资源简介

第一节　基因工程及其技术
第1课时　基因工程的发展历程和基因工程的基本工具
[学习目标]　1.简述基因工程的发展历程。2.阐明基因工程所需的三种基本工具的作用。
一、基因工程是在多学科基础上发展而来的和基因工程的工具酶
1．基因工程是在多学科基础上发展而来的
年份 科学家 主要成就
1957 科恩伯格 首次在大肠杆菌中发现了__________
1967 罗思和海林斯基 发现一种具有自我复制能力的环状DNA分子，即______
其他科学家 在大肠杆菌细胞中发现了__________
1970 特明和巴尔的摩 各自在RNA“肿瘤”病毒中发现了__________
史密斯等 从流感嗜血杆菌中分离到一种特异性很强的_________
1972 伯格等 完成了世界上首次DNA分子体外重组
1973 科恩等 __________转化大肠杆菌获得成功
科恩和博耶 证明真核生物的基因可以在______生物中进行表达
1977 桑格 首次对完整基因组的__________________进行测定
2.基因工程的工具酶
(1)基因工程的概念
操作环境
操作方法 人工“______”和“______”
操作过程 将外源目的基因与载体DNA进行组合形成________，然后导入__________，并使其在受体细胞中______
操作原理 基因重组
目的 产生人类需要的__________
(2)“分子剪刀”——限制性内切核酸酶(又称限制酶)
①特点及作用
a．特点：__________(专一性)很强。
b．作用：能识别________上特定的脱氧核苷酸序列，并使每条链中特定部位的两个脱氧核苷酸之间的____________断开。
②切割方式
a．错位切：在DNA分子两条链的________部位进行切割，切割后形成的两个DNA分子片段的末端均留下一段游离的______，这种单链称为__________。
b．平切：在DNA分子两条链上______的部位进行切割，切割后形成__________。
(3)“分子黏合剂”——DNA连接酶
①两个具有黏性末端的DNA分子的连接
a．通过____________可以将黏性末端的两条链之间的碱基连接起来。
b．DNA分子基本骨架之间的____________通过DNA连接酶的作用连接。
②DNA连接酶的分布及作用
a．分布：广泛存在于各种生物体内。
b．作用：在DNA复制、______以及体内外重组过程中起着重要作用。
③种类
种类 来源 作用
________连接酶 大肠杆菌 可以用于连接具有________的DNA分子
T4 DNA连接酶 T4噬菌体 可以用于连接具有黏性末端或______的DNA分子
判断正误
(1)DNA连接酶能将DNA两条单链之间的碱基通过氢键连接起来(　　)
(2)E.coli DNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端(　　)
(3)限制酶和DNA连接酶的作用部位不相同(　　)
任务一：分析限制酶与DNA连接酶
1．DNA连接酶与DNA聚合酶的作用一样吗？为什么？
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
2．不同生物的DNA分子能拼接起来的理论基础是什么？
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
3．现有5种不同的限制酶①HindⅢ、②XbaⅠ、③EcoRⅤ、④SpeⅠ和⑤XhoⅠ，它们的识别序列和切割位点如图所示，回答下列问题：
(1)若XbaⅠ切割DNA之后形成的末端为和，则XhoⅠ切割DNA之后形成的末端为________________________________________________________。
(2)切割DNA片段后可形成平末端的限制酶有______(填编号)，可以形成黏性末端的限制酶有________(填编号)。
(3)限制酶______(填编号)切割某一DNA片段后产生的DNA片段能与SpeⅠ切割另一DNA片段产生的DNA片段相连接，原因是__________________________________________。
1．回文序列
限制酶特异性识别和切割的部位具有回文序列，即在切割部位，一条链正向读的碱基顺序，与另一条链反向读的碱基顺序完全一致。例如：EcoRⅠ限制酶识别的DNA序列为，为回文序列。
2．即使利用不同的限制酶进行切割，但只要切割后产生的黏性末端互补(或相同)，就可用DNA连接酶连接起来。
3．与DNA相关的几种酶的比较
比较项目 DNA连接酶 限制酶 DNA聚合酶 解旋酶
作用部位 磷酸二酯键 磷酸二酯键 磷酸二酯键 氢键
作用对象 DNA片段 DNA 单个的脱氧核苷酸 DNA
作用结果 将两个DNA片段连接成完整的DNA分子 切割DNA分子 将单个的脱氧核苷酸连接到DNA单链末端 将双链DNA分子局部解旋为单链
1．下表为常用的限制酶及其识别序列和切割位点，由此推断以下说法中，正确的是(　　)
限制酶名称 识别序列和切割位点 限制酶名称 识别序列和切割位点
BamHⅠ G↓GATCC KpnⅠ GGTAC↓C
EcoRⅠ G↓AATTC Sau3AⅠ ↓GATC
HindⅡ GTY↓RAC SmaⅠ CCC↓GGG
注：Y＝C或T，R＝A或G。
A．一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列
B．若两种限制酶的识别序列相同，则形成的末端一定相同
C．不同的限制酶切割DNA分子后可以形成相同的黏性末端
D．限制酶EcoRⅠ进行一次切割，会切断2个磷酸二酯键，形成1个游离的5′末端
2．在基因工程操作过程中，DNA连接酶的作用是(　　)
A．将任意两个DNA片段连接起来
B．将具有相同黏性末端的DNA片段连接起来，包括DNA片段和碱基对之间的氢键
C．连接具有互补黏性末端或平末端的DNA片段，即形成磷酸二酯键
D．只连接具有相同黏性末端的DNA片段碱基对之间的氢键
二、“分子搬运工”——载体
1．概念：将外源基因导入__________，并使其在受体细胞中稳定____________，还需要一定的“分子搬运工”，基因工程上将它们称为载体。
2．种类：质粒、λ噬菌体的衍生物、动物病毒等。
3．质粒载体应该具有的DNA序列
序列 原因
使外源基因在受体细胞中稳定复制和遗传
标记基因 用于____________重组DNA分子
多种______的切割位点 便于外源基因的插入
判断正误
(1)作为载体的质粒通常采用抗生素合成基因作为标记基因(　　)
(2)载体的作用是携带外源基因导入受体细胞中，使之稳定存在并表达(　　)
(3)载体(如质粒)和细胞质膜中的载体蛋白的成分相同(　　)
(4)基因工程上用作载体的质粒一般都是经过人工改造的(　　)
(5)科学家发现质粒具有自我复制能力并能在细菌细胞之间转移(　　)
任务二：分析质粒作为载体的条件
如图所示为大肠杆菌及质粒的结构模式图，据图回答以下问题：
(1)从图示分析质粒及被某限制酶处理后各有几个游离的磷酸基团？
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
(2)某外源基因切割末端为，若质粒也可用同种限制酶处理，质粒应有的一段核苷酸序列及被该限制酶切割后的末端分别是什么？
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
(3)从图示分析质粒上的氨苄青霉素抗性基因有什么作用？
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
　标记基因的筛选原理
载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了载体的受体细胞。如图所示：
3．(多选)作为基因的运输工具——载体，必须具备的条件之一及理由是(　　)
A．能够在宿主细胞中稳定地保存下来并大量复制，以便提供大量的目的基因
B．具有多个限制酶切点，以便于目的基因的插入
C．具有某些标记基因，以便目的基因能够与其结合
D．载体的参与一定能够使目的基因在宿主细胞中成功表达
4.某细菌质粒上含有标记基因(如图)，通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转入成功。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况也不同，如图是外源基因插入位置(插入点有a、b、c)示意图，请根据表中提供的细菌生长情况，推测①②③三种重组后细菌的外源基因插入点，正确的一组是(　　)
插入点 细菌在含氨苄青霉素的培养基上的生长状况 细菌在含四环素的培养基上的生长状况
① 能生长 能生长
② 能生长 不能生长
③ 不能生长 能生长
A.①是c；②是b；③是a
B．①是a和b；②是a；③是b
C．①是a和b；②是b；③是a
D．①是c；②是a；③是b
答案精析
一、
梳理教材新知
1．DNA聚合酶　质粒　DNA连接酶　逆转录酶　限制性内切核酸酶　重组质粒　原核　核苷酸排列顺序　
2．(1)体外　剪切　拼接　重组DNA　受体细胞　表达　基因产物　(2)①a.特异性　b．DNA分子　磷酸二酯键　②a.不同　单链　黏性末端　b．相同　平末端　(3)①a.碱基互补配对　b．磷酸二酯键　②b.修复　③E.coli DNA　黏性末端　平末端　
判断正误
(1)×　(2)×　(3)×
提示　(1)DNA连接酶能将DNA两条单链之间的磷酸二酯键连接起来。(2)E.coli DNA连接酶只能连接黏性末端。(3)限制酶和DNA连接酶的作用部位都是磷酸二酯键。
探究核心知识
1．不一样。DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，不需要模板；DNA聚合酶是将单个脱氧核苷酸加到已有的DNA片段的末端形成磷酸二酯键，需要以一条DNA链作为模板。
2．(1)DNA基本组成单位相同：都是四种脱氧核苷酸。(2)双链DNA分子的空间结构相同：都是规则的双螺旋结构。(3)DNA碱基对之间的关系相同：均严格遵循碱基互补配对原则。
3．(1)和　(2)③　①②④⑤　(3)②　这两种限制酶切割DNA片段后形成的DNA片段的黏性末端是互补的
落实思维方法
1．C　[由于Y＝C或T，R＝A或G，因此HindⅡ可以识别多种核苷酸序列，A错误；若两种限制酶的识别序列相同，但切割位点不同，则形成的末端不相同，B错误；不同的限制酶切割DNA分子后可以形成相同的黏性末端，如BamHⅠ和Sau3A Ⅰ，C正确；限制酶EcoRⅠ切割一次，使DNA双链断开，会有2个磷酸二酯键断裂，形成2个黏性末端，形成2个游离的5′末端，D错误。]
2．C　[DNA连接酶将具有互补的黏性末端或平末端的DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键。]
二、
梳理教材新知
1．受体细胞　遗传和表达　
3．复制原点　鉴定和选择　限制酶　
判断正误
(1)×　(2)√　(3)×　(4)√　(5)√
提示　(1)作为载体的质粒通常采用抗生素抗性基因作为标记基因。(3)载体(如质粒)是DNA分子，而细胞质膜中的载体蛋白是蛋白质分子。
探究核心知识
(1)质粒有0个游离的磷酸基团，被某限制酶处理后有2个游离的磷酸基团。
(2)—ACGCGT—　CGCGT—
　—TGCGCA—；　　　A—。
(3)作标记基因，用于鉴定和选择重组DNA分子。
落实思维方法
3．AB　[作为载体必须具备的条件之一是具有多个限制酶切割位点，以便于目的基因的插入，B正确；作为载体必须具备的条件之一是具有某些标记基因，用于鉴定和选择重组DNA分子，C错误；目的基因导入受体细胞后不一定能够成功表达，需要进一步做筛选和鉴定，D错误。]
4．A(共74张PPT)
第1课时
第三章 基因工程
<<<
基因工程的发展历程和基因工程的基本工具
学习目标
1.简述基因工程的发展历程。
2.阐明基因工程所需的三种基本工具的作用。
内容索引
一、基因工程是在多学科基础上发展而来的和基因工程的工具酶
二、“分子搬运工”——载体
课时对点练
基因工程是在多学科基础上发展而来的和基因工程的工具酶
一
梳理　教材新知
1.基因工程是在多学科基础上发展而来的
年份 科学家 主要成就
1957 科恩伯格 首次在大肠杆菌中发现了___________
1967 罗思和海林斯基 发现一种具有自我复制能力的环状DNA分子，即_____
其他科学家 在大肠杆菌细胞中发现了___________
1970 特明和巴尔的摩 各自在RNA“肿瘤”病毒中发现了_________
DNA聚合酶
质粒
DNA连接酶
逆转录酶
年份 科学家 主要成就
1970 史密斯等 从流感嗜血杆菌中分离到一种特异性很强的_____
______________
1972 伯格等 完成了世界上首次DNA分子体外重组
1973 科恩等 转化大肠杆菌获得成功
科恩和博耶 证明真核生物的基因可以在 生物中进行表达
1977 桑格 首次对完整基因组的 进行测定
性内切核酸酶
限制
重组质粒
原核
核苷酸排列顺序
2.基因工程的工具酶
(1)基因工程的概念
操作环境 ______
操作方法 人工“ ”和“ ”
操作过程 将外源目的基因与载体DNA进行组合形成 ，然后导入 ，并使其在受体细胞中_____
操作原理 基因重组
目的 产生人类需要的_________
体外
剪切
拼接
重组DNA
受体细胞
表达
基因产物
(2)“分子剪刀”——限制性内切核酸酶(又称限制酶)
①特点及作用
a.特点： (专一性)很强。
b.作用：能识别 上特定的脱氧核苷酸序列，并使每条链中特定部位的两个脱氧核苷酸之间的 断开。
②切割方式
a.错位切：在DNA分子两条链的 部位进行切割，切割后形成的两个DNA分子片段的末端均留下一段游离的 ，这种单链称为 。
b.平切：在DNA分子两条链上 的部位进行切割，切割后形成 。
特异性
DNA分子
磷酸二酯键
不同
单链
黏性末端
相同
平末端
(3)“分子黏合剂”——DNA连接酶
①两个具有黏性末端的DNA分子的连接
a.通过 可以将黏性末端的两条链之间的碱基连接起来。
b.DNA分子基本骨架之间的 通过DNA连接酶的作用连接。
②DNA连接酶的分布及作用
a.分布：广泛存在于各种生物体内。
b.作用：在DNA复制、 以及体内外重组过程中起着重要作用。
碱基互补配对
磷酸二酯键
修复
③种类
种类 来源 作用
连接酶 大肠杆菌 可以用于连接具有 的DNA分子
T4 DNA连接酶 T4噬菌体 可以用于连接具有黏性末端或 的DNA分子
E.coli DNA
黏性末端
平末端
(1)DNA连接酶能将DNA两条单链之间的碱基通过氢键连接起来
(　　)
提示　DNA连接酶能将DNA两条单链之间的磷酸二酯键连接起来。
×
(2)E.coli DNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端(　　)
提示　E.coli DNA连接酶只能连接黏性末端。
(3)限制酶和DNA连接酶的作用部位不相同(　　)
提示　限制酶和DNA连接酶的作用部位都是磷酸二酯键。
×
×
任务一：分析限制酶与DNA连接酶
1.DNA连接酶与DNA聚合酶的作用一样吗？为什么？
探究　核心知识
提示　不一样。DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，不需要模板；DNA聚合酶是将单个脱氧核苷酸加到已有的DNA片段的末端形成磷酸二酯键，需要以一条DNA链作为模板。
2.不同生物的DNA分子能拼接起来的理论基础是什么？
提示　(1)DNA基本组成单位相同：都是四种脱氧核苷酸。
(2)双链DNA分子的空间结构相同：都是规则的双螺旋结构。
(3)DNA碱基对之间的关系相同：均严格遵循碱基互补配对原则。
3.现有5种不同的限制酶①HindⅢ、②XbaⅠ、③EcoRⅤ、④SpeⅠ和
⑤XhoⅠ，它们的识别序列和切割位点如图所示，回答下列问题：
(1)若XbaⅠ切割DNA之后形成的末端为 和 ，则XhoⅠ切
割DNA之后形成的末端为 。
和
(2)切割DNA片段后可形成平末端的限制酶有 (填编号)，可以形成黏性末端的限制酶有 (填编号)。
(3)限制酶 (填编号)切割某一DNA片段后产生的DNA片段能与SpeⅠ切割另一DNA片段产生的DNA片段相连接，原因是__________________
_____________________________________________。
③
①②④⑤
②
DNA片段后形成的DNA片段的黏性末端是互补的
这两种限制酶切割
核心归纳
1.回文序列
限制酶特异性识别和切割的部位具有回文序列，即在切割部位，一条链正向读的碱基顺序，与另一条链反向读的碱基顺序完全一致。
例如：EcoRⅠ限制酶识别的DNA序列为 ，为回文序列。
2.即使利用不同的限制酶进行切割，但只要切割后产生的黏性末端互补(或相同)，就可用DNA连接酶连接起来。
核心归纳
3.与DNA相关的几种酶的比较
比较项目 DNA连接酶 限制酶 DNA聚合酶 解旋酶
作用部位 磷酸二酯键 磷酸二酯键 磷酸二酯键 氢键
作用对象 DNA片段 DNA 单个的脱氧核苷酸 DNA
作用结果 将两个DNA片段连接成完整的DNA分子 切割DNA分子 将单个的脱氧核苷酸连接到DNA单链末端 将双链DNA分子局部解旋为单链
1.下表为常用的限制酶及其识别序列和切割位点，由此推断以下说法中，正确的是
落实　思维方法
限制酶名称 识别序列和切割位点 限制酶名称 识别序列和切割位点
BamHⅠ G↓GATCC KpnⅠ GGTAC↓C
EcoRⅠ G↓AATTC Sau3AⅠ ↓GATC
HindⅡ GTY↓RAC SmaⅠ CCC↓GGG
注：Y＝C或T，R＝A或G。
A.一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列
B.若两种限制酶的识别序列相同，则形成的末端一定相同
C.不同的限制酶切割DNA分子后可以形成相同的黏性末端
D.限制酶EcoRⅠ进行一次切割，会切断2个磷酸二酯键，形成1个游离的
5′末端
√
限制酶名称 识别序列和切割位点 限制酶名称 识别序列和切割位点
BamHⅠ G↓GATCC KpnⅠ GGTAC↓C
EcoRⅠ G↓AATTC Sau3AⅠ ↓GATC
HindⅡ GTY↓RAC SmaⅠ CCC↓GGG
由于Y＝C或T，R＝A或G，因此HindⅡ可以识别多种核苷酸序列，A错误；
若两种限制酶的识别序列相同，但切割位点不同，则形成的末端不相同，B错误；
不同的限制酶切割DNA分子后可以形成相同的黏性末端，如BamHⅠ和Sau3A Ⅰ，C正确；
限制酶EcoRⅠ切割一次，使DNA双链断开，会有2个磷酸二酯键断裂，形成2个黏性末端，形成2个游离的5′末端，D错误。
2.在基因工程操作过程中，DNA连接酶的作用是
A.将任意两个DNA片段连接起来
B.将具有相同黏性末端的DNA片段连接起来，包括DNA片段和碱基对之
间的氢键
C.连接具有互补黏性末端或平末端的DNA片段，即形成磷酸二酯键
D.只连接具有相同黏性末端的DNA片段碱基对之间的氢键
√
DNA连接酶将具有互补的黏性末端或平末端的DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键。
“分子搬运工”——载体
二
1.概念：将外源基因导入 ，并使其在受体细胞中稳定_______
，还需要一定的“分子搬运工”，基因工程上将它们称为载体。
2.种类：质粒、λ噬菌体的衍生物、动物病毒等。
梳理　教材新知
受体细胞
遗传和
表达
3.质粒载体应该具有的DNA序列
序列 原因
_________ 使外源基因在受体细胞中稳定复制和遗传
标记基因 用于___________重组DNA分子
多种_______的切割位点 便于外源基因的插入
复制原点
鉴定和选择
限制酶
(1)作为载体的质粒通常采用抗生素合成基因作为标记基因(　　)
提示　作为载体的质粒通常采用抗生素抗性基因作为标记基因。
×
(2)载体的作用是携带外源基因导入受体细胞中，使之稳定存在并表达(　　)
(3)载体(如质粒)和细胞质膜中的载体蛋白的成分相同(　　)
√
提示　载体(如质粒)是DNA分子，而细胞质膜中的载体蛋白是蛋白质分子。
×
(4)基因工程上用作载体的质粒一般都是经过人工改造的(　　)
(5)科学家发现质粒具有自我复制能力并能在细菌细胞之间转移(　　)
√
√
任务二：分析质粒作为载体的条件
如图所示为大肠杆菌及质粒的结构模式图，
据图回答以下问题：
探究　核心知识
(1)从图示分析质粒及被某限制酶处理后各有几个游离的磷酸基团？
提示　质粒有0个游离的磷酸基团，被某限制酶处理后有2个游离的磷酸基团。
(2)某外源基因切割末端为　　　　　，若质
粒也可用同种限制酶处理，质粒应有的一段核苷酸序列及被该限制酶切割后的末端分别是什么？
提示　—ACGCGT—　CGCGT—
　　　—TGCGCA—；　　 A—。
(3)从图示分析质粒上的氨苄青霉素抗性基因有什么作用？
提示　作标记基因，用于鉴定和选择重组DNA分子。
标记基因的筛选原理
核心归纳
载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了载体的受体细胞。如图所示：
3.(多选)作为基因的运输工具——载体，必须具备的条件之一及理由是
A.能够在宿主细胞中稳定地保存下来并大量复制，以便提供大量的目的
基因
B.具有多个限制酶切点，以便于目的基因的插入
C.具有某些标记基因，以便目的基因能够与其结合
D.载体的参与一定能够使目的基因在宿主细胞中成功表达
√
落实　思维方法
√
作为载体必须具备的条件之一是具有多个限制酶切割位点，以便于目的基因的插入，B正确；
作为载体必须具备的条件之一是具有某些标记基因，用于鉴定和选择重组DNA分子，C错误；
目的基因导入受体细胞后不一定能够成功表达，需要进一步做筛选和鉴定，D错误。
4.某细菌质粒上含有标记基因(如图)，通过标记基因可以推知
外源基因(目的基因)是否转入成功。外源基因插入的位置不同，
细菌在培养基上的生长情况也不同，如图是外源基因插入位
置(插入点有a、b、c)示意图，请根据表中提供的细菌生长情
况，推测①②③三种重组后细菌的外源基因插入点，正确的一组是
插入点 细菌在含氨苄青霉素的培养基上的生长状况 细菌在含四环素的培养基上的生长状况
① 能生长 能生长
② 能生长 不能生长
③ 不能生长 能生长
A.①是c；②是b；③是a
B.①是a和b；②是a；③是b
C.①是a和b；②是b；③是a
D.①是c；②是a；③是b
插入点 细菌在含氨苄青霉素的培养基上的生长状况 细菌在含四环素的培养基上的生长状况
① 能生长 能生长
② 能生长 不能生长
③ 不能生长 能生长
√
网络构建
课时对点练
三
题组一　基因工程的发展历程和工具酶
1.(2023·南通高二期中)基因工程取得成功，是基础理论和技术发展共同推动的，下列不属于基因工程相关的技术发现的是
A.限制性内切核酸酶的发现
B.尼伦伯格和马太对遗传密码的破译
C.基因转移载体——质粒的发现
D.DNA分子体外重组的实现
√
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
工具酶的发现属于基因工程相关的技术发现，A不符合题意；
1967年，罗思和海林斯基发现基因转移载体——质粒，属于基因工程相关的技术发现，C不符合题意；
1972年，伯格及其科研团队完成了世界上首次DNA分子体外重组，DNA分子体外重组的实现属于基因工程相关的技术发现，D不符合题意。
2.科学家们经过多年的努力，创立了一种新兴生物技术——基因工程。实施该工程的最终目的是
A.定向提取生物体的DNA分子
B.定向地对DNA分子进行人工“剪切”
C.在生物体外对DNA分子进行改造
D.产生人类需要的基因产物
√
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
基因工程是指在体外通过人工“剪切”和“拼接”等方法，将外源目的基因与载体DNA进行组合形成重组DNA，然后导入受体细胞，并使其在受体细胞中表达，产生人类需要的基因产物的技术。
3.DNA连接酶连接的是
A.脱氧核糖和磷酸 B.脱氧核糖和碱基
C.碱基和磷酸 D.碱基和碱基
√
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
DNA连接酶使两个DNA片段末端的两个脱氧核苷酸之间的脱氧核糖和磷酸形成磷酸二酯键。
4.限制酶是一种核酸切割酶，可辨识并切割DNA分子上特定的脱氧核苷酸序列。如图为四种限制酶BamHⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ以及BglⅡ的识别序列。箭头表示每一种限制酶的特定切割部位，其中哪两种限制酶所切割出来的DNA片段末端可以互补黏合？其正确的末端互补序列是
A.BamHⅠ和EcoRⅠ；末端互补序列AATT—
B.BamHⅠ和HindⅢ；末端互补序列GATC—
C.EcoRⅠ和HindⅢ；末端互补序列AATT—
D.BamHⅠ和BglⅡ；末端互补序列GATC—
√
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
限制酶所识别的是特定的脱氧核苷酸序列，并在特定部位进行切割，由图示可知，BamHⅠ和BglⅡ切割出来的DNA片段末端可以互补黏合，末端互补序列为GATC—。
5.下列关于如图所示DNA分子片段的说法，正确的是
A.限制酶可作用于①部位，解旋酶作用于③部位
B.限制酶可作用于④部位，解旋酶作用于①部位
C.作用于①部位的限制酶同时也可以作用于④部位
D.作用于①部位的限制酶与作用于⑤部位的限制酶的碱基识别序列相反
√
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
限制酶可作用于①②④⑤部位，解旋酶作用于
③部位，A正确，B错误；
作用于①部位的限制酶同时也可以作用于⑤部
位，C错误；
作用于①部位的限制酶与作用于⑤部位的限制酶的碱基识别序列相同，都是—GAATTC—，D错误。
题组二　“分子搬运工”——载体
6.质粒是基因工程中最常用的载体之一，它的主要特点是
①能自主复制　②不能自主复制　③结构很小　④化学本质是蛋白质　
⑤环状RNA　⑥环状DNA　⑦能“友好”地“借居”
A.①③⑤⑦ B.①④⑥
C.①③⑥⑦ D.②③⑥⑦
√
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
质粒能自主复制，以保证能在宿主细胞中稳定存在并复制，①正确，②错误；
质粒为小型环状DNA分子，其结构很小，③⑥正确，⑤错误；
质粒的化学本质是DNA，不是蛋白质，④错误；
质粒能“友好”地“借居”，便于目的基因的稳定存在和复制，⑦正确。
