污染又可降低生产成本。研究人员拟从土壤样品中分离该类酵母，并进行大量培养。如图所示为操作流程，请回答下列问题：
(1)配制培养基时，按照培养基配方准确称量各组分，将其溶解、定容后，调节培养基的__________，及时对培养基进行分装，并进行______________灭菌。
(2)取步骤②中不同梯度的稀释液加入标记好的无菌培养皿中，在步骤③中将温度约______________(填“25 ℃”“50 ℃”或“80 ℃”)的培养基倒入培养皿混匀，冷凝后倒置培养。
(3)挑取分离平板中长出的单菌落，按步骤④所示进行划线。下列叙述合理的有________(多选)。
a．.为保证无菌操作，接种针、接种环使用前都必须灭菌
b．划线时应避免划破培养基表面，以免不能形成正常菌落
c．挑取菌落时，应挑取多个菌落，分别测定酵母细胞中甲醇的含量
d．可以通过逐步提高培养基中甲醇的浓度，获得甲醇高耐受株
(4)步骤⑤中，为使酵母数量迅速增加，培养过程中需保证充足的营养和________供应。为监测酵母的活细胞密度，将发酵液稀释1 000倍后，经等体积台盼蓝染液染色，用25×16型血球计数板计数5个中格中的细胞数，理论上________色细胞的个数应不少于____________个，才能达到每毫升3×109个活细胞的预期密度。
14．(22分)(2024·南通高二调研)饲养动物常用的植物饲料中含有难溶的植酸钙等物质，很难被动物吸收利用，还影响对其他营养物质的利用。若在饲料中添加植酸酶，则能催化植酸钙水解成为动物可以吸收利用的磷酸盐等。以下是科研人员从作物根部土壤中分离、计数产植酸酶菌株的过程示意图。请回答下列问题：
(1)图示培养基中除了添加________________以外，应含有碳源、氮源、水、其他无机盐等基本营养物质。
(2)图1所示操作称为__________，该操作之前，培养基应该先__________。
(3)图2所示接种方法是________________，在操作过程中要利用的接种器具是__________。接种后，待菌液被培养基吸收后，再将培养皿__________，并在__________(填“皿底”或“皿盖”)做好标记。
(4)在3个平板上分别接入0.1 mL稀释液，经适当培养后，3个平板上菌落数分别是38、42、40，则1 g土壤中的活菌数约为__________个。统计菌落获得的菌落数比实际活菌数______(填“多”或“少”)，原因是____________________________________________________。
(5)图3是科研人员利用不同于图2方法分离产植酸酶菌株的示意图。下列对其操作及结果的叙述错误的是__________(多选)。
A．每次划线前均需在酒精灯火焰旁蘸取菌液
B．划线时带有菌种的接种环不能插入培养基中
C．只有在5区域中才能得到所需菌落
D．整个过程需要对接种环进行6次灼烧
答案精析
1．D　[划线时，不能将最后一区的划线与第一区的划线相连，D错误。]
2．C　[倒平板时，培养皿的盖不能完全打开。]
3．D　[由于每次使用接种环前后都要灼烧灭菌，从图甲中4次划线接种就可推断出，接种过程中接种环至少灼烧了5次，C正确；起始划线的区域长出的菌落多且密，根据甲、乙对应区域的对应位置对比，图甲中a区域为划线的结束位置，D错误。]
4．A　[培养基灭菌后再倒平板，倒平板后的培养皿不再进行灭菌，A错误；等待平板冷却凝固后，应将平板倒过来放置，如图乙中a所示，B正确。]
5．C　[平板划线法采用接种环进行操作，而稀释涂布平板法采用涂布器进行操作，A错误；接种后不能再灭菌，B错误；接种时，要进行无菌操作，需要在酒精灯火焰旁接种，避免空气中的微生物混入培养基，C正确；稀释涂布平板法可以用来进行微生物的计数，而平板划线法不能，D错误。]
6．A　[涂布完成后，将培养皿倒置于37 ℃恒温箱中培养1～2 d，B错误；计算平板上的菌落数时，应选择菌落数在30～300的平板进行计数，并取其平均值，C错误；若空白对照组上有5个菌落，说明培养基灭菌不彻底，需要重新进行实验，D错误。]
7．A　[该实验可设置空白对照组，以检验培养基是否受到杂菌污染，同时也能确定培养基是否符合要求；对样品中的尿素分解菌进行计数时可采用稀释涂布平板法进行接种；统计尿素分解菌的数目时，选取菌落数为30～300的平板进行计数，求其平均值。]
8．D　[过程④需在酒精灯火焰旁进行，以免造成污染，接种前后接种环均要进行灼烧灭菌，共接种5次，需要灼烧6次，B正确；通过选择培养得到的不一定都是能够分解尿素的微生物，比如有些微生物能利用尿素分解菌的代谢产物进行生长繁殖，所以还需根据菌落特征等做进一步的鉴定，C正确；斜面接种是常用的菌种传代和低温下保存菌种的方法，D错误。]