7.下列有关基因工程中载体的说法，正确的是
A.基因工程的操作中被用作载体的质粒是来自细菌的天然质粒
B.质粒是一种独立于细菌染色体外的双链环状DNA分子
C.具有标记基因，以便为目的基因的表达提供条件
D.基因工程中常用的载体除质粒外，还有λ噬菌体的衍生物、动物病毒等
√
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
基因工程的操作中被用作载体的质粒一般是人工改造后的质粒，A错误；
细菌是原核生物，没有染色体，B错误；
标记基因用于鉴定和选择重组DNA分子，与目的基因的表达无关，C错误。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
8.限制酶MunⅠ和限制酶EcoRⅠ的识别序列及切割位点分别是—C↓TTAAG—和—G↓AATTC—。如图表示四种质粒和目的基因，其中，质粒上箭头所指部位为酶的识别位点，阴影部分表示标记基因。适于作为图示目的基因载体的质粒是
√
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
用限制酶MunⅠ切割A质粒后，不会破
坏标记基因，而且还能产生与目的基因
两侧黏性末端相同的末端，适于作为目
的基因的载体，A符合题意；
B质粒没有标记基因，不适于作为目的基因的载体，B不符合题意；
C、D质粒含有标记基因，但使用限制酶切割后，标记基因会被破坏，因此不适于作为目的基因的载体，C、D不符合题意。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
9.如表列举了几种限制酶的识别序列及其切割位点(箭头表示相关酶的切割位点)。如图是酶切后产生的几种末端。下列说法正确的是
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
限制酶 AluⅠ BamHⅠ SmaⅠ Sau3AⅠ
识别序列及切割位点 AG↓CT TC↑GA CCC↓GGG GGG↑CCC
A.BamHⅠ切割的是氢键，AluⅠ切割的是磷酸二酯键
B.Sau3AⅠ和BamHⅠ切割产生的片段能够相连，但连接后的片段两者都
不能再切割
C.②④⑤对应的识别序列均能被Sau3AⅠ识别并切割
D.T4 DNA连接酶既能连接①③，也能连接②⑤，但后者连接效率低
√
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
BamHⅠ与AluⅠ切割的均是磷酸二酯键，A错误；
BamHⅠ切割G↓GATCC，Sau3AⅠ切割↓GATC，故二者切割后产生的黏性末端是相同的，因此二者切割后产生的黏性末端能够相连，连接后仍然存在GATC的序列，能被Sau3AⅠ切割，但是BamHⅠ不一定能切割，B错误；
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
②④⑤对应的识别序列都存在GATC，都能被Sau3AⅠ识别并切割，C正确；
T4 DNA连接酶既可以连接黏性末端，也可以连接平末端，而图中①③是平末端，②⑤是黏性末端，T4 DNA连接酶连接平末端时效率较低，D错误。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
10.(多选)下列有关质粒的叙述，不正确的是
A.质粒是细菌细胞不可缺少的遗传物质
B.质粒可用于基因的扩增和蛋白质的表达
C.每个细菌细胞都只含有一个质粒
D.质粒都由4种脱氧核糖核苷酸脱水缩合而成
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
√
√
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
细菌的遗传物质是DNA，质粒是某些细菌细胞质中的小型环状DNA分子，质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性作用，因此，质粒不是细菌细胞不可缺少的遗传物质，A错误；
质粒可以自主复制，目的基因与质粒连接形成重组质粒后，目的基因可随着质粒DNA的复制而复制，质粒上有基因(抗性基因)存在，因此质粒还可控制蛋白质的表达，B正确；
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
细菌细胞不都含有质粒，且含有质粒的细菌细胞不一定只有一个质粒，C错误；
质粒是小型环状DNA分子，因此是由4种脱氧核糖核苷酸脱水缩合而成的，D正确。
11.(多选)下列关于限制酶和DNA连接酶的叙述，错误的是
A.限制酶能在特定部位的两个核苷酸之间切断磷酸二酯键
B.DNA连接酶可以恢复DNA分子中的氢键，将两个DNA片段的黏性末端
之间的缝隙连接起来
C.在基因工程操作中，可以用DNA聚合酶代替DNA连接酶
D.限制酶广泛存在于动植物体内，微生物内很少分布
√
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
√
√
限制酶能够识别双链DNA分子上特定的核苷酸序列，能在特定部位的两个核苷酸之间切断磷酸二酯键，A正确；
DNA连接酶可以恢复DNA分子中的磷酸二酯键，将两个DNA片段的黏性末端之间的缝隙连接起来，B错误；
DNA聚合酶将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端形成磷酸二酯键，DNA连接酶是连接两个DNA的片段形成磷酸二酯键，在基因工程操作中，不可以用DNA聚合酶代替DNA连接酶，C错误；
限制酶主要来源于微生物，D错误。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
12.(多选)下列有关酶的叙述，不正确的是
A.DNA连接酶以DNA的一条链为模板，将单个脱氧核苷酸连接起来
B.DNA聚合酶可将两个DNA分子片段间的缝隙从5′端到3′端连接起来
C.逆转录酶是以RNA为模板指导核糖核苷酸连接合成DNA的酶
D.限制性内切核酸酶识别特定的脱氧核苷酸序列并在特定位点切割DNA
分子
√
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
√
√
DNA连接酶连接的是两个DNA片段，A错误；
DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸加到DNA单链末端，B错误；
逆转录酶是逆转录过程中需要的酶，该过程是以RNA为模板、以脱氧核苷酸为原料合成DNA的过程，C错误；
限制性内切核酸酶具有特异性(专一性)，即可以识别特定的脱氧核苷酸序列并在特定位点切割DNA分子，D正确。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
13.(2021·全国乙，38节选)用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中要使用多种工具酶，其中4种限制性内切核酸酶的切割位点如图所示。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
回答下列问题：
(1)常用的DNA连接酶有E·coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶，图中
_______________酶切割后的DNA片段可以用E.coli DNA连接酶连接。图中________________________________切割后的DNA片段可以用T4 DNA连接酶连接。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
EcoRⅠ、PstⅠ
EcoRⅠ、SmaⅠ、PstⅠ、EcoR Ⅴ
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
由图可以直接看出，EcoRⅠ、SmaⅠ、PstⅠ、EcoRⅤ切割后分别形成黏性末端、平末端、黏性末端和平末端；E·coli DNA连接酶可用于连接黏性末端，T4 DNA连接酶可用于连接黏性末端和平末端。
(2)DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是____________。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
磷酸二酯键
DNA连接酶催化形成磷酸二酯键。
(3)DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征，如质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中_____；质粒DNA分子上有______
_________________，便于外源DNA的插入；质粒DNA分子上有标记基因(如某种抗生素抗性基因)，利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是_________________________________________________________
__________________。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
复制
限制酶的切割位点
(多种)
用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
复制原点是在基因组上复制起始的一段序列，可以保证质粒在宿主细胞中复制。质粒上有(多种)限制酶的切割位点，可被限制酶切开并使目的基因插入其中。采用在含有特定抗生素的选择培养基上进行选择培养的方法可将含质粒载体的宿主细胞筛选出来。
14.如图1表示含有目的基因D的DNA片段长度(bp即碱基对)和部分碱基序列，图2表示一种质粒的结构和部分碱基序列。现有MspⅠ、BamHⅠ、MboⅠ、SmaⅠ 4种限制酶，它们识别的碱基序列和酶切位点分别为C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG。分析回答下列问题：
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
(1)限制酶切断的化学键所处的具体部位是___________________________
__________________________。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
的磷酸基团与脱氧核糖之间
一条链上相邻两个脱氧核苷酸
限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位相邻的两个核苷酸的磷酸基团与脱氧核糖之间的磷酸二酯键断裂。
(2)下列有关限制酶的叙述，正确的是_______(填字母，多选)。
A.从反应类型来看，限制酶催化的是一种水解反应
B.限制酶的活性受温度、pH的影响
C.一种限制酶只能识别双链DNA中某种特定的脱氧核苷酸序列
D.不同的限制酶切割DNA后都会形成黏性末端
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
ABC
DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有黏性末端和平末端两种形式，D错误。
(3)若用限制酶SmaⅠ完全切割图1所示DNA片段，其产物长度为537 bp、661 bp和______ bp。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
790
基因D片段有两个限制酶SmaⅠ酶切位点，完全切割后出现三个片段长度分别是537 bp、790 bp、661 bp。
(4)若图1中虚线方框内的碱基对被T－A碱基对替换，那么基因D就突变为基因d。从杂合子中分离出图1及其对应的DNA片段，用限制酶SmaⅠ完全切割，产物中共有_____种不同长度的DNA片段。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
4
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
发生基因突变后的基因d片段只有一个限制酶SmaⅠ酶切位点，完全切割后出现2个片段长度分别是1 327 bp、661 bp，基因D被限制酶SmaⅠ切割后，产生537 bp、790 bp、661 bp 3个片段，所以图1所示的DNA片段及其同源片段被切割后共出现4种不同长度的DNA片段。
(5)若将图2中质粒和目的基因D通过同一种限制酶处理后进行连接形成重组质粒，那么应选用的限制酶是________，理由是__________________
________________________________________
________________________________________
________________________________________
________________________________________
_____________。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
BamHⅠ
坏目的基因，MboⅠ会将质粒上的两个标记基因全破坏，BamHⅠ在目的基因两端和质粒抗生素A抗性基因上有识别序列，既能形成重组质粒，又因破坏两个标记基因中的一个，利于筛选
MspⅠ和SmaⅠ会破第2课时　PCR技术和利用PCR技术扩增DNA片段并完成电泳鉴定
[学习目标]　1.简述PCR的原理、条件及过程。2.尝试进行PCR的基本操作并电泳鉴定PCR的产物。
一、聚合酶链式反应(PCR)技术
1．简介：聚合酶链式反应(PCR)，是目的DNA片段(目的基因)的__________技术。
2．原理：DNA半保留复制。
3．反应条件：在向PCR管中加入一定量的____________、____________、4种、缓冲液和________________酶(Taq酶)、______等后，设置好反应程序，启动______，自动完成反应步骤。
4．反应程序
(1)变性：在约______高温下，作为模板的双链DNA______(变性)为两条单链DNA。
(2)退火：反应体系的温度降至约________，2条______分别与对应单链DNA上的特定部位配对。
(3)延伸：反应体系的温度回升到约______(Taq酶催化作用的______反应温度)，4种脱氧核苷三磷酸根据__________________原则，在______的作用下连接到引物______端之后，使引物链______，并形成互补的DNA双链。
(4)完成上述第一次循环后，PCR仪会按设定接着进行第二次、第三次……循环。
5．应用
(1)广泛应用于医学及分子生物学等领域，如病原体鉴定、____________、免疫学研究、癌基因探索及某些疾病治疗等。
(2)在古生物学、法医学等方面也有广泛的应用。
判断正误
(1)PCR反应中温度的周期性改变是为了DNA聚合酶催化不同的反应(　　)
(2)用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列(　　)
(3)PCR技术中，DNA模板链上碱基G和C的比例越高，DNA变性解链的温度就越高(　　)
(4)PCR需要热稳定的DNA聚合酶、解旋酶、4种dNTP和模板DNA之外，还需要引物等基本条件(　　)
(5)PCR的每一次循环都包括变性→退火→延伸三个步骤，延伸后的产物又可以作为下一次循环的模板(　　)
任务一：分析PCR扩增的过程
图1、图2分别表示PCR扩增技术相关过程，请思考回答下列问题：
(1)图1所示利用PCR技术扩增目的基因，在第几轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段？
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
(2)如果循环n次，则共需要消耗多少对引物？
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
(3)图2是某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理，请分别说明理由。
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
(4)要保证目的基因能与载体相连接，还要对引物进行什么操作？
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
　PCR中的数量关系
复制次数 1 2 3 n
DNA分子数 2 4 8 2n
含引物的DNA分子数 2 4 8 2n
含其中一种引物的DNA分子数 1＝21－1 3＝22－1 7＝23－1 2n－1
同时含两种引物的DNA分子数 0＝21－2 2＝22－2 6＝23－2 2n－2
共消耗引物的对数 1＝21－1 3＝22－1 7＝23－1 2n－1
含脱氧核苷酸链等长的DNA分子数 0＝21－2 0＝22－4 2＝23－6 2n－2n
1．利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似，过程如图所示。图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。下列叙述错误的是(　　)
A．引物A、B的碱基不能进行互补配对
B．退火的目的是让引物与单链DNA相结合
C．延伸时，Taq酶从引物的3′端连接脱氧核苷三磷酸
D．第二轮循环后，同时含有引物A、B的DNA占100%
2．合适的引物是利用PCR技术扩增目的基因的前提。下列关于引物的叙述，错误的是(　　)
A．引物设计的依据是目的基因两端部分脱氧核苷酸序列
B．引物G、C含量过高则所需的退火温度较高
C．引物之间或内部存在互补序列则会影响其与模板链的结合
D．引物的3′端添加限制酶识别序列有利于目的基因的酶切与连接
二、利用PCR技术扩增DNA片段并完成电泳鉴定
1．实验目的
(1)尝试运用PCR仪扩增DNA片段。
(2)关注PCR技术的应用。
(3)学习__________________检测DNA片段的方法和技术。
2．实验原理
(1)扩增DNA片段的过程包括______、__________和______等步骤的多次循环。
(2)理论上，每经过一个循环，样本中DNA片段的数量增加______，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过 n个循环后，DNA片段数量可扩增至原来的______倍。
(3)PCR反应体系包括：DNA模板、____________、dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、人工合成的__________、Taq酶等。
(4)在不同阶段，还需要控制PCR仪反应系统的______温度。
(5)PCR和体内DNA复制的差异
比较项目 PCR 细胞核内DNA复制
场所 试管中 细胞内
方式 半保留______ 局部区域复制 半保留________全链复制
起始位点 引物______端 复制起始位点
酶 仅一种DNA聚合酶(______酶) 多种酶
反应条件 温度变幅大 温和
解旋 ______解旋 ______解旋
引物 ______片段，______在复制的子链中 ________片段，______在复制的子链中
产物 引物界定的片段 核基因组
循环次数 人为设置 与细胞分裂同步
3.实验器材和试剂
(1)仪器：PCR仪、琼脂糖凝胶电泳系统、凝胶成像仪或____________、微孔加热器(微量恒温仪)等。
(2)试剂：DNA模板、dNTP混合物、Taq酶、双蒸水、10×PCR缓冲液等。
4．实验步骤
(1)PCR扩增目的基因
①配制反应体系。
②按程序进行扩增。
a．94 ℃______5 min→b.94 ℃变性1 min→c.55 ℃______1 min→d.72 ℃延伸2 min→e.重复b～d,30个循环→f.72 ℃________7～10 min。
(2)电泳分析
①电泳：维持恒压______ 1.5～2 h。
②电泳鉴定：采用凝胶成像仪或__________观察和记录电泳结果。
5．结果和分析：略。
判断正误
(1)PCR的引物为DNA片段并保留在子链中，细胞核内DNA复制所需引物为RNA片段，并且不保留在子链中(　　)
(2)DNA分子的大小影响其在凝胶中的迁移速率(　　)
(3)利用PCR扩增DNA片段时，在每一次循环的变性之前，通常要用94 ℃的高温处理反应液5 min进行预变性(　　)
任务二：PCR扩增DNA片段及电泳鉴定的分析
1．在电泳鉴定中，判断DNA片段扩增是否成功的依据是什么？
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
2．如果电泳鉴定的结果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因：______________出现污染；____________设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易聚合形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。
(1)凝胶中影响DNA分子迁移速率的因素：凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象。在利用PCR技术扩增DNA片段的实验中主要考虑DNA分子的迁移速率与其大小成反比。
(2)未出现扩增条带的原因主要有：
①Taq酶失活。
②引物出现质量问题。
③Mg2＋浓度过低。
④变性时的温度低，变性时间短。
(3)出现非特异性扩增条带的原因主要有：
①模板DNA出现污染。
②引物特异性不强或形成引物二聚体。
③Mg2＋浓度过高。
④退火时的温度过低等。
3．(多选)聚合酶链式反应(PCR)是一种用于体外扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，参与PCR反应的物质主要为五种：引物、酶、dNTP、模板和Mg2＋。下列有关说法正确的是(　　)
A．细胞核内DNA复制的引物是一小段RNA，PCR的引物通常是一小段DNA
B．酶是指热稳定的DNA聚合酶，它能从引物的3′端羟基(—OH)开始延伸DNA链
C．dNTP是脱氧核苷三磷酸，N代表A、U、C、G 4种碱基
D．引物自身不应存在连续的互补序列，引物对间也不应有较强的互补性
4．(2024·扬州高二期中)下列关于DNA片段的电泳鉴定实验的说法，不正确的是(　　)
A．电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程
B．用微量取液器吸取不同的DNA样品时，需要更换枪头
C．电泳结束后，可用显微镜观察形成的电泳条带
D．进行电泳时，带电分子会向着与其所带电荷相反的方向移动
答案精析
一、
梳理教材新知
1．体外扩增　
3．模板DNA　引物对　脱氧核苷三磷酸(dNTP)　热稳定的DNA聚合　Mg2＋　PCR仪　
4．(1)94 ℃　解旋　(2)55 ℃　引物　(3)72 ℃　最适　碱基互补配对　Taq酶　3′　延伸
5．(1)遗传病诊断　
判断正误
(1)×　(2)√　(3)√　(4)×　(5)√
提示　(1)PCR反应中温度的周期性改变是为了变性、退火和延伸都在最适的条件下进行。(4)PCR不需要解旋酶。
探究核心知识
(1)第三轮。
(2)共需要消耗2n－1对引物。
(3)第1组：引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效。第2组：引物Ⅰ′自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效。
(4)要在两种引物的5′端分别添加上限制酶的识别序列。
落实思维方法
1．D　[如果引物A和引物B发生碱基互补配对，则不能与相应模板链结合，无法完成子链的延伸，故引物A、B的碱基不能进行互补配对，A正确；退火的目的是让引物通过碱基互补配对与单链DNA结合，B正确；延伸时，在Taq酶的作用下，将4种脱氧核苷三磷酸加到引物的3′端，C正确；DNA复制为半保留复制，第二轮循环即DNA复制2次，共形成22＝4(个)DNA分子，其中含有最初模板链的2个DNA分子含有引物A或引物B，其余2个DNA分子均含有引物A和引物B，所以第二轮循环产物中同时含有引物A和引物B的DNA占50%，D错误。]
2．D　[在扩增目的基因前，需要设计可与目的基因的碱基序列互补的两种单链引物，在退火时引物分别与目的基因的两条链结合形成双链，便于Taq酶的结合进行延伸，因此引物设计的依据是目的基因两端部分脱氧核苷酸序列，A正确；每个G/C对有三个氢键，引物中G/C含量高，在比较高的温度下就可以与模板稳定结合，不需要继续降温(退火)，即引物中G/C含量越高，退火温度越高，B正确；引物自身不应存在互补序列，否则会出现引物与自身配对、引物与引物配对情况，降低PCR的效率，C正确；DNA聚合酶只能使新合成的DNA子链从5′→3′方向延伸，为了方便目的基因与质粒的连接，可在引物的5′端添加限制酶识别序列，D错误。]
二、
梳理教材新知
1．(3)琼脂糖凝胶电泳　
2．(1)变性　退火　延伸　(2)一倍　2n　(3)反应缓冲液　DNA引物对　(4)不同　(5)全连续　半不连续　3′　Taq　高温　解旋酶　DNA　保留　RNA　不保留　
3．(1)紫外透射仪　
4．(1)②预变性　退火　延伸　(2)①80 V　②紫外透射仪　
判断正误
(1)√　(2)√　(3)×
提示　(3)利用PCR扩增DNA片段时，在第一轮循环的变性之前，通常要用94 ℃的高温处理反应液5 min进行预变性，增加大分子模板DNA彻底变性的概率，同时激活Taq酶。
探究核心知识
1．可以通过凝胶成像仪或紫外透射仪直接观察DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的效果。
2．模板DNA　引物　
落实思维方法
3．ABD　[PCR过程中需要的酶是热稳定的DNA聚合酶(Taq酶)，它能从引物的3′端羟基(—OH)开始延伸DNA链，以形成DNA子链，B正确；dNTP是脱氧核苷三磷酸，N代表A、T、C、G 4种碱基，C错误；设计的引物是用于目的基因的复制，因此，引物应能与目的基因的碱基互补配对，但每种引物自身不应存在互补性，引物对间也不应有较强的互补性，防止引物自身配对，D正确。]
4．C　[电泳结束后，采用凝胶成像仪或紫外透射仪观察电泳条带，C错误。](共71张PPT)
第2课时
第三章 基因工程
<<<
PCR技术和利用PCR技术扩增DNA片段并完成电泳鉴定
学习目标
1.简述PCR的原理、条件及过程。
2.尝试进行PCR的基本操作并电泳鉴定PCR的产物。
内容索引
一、聚合酶链式反应(PCR)技术
二、利用PCR技术扩增DNA片段并完成电泳鉴定
课时对点练
聚合酶链式反应(PCR)技术
一
梳理　教材新知
1.简介：聚合酶链式反应(PCR)，是目的DNA片段(目的基因)的________技术。
2.原理：DNA半保留复制。
3.反应条件：在向PCR管中加入一定量的 、 、4种_____
__________________、缓冲液和 酶(Taq酶)、 等后，设置好反应程序，启动 ，自动完成反应步骤。
体外扩增
模板DNA
引物对
脱氧
核苷三磷酸(dNTP)
热稳定的DNA聚合
Mg2＋
PCR仪
4.反应程序
(1)变性：在约 高温下，作为模板的双链DNA (变性)为两条单链DNA。
(2)退火：反应体系的温度降至约 ，2条 分别与对应单链DNA上的特定部位配对。
(3)延伸：反应体系的温度回升到约 (Taq酶催化作用的 反应温度)，4种脱氧核苷三磷酸根据 原则，在 的作用下连接到引物 端之后，使引物链 ，并形成互补的DNA双链。
(4)完成上述第一次循环后，PCR仪会按设定接着进行第二次、第三次……循环。
94 ℃
解旋
55 ℃
引物
72 ℃
最适
碱基互补配对
Taq酶
3′
延伸
5.应用
(1)广泛应用于医学及分子生物学等领域，如病原体鉴定、 、免疫学研究、癌基因探索及某些疾病治疗等。
(2)在古生物学、法医学等方面也有广泛的应用。
遗传病诊断
(1)PCR反应中温度的周期性改变是为了DNA聚合酶催化不同的反应(　　)
提示　PCR反应中温度的周期性改变是为了变性、退火和延伸都在最适的条件下进行。
×
(2)用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列(　　)
(3)PCR技术中，DNA模板链上碱基G和C的比例越高，DNA变性解链的温度就越高(　　)
√
√
(4)PCR需要热稳定的DNA聚合酶、解旋酶、4种dNTP和模板DNA之外，还需要引物等基本条件(　　)
提示　PCR不需要解旋酶。
×
(5)PCR的每一次循环都包括变性→退火→延伸三个步骤，延伸后的产物又可以作为下一次循环的模板(　　)
√
任务一：分析PCR扩增的过程
图1、图2分别表示PCR扩增技术相关过程，请思考回答下列问题：
(1)图1所示利用PCR技术扩增目的基因，在第几轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段？
探究　核心知识
提示　第三轮。
(2)如果循环n次，则共需要消耗多少对引物？
提示　共需要消耗2n－1对引物。
(3)图2是某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理，请分别说明理由。
提示　第1组：引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效。第2组：引物Ⅰ′自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效。
(4)要保证目的基因能与载体相连接，还要对引物进行什么操作？
提示　要在两种引物的5′端分别添加上限制酶的识别序列。
核心归纳
PCR中的数量关系
复制次数 1 2 3 n
DNA分子数 2 4 8 2n
含引物的DNA分子数 2 4 8 2n
含其中一种引物的DNA分子数 1＝21－1 3＝22－1 7＝23－1 2n－1
同时含两种引物的DNA分子数 0＝21－2 2＝22－2 6＝23－2 2n－2
共消耗引物的对数 1＝21－1 3＝22－1 7＝23－1 2n－1
含脱氧核苷酸链等长的DNA分子数 0＝21－2 0＝22－4 2＝23－6 2n－2n
1.利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似，过程如图所示。图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。下列叙述错误的是
A.引物A、B的碱基不能进行互补配对
B.退火的目的是让引物与单链DNA相结合
C.延伸时，Taq酶从引物的3′端连接脱氧
核苷三磷酸
D.第二轮循环后，同时含有引物A、B的
DNA占100%
落实　思维方法
√
如果引物A和引物B发生碱基互补配对，
则不能与相应模板链结合，无法完成子
链的延伸，故引物A、B的碱基不能进
行互补配对，A正确；
退火的目的是让引物通过碱基互补配对
与单链DNA结合，B正确；
延伸时，在Taq酶的作用下，将4种脱氧核苷三磷酸加到引物的3′端，C正确；
DNA复制为半保留复制，第二轮循环
即DNA复制2次，共形成22＝4(个)DNA
分子，其中含有最初模板链的2个DNA
分子含有引物A或引物B，其余2个DNA
分子均含有引物A和引物B，所以第二
轮循环产物中同时含有引物A和引物B的DNA占50%，D错误。
2.合适的引物是利用PCR技术扩增目的基因的前提。下列关于引物的叙述，错误的是
A.引物设计的依据是目的基因两端部分脱氧核苷酸序列
B.引物G、C含量过高则所需的退火温度较高
C.引物之间或内部存在互补序列则会影响其与模板链的结合
D.引物的3′端添加限制酶识别序列有利于目的基因的酶切与连接
√
在扩增目的基因前，需要设计可与目的基因的碱基序列互补的两种单链引物，在退火时引物分别与目的基因的两条链结合形成双链，便于Taq酶的结合进行延伸，因此引物设计的依据是目的基因两端部分脱氧核苷酸序列，A正确；
每个G/C对有三个氢键，引物中G/C含量高，在比较高的温度下就可以与模板稳定结合，不需要继续降温(退火)，即引物中G/C含量越高，退火温度越高，B正确；
引物自身不应存在互补序列，否则会出现引物与自身配对、引物与引物配对情况，降低PCR的效率，C正确；
DNA聚合酶只能使新合成的DNA子链从5′→3′方向延伸，为了方便目的基因与质粒的连接，可在引物的5′端添加限制酶识别序列，D错误。
利用PCR技术扩增DNA
片段并完成电泳鉴定
二
1.实验目的
(1)尝试运用PCR仪扩增DNA片段。
(2)关注PCR技术的应用。
(3)学习 检测DNA片段的方法和技术。
2.实验原理
(1)扩增DNA片段的过程包括 、 和 等步骤的多次循环。
梳理　教材新知
琼脂糖凝胶电泳
变性
退火
延伸
(2)理论上，每经过一个循环，样本中DNA片段的数量增加 ，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过n个循环后，DNA片段数量可扩增至原来的 倍。
(3)PCR反应体系包括：DNA模板、 、dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、人工合成的 、Taq酶等。
(4)在不同阶段，还需要控制PCR仪反应系统的 温度。
一倍
2n
反应缓冲液
DNA引物对
不同
(5)PCR和体内DNA复制的差异
比较项目 PCR 细胞核内DNA复制
场所 试管中 细胞内
方式 半保留 局部区域复制 半保留 全链复制
起始位点 引物 端 复制起始位点
酶 仅一种DNA聚合酶( 酶) 多种酶
反应条件 温度变幅大 温和
解旋 解旋 解旋
全连续
半不连续
3′
Taq
高温
解旋酶
比较项目 PCR 细胞核内DNA复制
引物 片段， 在复制的子链中 片段， 在复制的子链中
产物 引物界定的片段 核基因组
循环次数 人为设置 与细胞分裂同步
DNA
保留
RNA
不保留
3.实验器材和试剂
(1)仪器：PCR仪、琼脂糖凝胶电泳系统、凝胶成像仪或 、微孔加热器(微量恒温仪)等。
(2)试剂：DNA模板、dNTP混合物、Taq酶、双蒸水、10×PCR缓冲液等。
4.实验步骤
(1)PCR扩增目的基因
①配制反应体系。
②按程序进行扩增。
a.94 ℃ 5 min→b.94 ℃变性1 min→c.55 ℃ 1 min→d.72 ℃延伸
2 min→e.重复b～d,30个循环→f.72 ℃ 7～10 min。
紫外透射仪
预变性
退火
延伸
(2)电泳分析
①电泳：维持恒压 1.5～2 h。
②电泳鉴定：采用凝胶成像仪或 观察和记录电泳结果。
5.结果和分析：略。
80 V
紫外透射仪
(1)PCR的引物为DNA片段并保留在子链中，细胞核内DNA复制所需引物为RNA片段，并且不保留在子链中(　　)
(2)DNA分子的大小影响其在凝胶中的迁移速率(　　)
(3)利用PCR扩增DNA片段时，在每一次循环的变性之前，通常要用94 ℃的高温处理反应液5 min进行预变性(　　)
×
提示　利用PCR扩增DNA片段时，在第一轮循环的变性之前，通常要用94 ℃的高温处理反应液5 min进行预变性，增加大分子模板DNA彻底变性的概率，同时激活Taq酶。
√
√
任务二：PCR扩增DNA片段及电泳鉴定的分析
1.在电泳鉴定中，判断DNA片段扩增是否成功的依据是什么？
探究　核心知识
提示　可以通过凝胶成像仪或紫外透射仪直接观察DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的效果。
2.如果电泳鉴定的结果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因：
出现污染； 设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易聚合形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。
模板DNA
引物
核心归纳
(1)凝胶中影响DNA分子迁移速率的因素：凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象。在利用PCR技术扩增DNA片段的实验中主要考虑DNA分子的迁移速率与其大小成反比。
(2)未出现扩增条带的原因主要有：
①Taq酶失活。
②引物出现质量问题。
③Mg2＋浓度过低。
④变性时的温度低，变性时间短。
核心归纳
(3)出现非特异性扩增条带的原因主要有：
①模板DNA出现污染。
②引物特异性不强或形成引物二聚体。
③Mg2＋浓度过高。
④退火时的温度过低等。
3.(多选)聚合酶链式反应(PCR)是一种用于体外扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，参与PCR反应的物质主要为五种：引物、酶、dNTP、模板和Mg2＋。下列有关说法正确的是
A.细胞核内DNA复制的引物是一小段RNA，PCR的引物通常是一小段
DNA
B.酶是指热稳定的DNA聚合酶，它能从引物的3′端羟基(—OH)开始延
伸DNA链
C.dNTP是脱氧核苷三磷酸，N代表A、U、C、G 4种碱基
D.引物自身不应存在连续的互补序列，引物对间也不应有较强的互补性
√
落实　思维方法
√
√
PCR过程中需要的酶是热稳定的DNA聚合酶(Taq酶)，它能从引物的3′端羟基(—OH)开始延伸DNA链，以形成DNA子链，B正确；
dNTP是脱氧核苷三磷酸，N代表A、T、C、G 4种碱基，C错误；
设计的引物是用于目的基因的复制，因此，引物应能与目的基因的碱基互补配对，但每种引物自身不应存在互补性，引物对间也不应有较强的互补性，防止引物自身配对，D正确。
4.(2024·扬州高二期中)下列关于DNA片段的电泳鉴定实验的说法，不正确的是
A.电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程
B.用微量取液器吸取不同的DNA样品时，需要更换枪头
C.电泳结束后，可用显微镜观察形成的电泳条带
D.进行电泳时，带电分子会向着与其所带电荷相反的方向移动
√
电泳结束后，采用凝胶成像仪或紫外透射仪观察电泳条带，C错误。
网络构建
课时对点练
三
题组一　聚合酶链式反应(PCR)技术
1.下列关于PCR技术的叙述，正确的是
A.PCR技术建立在对扩增的目的基因序列完全已知的基础上
B.该技术需要解旋酶和热稳定的DNA聚合酶
C.该技术需要一对特异性的引物，要求一对引物的序列是互补的
D.该技术利用DNA半保留复制的原理，需要模板、原料、酶等条件
√
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
PCR技术扩增的目的基因序列不一定是完全已知的，A错误；
该技术是通过高温来使DNA解旋的，不需要解旋酶，B错误；
该技术需要的一对引物，分别能与模板DNA的两条链进行碱基互补配对，其序列不能互补，C错误。
2.PCR又称聚合酶链式反应，现在已成为分子生物学实验中的一种常规手段，它可以在体外很短的时间内将DNA大量扩增。你认为下列符合在体外进行PCR反应条件的一组是
①稳定的缓冲溶液环境　②DNA模板　③引物　④dNTP　⑤热稳定的DNA聚合酶　⑥解旋酶　⑦限制性内切核酸酶　⑧温控设备
A.①②③④⑤⑥ B.①②③④⑤⑥⑦⑧
C.③④⑤⑥⑧ D.①②③④⑤⑧
√
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
PCR反应的实质是模拟体内DNA复制，因此需要稳定的缓冲溶液环境，①符合题意；
PCR反应需要一定量的模板DNA、引物对、4种dNTP(提供能量和原料)、热稳定的DNA聚合酶，②③④⑤符合题意；
PCR反应过程中通过高温使DNA变性解旋，不需要解旋酶，⑥不符合题意；
PCR反应不需要限制性内切核酸酶，⑦不符合题意；
PCR反应过程中需要控制的关键因素是温度，因此需要温控设备，⑧符合题意。
3.下列关于聚合酶链式反应(PCR)技术的叙述，正确的是
A.PCR过程中只需要两个引物分子
B.PCR的循环过程分为变性、退火和延伸三步
C.PCR扩增仪需保持在37 ℃以维持Taq酶最佳活性
D.PCR过程中边解旋边复制
√
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
PCR过程中需要两种引物，引物的数目需要根据扩增的次数确定，A错误；
PCR的循环过程分为高温变性(DNA双链打开)、退火(模板链与引物结合)和延伸(合成子链)三步，B正确；
PCR扩增仪温度会达到90 ℃以上，C错误；
PCR过程中，在变性阶段打开双链，延伸阶段合成子链，故先解旋再复制，D错误。
4.下列有关PCR过程的叙述，错误的是
A.变性过程中破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键
B.复制过程中引物与DNA模板链的结合依靠碱基互补配对原则完成
C.延伸过程中需要DNA聚合酶、四种核糖核苷酸
D.PCR技术与细胞内DNA复制相比所需要的酶的最适温度较高
√
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
延伸过程中需要热稳定的DNA聚合酶、四种脱氧核苷三磷酸、引物对等，C错误。
5.PCR技术中，如何设计引物
A.PCR引物要根据需要扩增的目标DNA的碱基序列来设计
B.PCR引物要根据已知的DNA序列对应的RNA序列来设计
C.PCR引物要根据已知的DNA序列对应的tRNA的序列来设计
D.以上方法都不正确
√
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
设计引物就是直接根据基因序列来设计，即根据需要扩增的目标DNA的碱基序列来设计，A符合题意。
6.利用PCR将某小段含目的基因的DNA分子扩增循环n次，则
A.需要已知目的基因的全部序列以便设计引物
B.共需2n－2个引物参与子代DNA分子的合成
C.应向反应体系中加入解旋酶、DNA聚合酶、缓冲液等
D.理论上第4轮循环产物中含两种引物的DNA片段占7/8
√
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
只需要已知目的基因两端的部分序列便可设计引物，A错误；
扩增循环n次，需一种引物的数量为2n－1，常规PCR共需两种引物的数量为2×(2n－1)＝2n＋1－2，B错误；
不需向PCR的反应体系中加入解旋酶，C错误；
理论上第4轮循环产物中含两种引物的DNA片段占(24－2)/16＝7/8，D正确。
题组二　利用PCR技术扩增DNA片段并完成电泳鉴定
7.下列关于体内DNA复制和PCR技术的叙述错误的是
A.都遵循碱基互补配对原则
B.都需要破坏氢键
C.都需要DNA聚合酶
D.都是从引物的5′端延伸子链
√
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
8.(2024·泰州高二期末)某研究小组利用PCR技术扩增目的基因，并对扩增产物进行电泳，没有出现目的基因的扩增带，下列原因不可能的是
A.变性温度设置太低 B.两种引物浓度不等
C.使用的Taq酶失活 D.退火温度设置太高
√
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
变性温度过低，则DNA双链不能充分解开，影响目的基因的扩增，A不符合题意；
两种引物浓度不等不会导致不出现目的基因的扩增带，B符合题意；
使用的Taq酶失活会影响子链的合成，进而影响目的基因的扩增，C不符合题意；
PCR扩增时，退火温度的设定是成败的关键，退火温度设置太高会影响模板与引物的碱基配对，导致目的基因扩增失败，D不符合题意。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
9.(2023·徐州高二质检)在PCR反应体系中，加入过量的只与双链而不与单链DNA结合的荧光染料可用来鉴定扩增结果，该染料在游离状态不发出荧光，只有在DNA复制过程中掺入DNA双链中才发出荧光。下列分析错误的是
A.PCR体系中需要加入Mg2＋来激活Taq酶
B.若要扩增一个DNA上的某基因，应加入DNA的两种引物和该基因的两
种引物
C.荧光染料在每个循环的延伸阶段掺入双链DNA中
D.荧光信号强度与产物的数量呈正相关
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
√
在PCR体系中需要加入Mg2＋来激活耐高温的DNA聚合酶，用于合成DNA子链，A正确；
若要扩增一个DNA上的某基因，应加入该基因的两种引物，B错误；
荧光染料只有在DNA复制过程中掺入DNA双链中才发出荧光，在PCR反应的延伸阶段形成DNA双链，C正确；
荧光染料可用来鉴定扩增结果，扩增的产物越多，则荧光信号强度越强，D正确。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
10.引物在极大程度上决定了PCR的成败，下列关于引物的说法，不正确的是
A.PCR和生物体内的DNA合成都需要引物，PCR引物一般是单链DNA
B.若引物的C、G碱基含量相对较高，PCR退火步骤的温度需要适当升高
C.在PCR的退火步骤，两种引物分别结合在模板链的3′端和5′端
D.若初始有10个胰岛素基因，PCR中进行10轮循环，至少需要20 460个引
物分子
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
√
PCR和生物体内的DNA合成都需要引物，体内的DNA复制引物通常是RNA，PCR引物一般是单链DNA，A正确；
G与C之间有3个氢键，稳定性高，若引物的C、G碱基含量相对较高，PCR退火步骤的温度需要适当升高，B正确；
在PCR的退火步骤，两种引物都结合在模板链的3′端，C错误；
若初始有10个胰岛素基因，PCR中进行10轮循环，得到10×210＝10 240(个)DNA分子，共10 240×2＝20 480条链，由于初始的20条链不需要引物，故至少需要20 480－20＝20 460(个)引物分子，D正确。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
11.(多选)(2024·苏州高二期中)下列有关PCR的叙述，正确的有
A.PCR所需引物和体内DNA复制所需引物不同
B.引物长度和退火温度均会影响PCR扩增的特异性
C.PCR产物电泳时的迁移速率与DNA分子的大小有关，与凝胶的浓度无关
D.PCR预变性的目的是增加大分子模板DNA彻底变性的概率
√
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
√
√
PCR所需引物是一小段DNA，体内DNA复制所需引物是一小段RNA，A正确；
由于引物的序列具有特异性，所以PCR扩增的特异性一般是由引物的特异性决定的，当退火温度高时，只有引物与模板碱基匹配程度高，才能结合到模板上，而引物与模板匹配程度低的区域则不能结合，所以引物长度和退火温度均会影响PCR扩增的特异性，B正确；
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
PCR产物电泳时的迁移速率与DNA分子的大小和凝胶的浓度都有关，C错误；
在循环之前，常要进行一次预变性，以增加大分子模板DNA彻底变性的概率，D正确。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
12.(多选)(2024·扬州高二期中)聚合酶链式反应(PCR)是一种体外扩增DNA片段的技术，某DNA片段的PCR反应程序如图所示。下列叙述错误的是
A.预变性可促进模板DNA边解旋边复制
B.退火是让解旋状态模板DNA恢复双螺旋
C.延伸结束后，新片段中的引物将被切除
D.终延伸可使目的基因的扩增更加充分
√
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
√
√
预变性的目的是破坏DNA中可能存
在的较难破坏的复杂二级结构，使
DNA充分变性，A错误；
退火是让两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，B错误；
延伸结束后，新片段中不会切除引物，C错误；
终延伸过程是为了让引物完全延伸，并让单链产物完全复性形成双链结构，可使目的基因的扩增更加充分，D正确。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
13.(2023·盐城实验高级中学高二期中)金属硫蛋白(MT)是一类广泛存在的金属结合蛋白，某研究小组计划通过聚合酶链式反应(PCR)扩增获得目的基因，构建转基因工程菌，用于重金属废水的净化处理。如图是PCR扩增过程的示意图，请回答下列问题：
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
(1)从高表达MT蛋白的生物组织中提取mRNA，通过________获得DNA用于PCR扩增。
逆转录
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
PCR是在体外进行DNA扩增，提取的mRNA不能用于PCR扩增，需要经过逆转录获得DNA后才可用于PCR扩增。
(2)设计一对与MT基因两端序列互补配对的引物(引物1和引物2)，为方便构建重组质粒，在引物中需要增加适当的_______
___________________切割位点。设计引物时需要避免引物之间发生___________
____，而造成引物自连。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
限制性
内切核酸酶(限制酶)
碱基互补配
对
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
设计一对与MT基因两端序列互补配对的引物(引物1和引物2)，需要在引物中增加适当的限制性内切核酸酶(限制酶)的识别序列，便于构建重组质粒。为了避免引物自连，设计引物时需要避免引物之间发生碱基互补配对。
(3)图中步骤1代表_______，步骤2代表退火，步骤3代表_______，这3个步骤组成一轮循环。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
变性
延伸
根据PCR的过程可知，图中步骤1为变性，步骤2为退火，步骤3为延伸，这3个步骤构成一轮循环。
(4)PCR扩增时，退火温度的设定是成败的关键。退火温度过高会破坏____________
的碱基配对。退火温度的设定与引物长度、碱基组成有关，长度相同但____________
的引物需要设定更高的退火温度。
引物与模板
G、C含量高
退火温度的设定与引物长度、碱基组成有关，退火温度过高会破坏引物与模板的碱基配对。因G、C之间氢键数多于A、T之间氢键数，故在使用G、C含量高的引物时需要设定更高的退火温度。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
(5)如果PCR得不到任何扩增产物，则可以采取的改进措施有_______(填序号)。
①升高退火温度
②降低退火温度
③重新设计引物
②③
如果PCR得不到任何扩增产物，可能的原因是退火温度过高；也可能是未按照目的基因两端的核苷酸序列来设计引物，需要重新设计。因此可采取的措施有降低退火温度、重新设计引物等。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
14.(2024·扬州高二质检)在PCR技术中，除了作为复制对象的长链DNA之外，反应溶液中还添加有作为引物的短链DNA、dNTP(脱氧核苷三磷酸，N表示任意某一种碱基)和酶。实验时需要使反应溶液的温度周期性地发生变化以完成“变性—退火—延伸”的循环。DNA退火温度与互补碱基对之间的氢键数呈正相关。回答下列问题：
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
(1)PCR是________________的缩写，PCR反应溶液中添加Mg2＋的作用是________________________________
______。
聚合酶链式反应
激活热稳定的DNA聚合酶(Taq酶)的活性
PCR是体外扩增DNA技术，是聚合酶链式反应的缩写。PCR反应溶液中添加Mg2＋的作用是激活热稳定的DNA聚合酶(Taq酶)的活性。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