9．D　[农田或公园土壤中含有较多的产脲酶的微生物，A不符合题意；为了筛选可分解尿素的细菌，配制的培养基应选择尿素作为唯一氮源，能合成脲酶的微生物在该培养基上能生长，B不符合题意；当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，C不符合题意；在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将尿素分解成氨，氨会使培养基的pH升高，酚红指示剂将变红，因此在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，能对分离的菌种做进一步鉴定，D符合题意。]
10．D　[幽门螺杆菌生活在人体胃液中，胃液为酸性环境(pH为1.5左右)，因此灭菌之前应先将培养基的pH调节至酸性，A错误；根据题意可知，用幽门螺杆菌的数量表示感染情况，因此图示接种方法应能统计幽门螺杆菌的数量，图中X步骤为接种，需用稀释涂布平板法才能计数，B错误；目的菌接种到培养基后，待涂布的菌液被培养基吸收后，才能将平板倒置，C错误；幽门螺杆菌含有脲酶，脲酶将尿素分解成氨，氨会使培养基的pH升高，因此如果在培养基中加入酚红指示剂，若有幽门螺杆菌，则菌落周围会出现红色透明圈，D正确。]
11．AB　[培养基应先灭菌再分装于培养皿中，A不合理；涂布时所用菌液一般为0.1 mL，平板上的菌落数目应介于30～300个，涂布用的菌浓度应控制在300～3 000个/mL，B不合理；需通过预实验考察辐射时间对存活率的影响，再进行正式实验，以确定最佳诱变时间，C合理；石油降解菌能分解石油获得碳源，形成菌落，挑取培养基上长出的较大单菌落，纯化后进行降解效率分析，以获得能高效降解石油的菌种，D合理。]
12．ABC　[用未接种的平板共同培养，可以检验培养过程中是否有杂菌污染，若有污染，则平板上会有微生物生长，A正确；将培养皿倒置培养有利于减少水分蒸发，防止冷凝水滴落冲散单菌落，避免杂菌污染，方便观察计数，C正确；稀释涂布平板法中用不到接种环，D错误。]
13．(1)pH　湿热(高压蒸汽)　(2)50 ℃　(3)a、b、d　(4)氧气　无　30
解析　(1)配制培养基时，按照培养基配方准确称取各组分之后，溶解定容，再调节培养基的pH，一般情况下，采用湿热灭菌法对培养基进行灭菌。(3)在对酵母菌进行划线纯化时，为保证无菌操作，接种针、接种环使用前都必须灭菌；且在划线时应避免划破培养基表面，以免不能形成正常菌落；本实验是为了获得能以工业废甲醇作为碳源的酵母，故在实验过程中可以通过逐步提高培养基中甲醇的浓度，获得甲醇高耐受株。(4)酵母菌是兼性厌氧型真菌，在有氧条件下大量繁殖。酵母菌扩大培养时，需保证充足的营养和氧气供应。“用等体积台盼蓝染液染色”，即计数室中培养液体积实际只有0.1÷2＝0.05 mm3，设5个中方格中无色(活细胞不被台盼蓝染色)细胞数目为x个，则3×109＝x/5×25×1 000×1 000÷0.05，解得x＝30。
14．(1)植酸钙、琼脂　(2)倒平板　灭菌　(3)稀释涂布平板法　涂布器　倒置　皿底　(4)4×108　少　当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落　(5)AC　
解析　(1)科研人员要从作物根部土壤中分离产植酸酶的菌株，所以培养基要添加植酸钙，按照图示，选用培养基应为固体培养基，应该加入琼脂。(2)图1所示操作称为倒平板，该操作之前，培养基应该先进行灭菌。(3)图2所示接种方法是稀释涂布平板法，在操作过程中要利用的接种器具是涂布器。接种后，待菌液被培养基吸收后，再将培养皿倒置，并在皿底做好标记。(4)将1 g土壤加入999 mL的无菌水中，再经过3次10倍的稀释，最后取0.1 mL进行涂布，则培养基上的活菌数已经进行106倍稀释，3个平板上菌落数分别是38、42、40，平均值为40，则1 g土壤中的活菌数约为40/0.1×106＝4×108(个)。该方法统计获得的菌落数比实际的活菌数低，因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。(5)除第一次划线前需在酒精灯火焰旁蘸取菌液外，第二次划线从第一次划线的末端开始(即第二次之后的划线都从上次划线的末端开始)，A错误；在5个区域中，只要有单个活细菌，通过培养即可获得所需菌落，C错误。

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