(2)实验1：在图1的引物1到引物4中，只使用1种作为引物，退火的温度设定为T ℃，PCR后只合成了与模板DNA2相同的单链。该实验使用的引物是引物_____。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
2
实验2：将引物变更为图1中的引物3和引物4，其他条件与实验1相同的情况下进行PCR，双链DNA完全没有被复制，请在图2中，将引物3和引物4与模板链区段1～4结合的关系绘制出来。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
答案　
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
1种引物只能与DNA的一条链相结合，以一条链为模板，合成一段DNA，PCR后只合成了与模板DNA2相同的单链，因此所选引物的5′端应该是与模板DNA1的3′端相结合，并且互补配对，则对应的为引物2。
(3)实验3：对图3此处中的双链DNA，使用引物5和引物6，将退火的温度设定为T ℃，进行了PCR。结果是双链DNA完全得不到复制。而当设定温度改变后，双链DNA得到了复制。温度改变的大致思路是___________
__________。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
适当降低
退火温度
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
PCR过程是利用温度变化来进行DNA的体外复制，适当降低退火温度，可以使改变温度后的引物更容易与模板通过碱基互补结合，从而使扩增成功。第3课时　目的基因的获取、DNA的粗提取和鉴定、基因表达载体的构建
[学习目标]　1.简述目的基因的获取方法。2.简述基因表达载体的组成及构建过程。3.概述DNA的粗提取和鉴定的原理及过程。
一、目的基因的获取
1．基因工程的基本操作程序
包括________________、______________、________________________，以及目的基因及其表达产物的检测鉴定等步骤。
2．目的基因的获取
(1)通过化学合成法直接人工合成目的基因
①比较小的目的基因：在明确__________________后，可以通过DNA合成仪直接人工合成。
②全基因或较大基因
a．方法：使用__________的方法。
b．合成过程
ⅰ.合成基因的部分__________片段。
ⅱ.适当条件下退火得到________________复合体。
ⅲ.在______存在的条件下，通过________酶将双链DNA的突出5′端补平，合成相应的互补链，再用相应的____________修复缺口，获得两条完整的互补双链。
(2)通过基因文库获取目的基因
①基因组文库
a．概念：含有某种生物体全部基因片段的重组DNA的克隆群体。
b．构建过程
将提纯的原核生物或者真核生物的基因组DNA______―→随机片段体外______一组含有不同DNA片段的____________分子群体。
c．筛选：一般采用____________的方法，将某基因的__________作为筛选的探针，在基因组文库中筛选含有目的基因的菌落，进行扩增、分离回收而获得目的基因。
②cDNA文库
a．概念：包含着某种细胞全部____________信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。
b．构建过程
从组织细胞中提取__________，__________成cDNA，与适当载体连接后______宿主。
c．构建合适的cDNA文库已成为获取__________目的基因的常用方法。
(3)获得基因组DNA或mRNA的基本过程
______细胞使核酸分子释放出来
↓
从释放出来的细胞成分中______核酸分子
↓
______获得核酸分子
(4)质粒DNA的提取：先用__________获取质粒，再提取质粒DNA。
(5)纯化DNA的原理：通常利用DNA与RNA、蛋白质等物质在__________方面的差异。
判断正误
(1)对于核苷酸序列已知且比较小的基因可通过化学合成法直接人工合成(　　)
(2)Klenow酶是一种能将双链DNA的突出3′端补平的DNA聚合酶(　　)
(3)一般采用核酸探针杂交的方法从基因组文库中筛选目的基因(　　)
(4)cDNA文库比基因组文库大得多(　　)
任务一：cDNA文库的建立及分析
根据提供的资料和所学内容，讨论并回答下列问题：
资料　真核生物的基因结构及转录和加工过程图。
(1)cDNA文库是从某种生物的某一细胞中提取出mRNA，经逆转录过程获得的基因文库，为什么该基因文库仅含有该生物的部分基因？
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
(2)根据提供的资料，推测cDNA文库与基因组文库相比，得到的基因中不含有哪些结构？
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
　基因组文库与cDNA文库的比较
比较项目 cDNA文库 基因组文库
文库大小 小 大
基因中启动子(具有启动作用的DNA片段) 无 有
基因中内含子(位于编码蛋白质序列内的非编码DNA片段) 无 有
基因多少 某种生物的部分基因 某种生物的全部基因
物种间的基因交流 可以 部分基因可以
1．下列关于基因文库的叙述，错误的是(　　)
A．cDNA文库中的基因可以在不同物种间进行交流
B．水稻基因组文库中的每个受体菌都含有水稻全部的基因
C．可从牛垂体细胞的cDNA文库中获取生长激素基因
D．构建基因组文库时需要使用限制酶和DNA连接酶
2．(多选)下列关于基因工程及应用的叙述，不正确的是(　　)
A．从cDNA文库中能获取某种生物的全部基因
B．一种核酸探针能从基因组文库中筛选出多种基因
C．利用半合成法合成全基因时只需要DNA连接酶
D．构建合适的cDNA文库是获取真核生物目的基因的常用方法
二、DNA的粗提取和鉴定
1．DNA的粗提取
2．DNA的鉴定
(1)原理：在______条件下，DNA与______发生反应，溶液呈______。
(2)步骤：将分离的丝状物放入物质的量浓度为2 mol·L－1的______溶液中，使其溶解，再加入____________，______加热数分钟，溶液出现______。
判断正误
(1)在鸡血细胞液中加入蒸馏水，搅拌、过滤，取其沉淀物(　　)
(2)实验中加入2 mol·L－1的NaCl的目的是析出DNA(　　)
(3)当NaCl的浓度低于2 mol·L－1时，DNA的溶解度下降，从溶液中析出(　　)
(4)DNA溶液中加入二苯胺试剂就会变蓝色(　　)
任务二：DNA的粗提取和鉴定的探讨
根据DNA的粗提取和鉴定过程及提供的资料，讨论并回答下列问题：
资料1　DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度曲线。
资料2　DNA与蛋白质等物质的物理和化学性质有差异，如DNA不溶于乙醇，但某些蛋白质溶于乙醇。
(1)能否选用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料？为什么？
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
(2)根据资料1回答，在DNA的粗提取中，两次加入蒸馏水的作用相同吗？如不相同，分别分析其目的。
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
(3)根据资料2中DNA和蛋白质在乙醇中的溶解度的特点，分析如何将DNA和蛋白质进一步分离？
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
　实验材料的选取
(1)一般选取鸡血来提取DNA，鸡血中血细胞含量高，DNA含量丰富，材料易得，细胞易吸水涨破。也可以选用植物细胞如洋葱等，只是破碎植物细胞比较麻烦，提取洋葱DNA时，需要先将洋葱切碎，然后加入一定量的洗涤剂和食盐，进行充分搅拌和研磨，过滤后收集研磨液。
(2)该实验中不能选用猪血等哺乳动物的血，因为哺乳动物成熟的红细胞没有细胞核和各种细胞器。
3．下列有关“DNA的粗提取和鉴定”实验的叙述，正确的是(　　)
A．新鲜猪血、菜花等动植物材料均可用于DNA的粗提取
B．选用洋葱作为实验材料时可以使用吸水涨破法破坏细胞
C．DNA可溶于2 mol/L的NaCl溶液
D．溶有DNA的NaCl溶液中加入二苯胺试剂后，颜色呈紫色
4．图1、2分别为“DNA的粗提取和鉴定”实验中部分操作示意图，下列叙述错误的是(　　)
A．图1中完成过滤后应向滤液中加入一定量的柠檬酸钠溶液
B．图2完成后要将玻璃棒上丝状物重新溶解到2 mol·L－1 的NaCl溶液中进行后续鉴定
C．图1、2中加入蒸馏水的目的不同
D．图1、2中搅拌的目的不同
三、基因表达载体的构建
1．构建基因表达载体的目的
(1)使目的基因进入受体细胞并_________________________________________________。
(2)使目的基因能稳定存在且____________给后代。
2．基因表达载体的组成
3．载体的种类
(2)有些载体兼有克隆载体和表达载体的特点。
判断正误
(1)构建基因表达载体需用到的工具酶是限制酶、DNA连接酶和载体(　　)
(2)基因表达载体中有的含有启动密码子和终止密码子(　　)
(3)标记基因一定是抗生素抗性基因(　　)
任务三：基因表达载体构建的探讨
1．为什么目的基因要插入启动子和终止子之间？
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
2．构建基因表达载体时，可以选择用同一种限制酶或两种能产生相同末端的限制酶分别切割载体和目的基因所在的DNA分子，这两种方法分别简称为“单酶切法”和“双酶分别切割法”。此处，还可以选择用两种能产生不同黏性末端的限制酶分别同时切割载体和含有目的基因的DNA分子，这种新的方法被称为“双酶同时切割法”。
注：Ampr表示氨苄青霉素抗性基因。
由图示可知，质粒经BamHⅠ和EcoRⅠ切割后，分别形成黏性末端1与2，目的基因所在的DNA分子经BamHⅠ和EcoRⅠ切割后，分别形成黏性末端3与4。
请结合上述内容回答下列问题：
(1)已知限制酶BamHⅠ和EcoRⅠ识别的核苷酸序列和切割位点分别为
则DNA分子经BamHⅠ和EcoRⅠ切割后所形成的末端是否互补(相同)
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
(2)黏性末端1与2能否经DNA连接酶连接？3与4呢？为什么？这说明“双酶同时切割法”具有什么优点？
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
(3)黏性末端1与4、2与3能否经DNA连接酶连接？这说明“双酶同时切割法”具有什么优点？
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
1．根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类
(1)应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。
(2)不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。
(3)为避免目的基因和质粒的自身环化和反向连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶切割(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)。
2．基因表达载体的构建过程
5．以下关于基因表达载体构建的说法，正确的是(　　)
A．基因表达载体的构建是在生物体的细胞内完成的
B．基因表达载体中只有启动子才能驱动目的基因转录出mRNA
C．基因表达载体的组成应包括启动子、终止密码子、目的基因、标记基因等
D．基因表达载体通常采用抗生素合成基因作为标记基因
6．(多选)(2024·宿迁高二期末)番茄在较低温度下运输或储存的过程中容易出现冻伤的现象。科学家利用基因工程技术培育出抗冻的转基因番茄。如图为外源DNA和质粒上标出的酶切位点及相关基因，其中AFPs基因为抗冻基因。下列相关叙述正确的是(　　)
A．基因工程中常用的工具酶有限制酶、DNA连接酶和质粒
B．获得的AFPs基因应插入质粒上的启动子与终止子之间
C．应用BamHⅠ和HindⅢ切割目的基因和质粒以避免目的基因反接
D．能在含青霉素的培养基上生长的受体细胞中一定都含有AFPs基因
答案精析
一、
梳理教材新知
1．目的基因的获取　基因表达载体的构建　将目的基因导入受体细胞　
2．(1)①脱氧核苷酸序列　②a.半合成　b．ⅰ.寡核苷酸　ⅱ.模板—引物　ⅲ.dNTP　Klenow　DNA连接酶　(2)①b.酶解　重组　重组DNA　c．核酸探针杂交　已知片段　②a.mRNA　b．mRNA　逆转录　转化　c．真核生物　(3)裂解　分离　纯化　(4)碱裂解法　(5)理化性质　
判断正误
(1)√　(2)×　(3)√　(4)×
提示　(2)Klenow酶是一种能将双链DNA的突出5′端补平的DNA聚合酶。(4)cDNA文库比基因组文库小得多。
探究核心知识
(1)由于基因的选择性表达，某种生物的某一细胞中仅有部分基因转录出mRNA，所以由该细胞中的mRNA逆转录得到的基因文库(cDNA文库)仅含有该生物的部分基因。
(2)cDNA文库中的基因不含有启动子、终止子、内含子等结构。
落实思维方法
1．B　[水稻基因组文库中的每个受体菌重组DNA只含有部分水稻基因，B错误。]
2．ABC　[从cDNA文库中只能获取某种生物的部分基因，从基因组文库中才能获取某种生物的全部基因，A错误；一种核酸探针只能筛选出一种基因，B错误；利用半合成法合成全基因时需要Klenow酶和DNA连接酶，C错误。]
二、
梳理教材新知
1．柠檬酸钠　蒸馏水　蒸馏水　DNA
2．(1)酸性　二苯胺　蓝色　(2)NaCl　二苯胺试剂　沸水浴
蓝色　
判断正误
(1)×　(2)×　(3)√　(4)×
提示　(1)在鸡血细胞液中加入蒸馏水，搅拌、过滤，取其滤液。(2)实验中加入2 mol·L－1的NaCl的目的是使DNA充分溶解。(4)DNA溶液中加入二苯胺试剂，沸水浴加热数分钟，溶液变蓝色。
探究核心知识
(1)不能；哺乳动物成熟的红细胞无细胞核和各种细胞器，无DNA分子。
(2)实验中两次加入蒸馏水的目的不相同。第一次加入的目的是使鸡血细胞吸水涨破，释放出核物质，第二次加入的目的是稀释NaCl溶液，从而析出DNA。
(3)向溶解有DNA和蛋白质的溶液中加入适量冷却的、体积分数为95%的乙醇溶液，溶液中会出现白色丝状物即DNA，而部分蛋白质会溶解在乙醇溶液中，这样可以对DNA起到进一步的纯化作用。
落实思维方法
3．C　[猪是哺乳动物，其成熟的红细胞没有细胞核和各种细胞器，所以猪血不能用于DNA的粗提取，A错误；植物细胞含有细胞壁，不能使用吸水涨破法破坏细胞，B错误；溶有DNA的NaCl溶液中加入二苯胺试剂，需沸水浴加热后冷却，再观察溶液颜色(呈蓝色)，D错误。]
4．A　[在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液，A错误；图2完成后另取烧杯加2 mol·L－1NaCl溶液使丝状物重新溶解，进行后续鉴定，B正确；图1加入蒸馏水是使细胞吸水破裂，图2加入蒸馏水是析出DNA，C正确；图1搅拌是为了破碎鸡血细胞，图2用玻璃棒沿一个方向轻轻搅拌，卷起丝状物，获得含有一定杂质的DNA，图1、2中搅拌的目的不同，D正确。]
三、
梳理教材新知
1．(1)有效表达　(2)遗传　
2．启动子　上游　RNA聚合酶　终止子　下游　转录　标记　筛选　受体细胞　复制并遗传
3．(1)克隆　表达　调控元件
判断正误
(1)×　(2)×　(3)×
提示　(1)载体不是酶。(2)基因表达载体中含有启动子和终止子，密码子属于mRNA，不是DNA的成分。(3)标记基因常用的是抗生素抗性基因或某些生化标记基因。
探究核心知识
1．启动子位于目的基因的上游，是RNA聚合酶识别、结合的部位，使转录开始；终止子位于目的基因的下游，使转录终止；只有顺序正确，目的基因才能正常转录。
2．(1)不互补(不相同)。
(2)均不能；因为这两种限制酶切割后形成的黏性末端不互补(不相同)。这说明“双酶同时切割法”能够避免载体和目的基因的自身环化。
(3)均不能；这说明“双酶同时切割法”能够避免载体与目的基因的反向连接。
落实思维方法
5．B　[基因表达载体的构建是在生物体外完成的，A错误；启动子是一段有特殊结构的DNA片段，位于目的基因的上游，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质，B正确；基因表达载体的组成应包括启动子、终止子、目的基因、标记基因等，终止密码子位于mRNA上，C错误；基因表达载体通常采用抗生素抗性基因作为标记基因，D错误。]
6．BC　[基因工程中常用的工具酶有限制酶、DNA连接酶，质粒属于基因工程中的常见工具，但不属于酶，A错误；启动子和终止子分别控制基因转录的开始和结束，获得的AFPs基因应插入质粒上的启动子与终止子之间，以保证目的基因能够正确的表达，B正确；为了防止目的基因和质粒自连或反接，应该选择两种限制酶进行切割，在目的基因两端、质粒上分别形成两种黏性末端，结合题图可知应用BamHⅠ和HindⅢ，C正确；仅导入了质粒的情况下细胞也具有青霉素抗性，故能在含青霉素的培养基上生长的受体细胞中不一定含有AFPs基因，D错误。](共83张PPT)
第3课时
第三章 基因工程
<<<
目的基因的获取、DNA的粗提取和鉴定、基因表达载体的构建
学习目标
1.简述目的基因的获取方法。
2.简述基因表达载体的组成及构建过程。
3.概述DNA的粗提取和鉴定的原理及过程。
内容索引
一、目的基因的获取
二、DNA的粗提取和鉴定
课时对点练
三、基因表达载体的构建
目的基因的获取
一
梳理　教材新知
1.基因工程的基本操作程序
包括 、 、 ，以及目的基因及其表达产物的检测鉴定等步骤。
2.目的基因的获取
(1)通过化学合成法直接人工合成目的基因
①比较小的目的基因：在明确 后，可以通过DNA合成仪直接人工合成。
目的基因的获取
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
脱氧核苷酸序列
②全基因或较大基因
a.方法：使用 的方法。
b.合成过程
ⅰ.合成基因的部分 片段。
ⅱ.适当条件下退火得到 复合体。
ⅲ.在 存在的条件下，通过 酶将双链DNA的突出5′端补平，合成相应的互补链，再用相应的 修复缺口，获得两条完整的互补双链。
半合成
寡核苷酸
模板—引物
dNTP
Klenow
DNA连接酶
(2)通过基因文库获取目的基因
①基因组文库
a.概念：含有某种生物体全部基因片段的重组DNA的克隆群体。
b.构建过程
将提纯的原核生物或者真核生物的基因组DNA ―→随机片段
体外 一组含有不同DNA片段的_____
分子群体。
酶解
重组
重组
DNA
c.筛选：一般采用 的方法，将某基因的 作为筛选的探针，在基因组文库中筛选含有目的基因的菌落，进行扩增、分离回收而获得目的基因。
②cDNA文库
a.概念：包含着某种细胞全部 信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。
b.构建过程
从组织细胞中提取 ， 成cDNA，与适当载体连接后 宿主。
c.构建合适的cDNA文库已成为获取 目的基因的常用方法。
核酸探针杂交
已知片段
mRNA
mRNA
逆转录
转化
真核生物
(3)获得基因组DNA或mRNA的基本过程
细胞使核酸分子释放出来
↓
从释放出来的细胞成分中 核酸分子
↓
获得核酸分子
(4)质粒DNA的提取：先用 获取质粒，再提取质粒DNA。
(5)纯化DNA的原理：通常利用DNA与RNA、蛋白质等物质在_________方面的差异。
裂解
分离
纯化
碱裂解法
理化性质
(1)对于核苷酸序列已知且比较小的基因可通过化学合成法直接人工合成(　　)
(2)Klenow酶是一种能将双链DNA的突出3′端补平的DNA聚合酶
(　　)
提示　Klenow酶是一种能将双链DNA的突出5′端补平的DNA聚合酶。
√
×
(3)一般采用核酸探针杂交的方法从基因组文库中筛选目的基因
(　　)
(4)cDNA文库比基因组文库大得多(　　)
提示　cDNA文库比基因组文库小得多。
√
×
任务一：cDNA文库的建立及分析
根据提供的资料和所学内容，讨论并回答下列问题：
资料　真核生物的基因结构及转录和加工过程图。
(1)cDNA文库是从某种生物的某一细胞中提取出mRNA，经逆转录过程获得的基因文库，为什么该基因文库仅含有该生物的部分基因？
探究　核心知识
提示　由于基因的选择性表达，某种生物的某一细胞中仅有部分基因转录出mRNA，所以由该细胞中的mRNA逆转录得到的基因文库(cDNA文库)仅含有该生物的部分基因。
(2)根据提供的资料，推测cDNA文库与基因组文库相比，得到的基因中不含有哪些结构？
提示　cDNA文库中的基因不含有启动子、终止子、内含子等结构。
核心归纳
基因组文库与cDNA文库的比较
比较项目 cDNA文库 基因组文库
文库大小 小 大
基因中启动子(具有启动作用的DNA片段) 无 有
基因中内含子(位于编码蛋白质序列内的非编码DNA片段) 无 有
基因多少 某种生物的部分基因 某种生物的全部基因
物种间的基因交流 可以 部分基因可以
1.下列关于基因文库的叙述，错误的是
A.cDNA文库中的基因可以在不同物种间进行交流
B.水稻基因组文库中的每个受体菌都含有水稻全部的基因
C.可从牛垂体细胞的cDNA文库中获取生长激素基因
D.构建基因组文库时需要使用限制酶和DNA连接酶
落实　思维方法
√
水稻基因组文库中的每个受体菌重组DNA只含有部分水稻基因，B错误。
2.(多选)下列关于基因工程及应用的叙述，不正确的是
A.从cDNA文库中能获取某种生物的全部基因
B.一种核酸探针能从基因组文库中筛选出多种基因
C.利用半合成法合成全基因时只需要DNA连接酶
D.构建合适的cDNA文库是获取真核生物目的基因的常用方法
√
从cDNA文库中只能获取某种生物的部分基因，从基因组文库中才能获取某种生物的全部基因，A错误；
一种核酸探针只能筛选出一种基因，B错误；
利用半合成法合成全基因时需要Klenow酶和DNA连接酶，C错误。
√
√
DNA的粗提取和鉴定
二
1.DNA的粗提取
梳理　教材新知
柠檬
酸钠
蒸馏水
DNA
蒸馏水
2.DNA的鉴定
(1)原理：在 条件下，DNA与 发生反应，溶液呈 。
(2)步骤：将分离的丝状物放入物质的量浓度为2 mol·L－1的 溶液中，使其溶解，再加入 ， 加热数分钟，溶液出现 。
酸性
二苯胺
蓝色
NaCl
二苯胺试剂
沸水浴
蓝色
(1)在鸡血细胞液中加入蒸馏水，搅拌、过滤，取其沉淀物(　　)
提示　在鸡血细胞液中加入蒸馏水，搅拌、过滤，取其滤液。
×
(2)实验中加入2 mol·L－1的NaCl的目的是析出DNA(　　)
提示　实验中加入2 mol·L－1的NaCl的目的是使DNA充分溶解。
×
(3)当NaCl的浓度低于2 mol·L－1时，DNA的溶解度下降，从溶液中析出(　　)
(4)DNA溶液中加入二苯胺试剂就会变蓝色(　　)
√
×
提示　DNA溶液中加入二苯胺试剂，沸水浴加热数分钟，溶液变蓝色。
任务二：DNA的粗提取和鉴定的探讨
根据DNA的粗提取和鉴定过程及提供的资料，讨论并回答下列问题：
资料1　DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度曲线。
探究　核心知识
资料2　DNA与蛋白质等物质的物理和化学性质有差异，如DNA不溶于乙醇，但某些蛋白质溶于乙醇。
(1)能否选用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料？为什么？
提示　不能；哺乳动物成熟的红细胞无细胞核和各种细胞器，无DNA分子。
(2)根据资料1回答，在DNA的粗提取中，两次加入蒸馏水的作用相同吗？如不相同，分别分析其目的。
提示　实验中两次加入蒸馏水的目的不相同。第一次加入的目的是使鸡血细胞吸水涨破，释放出核物质，第二次加入的目的是稀释NaCl溶液，从而析出DNA。
(3)根据资料2中DNA和蛋白质在乙醇中的溶解度的特点，分析如何将DNA和蛋白质进一步分离？
提示　向溶解有DNA和蛋白质的溶液中加入适量冷却的、体积分数为95%的乙醇溶液，溶液中会出现白色丝状物即DNA，而部分蛋白质会溶解在乙醇溶液中，这样可以对DNA起到进一步的纯化作用。
实验材料的选取
核心归纳
(1)一般选取鸡血来提取DNA，鸡血中血细胞含量高，DNA含量丰富，材料易得，细胞易吸水涨破。也可以选用植物细胞如洋葱等，只是破碎植物细胞比较麻烦，提取洋葱DNA时，需要先将洋葱切碎，然后加入一定量的洗涤剂和食盐，进行充分搅拌和研磨，过滤后收集研磨液。
(2)该实验中不能选用猪血等哺乳动物的血，因为哺乳动物成熟的红细胞没有细胞核和各种细胞器。
3.下列有关“DNA的粗提取和鉴定”实验的叙述，正确的是
A.新鲜猪血、菜花等动植物材料均可用于DNA的粗提取
B.选用洋葱作为实验材料时可以使用吸水涨破法破坏细胞
C.DNA可溶于2 mol/L的NaCl溶液
D.溶有DNA的NaCl溶液中加入二苯胺试剂后，颜色呈紫色
√
落实　思维方法
猪是哺乳动物，其成熟的红细胞没有细胞核和各种细胞器，所以猪血不能用于DNA的粗提取，A错误；
植物细胞含有细胞壁，不能使用吸水涨破法破坏细胞，B错误；
溶有DNA的NaCl溶液中加入二苯胺试剂，需沸水浴加热后冷却，再观察溶液颜色(呈蓝色)，D错误。
4.图1、2分别为“DNA的粗提取和鉴定”实验中部分操作示意图，下列叙述错误的是
A.图1中完成过滤后应向滤液中加入
一定量的柠檬酸钠溶液
B.图2完成后要将玻璃棒上丝状物重
新溶解到2 mol·L－1 的NaCl溶液中
进行后续鉴定
C.图1、2中加入蒸馏水的目的不同
D.图1、2中搅拌的目的不同
√
在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏
水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收
集滤液，A错误；
图2完成后另取烧杯加2 mol·L－1NaCl
溶液使丝状物重新溶解，进行后续鉴定，B正确；
图1加入蒸馏水是使细胞吸水破裂，图2加入蒸馏水是析出DNA，C正确；
图1搅拌是为了破碎鸡血细胞，图2用玻璃棒沿一个方向轻轻搅拌，卷起丝状物，获得含有一定杂质的DNA，图1、2中搅拌的目的不同，D正确。
基因表达载体的构建
三
1.构建基因表达载体的目的
(1)使目的基因进入受体细胞并 。
(2)使目的基因能稳定存在且 给后代。
梳理　教材新知
有效表达
遗传
2.基因表达载体的组成
复制并遗传
启动子
上游
RNA聚合酶
终止子
下游
转录
标记
筛选
受体细胞
3.载体的种类
(2)有些载体兼有克隆载体和表达载体的特点。
调控
克隆
表达
元件
(1)构建基因表达载体需用到的工具酶是限制酶、DNA连接酶和载体
(　　)
提示　载体不是酶。
×
(2)基因表达载体中有的含有启动密码子和终止密码子(　　)
提示　基因表达载体中含有启动子和终止子，密码子属于mRNA，不是DNA的成分。
×
(3)标记基因一定是抗生素抗性基因(　　)
×
提示　标记基因常用的是抗生素抗性基因或某些生化标记基因。
任务三：基因表达载体构建的探讨
1.为什么目的基因要插入启动子和终止子之间？
探究　核心知识
提示　启动子位于目的基因的上游，是RNA聚合酶识别、结合的部位，使转录开始；终止子位于目的基因的下游，使转录终止；只有顺序正确，目的基因才能正常转录。
2.构建基因表达载体时，可以选择用同一种限制酶或两种能产生相同末端的限制酶分别切割载体和目的基因所在的DNA分子，这两种方法分别简称为“单酶切法”和“双酶分
别切割法”。此处，还可以选择
用两种能产生不同黏性末端的限
制酶分别同时切割载体和含有目
的基因的DNA分子，这种新的方
法被称为“双酶同时切割法”。
注：Ampr表示氨苄青霉素抗性基因。
由图示可知，质粒经BamHⅠ和EcoRⅠ切割后，分别形成黏性末端1与2，目的基因所在的DNA分子经BamHⅠ和EcoRⅠ切割后，分别形成黏性末端3与4。
请结合上述内容回答下列问题：
(1)已知限制酶BamHⅠ和EcoRⅠ识别的核苷酸序列和切割位点分别为
则DNA分子经BamHⅠ和EcoRⅠ切割后所形成的末端是否互补(相同)
提示　不互补(不相同)。
(2)黏性末端1与2能否经DNA连接酶连接？3与4呢？为什么？这说明“双酶同时切割法”具有什么优点？
提示　均不能；因为这两种限制酶切割后形成的黏性末端不互补(不相同)。这说明“双酶同时切割法”能够避免载体和目的基因的自身环化。
(3)黏性末端1与4、2与3能否经DNA连接酶连接？这说明“双酶同时切割法”具有什么优点？
提示　均不能；这说明“双酶同时切割法”能够避免载体与目的基因的反向连接。
核心归纳
1.根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类
(1)应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图
甲可选择PstⅠ。
(2)不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，
如图甲不能选择SmaⅠ。
(3)为避免目的基因和质粒的自身环化和反向连接，
也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶切割(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)。
核心归纳
2.基因表达载体的构建过程
5.以下关于基因表达载体构建的说法，正确的是
A.基因表达载体的构建是在生物体的细胞内完成的
B.基因表达载体中只有启动子才能驱动目的基因转录出mRNA
C.基因表达载体的组成应包括启动子、终止密码子、目的基因、标记基
　因等
D.基因表达载体通常采用抗生素合成基因作为标记基因
√
落实　思维方法
基因表达载体的构建是在生物体外完成的，A错误；
启动子是一段有特殊结构的DNA片段，位于目的基因的上游，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质，B正确；
基因表达载体的组成应包括启动子、终止子、目的基因、标记基因等，终止密码子位于mRNA上，C错误；
基因表达载体通常采用抗生素抗性基因作为标记基因，D错误。
6.(多选)(2024·宿迁高二期末)番茄在较低温度下运输或储存的过程中容易出现冻伤的现象。科学家利用基因工程技术培育出抗冻的转基因番茄。如图为外源DNA和质粒上标出的酶切位点及相关基因，其中AFPs基因为抗冻基因。下列相关叙述正确的是
A.基因工程中常用的工具酶有限制酶、
　DNA连接酶和质粒
B.获得的AFPs基因应插入质粒上的启动子与终止子之间
C.应用BamHⅠ和HindⅢ切割目的基因和质粒以避免目的基因反接
D.能在含青霉素的培养基上生长的受体细胞中一定都含有AFPs基因
√
√
基因工程中常用的工具酶有限制酶、
DNA连接酶，质粒属于基因工程中
的常见工具，但不属于酶，A错误；
启动子和终止子分别控制基因转录的开始和结束，获得的AFPs基因应插入质粒上的启动子与终止子之间，以保证目的基因能够正确的表达，B正确；
为了防止目的基因和质粒自连或反接，应该选择两种限制酶进行切割，在目的基因两端、质粒上分别形成两种黏性末端，结合题图可知应用BamHⅠ和HindⅢ，C正确；
仅导入了质粒的情况下细胞也具有
青霉素抗性，故能在含青霉素的培
养基上生长的受体细胞中不一定含
有AFPs基因，D错误。
网络构建
课时对点练
四
题组一　目的基因的获取
1.下列不属于获取目的基因的方法是
A.从基因文库中提取
B.利用逆转录合成
C.利用DNA转录合成
D.利用化学方法人工合成
√
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
利用DNA转录合成的是RNA，不是基因，C符合题意。
2.下列关于基因文库的说法，正确的是
A.cDNA文库中的基因也有启动子
B.一种生物的cDNA文库只有一种
C.基因组文库中的基因都可以在物种间进行基因交流
D.cDNA文库中只含有某种生物的部分基因
√
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
cDNA文库中的基因都没有启动子，A错误；
由于cDNA文库中只含有某种生物的部分基因，因此该种基因文库可能有多种，而基因组文库中含有某种生物的全部基因，因此只有一种，B错误，D正确；
基因组文库中的部分基因可以在物种间进行基因交流，C错误。
3.观察分析下图，该图表示的过程是
A.构建基因组文库
B.构建cDNA文库
C.构建基因表达载体
D.构建转基因工程菌
√
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
由图可知，该过程利用的是某种生物的基因组DNA，用限制酶切割后，与载体连接注入受体菌中，该过程是构建基因组文库。
4.为了在大肠杆菌细胞中成功表达人胰岛素基因，首先需要提取细胞的mRNA，经逆转录等过程来获取目的基因。下列相关叙述错误的是
A.用于逆转录的mRNA只能从胰岛B细胞中获取
B.逆转录过程需要四种游离的核糖核苷酸作为原料
C.经逆转录得到的目的基因不含启动子和内含子
D.逆转录获取目的基因时遵循碱基互补配对原则
√
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
胰岛素基因只在胰岛B细胞中表达，因此只能从胰岛B细胞中获取用于逆转录的mRNA，A正确；
逆转录过程是以RNA为模板合成DNA的过程，以四种游离的脱氧核糖核苷酸为原料，B错误。
题组二　DNA的粗提取和鉴定
5.在“DNA的粗提取和鉴定”实验中，实验原理是DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同。DNA的溶解和析出与图中所示曲线的对应点符合的是
A.a点浓度最适合析出DNA
B.b点浓度最适合析出DNA
C.c点浓度最适合溶解DNA
D.d点浓度最适合析出DNA
√
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
由题图可知，DNA在物质的量浓度为0.14 mol·L－1的NaCl溶液中的溶解度最小，因此最适合析出DNA，但是随着NaCl溶液浓度的增大或减小，DNA溶解度均逐渐增大。
6.(2019·江苏，10)下列关于DNA粗提取和鉴定的叙述，错误的是
A.用同样方法从等体积兔血和鸡血中提取的DNA量相近
B.DNA析出过程中，搅拌操作要轻柔以防DNA断裂
C.预冷的乙醇可用来进一步纯化粗提的DNA
D.用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行水浴加热
√
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
哺乳动物(如兔)成熟的红细胞无细胞核和众多细胞器，不能提取到DNA，故兔血不宜作为该实验的实验材料，A错误；
为防止DNA断裂，在DNA析出过程中搅拌操作要轻柔且沿着一个方向，B正确；
DNA不溶于乙醇溶液，但是细胞中的某些蛋白质溶于乙醇溶液，预冷的、体积分数为95%的乙醇溶液可用来进一步纯化粗提的DNA，C正确；
在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺呈现蓝色，因此，用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行水浴加热，D正确。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
题组三　基因表达载体的构建
7.如图是基因工程中基因表达载体的模式图，若结构X是表达载体所必需的，则X最可能是
A.目的基因插入位点
B.启动子
C.标记基因
D.DNA聚合酶识别位点
√
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
基因表达载体由启动子、终止子、标记基因、复制原点和目的基因等组成。题图中有终止子、标记基因(抗生素抗性基因)、目的基因、复制原点等，还缺少启动子。启动子位于目的基因的上游，所以X最可能是启动子，B符合题意。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
8.(2023·辽宁，8)CD163蛋白是PRRSV病毒感染家畜的受体。为实时监控CD163蛋白的表达和转运过程，将红色荧光蛋白RFP基因与CD163基因拼接在一起(如图)，使其表达成一条多肽。该拼接过程的关键步骤是除去
A.CD163基因中编码起始密码子的序列
B.CD163基因中编码终止密码子的序列
C.RFP基因中编码起始密码子的序列
D.RFP基因中编码终止密码子的序列
√
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
拼接在一起的红色荧光蛋白RFP基因与CD163基因都需要进行转录和翻译，使其表达成一条多肽，因此拼接在一起的CD163基因转录形成的mRNA中不能出现终止密码子，否则在翻译时会提前终止，无法表达出既含CD163蛋白又含红色荧光蛋白的一整条多肽，因此该拼接过程的关键步骤是除去CD163基因中编码终止密码子的序列。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
9.若要利用某目的基因(如图甲)和P1噬菌体载体(如图乙)构建重组DNA(如图丙)，限制性内切核酸酶的酶切位点分别是BglⅡ(－A↓GATCT－)，EcoRⅠ(－G↓AATTC－)和Sau3AⅠ(－↓GATC－)。下列分析正确的是
A.用EcoRⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体
B.用BglⅡ和EcoRⅠ切割目的基因和P1噬
　菌体载体
C.用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬
　菌体载体
D.用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
√
10.某RNA病毒的抗原性和感染性与其表面的S蛋白密切相关，现利用基因工程的方法生产相关疫苗，图甲为构建S蛋白基因表达载体的过程，图乙为重组质粒(长度为2 000 bp)被相关酶切割后的电泳结果。下列相关叙述不正确的是
A.图甲中①②③过程都涉及磷酸二酯键
　的形成
B.图甲中③过程是基因工程的核心工作
C.由图乙可推知HindⅢ在重组质粒上有3个酶切位点
D.由图乙可推知BamHⅠ在重组质粒上有3个酶切位点
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
√
①为逆转录过程，②为DNA复制，
③为PCR技术，三者都涉及核酸链
的延伸，故都有磷酸二酯键的形成，
A正确；
③表示目的基因的获取，基因工程的核心工作是构建基因表达载体，B错误；
用HindⅢ将质粒(2 000 bp)切割后形成了200 bp、400 bp和1 400 bp共3个片段，说明HindⅢ在重组质粒上有3个酶切位点，C正确；
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
HindⅢ在重组质粒上有3个酶切位点，
用HindⅢ和BamHⅠ将质粒切割后形
成了200 bp、420 bp、560 bp的片段，
2 000＝420×2＋560＋200×3，所以
一共形成了6个片段，共有6个酶切位点，因此BamHⅠ在重组质粒上有6－3＝3(个)酶切位点，D正确。
11.(多选)如图为某基因结构示意图及该基因上几种限制酶的酶切位点，下列相关叙述错误的是
A.图中所示基因可能来自真核生物，
　也可能来自原核生物
B.利用PCR技术扩增该基因时，形成磷酸二酯键所需要的能量可由dNTP
　提供
C.利用PCR技术扩增该基因时，可根据Ⅰ、Ⅲ区域的DNA序列设计引物
D.用该基因作为目的基因和质粒构建重组质粒时，只能用SmaⅠ切割
√
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
√
图中基因的编码区存在外显子和
内含子，因此该目的基因来源于
真核生物，A错误；
Ⅰ、Ⅲ区域位于编码区上、下游，可根据这两区域DNA序列设计引物，C正确；
SmaⅠ的酶切位点在编码区，会破坏目的基因，所以不能用SmaⅠ切割目的基因，D错误。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
12.(多选)下列关于“DNA的粗提取和鉴定”实验的叙述，错误的是
A.酵母和菜花均可作为提取DNA的材料
B.DNA既溶于2 mol/L NaCl溶液，也溶于蒸馏水
C.向鸡血细胞液中加蒸馏水搅拌，可见玻璃棒上有白色絮状物
D.DNA溶液加入二苯胺试剂沸水浴加热，冷却后变紫
√
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
√
理论上只要含有DNA的生物组织均可作为该实验的材料，因此酵母和菜花均可作为提取DNA的材料，A正确；
向鸡血细胞液中加蒸馏水搅拌，可使细胞破裂，释放DNA，但玻璃棒上不会出现白色絮状物，C错误；
DNA溶液加入二苯胺试剂沸水浴加热，冷却后变蓝，D错误。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
13.CTAB法是一种提取植物DNA的方法。通过有机溶剂抽提，去除蛋白质等杂质后，加入异丙醇获得的
沉淀为CTAB与核酸复合物，用
体积分数为75%的乙醇洗涤可去
除CTAB，具体流程如图。请回
答下列问题：
(1)氯仿—异戊醇的密度大于水，能使蛋白质变性沉淀，与水和DNA均不相溶，且对DNA影响极小。过程②中加入氯仿—异戊醇离心后，DNA主要存在于A中，则A为________(填“上清液”或“沉淀物”)。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
上清液
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
氯仿—异戊醇密度大于水，能使蛋白质变性沉淀，与水和DNA均不相溶，这说明过程②中加入氯仿—异戊醇离心后，DNA主要存在于上清液中。
(2)过程④用体积分数为75%的乙醇洗涤后的沉淀物中含有RNA，为得到较为纯净的DNA，可先用一定浓度的_______溶液溶解沉淀物，然后加入______酶，再重复步骤_____(填图中序号)，最后在上清液中加入冷却的、体积分数为________________，得到较纯净的DNA。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
NaCl
RNA
②
95%的乙醇溶液
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
去除沉淀物中的RNA需要使用RNA酶，故可先用一定浓度的NaCl溶液溶解沉淀物，然后加入RNA酶，再重复步骤②，最后在上清液中加入冷却的、体积分数为95%的乙醇溶液，得到较纯净的DNA。
14.科研人员利用大肠杆菌构建了抗虫基因文库。
最新研究发现漏斗蜘蛛中的AH基因控制合成的
毒素肽具有显著的杀虫效果，现以p—B质粒为
载体，构建AH基因的cDNA文库。图1表示p—B
质粒，其中Cmlr表示氯霉素抗性基因，ccdB基因表达产物能抑制大肠杆菌DNA的复制。图中箭头表示相关限制酶的酶切位点，且不同种限制酶识别序列不同，其中AiuⅠ、XbaⅠ、SspⅠ和MfeⅠ识别的碱基序列和酶切位点分别是－AG↓CT－、－T↓CTAGA－、－AAT↓ATT－、－C↓AATTG－。请分析并回答下列问题：
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
(1)为获得AH基因的cDNA，先要从漏斗蜘蛛毒素肽分泌细胞中提取_______，再通过_______合成出AH基因的cDNA。若从漏斗蜘蛛其他组织细胞提取，则难以成功，原因是_________________________________
_________________________。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
mRNA
逆转录
AH基因在其他组织细胞中不表达，提取不到AH基因的mRNA
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
AH基因的cDNA可以通过逆转录获得，因此需要先从漏斗蜘蛛毒素肽分泌细胞中提取mRNA，再逆转录合成AH基因的cDNA。由于AH基因在其他组织细胞中是不表达的，因此若从漏斗蜘蛛其他组织细胞提取，则难以成功。
(2)若已知AH基因的cDNA两端部分序列为5′－AACTATGCGC……
CGTAGCCTCT－3′，请写出PCR扩增该cDNA时的两个引物对应的局部序列(前10个碱基序列)，并标明5′端和3′端：______________________、________________________。一个初始双链cDNA经四轮循环后，共消耗这两种引物的数量为_____个。
5′－AACTATGCGC－3′
5′－AGAGGCTACG－3′
30
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
根据题意分析，已知AH基因的cDNA两端部分序列为5′－AACTATGCGC……CGTAGCCTCT－3′，引物只能引导子链从5′端向3′端延伸，且与目的基因(双链)两侧的碱基序列是互补的，因此两个引物对应的局部序列(前10个碱基序列)为5′－AACTATGCGC－3′、5′－AGAGGCTACG－3′。PCR技术的原理是DNA的半保留复制，则一个初始
双链cDNA经四轮循环后，共消耗这两种引物的数量为2n＋1－2＝25－2＝30(个)。
(3)利用图中的质粒和AH基因构建重组质粒时，宜选用限制酶__________
_______双酶切割质粒，再选用限制酶______________切割目的基因，将切割后获得的DNA片段混合，经____________处理后，再与大肠杆菌混合培养。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
AiuⅠ和
MfeⅠ
SspⅠ和MfeⅠ
DNA连接酶
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
根据图示分析可知，若用XbaⅠ切割会破坏复制原点；由于ccdB基因表达产物能抑制大肠杆菌DNA的复制，因此构建基因表达载体时，应该破坏该基因，即需要用MfeⅠ切割；若用SphⅠ和MfeⅠ切割会导致启动子丢失，若用MfeⅠ和SacⅠ切割，则不能获取目的基因。综上，利用图中的质粒和AH基因构建重组质粒时，切割质粒的酶应该是AiuⅠ(产生平末
端)和MfeⅠ，切割目的基因的酶应该是SspⅠ(产生平末端)和MfeⅠ。第4课时　将目的基因导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测鉴定
[学习目标]　1.阐明将目的基因导入受体细胞的方法。2.阐明目的基因及其表达产物的检测鉴定的方法。
一、将目的基因导入受体细胞
1．将目的基因导入植物细胞
(1)主要方法：___________________________________________________________。
(2)农杆菌
①感染对象：能在自然条件下感染________植物或裸子植物，但不会感染大多数单子叶植物。
②感染原因：当双子叶植物或裸子植物受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量的______化合物，吸引农杆菌向伤口处移动。
③特点：农杆菌含有Ti质粒，上面有一段__________(T－DNA)，能进入受体细胞，并整合到受体细胞__________的DNA上。
(3)农杆菌转化法的原理：将目的基因插到农杆菌Ti质粒的______特定区段上，再通过T－DNA将其插入植物细胞__________上，使目的基因得到稳定的____________。
2．将目的基因导入哺乳动物细胞
(1)方法
①主要方法：____________。
②其他方法：用__________与目的基因构建载体，再去感染受体动物细胞，使目的基因导入动物细胞内。
(2)转基因动物的制备过程
使母畜在预先确定的时间排卵并______
↓
收集____________
↓
在显微镜下用口径为1 μm的玻璃微管向受精卵注射含500～600个拷贝的__________的载体
↓
把这些受精卵移植到处于
____________的母畜子宫内
↓
转基因动物
3．将目的基因导入微生物细胞
(1)感受态细胞：经过适当处理(如用______处理)后，细胞质膜对DNA的________会发生改变，细胞变得______接受外来的DNA，处于这种状态的细胞称为________细胞。
(2)过程：Ca2＋处理细胞―→________细胞―→感受态细胞和重组的______________混合转化后的细胞带有目的基因的微生物。
判断正误
(1)为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵作为受体细胞(　　)
(2)将目的基因导入动物细胞的方法主要是显微注射法(　　)
(3)微生物细胞经Ca2＋处理，其细胞质膜对DNA的通透性发生改变(　　)
任务一：目的基因导入受体细胞方法的分析
如图为利用农杆菌转化法制备转基因植物的过程图，据图回答下列问题：
(1)重组Ti质粒的构建需要哪些酶的作用？
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
(2)在利用农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞的过程中，一定要将目的基因插到Ti质粒的T－DNA上的原因是什么？
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
(3)构建的表达载体是直接导入植物细胞吗？
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
(4)在制备转基因动物的过程中常用受精卵作为受体细胞的原因是什么？
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
(5)若制备转基因动物过程中用体细胞作受体细胞，如何得到转基因个体？
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
　农杆菌转化法中两次拼接、两次导入的辨析
(1)两次拼接：第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T－DNA上；第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基因的T－DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上。
(2)两次导入：第一次导入是将含目的基因的重组Ti质粒导入农杆菌；第二次导入(非人工操作)是将含目的基因的T－DNA导入受体细胞。
1．Ti质粒是根癌农杆菌拟核外的遗传物质，常作为植物基因工程的载体。下列关于Ti质粒的叙述，正确的是(　　)
A．Ti质粒中每个脱氧核糖均与2个磷酸基团和1个碱基相连
B．Ti质粒是能够自主复制的单链DNA
C．用Ca2＋处理植物细胞有利于重组Ti质粒的导入
D．Ti质粒可随机整合到农杆菌的拟核DNA上
2．(多选)下列关于将目的基因导入受体细胞的说法中，正确的是(　　)
A．农杆菌在自然条件下不侵染单子叶植物的原因是单子叶植物产生的酚类化合物有刺激性
B．将目的基因导入动物细胞采用最多的方法是显微注射法
C．为使大肠杆菌易吸收DNA分子，应先用一定浓度的CaCl2溶液进行处理
D．在显微注射法中，不需要先构建基因表达载体
二、目的基因及其表达产物的检测鉴定
1．检测与鉴定的原因：基因导入受体细胞后，能否有效地____________目的基因并产生相应的性状，需要进一步做筛选和鉴定。
2．分子水平的检测
(1)从DNA方面进行检测
①检测方法：DNA分子杂交法。
②检测原理：具有一定__________的两条DNA单链，在一定条件下(适宜的温度等)可以按照____________原则形成双链。
③基因探针：用放射性__________或______标记的已知DNA片段。
④结果分析：若待测DNA中有能与基因探针______的特异性DNA片段，用于______的放射性同位素标记或荧光标记会指示出其所在的______，表明目的基因已经插入转基因生物的______分子中。
⑤检测过程
(2)从RNA方面进行检测
①检测目的：检测目的基因是否能发挥其______，即是否__________出相应的mRNA分子。
②检测方法：____________。
③检测过程：从待测转基因生物细胞中提取______分子，用已标记的__________片段作为探针与mRNA杂交，如果有______出现，表明目的基因转录出相应的mRNA分子。
(3)从蛋白质方面进行检测
①检测方法：______________法。
②检测过程：从待测转基因生物中提取蛋白质，再用相应的抗体进行__________杂交。
③结果分析：如果有______出现，说明目的基因已经表达出相应的蛋白质。
3．个体水平的检测
(1)检测目的：对生物的某些____________进行鉴定。
(2)实例：对于导入某种鱼的抗冻蛋白基因的转基因番茄进行个体检测，需要栽培转基因番茄获得果实后，再与__________比较，确定其是否具有了抗冻性状。
判断正误
(1)基因探针是用放射性同位素或荧光标记的DNA单链(　　)
(2)检测目的基因是否成功表达可用DNA分子杂交法(　　)
(3)抗原—抗体杂交遵循碱基互补配对原则(　　)
(4)基因工程是否成功需从个体生物学水平对生物的性状进行鉴定(　　)
(5)通过基因工程产生的变异属于基因重组，是不定向的(　　)
任务二：目的基因的检测与鉴定方法的探讨
根据图示回答相关问题。
(1)从图示过程分析，检测结果能说明什么？
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
(2)分析①过程如何操作？
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
(3)②过程是用什么方法？
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
(4)③④过程是如何达到目的的？
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
　常见转基因生物在个体水平上鉴定、检测的方法
转基因生物 检测方法 观察目标
抗虫植物 饲喂害虫 害虫死亡
抗病毒(菌)植物 病毒(菌)感染 未侵染上病斑
抗盐植物 盐水浇灌 正常生长
抗除草剂植物 喷洒除草剂 正常生长
3．利用外源基因在受体细胞中表达，可生产人类所需的产品。下列选项中能说明目的基因在导入受体细胞后完成表达的是(　　)
A．棉花细胞中检测到载体上的标记基因
B．山羊乳腺细胞中检测到人生长激素基因
C．大肠杆菌中检测到人胰岛素基因的mRNA
D．酵母菌细胞中提取到人的干扰素
4．(多选)(2024·徐州高二月考)如图为某科研人员利用DNA分子探针鉴定50 mL菌液样品中是否含有某特定DNA的细菌的示意图。下列叙述错误的是(　　)
A．培养皿中菌落数就是样品中含有的实际活菌数目
B．重组质粒与探针进行分子杂交的原理是碱基互补配对原则
C．外源DNA必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行复制
D．放射自显影结果可以显示原培养皿中含有特定DNA的细菌菌落位置
答案精析
一、
梳理教材新知
1．(1)农杆菌转化法　(2)①双子叶　②酚类　③转移DNA　染色体　(3)T－DNA　染色体的DNA　遗传和表达　
2．(1)①显微注射法　②病毒DNA　(2)受精　受精卵　目的基因　相同发情周期　
3．(1)Ca2＋　通透性　容易　感受态　(2)感受态　基因表达载体　
判断正误
(1)×　(2)√　(3)√
提示　(1)为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时常以体细胞作为受体细胞。
探究核心知识
(1)限制酶、DNA连接酶。
(2)农杆菌中的Ti质粒上的T－DNA(可转移的DNA)可转移至被侵染的细胞，并且整合到该细胞染色体的DNA上。
(3)不是，实际上构建的基因表达载体是先导入农杆菌中，然后用农杆菌去侵染植物细胞。
(4)因为受精卵具有全能性。
(5)可利用核移植技术。
落实思维方法
1．A　[Ti质粒是双链环状DNA分子，每个脱氧核糖均与2个磷酸基团和1个碱基相连，A正确；用Ca2＋处理农杆菌有利于重组Ti质粒的导入，C错误；Ti质粒的T－DNA片段可随机整合到受体细胞染色体的DNA上，D错误。]
2．BC
二、
梳理教材新知
1．表达　
2．(1)②同源性　碱基互补配对　③同位素　荧光　④互补　示踪　位置　DNA　⑤放射性　荧光　(2)①功能　转录　②分子杂交技术　③mRNA　目的基因　杂交带　(3)①抗原—抗体杂交　②抗原—抗体　③杂交带　
3．(1)特定性状　(2)天然产品　
判断正误
(1)√　(2)×　(3)×　(4)√　(5)×
提示　(2)检测目的基因是否成功表达需用和抗原—抗体杂交法。(3)抗原—抗体杂交的原理是抗原和抗体的特异性结合，不出现碱基互补配对。(5)通过基因工程产生的变异属于基因重组，是定向的。
探究核心知识
(1)杂交带的出现说明目的基因已插入受体细胞的DNA分子上。
(2)使用相关限制酶切割。
(3)琼脂糖凝胶电泳法。
(4)③④过程是检测过程。通过③过程可以把双链DNA片段解链成单链DNA片段，④过程加入用放射性物质标记的DNA探针进行检测，如果在待测的DNA片段中有目的基因的序列，则会与探针进行碱基互补配对，形成杂交带，从而证明目的基因已成功导入受体细胞。
落实思维方法
3．D　[A、B两项只能说明目的基因已导入受体细胞中；C项说明目的基因在受体细胞中转录出了mRNA；D项含有人的干扰素基因的酵母菌合成了人的干扰素，说明目的基因完成了表达。]
4．AC　[根据培养皿中菌落数只能估算样品中含有的活菌数目，A错误；外源DNA必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能转录，而复制需要有复制原点，C错误；放射自显影结果可以显示原培养皿中含有特定DNA的细菌菌落位置，因为菌落附着在膜上的位置是固定的，放射自显影后可以一一对应起来，D正确。](共79张PPT)
第4课时
第三章 基因工程
<<<
将目的基因导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测鉴定
学习目标
1.阐明将目的基因导入受体细胞的方法。
2.阐明目的基因及其表达产物的检测鉴定的方法。
内容索引
一、将目的基因导入受体细胞
二、目的基因及其表达产物的检测鉴定
课时对点练
将目的基因导入受体细胞
一
梳理　教材新知
1.将目的基因导入植物细胞
(1)主要方法： 。
(2)农杆菌
①感染对象：能在自然条件下感染 植物或裸子植物，但不会感染大多数单子叶植物。
②感染原因：当双子叶植物或裸子植物受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量的 化合物，吸引农杆菌向伤口处移动。
③特点：农杆菌含有Ti质粒，上面有一段 (T－DNA)，能进入受体细胞，并整合到受体细胞 的DNA上。
农杆菌转化法
双子叶
酚类
转移DNA
染色体
(3)农杆菌转化法的原理：将目的基因插到农杆菌Ti质粒的 特定区段上，再通过T－DNA将其插入植物细胞 上，使目的基因得到稳定的 。
2.将目的基因导入哺乳动物细胞
(1)方法
①主要方法： 。
②其他方法：用 与目的基因构建载体，再去感染受体动物细胞，使目的基因导入动物细胞内。
T－DNA
染色体的DNA
遗传和表达
显微注射法
病毒DNA
(2)转基因动物的制备过程
使母畜在预先确定的时间排卵并_____
↓
收集_______
↓
在显微镜下用口径为1 μm的玻璃微管向受精卵注射含500～600个拷贝的_________的载体
↓
把这些受精卵移植到处于______________的母畜子宫内
↓
转基因动物
受精
受精卵
目的基因
相同发情周期
3.将目的基因导入微生物细胞
(1)感受态细胞：经过适当处理(如用 处理)后，细胞质膜对DNA的
会发生改变，细胞变得 接受外来的DNA，处于这种状态的细胞称为 细胞。
(2)过程：Ca2＋处理细胞―→ 细胞―→感受态细胞和重组的______
混合 转化后的细胞 带有目的基因的微生物。
Ca2＋
通透性
容易
感受态
感受态
基因表
达载体
(1)为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵作为受体细胞(　　)
提示　为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时常以体细胞作为受体细胞。
×
(2)将目的基因导入动物细胞的方法主要是显微注射法(　　)
(3)微生物细胞经Ca2＋处理，其细胞质膜对DNA的通透性发生改变
(　　)
√
√
任务一：目的基因导入受体细胞方法的分析
如图为利用农杆菌转化法制备转基因植物的过程图，据图回答下列问题：
(1)重组Ti质粒的构建需要哪些酶的作用？
探究　核心知识
提示　限制酶、DNA连接酶。
(2)在利用农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞的过程中，一定要将目的基因插到Ti质粒的T－DNA上的原因是什么？
提示　农杆菌中的Ti质粒上的T－DNA(可转移的DNA)可转移至被侵染的细胞，并且整合到该细胞染色体的DNA上。
(3)构建的表达载体是直接导入植物细胞吗？
提示　不是，实际上构建的基因表达载体是先导入农杆菌中，然后用农杆菌去侵染植物细胞。
提示　因为受精卵具有全能性。
(4)在制备转基因动物的过程中常用受精卵作为受体细胞的原因是什么？
提示　可利用核移植技术。
(5)若制备转基因动物过程中用体细胞作受体细胞，如何得到转基因个体？
核心归纳
(1)两次拼接：第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T－DNA上；第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基因的T－DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上。
(2)两次导入：第一次导入是将含目的基因的重组Ti质粒导入农杆菌；第二次导入(非人工操作)是将含目的基因的T－DNA导入受体细胞。
农杆菌转化法中两次拼接、两次导入的辨析
1.Ti质粒是根癌农杆菌拟核外的遗传物质，常作为植物基因工程的载体。下列关于Ti质粒的叙述，正确的是
A.Ti质粒中每个脱氧核糖均与2个磷酸基团和1个碱基相连
B.Ti质粒是能够自主复制的单链DNA
C.用Ca2＋处理植物细胞有利于重组Ti质粒的导入
D.Ti质粒可随机整合到农杆菌的拟核DNA上
落实　思维方法
√
Ti质粒是双链环状DNA分子，每个脱氧核糖均与2个磷酸基团和1个碱基相连，A正确；
用Ca2＋处理农杆菌有利于重组Ti质粒的导入，C错误；
Ti质粒的T－DNA片段可随机整合到受体细胞染色体的DNA上，D错误。
2.(多选)下列关于将目的基因导入受体细胞的说法中，正确的是
A.农杆菌在自然条件下不侵染单子叶植物的原因是单子叶植物产生的酚
类化合物有刺激性
B.将目的基因导入动物细胞采用最多的方法是显微注射法
C.为使大肠杆菌易吸收DNA分子，应先用一定浓度的CaCl2溶液进行处理
D.在显微注射法中，不需要先构建基因表达载体
√
√
目的基因及其表达产物的检测鉴定
二
1.检测与鉴定的原因：基因导入受体细胞后，能否有效地 目的基因并产生相应的性状，需要进一步做筛选和鉴定。
2.分子水平的检测
(1)从DNA方面进行检测
①检测方法：DNA分子杂交法。
②检测原理：具有一定 的两条DNA单链，在一定条件下(适宜的温度等)可以按照 原则形成双链。
③基因探针：用放射性 或 标记的已知DNA片段。
梳理　教材新知
表达
同源性
碱基互补配对
同位素
荧光
④结果分析：若待测DNA中有能与基因探针 的特异性DNA片段，用于 的放射性同位素标记或荧光标记会指示出其所在的 ，表明目的基因已经插入转基因生物的 分子中。
⑤检测过程
互补
示踪
位置
DNA
(2)从RNA方面进行检测
①检测目的：检测目的基因是否能发挥其 ，即是否 出相应的mRNA分子。
②检测方法： 。
③检测过程：从待测转基因生物细胞中提取 分子，用已标记的
片段作为探针与mRNA杂交，如果有 出现，表明目的基因转录出相应的mRNA分子。
(3)从蛋白质方面进行检测
①检测方法： 法。
功能
转录
分子杂交技术
mRNA
目的基因
杂交带
抗原—抗体杂交
②检测过程：从待测转基因生物中提取蛋白质，再用相应的抗体进行
杂交。
③结果分析：如果有 出现，说明目的基因已经表达出相应的蛋白质。
3.个体水平的检测
(1)检测目的：对生物的某些 进行鉴定。
(2)实例：对于导入某种鱼的抗冻蛋白基因的转基因番茄进行个体检测，需要栽培转基因番茄获得果实后，再与 比较，确定其是否具有了抗冻性状。
抗原—抗体
杂交带
特定性状
天然产品
(1)基因探针是用放射性同位素或荧光标记的DNA单链(　　)
(2)检测目的基因是否成功表达可用DNA分子杂交法(　　)
提示　检测目的基因是否成功表达需用和抗原—抗体杂交法。
√
(3)抗原—抗体杂交遵循碱基互补配对原则(　　)
×
提示　抗原—抗体杂交的原理是抗原和抗体的特异性结合，不出现碱基互补配对。
×
(4)基因工程是否成功需从个体生物学水平对生物的性状进行鉴定
(　　)
(5)通过基因工程产生的变异属于基因重组，是不定向的(　　)
√
×
提示　通过基因工程产生的变异属于基因重组，是定向的。
任务二：目的基因的检测与鉴定方法的探讨
根据图示回答相关问题。
(1)从图示过程分析，检测结果能说明什么？
探究　核心知识
提示　杂交带的出现说明目的基因已插入受体细胞的DNA分子上。
(2)分析①过程如何操作？
提示　使用相关限制酶切割。
(3)②过程是用什么方法？
提示　琼脂糖凝胶电泳法。
(4)③④过程是如何达到目的的？
提示　③④过程是检测过程。通过③过程
可以把双链DNA片段解链成单链DNA片
段，④过程加入用放射性物质标记的DNA探针进行检测，如果在待测的DNA片段中有目的基因的序列，则会与探针进行碱基互补配对，形成杂交带，从而证明目的基因已成功导入受体细胞。
常见转基因生物在个体水平上鉴定、检测的方法
核心归纳
转基因生物 检测方法 观察目标
抗虫植物 饲喂害虫 害虫死亡
抗病毒(菌)植物 病毒(菌)感染 未侵染上病斑
抗盐植物 盐水浇灌 正常生长
抗除草剂植物 喷洒除草剂 正常生长
3.利用外源基因在受体细胞中表达，可生产人类所需的产品。下列选项中能说明目的基因在导入受体细胞后完成表达的是
A.棉花细胞中检测到载体上的标记基因
B.山羊乳腺细胞中检测到人生长激素基因
C.大肠杆菌中检测到人胰岛素基因的mRNA
D.酵母菌细胞中提取到人的干扰素
√
落实　思维方法
A、B两项只能说明目的基因已导入受体细胞中；
C项说明目的基因在受体细胞中转录出了mRNA；
D项含有人的干扰素基因的酵母菌合成了人的干扰素，说明目的基因完成了表达。
4.(多选)(2024·徐州高二月考)如图为某科研人员利用DNA分子探针鉴定50 mL菌液样品中是否含有某特定DNA的细菌的示意图。下列叙述错误的是
A.培养皿中菌落数就是样品中含有的
实际活菌数目
B.重组质粒与探针进行分子杂交的原
理是碱基互补配对原则
C.外源DNA必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行复制
D.放射自显影结果可以显示原培养皿中含有特定DNA的细菌菌落位置
√
√
根据培养皿中菌落数只能估算样品
中含有的活菌数目，A错误；
外源DNA必须位于重组质粒的启动
子和终止子之间才能转录，而复制
需要有复制原点，C错误；
放射自显影结果可以显示原培养皿中含有特定DNA的细菌菌落位置，因为菌落附着在膜上的位置是固定的，放射自显影后可以一一对应起来，D正确。
网络构建
课时对点练
三
题组一　将目的基因导入受体细胞
1.利用农杆菌转化法将目的基因转入受体细胞后，目的基因插入的位置是
A.Ti质粒上
B.受体细胞染色体的DNA上
C.T－DNA上
D.农杆菌的拟核
√
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
将目的基因导入植物细胞的方法主要是农杆菌转化法，农杆菌转化法就是将目的基因插到农杆菌Ti质粒的T－DNA特定区段上，再通过T－DNA将其插入植物细胞染色体的DNA上，使目的基因得到稳定的遗传和表达，故选B。
15
2.下列关于目的基因导入受体细胞的叙述，不正确的是
A.将目的基因导入植物细胞时，农杆菌转化法适用于大多数单子叶植物
B.显微注射法是转基因动物中采用最多的方法
C.大肠杆菌最常用的转化方法是使细胞的生理状态发生改变
D.农杆菌转化法是将目的基因导入植物细胞最常用的方法
√
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
将目的基因导入植物细胞常用的方法是农杆菌转化法，该方法适用于双子叶植物和裸子植物，大多数单子叶植物不适用，A错误，D正确；
大肠杆菌最常用的转化方法是用一定浓度的CaCl2溶液处理细胞，使细胞的生理状态发生改变，C正确。
15
3.科学家通过改变一种名为NR2B的基因研制出了转基因超级小鼠J，与普通老鼠相比，转基因超级小鼠更加聪明，大脑运转更加迅速，它能够轻松完成迷宫任务。下列关于转基因超级小鼠J产生过程的描述，错误的是
A.NR2B基因可通过PCR技术进行扩增
B.改变后的NR2B基因作为目的基因，可直接注入小鼠受精卵内
C.通常采用显微注射法将改变后的NR2B基因重组质粒导入小鼠受精卵内
D.可采用基因探针检测改变后的NR2B基因是否导入小鼠体内
√
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
PCR技术可在体外大量扩增目的基因，A正确；
改变后的NR2B基因作为目的基因，需要与载体结合后才可导入小鼠受精卵内，B错误；
将目的基因导入动物细胞常采用显微注射法，C正确。
15
4.科研人员以抗四环素基因为标记基因，通过基因工程的方法让大肠杆菌生产鼠的β-珠蛋白，治疗鼠的镰状细胞贫血。下列相关叙述中，正确的是
A.基因表达载体中的启动子是DNA聚合酶识别和结合的位点
B.利用小鼠的成熟红细胞提取mRNA可获得β-珠蛋白基因的编码序列
C.常用Ca2＋处理大肠杆菌使其成为易于吸收DNA的感受态细胞
D.用含有四环素的培养基筛选出的大肠杆菌一定含有β-珠蛋白基因
√
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
基因表达载体中的启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，可用于驱动基因的转录，A错误；
哺乳动物的成熟红细胞中没有细胞核和核糖体等结构，所以不能利用小鼠的成熟红细胞提取mRNA，B错误；
标记基因的作用是初步筛选含有目的基因的受体细胞，用含有四环素的培养基筛选出的大肠杆菌导入的可能是普通质粒或重组质粒，不一定含有β-珠蛋白基因，D错误。
15
5.天然蓝色花产生的主要原因是花瓣细胞液泡中的花青素在碱性条件下显蓝色。我国科学家利用链霉菌的靛蓝合成酶基因(idgS)及其激活基因(sfp)构建基因表达载体(如图)，通过农杆菌转化法导入白玫瑰中，在细胞质基质中形成稳定显色的靛蓝。下列相关叙述错误的是
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
A.将idgS基因插入Ti质粒时使用的限制酶是SpeⅠ和SacⅠ
B.sfp和idgS基因具有各自的启动子，前者调控后者的表达
C.sfp和idgS基因表达时以DNA的同一条链为模板进行转录
D.农杆菌可将Ti质粒上的T－DNA整合到白玫瑰染色体的DNA上
√
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
分析题图可知，idgS基因插入Ti质粒
的位置在限制酶SpeⅠ和SacⅠ的识别
序列之间，因此需要用限制酶SpeⅠ
和SacⅠ对目的基因即idgS基因和Ti
质粒进行酶切，A正确；
sfp基因的启动子是启动子1，idgS基因的启动子是启动子2，sfp基因是idgS基因的激活基因，因此前者调控后者的表达，B正确；
15
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
sfp基因启动子在其右侧，终止子在
其左侧，因此该基因转录是自右向
左进行；idgS基因启动子在其左侧，
终止子在其右侧，因此该基因转录
是自左向右进行，由于转录时生成
RNA的方向只能是5′→3′，因此可推知这两种基因必定不是以DNA的同一条链为模板进行转录的，C错误；
15
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
由于农杆菌侵染植物细胞时，可将
其Ti质粒上的T－DNA整合到宿主
细胞的染色体DNA上，因此可以将
目的基因插入T－DNA中，然后即
可整合到白玫瑰染色体的DNA上，
D正确。
15
题组二　目的基因及其表达产物的检测鉴定
6.要检测受体DNA中是否成功插入了目的基因，需要用基因探针，这里的基因探针是指
A.用于检测疾病的医疗器械
B.带标记的含目的基因的DNA片段
C.带标记的蛋白质分子
D.人工合成的免疫球蛋白
√
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
含有目的基因的DNA片段用放射性同位素或荧光等作标记后可以作为基因探针。
15
7.将鱼的抗冻蛋白基因导入番茄，有效地提高了番茄的耐寒能力。能最终鉴定转基因番茄培育是否成功的方法是
A.在试验田中观察番茄的耐寒能力
B.检测番茄的体细胞中是否存在鱼的抗冻蛋白
C.检测鱼的抗冻蛋白基因是否转录出了mRNA
D.检测番茄体细胞中是否有鱼的抗冻蛋白基因
√
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
在试验田中观察番茄的耐寒能力是在个体水平上的鉴定，也是最终鉴定转基因番茄培育是否成功的方法，A符合题意；
检测番茄的体细胞中是否存在鱼的抗冻蛋白，是检测目的基因是否翻译，B不符合题意；
检测鱼的抗冻蛋白基因是否转录出了mRNA，是检测目的基因是否转录，C不符合题意；
检测番茄体细胞中是否有鱼的抗冻蛋白基因，是检测目的基因是否导入受体细胞，D不符合题意。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
8.为增强玉米植株的抗旱性，研究者构建含有某微生物抗旱基因E的重组质粒，用农杆菌转化法转入玉米幼胚组织细胞中，获得抗旱的转基因玉米。下列相关叙述不正确的是
A.可通过分子杂交技术检测目的基因是否转录出mRNA
B.将重组质粒置于经CaCl2溶液处理的农杆菌悬液中，可以获得转化的农
杆菌
C.用农杆菌转化法将E基因转入玉米幼胚组织细胞需要严格进行无菌操作
D.用E蛋白的抗体进行抗原—抗体杂交，可在个体水平检测转基因玉米
的抗旱性状
√
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
用E蛋白的抗体进行抗原—抗体杂交，属于分子水平的检测，D错误。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
9.为了增加菊花花色类型，研究者从其他植物中克隆出花色基因C(图1)，拟将其与质粒(图2)重组，再借助农杆菌导入菊花中。下列操作与实验目的不符的是
A.用限制酶EcoRⅠ和DNA连接酶构建重
组质粒
B.用含C基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织，
将C基因导入细胞
C.在培养基中添加卡那霉素，筛选被转化的菊花细胞
D.用DNA分子杂交方法检测C基因是否整合到菊花染色体上
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
√
15
根据目的基因两侧的限制酶切割位点
可知，用限制酶EcoRⅠ和DNA连接酶
构建重组质粒，A正确；
将目的基因导入植物细胞常用农杆菌
转化法，即用含C基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织，将C基因导入细胞，B正确；
图2中显示标记基因是潮霉素抗性基因，因此可在培养基中添加潮霉素来筛选被转化的菊花细胞，C错误。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
10.(2024·南通高二质检)人体内的t－PA蛋白能高效降解由纤维蛋白凝聚而成的血栓，是急性心肌梗死和脑血栓的急救药，改造后的t－PA蛋白能显著降低出血副作用。如图表示构建含t－PA改良基因重组质粒的过程示意图。下列相关说法错误的是
A.构建重组质粒时，选用的限制酶是XmaⅠ和BglⅡ
B.需要DNA聚合酶将t－PA改良基因与质粒连接
C.新霉素抗性基因的作用是便于将导入质粒的大肠
杆菌筛选出来
D.在加入新霉素的培养基中选择呈白色的菌落选育工程菌株
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
√
15
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
根据图中目的基因两端的黏性末端以及各
种限制酶的切割位点可知，在构建重组质
粒时，选用限制酶XmaⅠ和BglⅡ切割质粒，
才能与目的基因t－PA改良基因高效连接，
A正确；
将t－PA改良基因与质粒连接的酶是DNA连接酶，不是DNA聚合酶，B错误；
15
在构建重组质粒时，其中的新霉素抗性基
因没有被破坏，因此可以根据对新霉素的
抗性将成功导入质粒的大肠杆菌筛选出来，
即该基因的作用是便于将成功导入质粒的
大肠杆菌筛选出来，C正确；
重组质粒已经破坏了mlacZ基因，其不会表达产物，即细胞呈白色，所以，在加入新霉素的培养基中选择呈白色的菌落选育工程菌株，D正确。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
11.(多选)利用基因工程技术生产羧酸酯酶(CarE)制剂的流程如图所示，下列有关叙述正确的是
A.过程①需使用逆转录酶
B.过程②利用PCR技术扩增CarE基因需使用解旋酶和热稳定的DNA聚合酶
C.过程③可用NaCl溶液处理大肠杆菌，使之成为感受态细胞
D.过程④可利用DNA分子杂交技术鉴定目的基因是否已导入受体细胞
√
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
√
15
过程②表示目的基因的获取，利用PCR技术对目的基因进行扩增的过程中，不需要使用解旋酶，解旋是通过高温解链实现的，B错误；
过程③表示将重组表达载体(目的基因)导入受体细胞，若受体细胞为大肠杆菌细胞，则需要用一定浓度的CaCl2溶液处理，使之成为感受态细胞，C错误。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
12.(多选)研究者从某微生物中提取出抗旱基因，将其与载体DNA重组，再导入玉米中增加玉米的抗旱性，如图表示该转基因玉米的培育过程，其中字母a、b表示具体的结构，数字①～④表示具体的过程。下列叙述错误的是
A.从微生物细胞中获取的基因需要加工后才能作为目的基因导入玉米细胞中
B.基因表达载体构建的过程需要DNA聚合酶、DNA连接酶、限制酶
C.图中b是愈伤组织，③与④过程中所需植物激素的含量、比例相同
D.用抗原—抗体杂交的方法检测没有杂交带出现，说明目的基因导入不成功
√
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
√
√
15
基因表达载体构建的过程需要DNA连接酶、限制酶，不需要DNA聚合酶，B错误；
③④分别表示脱分化、再分化过程，这两个过程中都需要生长素和细胞分裂素，但二者的含量、比例不相同，C错误；
用抗原—抗体杂交的方法检测没有出现杂交带，只能说明目的基因没有表达，但不能说明目的基因导入不成功，D错误。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
13.(多选)(2024·盐城高二月考)盐害是全球水稻减产的重要原因之一，专家通过农杆菌中的质粒将CMO基因、BADH基因、mtld基因、gutD基因和SAMDC基因5个耐盐基因导入水稻，获得了一批耐盐转基因植株。有关耐盐转基因水稻培育的分析，正确的是
A.该转基因水稻与原野生型水稻不存在生殖隔离
B.该基因工程所需的限制性内切核酸酶可能有多种
C.只要目的基因进入水稻细胞，水稻就会表现出抗盐性状
D.可通过将水稻种植到有农杆菌的土壤中观察目的基因是否表达
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
√
√
15
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
转基因属于基因重组，未产生新物种，该转基因水稻与原野生型水稻不存在生殖隔离，A正确；
不同的目的基因可能需要不同的限制酶进行切割，因此该基因工程所需的限制性内切核酸酶可能有多种，B正确；
目的基因进入水稻细胞后，还要检测目的基因是否表达，如果不表达，水稻不会表现出抗盐性状，C错误；
可通过将水稻种植到盐碱地观察水稻是否表现出抗盐性状，D错误。
15
14.(2024·苏州高二检测)人的血清蛋白(HSA)具有重要的医用价值，研究人员欲用转基因牛来大量生产HSA。如图1为HSA基因片段和人工构建的大肠杆菌质粒pBR322，图中Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Neor表示新霉素抗性基因，箭头表示切割形成末端完全不同的4种限制酶的切割位点。请据图回答问题：
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
(1)人工构建pBR322质粒除了含特定限制酶切割位点、标记基因、复制原点外，还必须有________________(答出两点)等。
(2)若选用牛作为受体动物，可用________作为受体细胞，通过_________
方法将目的基因导入受体细胞中。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
启动子、终止子
受精卵
显微注射
15
(3)据图分析，在构建基因表达载体时，选择________________作为切割质粒和目的基因的限制酶可提高目的基因和载体的正确连接效率，原因是_____________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________________________。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
EcoRⅠ和PstⅠ
这两种酶能切割质粒和目的基因，能得到不同的黏性末端，避免质粒和目的基因自连及反接(或这两种酶切割DNA形成不同的黏性末端，可避免质粒和目的基因的自身环化和反向连接)
15
据图1可知，用BamHⅠ切割会破
坏目的基因，用TthⅢ1切割会破
坏质粒中的复制原点，而EcoRⅠ
和PstⅠ这两种酶能切割质粒和目
的基因，不破坏目的基因和复制原点等，且能得到不同的黏性末端，避免质粒和目的基因自连及反接，因此在构建基因表达载体时，选择EcoRⅠ和PstⅠ作为切割质粒和目的基因的限制酶可提高目的基因和载体的正确连接效率。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
(4)为了排除普通受体细胞(未导入质粒)、空质粒受体细胞(导入pBR322质粒而非重组质粒)的干扰，目的基因导入后，进行了进一步筛选：制备甲、乙两种培养基，甲培养基含新霉素，乙培养基含新霉素和氨苄青霉素，含重组质粒的受体细胞在甲培养基上_____(填“能”或“不能”)生存，在乙培养基上______(填“能”或“不能”)生存。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
能
不能
15
分析图1可知，PstⅠ破坏了氨苄青霉素抗性基因(Ampr)，构建的重组质粒对氨苄青霉素无抗性，但具有新霉素抗性基因，而甲培养基中含有新霉素，因此，含重组质粒的受体细胞能在甲培养基上生存，不能在乙培养基中生存。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
(5)据图2分析，利用PCR技术获取HSA基因时，应选择甲、乙、丙、丁四种引物中的_________，若扩增4次，共需要引物_____个。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
乙、丙
30
15
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
PCR时，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3′端开始延伸子链，即DNA的合成方向是从子链的5′端向3′端，因此据图2分析，利用PCR技术获取HSA基因时，应选择乙、丙作为引物。若扩增4次，会产生16个DNA(32条链)，其中有2条链是模板链，不需要引物，所以共需要引物30个。
15
15.我国科学家经过长达10年不懈努力，从野生玉米“大刍草”中，成功找回玉米人工驯化过程中丢失的一个控制高蛋白含量的优良基因THP9，将此高蛋白基因克隆出来并转移到玉米细胞内，获得转基因高蛋白玉米新品种。请回答相关问题：
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
EcoRⅠ BamHⅠ KpnⅠ MfeⅠ HindⅢ

15
(1)THP9基因游离的磷酸基团侧为________(填“5′端”或“3′端”)，已知图中THP9基因转录方向为从左往右，则TPH9基因转录时的模板链是_____链。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
5′端
乙
15
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
THP9基因游离的磷酸基团侧为5′端，已知图中THP9基因转录方向为从左往右，RNA聚合酶沿着子链的5′端向3′端延伸，即图中的乙链是模板链。
15
(2)构建基因表达载体时，若科研人员需将THP9基因整合到如图质粒上，应使用限制酶________________切割图中质粒，使用限制酶__________________切割图中含THP9基因的DNA片段，以获得能正确表达THP9基因的重组质粒。这些限制酶一般来源于原核生物，
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
MfeⅠ、HindⅢ
EcoRⅠ、HindⅢ
它们不会切割其本身的DNA分子，原因可能是其DNA分子中不存在该酶的识别序列或_____________________。
识别序列已经被修饰
15
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
图中THP9基因转录方向为从左往右，即启
动子位于左端，终止子位于右端，因为该基
因右侧只有一个酶切位点，故一定用HindⅢ
切割质粒和目的基因，不能用EcoRⅠ切割质
粒(含两个切割位点，切成片段了)，也不能
用BamHⅠ切割质粒(会切断启动子)，那么在HindⅢ的左侧只有MfeⅠ序列，而目的基因不能用该酶切割，与MfeⅠ能形成相同黏性末端的
15
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
是EcoRⅠ，故质粒用MfeⅠ、HindⅢ切割，目的基因用EcoRⅠ、HindⅢ切割。限制酶一般来源于原核生物，其DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰，故不会切割本身的DNA分子。
15
(3)为了筛选出含重组质粒的受体细胞，应在添加____________的选择培养基上培养，培养后获得的菌落不能判定是否含有重组质粒，原因是_________________________________
________________。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
氨苄青霉素
含未重组质粒(或普通质粒)的受体细胞也能正常生长
15
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
为了筛选出含重组质粒的受体细胞，应在添加氨苄青霉素的选择培养基上培养，培养后获得的菌落不能判定是否含有重组质粒，原因是含未重组质粒(或普通质粒)的受体细胞也能正常生长。
15
(4)科研人员常用DNA分子杂交技术检测THP9基因有没有整合到受体细胞的染色体DNA上。检测时常使用_____________________标记的目的基因单链片段作为探针。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
放射性同位素(或荧光)
用DNA分子杂交技术检测THP9基因有没有整合到受体细胞的染色体DNA上，该过程常使用放射性同位素或荧光标记的目的基因单链片段作为探针。
15
(5)为了检测转基因玉米新品种的培育是否成功，科研人员在个体水平上的检测方法是________________________________________________________。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
将转基因玉米田间种植后收获玉米籽粒，检测其蛋白质含量
为了检测转基因技术是否成功，可进行分子水平、个体水平的检测，个体水平上的检测方法是将转基因玉米田间种植后收获玉米籽粒，检测其蛋白质含量。
15第三章 基因工程
作业15　基因工程的发展历程和基因工程的基本工具
(分值：100分)
第1～10题，每题6分；第11～12题，每题7分，共74分。
题组一　基因工程的发展历程和工具酶
1．(2023·南通高二期中)基因工程取得成功，是基础理论和技术发展共同推动的，下列不属于基因工程相关的技术发现的是(　　)
A．限制性内切核酸酶的发现
B．尼伦伯格和马太对遗传密码的破译
C．基因转移载体——质粒的发现
D．DNA分子体外重组的实现
2．科学家们经过多年的努力，创立了一种新兴生物技术——基因工程。实施该工程的最终目的是(　　)
A．定向提取生物体的DNA分子
B．定向地对DNA分子进行人工“剪切”
C．在生物体外对DNA分子进行改造
D．产生人类需要的基因产物
3．DNA连接酶连接的是(　　)
A．脱氧核糖和磷酸 B．脱氧核糖和碱基
C．碱基和磷酸 D．碱基和碱基
4．限制酶是一种核酸切割酶，可辨识并切割DNA分子上特定的脱氧核苷酸序列。如图为四种限制酶BamHⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ以及BglⅡ的识别序列。箭头表示每一种限制酶的特定切割部位，其中哪两种限制酶所切割出来的DNA片段末端可以互补黏合？其正确的末端互补序列是(　　)
A．BamHⅠ和EcoRⅠ；末端互补序列AATT—
B．BamHⅠ和HindⅢ；末端互补序列GATC—
C．EcoRⅠ和HindⅢ；末端互补序列AATT—
D．BamHⅠ和BglⅡ；末端互补序列GATC—
5．下列关于如图所示DNA分子片段的说法，正确的是(　　)
A．限制酶可作用于①部位，解旋酶作用于③部位
B．限制酶可作用于④部位，解旋酶作用于①部位
C．作用于①部位的限制酶同时也可以作用于④部位
D．作用于①部位的限制酶与作用于⑤部位的限制酶的碱基识别序列相反
题组二　“分子搬运工”——载体
6．质粒是基因工程中最常用的载体之一，它的主要特点是(　　)
①能自主复制　②不能自主复制　③结构很小　④化学本质是蛋白质　⑤环状RNA　⑥环状DNA　⑦能“友好”地“借居”
A．①③⑤⑦ B．①④⑥
C．①③⑥⑦ D．②③⑥⑦
7．下列有关基因工程中载体的说法，正确的是(　　)
A．基因工程的操作中被用作载体的质粒是来自细菌的天然质粒
B．质粒是一种独立于细菌染色体外的双链环状DNA分子
C．具有标记基因，以便为目的基因的表达提供条件
D．基因工程中常用的载体除质粒外，还有λ噬菌体的衍生物、动物病毒等
8．限制酶MunⅠ和限制酶EcoRⅠ的识别序列及切割位点分别是—C↓TTAAG—和—G↓AATTC—。如图表示四种质粒和目的基因，其中，质粒上箭头所指部位为酶的识别位点，阴影部分表示标记基因。适于作为图示目的基因载体的质粒是(　　)
A　　　　　B
C　　　　　D
9．如表列举了几种限制酶的识别序列及其切割位点(箭头表示相关酶的切割位点)。如图是酶切后产生的几种末端。下列说法正确的是(　　)
限制酶 AluⅠ BamHⅠ SmaⅠ Sau3AⅠ
识别序列及切割位点 AG↓CT TC↑GA CCC↓GGG GGG↑CCC
A．BamHⅠ切割的是氢键，AluⅠ切割的是磷酸二酯键
B．Sau3AⅠ和BamHⅠ切割产生的片段能够相连，但连接后的片段两者都不能再切割
C．②④⑤对应的识别序列均能被Sau3AⅠ识别并切割
D．T4 DNA连接酶既能连接①③，也能连接②⑤，但后者连接效率低
10．(多选)下列有关质粒的叙述，不正确的是(　　)
A．质粒是细菌细胞不可缺少的遗传物质
B．质粒可用于基因的扩增和蛋白质的表达
C．每个细菌细胞都只含有一个质粒
D．质粒都由4种脱氧核糖核苷酸脱水缩合而成
11．(多选)下列关于限制酶和DNA连接酶的叙述，错误的是(　　)
A．限制酶能在特定部位的两个核苷酸之间切断磷酸二酯键
B．DNA连接酶可以恢复DNA分子中的氢键，将两个DNA片段的黏性末端之间的缝隙连接起来
C．在基因工程操作中，可以用DNA聚合酶代替DNA连接酶
D．限制酶广泛存在于动植物体内，微生物内很少分布
12．(多选)下列有关酶的叙述，不正确的是(　　)
A．DNA连接酶以DNA的一条链为模板，将单个脱氧核苷酸连接起来
B．DNA聚合酶可将两个DNA分子片段间的缝隙从5′端到3′端连接起来
C．逆转录酶是以RNA为模板指导核糖核苷酸连接合成DNA的酶
D．限制性内切核酸酶识别特定的脱氧核苷酸序列并在特定位点切割DNA分子
13．(12分)(2021·全国乙，38节选)用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中要使用多种工具酶，其中4种限制性内切核酸酶的切割位点如图所示。
回答下列问题：
(1)常用的DNA连接酶有E·coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶，图中__________________酶切割后的DNA片段可以用E.coli DNA连接酶连接。图中________________________________切割后的DNA片段可以用T4 DNA连接酶连接。
(2)DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是____________。
(3)DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征，如质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中______________；质粒DNA分子上有____________________，便于外源DNA的插入；质粒DNA分子上有标记基因(如某种抗生素抗性基因)，利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是_________________________________________________
________________________________________________________________________。
14．(14分)如图1表示含有目的基因D的DNA片段长度(bp即碱基对)和部分碱基序列，图2表示一种质粒的结构和部分碱基序列。现有MspⅠ、BamHⅠ、MboⅠ、SmaⅠ 4种限制酶，它们识别的碱基序列和酶切位点分别为C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG。分析回答下列问题：
(1)限制酶切断的化学键所处的具体部位是_________________________________________。
(2)下列有关限制酶的叙述，正确的是__________(填字母，多选)。
A．从反应类型来看，限制酶催化的是一种水解反应
B．限制酶的活性受温度、pH的影响
C．一种限制酶只能识别双链DNA中某种特定的脱氧核苷酸序列
D．不同的限制酶切割DNA后都会形成黏性末端
(3)若用限制酶SmaⅠ完全切割图1所示DNA片段，其产物长度为537 bp、661 bp和________ bp。
(4)若图1中虚线方框内的碱基对被T－A碱基对替换，那么基因D就突变为基因d。从杂合子中分离出图1及其对应的DNA片段，用限制酶SmaⅠ完全切割，产物中共有________种不同长度的DNA片段。
(5)(6分)若将图2中质粒和目的基因D通过同一种限制酶处理后进行连接形成重组质粒，那么应选用的限制酶是________，理由是___________________________________________。
答案精析
1．B　[工具酶的发现属于基因工程相关的技术发现，A不符合题意；1967年，罗思和海林斯基发现基因转移载体——质粒，属于基因工程相关的技术发现，C不符合题意；1972年，伯格及其科研团队完成了世界上首次DNA分子体外重组，DNA分子体外重组的实现属于基因工程相关的技术发现，D不符合题意。]
2．D　[基因工程是指在体外通过人工“剪切”和“拼接”等方法，将外源目的基因与载体DNA进行组合形成重组DNA，然后导入受体细胞，并使其在受体细胞中表达，产生人类需要的基因产物的技术。]
3．A　[DNA连接酶使两个DNA片段末端的两个脱氧核苷酸之间的脱氧核糖和磷酸形成磷酸二酯键。]
4．D　[限制酶所识别的是特定的脱氧核苷酸序列，并在特定部位进行切割，由图示可知，BamHⅠ和BglⅡ切割出来的DNA片段末端可以互补黏合，末端互补序列为GATC—。]
5．A　[限制酶可作用于①②④⑤部位，解旋酶作用于③部位，A正确，B错误；作用于①部位的限制酶同时也可以作用于⑤部位，C错误；作用于①部位的限制酶与作用于⑤部位的限制酶的碱基识别序列相同，都是—GAATTC—，D错误。]
6．C　[质粒能自主复制，以保证能在宿主细胞中稳定存在并复制，①正确，②错误；质粒为小型环状DNA分子，其结构很小，③⑥正确，⑤错误；质粒的化学本质是DNA，不是蛋白质，④错误；质粒能“友好”地“借居”，便于目的基因的稳定存在和复制，⑦正确。]
7．D　[基因工程的操作中被用作载体的质粒一般是人工改造后的质粒，A错误；细菌是原核生物，没有染色体，B错误；标记基因用于鉴定和选择重组DNA分子，与目的基因的表达无关，C错误。]
8．A　[用限制酶MunⅠ切割A质粒后，不会破坏标记基因，而且还能产生与目的基因两侧黏性末端相同的末端，适于作为目的基因的载体，A符合题意；B质粒没有标记基因，不适于作为目的基因的载体，B不符合题意；C、D质粒含有标记基因，但使用限制酶切割后，标记基因会被破坏，因此不适于作为目的基因的载体，C、D不符合题意。]
9．C　[BamHⅠ与AluⅠ切割的均是磷酸二酯键，A错误；BamHⅠ切割G↓GATCC，Sau3AⅠ切割↓GATC，故二者切割后产生的黏性末端是相同的，因此二者切割后产生的黏性末端能够相连，连接后仍然存在GATC的序列，能被Sau3AⅠ切割，但是BamHⅠ不一定能切割，B错误；②④⑤对应的识别序列都存在GATC，都能被Sau3AⅠ识别并切割，C正确；T4 DNA连接酶既可以连接黏性末端，也可以连接平末端，而图中①③是平末端，②⑤是黏性末端，T4 DNA连接酶连接平末端时效率较低，D错误。]
10．AC　[细菌的遗传物质是DNA，质粒是某些细菌细胞质中的小型环状DNA分子，质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性作用，因此，质粒不是细菌细胞不可缺少的遗传物质，A错误；质粒可以自主复制，目的基因与质粒连接形成重组质粒后，目的基因可随着质粒DNA的复制而复制，质粒上有基因(抗性基因)存在，因此质粒还可控制蛋白质的表达，B正确；细菌细胞不都含有质粒，且含有质粒的细菌细胞不一定只有一个质粒，C错误；质粒是小型环状DNA分子，因此是由4种脱氧核糖核苷酸脱水缩合而成的，D正确。]
11．BCD　[限制酶能够识别双链DNA分子上特定的核苷酸序列，能在特定部位的两个核苷酸之间切断磷酸二酯键，A正确；DNA连接酶可以恢复DNA分子中的磷酸二酯键，将两个DNA片段的黏性末端之间的缝隙连接起来，B错误；DNA聚合酶将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端形成磷酸二酯键，DNA连接酶是连接两个DNA的片段形成磷酸二酯键，在基因工程操作中，不可以用DNA聚合酶代替DNA连接酶，C错误；限制酶主要来源于微生物，D错误。]
12．ABC　[DNA连接酶连接的是两个DNA片段，A错误；DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸加到DNA单链末端，B错误；逆转录酶是逆转录过程中需要的酶，该过程是以RNA为模板、以脱氧核苷酸为原料合成DNA的过程，C错误；限制性内切核酸酶具有特异性(专一性)，即可以识别特定的脱氧核苷酸序列并在特定位点切割DNA分子，D正确。]
13．(1)EcoRⅠ、PstⅠ　EcoRⅠ、SmaⅠ、PstⅠ、EcoR Ⅴ　(2)磷酸二酯键　(3)复制　(多种)限制酶的切割位点　用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞
解析　(1)由图可以直接看出，EcoRⅠ、SmaⅠ、PstⅠ、EcoRⅤ切割后分别形成黏性末端、平末端、黏性末端和平末端；E·coli DNA连接酶可用于连接黏性末端，T4 DNA连接酶可用于连接黏性末端和平末端。(2)DNA连接酶催化形成磷酸二酯键。(3)复制原点是在基因组上复制起始的一段序列，可以保证质粒在宿主细胞中复制。质粒上有(多种)限制酶的切割位点，可被限制酶切开并使目的基因插入其中。采用在含有特定抗生素的选择培养基上进行选择培养的方法可将含质粒载体的宿主细胞筛选出来。
14．(1)一条链上相邻两个脱氧核苷酸的磷酸基团与脱氧核糖之间　(2)ABC　(3)790　(4)4　(5)BamHⅠ　MspⅠ和SmaⅠ会破坏目的基因，MboⅠ会将质粒上的两个标记基因全破坏，BamHⅠ在目的基因两端和质粒抗生素A抗性基因上有识别序列，既能形成重组质粒，又因破坏两个标记基因中的一个，利于筛选
解析　(1)限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位相邻的两个核苷酸的磷酸基团与脱氧核糖之间的磷酸二酯键断裂。(2)DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有黏性末端和平末端两种形式，D错误。(3)基因D片段有两个限制酶SmaⅠ酶切位点，完全切割后出现三个片段长度分别是537 bp、790 bp、661 bp。(4)发生基因突变后的基因d片段只有一个限制酶SmaⅠ酶切位点，完全切割后出现2个片段长度分别是1 327 bp、661 bp，基因D被限制酶SmaⅠ切割后，产生537 bp、790 bp、661 bp 3个片段，所以图1所示的DNA片段及其同源片段被切割后共出现4种不同长度的DNA片段。作业16　PCR技术和利用PCR技术扩增DNA片段并完成电泳鉴定
(分值：100分)
第1～12题，每题6分，共72分。
题组一　聚合酶链式反应(PCR)技术
1．下列关于PCR技术的叙述，正确的是(　　)
A．PCR技术建立在对扩增的目的基因序列完全已知的基础上
B．该技术需要解旋酶和热稳定的DNA聚合酶
C．该技术需要一对特异性的引物，要求一对引物的序列是互补的
D．该技术利用DNA半保留复制的原理，需要模板、原料、酶等条件
2．PCR又称聚合酶链式反应，现在已成为分子生物学实验中的一种常规手段，它可以在体外很短的时间内将DNA大量扩增。你认为下列符合在体外进行PCR反应条件的一组是(　　)
①稳定的缓冲溶液环境　②DNA模板　③引物　④dNTP　⑤热稳定的DNA聚合酶　⑥解旋酶　⑦限制性内切核酸酶　⑧温控设备
A．①②③④⑤⑥ B．①②③④⑤⑥⑦⑧
C．③④⑤⑥⑧ D．①②③④⑤⑧
3．下列关于聚合酶链式反应(PCR)技术的叙述，正确的是(　　)
A．PCR过程中只需要两个引物分子
B．PCR的循环过程分为变性、退火和延伸三步
C．PCR扩增仪需保持在37 ℃以维持Taq酶最佳活性
D．PCR过程中边解旋边复制
4．下列有关PCR过程的叙述，错误的是(　　)
A．变性过程中破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键
B．复制过程中引物与DNA模板链的结合依靠碱基互补配对原则完成
C．延伸过程中需要DNA聚合酶、四种核糖核苷酸
D．PCR技术与细胞内DNA复制相比所需要的酶的最适温度较高
5．PCR技术中，如何设计引物(　　)
A．PCR引物要根据需要扩增的目标DNA的碱基序列来设计
B．PCR引物要根据已知的DNA序列对应的RNA序列来设计
C．PCR引物要根据已知的DNA序列对应的tRNA的序列来设计
D．以上方法都不正确
6．利用PCR将某小段含目的基因的DNA分子扩增循环n次，则(　　)
A．需要已知目的基因的全部序列以便设计引物
B．共需2n－2个引物参与子代DNA分子的合成
C．应向反应体系中加入解旋酶、DNA聚合酶、缓冲液等
D．理论上第4轮循环产物中含两种引物的DNA片段占7/8
题组二　利用PCR技术扩增DNA片段并完成电泳鉴定
7．下列关于体内DNA复制和PCR技术的叙述错误的是(　　)
A．都遵循碱基互补配对原则
B．都需要破坏氢键
C．都需要DNA聚合酶
D．都是从引物的5′端延伸子链
8．(2024·泰州高二期末)某研究小组利用PCR技术扩增目的基因，并对扩增产物进行电泳，没有出现目的基因的扩增带，下列原因不可能的是(　　)
A．变性温度设置太低 B．两种引物浓度不等
C．使用的Taq酶失活 D．退火温度设置太高
9．(2023·徐州高二质检)在PCR反应体系中，加入过量的只与双链而不与单链DNA结合的荧光染料可用来鉴定扩增结果，该染料在游离状态不发出荧光，只有在DNA复制过程中掺入DNA双链中才发出荧光。下列分析错误的是(　　)
A．PCR体系中需要加入Mg2＋来激活Taq酶
B．若要扩增一个DNA上的某基因，应加入DNA的两种引物和该基因的两种引物
C．荧光染料在每个循环的延伸阶段掺入双链DNA中
D．荧光信号强度与产物的数量呈正相关
10．引物在极大程度上决定了PCR的成败，下列关于引物的说法，不正确的是(　　)
A．PCR和生物体内的DNA合成都需要引物，PCR引物一般是单链DNA
B．若引物的C、G碱基含量相对较高，PCR退火步骤的温度需要适当升高
C．在PCR的退火步骤，两种引物分别结合在模板链的3′端和5′端
D．若初始有10个胰岛素基因，PCR中进行10轮循环，至少需要20 460个引物分子
11．(多选)(2024·苏州高二期中)下列有关PCR的叙述，正确的有(　　　　)
A．PCR所需引物和体内DNA复制所需引物不同
B．引物长度和退火温度均会影响PCR扩增的特异性
C．PCR产物电泳时的迁移速率与DNA分子的大小有关，与凝胶的浓度无关
D．PCR预变性的目的是增加大分子模板DNA彻底变性的概率
12．(多选)(2024·扬州高二期中)聚合酶链式反应(PCR)是一种体外扩增DNA片段的技术，某DNA片段的PCR反应程序如图所示。下列叙述错误的是(　　　　)
A．预变性可促进模板DNA边解旋边复制
B．退火是让解旋状态模板DNA恢复双螺旋
C．延伸结束后，新片段中的引物将被切除
D．终延伸可使目的基因的扩增更加充分
13．(16分)(2023·盐城实验高级中学高二期中)金属硫蛋白(MT)是一类广泛存在的金属结合蛋白，某研究小组计划通过聚合酶链式反应(PCR)扩增获得目的基因，构建转基因工程菌，用于重金属废水的净化处理。如图是PCR扩增过程的示意图，请回答下列问题：
(1)从高表达MT蛋白的生物组织中提取mRNA，通过____________获得DNA用于PCR扩增。
(2)设计一对与MT基因两端序列互补配对的引物(引物1和引物2)，为方便构建重组质粒，在引物中需要增加适当的________________切割位点。设计引物时需要避免引物之间发生________________，而造成引物自连。
(3)图中步骤1代表__________，步骤2代表退火，步骤3代表__________，这3个步骤组成一轮循环。
(4)PCR扩增时，退火温度的设定是成败的关键。退火温度过高会破坏___________________的碱基配对。退火温度的设定与引物长度、碱基组成有关，长度相同但________________的引物需要设定更高的退火温度。
(5)如果PCR得不到任何扩增产物，则可以采取的改进措施有____________(填序号)。
①升高退火温度　②降低退火温度　③重新设计引物
14．(12分)(2024·扬州高二质检)在PCR技术中，除了作为复制对象的长链DNA之外，反应溶液中还添加有作为引物的短链DNA、dNTP(脱氧核苷三磷酸，N表示任意某一种碱基)和酶。实验时需要使反应溶液的温度周期性地发生变化以完成“变性—退火—延伸”的循环。DNA退火温度与互补碱基对之间的氢键数呈正相关。回答下列问题：
(1)PCR是________________的缩写，PCR反应溶液中添加Mg2＋的作用是________________________________________________________________________。
(2)(6分)实验1：在图1的引物1到引物4中，只使用1种作为引物，退火的温度设定为T ℃，PCR后只合成了与模板DNA2相同的单链。该实验使用的引物是引物________。
实验2：将引物变更为图1中的引物3和引物4，其他条件与实验1相同的情况下进行PCR，双链DNA完全没有被复制，请在图2中，将引物3和引物4与模板链区段1～4结合的关系绘制出来。
(3)实验3：对图3此处中的双链DNA，使用引物5和引物6，将退火的温度设定为T ℃，进行了PCR。结果是双链DNA完全得不到复制。而当设定温度改变后，双链DNA得到了复制。温度改变的大致思路_________________________________________________________。
答案精析
1．D　[PCR技术扩增的目的基因序列不一定是完全已知的，A错误；该技术是通过高温来使DNA解旋的，不需要解旋酶，B错误；该技术需要的一对引物，分别能与模板DNA的两条链进行碱基互补配对，其序列不能互补，C错误。]
2．D　[PCR反应的实质是模拟体内DNA复制，因此需要稳定的缓冲溶液环境，①符合题意；PCR反应需要一定量的模板DNA、引物对、4种dNTP(提供能量和原料)、热稳定的DNA聚合酶，②③④⑤符合题意；PCR反应过程中通过高温使DNA变性解旋，不需要解旋酶，⑥不符合题意；PCR反应不需要限制性内切核酸酶，⑦不符合题意；PCR反应过程中需要控制的关键因素是温度，因此需要温控设备，⑧符合题意。]
3．B　[PCR过程中需要两种引物，引物的数目需要根据扩增的次数确定，A错误；PCR的循环过程分为高温变性(DNA双链打开)、退火(模板链与引物结合)和延伸(合成子链)三步，B正确；PCR扩增仪温度会达到90 ℃以上，C错误；PCR过程中，在变性阶段打开双链，延伸阶段合成子链，故先解旋再复制，D错误。]
4．C　[延伸过程中需要热稳定的DNA聚合酶、四种脱氧核苷三磷酸、引物对等，C错误。]
5．A　[设计引物就是直接根据基因序列来设计，即根据需要扩增的目标DNA的碱基序列来设计，A符合题意。]
6．D　[只需要已知目的基因两端的部分序列便可设计引物，A错误；扩增循环n次，需一种引物的数量为2n－1，常规PCR共需两种引物的数量为2×(2n－1)＝2n＋1－2，B错误；不需向PCR的反应体系中加入解旋酶，C错误；理论上第4轮循环产物中含两种引物的DNA片段占(24－2)/16＝7/8，D正确。]
7．D
8．B　[变性温度过低，则DNA双链不能充分解开，影响目的基因的扩增，A不符合题意；两种引物浓度不等不会导致不出现目的基因的扩增带，B符合题意；使用的Taq酶失活会影响子链的合成，进而影响目的基因的扩增，C不符合题意；PCR扩增时，退火温度的设定是成败的关键，退火温度设置太高会影响模板与引物的碱基配对，导致目的基因扩增失败，D不符合题意。]
9．B　[在PCR体系中需要加入Mg2＋来激活耐高温的DNA聚合酶，用于合成DNA子链，A正确；若要扩增一个DNA上的某基因，应加入该基因的两种引物，B错误；荧光染料只有在DNA复制过程中掺入DNA双链中才发出荧光，在PCR反应的延伸阶段形成DNA双链，C正确；荧光染料可用来鉴定扩增结果，扩增的产物越多，则荧光信号强度越强，D正确。]
10．C　[PCR和生物体内的DNA合成都需要引物，体内的DNA复制引物通常是RNA，PCR引物一般是单链DNA，A正确；G与C之间有3个氢键，稳定性高，若引物的C、G碱基含量相对较高，PCR退火步骤的温度需要适当升高，B正确；在PCR的退火步骤，两种引物都结合在模板链的3′端，C错误；若初始有10个胰岛素基因，PCR中进行10轮循环，得到10×210＝10 240(个)DNA分子，共10 240×2＝20 480条链，由于初始的20条链不需要引物，故至少需要20 480－20＝20 460(个)引物分子，D正确。]
11．ABD　[PCR所需引物是一小段DNA，体内DNA复制所需引物是一小段RNA，A正确；由于引物的序列具有特异性，所以PCR扩增的特异性一般是由引物的特异性决定的，当退火温度高时，只有引物与模板碱基匹配程度高，才能结合到模板上，而引物与模板匹配程度低的区域则不能结合，所以引物长度和退火温度均会影响PCR扩增的特异性，B正确；PCR产物电泳时的迁移速率与DNA分子的大小和凝胶的浓度都有关，C错误；在循环之前，常要进行一次预变性，以增加大分子模板DNA彻底变性的概率，D正确。]
12．ABC　[预变性的目的是破坏DNA中可能存在的较难破坏的复杂二级结构，使DNA充分变性，A错误；退火是让两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，B错误；延伸结束后，新片段中不会切除引物，C错误；终延伸过程是为了让引物完全延伸，并让单链产物完全复性形成双链结构，可使目的基因的扩增更加充分，D正确。]
13．(1)逆转录　(2)限制性内切核酸酶(限制酶)　碱基互补配对　(3)变性　延伸　(4)引物与模板　G、C含量高　(5)②③
解析　(1)PCR是在体外进行DNA扩增，提取的mRNA不能用于PCR扩增，需要经过逆转录获得DNA后才可用于PCR扩增。(2)设计一对与MT基因两端序列互补配对的引物(引物1和引物2)，需要在引物中增加适当的限制性内切核酸酶(限制酶)的识别序列，便于构建重组质粒。为了避免引物自连，设计引物时需要避免引物之间发生碱基互补配对。(3)根据PCR的过程可知，图中步骤1为变性，步骤2为退火，步骤3为延伸，这3个步骤构成一轮循环。(4)退火温度的设定与引物长度、碱基组成有关，退火温度过高会破坏引物与模板的碱基配对。因G、C之间氢键数多于A、T之间氢键数，故在使用G、C含量高的引物时需要设定更高的退火温度。(5)如果PCR得不到任何扩增产物，可能的原因是退火温度过高；也可能是未按照目的基因两端的核苷酸序列来设计引物，需要重新设计。因此可采取的措施有降低退火温度、重新设计引物等。
14．(1)聚合酶链式反应　激活热稳定的DNA聚合酶(Taq酶)的活性　(2)2
(3)适当降低退火温度
解析　(1)PCR是体外扩增DNA技术，是聚合酶链式反应的缩写。PCR反应溶液中添加Mg2＋的作用是激活热稳定的DNA聚合酶(Taq酶)的活性。(2)1种引物只能与DNA的一条链相结合，以一条链为模板，合成一段DNA，PCR后只合成了与模板DNA2相同的单链，因此所选引物的5′端应该是与模板DNA1的3′端相结合，并且互补配对，则对应的为引物2。(3)PCR过程是利用温度变化来进行DNA的体外复制，适当降低退火温度，可以使改变温度后的引物更容易与模板通过碱基互补结合，从而使扩增成功。作业17　目的基因的获取、DNA的粗提取和鉴定、基因表达载体的构建
(分值：100分)
第1～12题，每题6分，共72分。
题组一　目的基因的获取
1．下列不属于获取目的基因的方法是(　　)
A．从基因文库中提取
B．利用逆转录合成
C．利用DNA转录合成
D．利用化学方法人工合成
2．下列关于基因文库的说法，正确的是(　　)
A．cDNA文库中的基因也有启动子
B．一种生物的cDNA文库只有一种
C．基因组文库中的基因都可以在物种间进行基因交流
D．cDNA文库中只含有某种生物的部分基因
3．观察分析下图，该图表示的过程是(　　)
A．构建基因组文库 B．构建cDNA文库
C．构建基因表达载体 D．构建转基因工程菌
4．为了在大肠杆菌细胞中成功表达人胰岛素基因，首先需要提取细胞的mRNA，经逆转录等过程来获取目的基因。下列相关叙述错误的是(　　)
A．用于逆转录的mRNA只能从胰岛B细胞中获取
B．逆转录过程需要四种游离的核糖核苷酸作为原料
C．经逆转录得到的目的基因不含启动子和内含子
D．逆转录获取目的基因时遵循碱基互补配对原则
题组二　DNA的粗提取和鉴定
5．在“DNA的粗提取和鉴定”实验中，实验原理是DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同。DNA的溶解和析出与图中所示曲线的对应点符合的是(　　)
A．a点浓度最适合析出DNA
B．b点浓度最适合析出DNA
C．c点浓度最适合溶解DNA
D．d点浓度最适合析出DNA
6．(2019·江苏，10)下列关于DNA粗提取和鉴定的叙述，错误的是(　　)
A．用同样方法从等体积兔血和鸡血中提取的DNA量相近
B．DNA析出过程中，搅拌操作要轻柔以防DNA断裂
C．预冷的乙醇可用来进一步纯化粗提的DNA
D．用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行水浴加热
题组三　基因表达载体的构建
7．如图是基因工程中基因表达载体的模式图，若结构X是表达载体所必需的，则X最可能是(　　)
A．目的基因插入位点
B．启动子
C．标记基因
D．DNA聚合酶识别位点
8．(2023·辽宁，8)CD163蛋白是PRRSV病毒感染家畜的受体。为实时监控CD163蛋白的表达和转运过程，将红色荧光蛋白RFP基因与CD163基因拼接在一起(如图)，使其表达成一条多肽。该拼接过程的关键步骤是除去(　　)
A．CD163基因中编码起始密码子的序列
B．CD163基因中编码终止密码子的序列
C．RFP基因中编码起始密码子的序列
D．RFP基因中编码终止密码子的序列
9．若要利用某目的基因(如图甲)和P1噬菌体载体(如图乙)构建重组DNA(如图丙)，限制性内切核酸酶的酶切位点分别是BglⅡ(－A↓GATCT－)，EcoRⅠ(－G↓AATTC－)和Sau3AⅠ(－↓GATC－)。下列分析正确的是(　　)
A．用EcoRⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体
B．用BglⅡ和EcoRⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体
C．用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体
D．用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体
10．某RNA病毒的抗原性和感染性与其表面的S蛋白密切相关，现利用基因工程的方法生产相关疫苗，图甲为构建S蛋白基因表达载体的过程，图乙为重组质粒(长度为2 000 bp)被相关酶切割后的电泳结果。下列相关叙述不正确的是(　　)
A．图甲中①②③过程都涉及磷酸二酯键的形成
B．图甲中③过程是基因工程的核心工作
C．由图乙可推知HindⅢ在重组质粒上有3个酶切位点
D．由图乙可推知BamHⅠ在重组质粒上有3个酶切位点
11．(多选)如图为某基因结构示意图及该基因上几种限制酶的酶切位点，下列相关叙述错误的是(　　)
A．图中所示基因可能来自真核生物，也可能来自原核生物
B．利用PCR技术扩增该基因时，形成磷酸二酯键所需要的能量可由dNTP提供
C．利用PCR技术扩增该基因时，可根据Ⅰ、Ⅲ区域的DNA序列设计引物
D．用该基因作为目的基因和质粒构建重组质粒时，只能用SmaⅠ切割
12．(多选)下列关于“DNA的粗提取和鉴定”实验的叙述，错误的是(　　)
A．酵母和菜花均可作为提取DNA的材料
B．DNA既溶于2 mol/L NaCl溶液，也溶于蒸馏水
C．向鸡血细胞液中加蒸馏水搅拌，可见玻璃棒上有白色絮状物
D．DNA溶液加入二苯胺试剂沸水浴加热，冷却后变紫
13．(10分)CTAB法是一种提取植物DNA的方法。通过有机溶剂抽提，去除蛋白质等杂质后，加入异丙醇获得的沉淀为CTAB与核酸复合物，用体积分数为75%的乙醇洗涤可去除CTAB，具体流程如图。请回答下列问题：
(1)氯仿—异戊醇的密度大于水，能使蛋白质变性沉淀，与水和DNA均不相溶，且对DNA影响极小。过程②中加入氯仿—异戊醇离心后，DNA主要存在于A中，则A为__________(填“上清液”或“沉淀物”)。
(2)过程④用体积分数为75%的乙醇洗涤后的沉淀物中含有RNA，为得到较为纯净的DNA，可先用一定浓度的__________溶液溶解沉淀物，然后加入__________酶，再重复步骤________(填图中序号)，最后在上清液中加入冷却的、体积分数为________________，得到较纯净的DNA。
14．(18分)科研人员利用大肠杆菌构建了抗虫基因文库。最新研究发现漏斗蜘蛛中的AH基因控制合成的毒素肽具有显著的杀虫效果，现以p—B质粒为载体，构建AH基因的cDNA文库。图1表示p—B质粒，其中Cmlr表示氯霉素抗性基因，ccdB基因表达产物能抑制大肠杆菌DNA的复制。图中箭头表示相关限制酶的酶切位点，且不同种限制酶识别序列不同，其中AiuⅠ、XbaⅠ、SspⅠ和MfeⅠ识别的碱基序列和酶切位点分别是－AG↓CT－、－T↓CTAGA－、－AAT↓ATT－、－C↓AATTG－。请分析并回答下列问题：
(1)为获得AH基因的cDNA，先要从漏斗蜘蛛毒素肽分泌细胞中提取____________，再通过____________合成出AH基因的cDNA。若从漏斗蜘蛛其他组织细胞提取，则难以成功，原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(2)若已知AH基因的cDNA两端部分序列为5′－AACTATGCGC……CGTAGCCTCT－3′，请写出PCR扩增该cDNA时的两个引物对应的局部序列(前10个碱基序列)，并标明5′端和3′端：______________________、________________________。一个初始双链cDNA经四轮循环后，共消耗这两种引物的数量为________个。
(3)利用图中的质粒和AH基因构建重组质粒时，宜选用限制酶______________________双酶切割质粒，再选用限制酶____________________________切割目的基因，将切割后获得的DNA片段混合，经____________处理后，再与大肠杆菌混合培养。
答案精析
1．C　[利用DNA转录合成的是RNA，不是基因，C符合题意。]
2．D　[cDNA文库中的基因都没有启动子，A错误；由于cDNA文库中只含有某种生物的部分基因，因此该种基因文库可能有多种，而基因组文库中含有某种生物的全部基因，因此只有一种，B错误，D正确；基因组文库中的部分基因可以在物种间进行基因交流，C错误。]
3．A　[由图可知，该过程利用的是某种生物的基因组DNA，用限制酶切割后，与载体连接注入受体菌中，该过程是构建基因组文库。]
4．B　[胰岛素基因只在胰岛B细胞中表达，因此只能从胰岛B细胞中获取用于逆转录的mRNA，A正确；逆转录过程是以RNA为模板合成DNA的过程，以四种游离的脱氧核糖核苷酸为原料，B错误。]
5．B　[由题图可知，DNA在物质的量浓度为0.14 mol·L－1的NaCl溶液中的溶解度最小，因此最适合析出DNA，但是随着NaCl溶液浓度的增大或减小，DNA溶解度均逐渐增大。]
6．A　[哺乳动物(如兔)成熟的红细胞无细胞核和众多细胞器，不能提取到DNA，故兔血不宜作为该实验的实验材料，A错误；为防止DNA断裂，在DNA析出过程中搅拌操作要轻柔且沿着一个方向，B正确；DNA不溶于乙醇溶液，但是细胞中的某些蛋白质溶于乙醇溶液，预冷的、体积分数为95%的乙醇溶液可用来进一步纯化粗提的DNA，C正确；在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺呈现蓝色，因此，用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行水浴加热，D正确。]
7．B　[基因表达载体由启动子、终止子、标记基因、复制原点和目的基因等组成。题图中有终止子、标记基因(抗生素抗性基因)、目的基因、复制原点等，还缺少启动子。启动子位于目的基因的上游，所以X最可能是启动子，B符合题意。]
8．B　[拼接在一起的红色荧光蛋白RFP基因与CD163基因都需要进行转录和翻译，使其表达成一条多肽，因此拼接在一起的CD163基因转录形成的mRNA中不能出现终止密码子，否则在翻译时会提前终止，无法表达出既含CD163蛋白又含红色荧光蛋白的一整条多肽，因此该拼接过程的关键步骤是除去CD163基因中编码终止密码子的序列。]
9．D
10．B　[①为逆转录过程，②为DNA复制，③为PCR技术，三者都涉及核酸链的延伸，故都有磷酸二酯键的形成，A正确；③表示目的基因的获取，基因工程的核心工作是构建基因表达载体，B错误；用HindⅢ将质粒(2 000 bp)切割后形成了200 bp、400 bp和1 400 bp共3个片段，说明HindⅢ在重组质粒上有3个酶切位点，C正确；HindⅢ在重组质粒上有3个酶切位点，用HindⅢ和BamHⅠ将质粒切割后形成了200 bp、420 bp、560 bp的片段，2 000＝420×2＋560＋200×3，所以一共形成了6个片段，共有6个酶切位点，因此BamHⅠ在重组质粒上有6－3＝3(个)酶切位点，D正确。]
11．AD　[图中基因的编码区存在外显子和内含子，因此该目的基因来源于真核生物，A错误；Ⅰ、Ⅲ区域位于编码区上、下游，可根据这两区域DNA序列设计引物，C正确；SmaⅠ的酶切位点在编码区，会破坏目的基因，所以不能用SmaⅠ切割目的基因，D错误。]
12．CD　[理论上只要含有DNA的生物组织均可作为该实验的材料，因此酵母和菜花均可作为提取DNA的材料，A正确；向鸡血细胞液中加蒸馏水搅拌，可使细胞破裂，释放DNA，但玻璃棒上不会出现白色絮状物，C错误；DNA溶液加入二苯胺试剂沸水浴加热，冷却后变蓝，D错误。]
13．(1)上清液　(2)NaCl　RNA　②　95%的乙醇溶液
解析　(1)氯仿—异戊醇密度大于水，能使蛋白质变性沉淀，与水和DNA均不相溶，这说明过程②中加入氯仿—异戊醇离心后，DNA主要存在于上清液中。(2)去除沉淀物中的RNA需要使用RNA酶，故可先用一定浓度的NaCl溶液溶解沉淀物，然后加入RNA酶，再重复步骤②，最后在上清液中加入冷却的、体积分数为95%的乙醇溶液，得到较纯净的DNA。
14．(1)mRNA　逆转录　AH基因在其他组织细胞中不表达，提取不到AH基因的mRNA　(2)5′－AACTATGCGC－3′　5′－AGAGGCTACG－3′　30　(3)AiuⅠ和MfeⅠ　SspⅠ和MfeⅠ　DNA连接酶
解析　(1)AH基因的cDNA可以通过逆转录获得，因此需要先从漏斗蜘蛛毒素肽分泌细胞中提取mRNA，再逆转录合成AH基因的cDNA。由于AH基因在其他组织细胞中是不表达的，因此若从漏斗蜘蛛其他组织细胞提取，则难以成功。(2)根据题意分析，已知AH基因的cDNA两端部分序列为5′－AACTATGCGC……CGTAGCCTCT－3′，引物只能引导子链从5′端向3′端延伸，且与目的基因(双链)两侧的碱基序列是互补的，因此两个引物对应的局部序列(前10个碱基序列)为5′－AACTATGCGC－3′、5′－AGAGGCTACG－3′。PCR技术的原理是DNA的半保留复制，则一个初始双链cDNA经四轮循环后，共消耗这两种引物的数量为2n＋1－2＝25－2＝30(个)。(3)根据图示分析可知，若用XbaⅠ切割会破坏复制原点；由于ccdB基因表达产物能抑制大肠杆菌DNA的复制，因此构建基因表达载体时，应该破坏该基因，即需要用MfeⅠ切割；若用SphⅠ和MfeⅠ切割会导致启动子丢失，若用MfeⅠ和SacⅠ切割，则不能获取目的基因。综上，利用图中的质粒和AH基因构建重组质粒时，切割质粒的酶应该是AiuⅠ(产生平末端)和MfeⅠ，切割目的基因的酶应该是SspⅠ(产生平末端)和MfeⅠ。作业18　将目的基因导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测鉴定
(分值：100分)
第1～12题，每题5分；第13题6分，共66分。
题组一　将目的基因导入受体细胞
1．利用农杆菌转化法将目的基因转入受体细胞后，目的基因插入的位置是(　　)
A．Ti质粒上
B．受体细胞染色体的DNA上
C．T－DNA上
D．农杆菌的拟核
2．下列关于目的基因导入受体细胞的叙述，不正确的是(　　)
A．将目的基因导入植物细胞时，农杆菌转化法适用于大多数单子叶植物
B．显微注射法是转基因动物中采用最多的方法
C．大肠杆菌最常用的转化方法是使细胞的生理状态发生改变
D．农杆菌转化法是将目的基因导入植物细胞最常用的方法
3．科学家通过改变一种名为NR2B的基因研制出了转基因超级小鼠J，与普通老鼠相比，转基因超级小鼠更加聪明，大脑运转更加迅速，它能够轻松完成迷宫任务。下列关于转基因超级小鼠J产生过程的描述，错误的是(　　)
A．NR2B基因可通过PCR技术进行扩增
B．改变后的NR2B基因作为目的基因，可直接注入小鼠受精卵内
C．通常采用显微注射法将改变后的NR2B基因重组质粒导入小鼠受精卵内
D．可采用基因探针检测改变后的NR2B基因是否导入小鼠体内
4．科研人员以抗四环素基因为标记基因，通过基因工程的方法让大肠杆菌生产鼠的β-珠蛋白，治疗鼠的镰状细胞贫血。下列相关叙述中，正确的是(　　)
A．基因表达载体中的启动子是DNA聚合酶识别和结合的位点
B．利用小鼠的成熟红细胞提取mRNA可获得β-珠蛋白基因的编码序列
C．常用Ca2＋处理大肠杆菌使其成为易于吸收DNA的感受态细胞
D．用含有四环素的培养基筛选出的大肠杆菌一定含有β-珠蛋白基因
5．天然蓝色花产生的主要原因是花瓣细胞液泡中的花青素在碱性条件下显蓝色。我国科学家利用链霉菌的靛蓝合成酶基因(idgS)及其激活基因(sfp)构建基因表达载体(如图)，通过农杆菌转化法导入白玫瑰中，在细胞质基质中形成稳定显色的靛蓝。下列相关叙述错误的是(　　)
A．将idgS基因插入Ti质粒时使用的限制酶是SpeⅠ和SacⅠ
B．sfp和idgS基因具有各自的启动子，前者调控后者的表达
C．sfp和idgS基因表达时以DNA的同一条链为模板进行转录
D．农杆菌可将Ti质粒上的T－DNA整合到白玫瑰染色体的DNA上
题组二　目的基因及其表达产物的检测鉴定
6．要检测受体DNA中是否成功插入了目的基因，需要用基因探针，这里的基因探针是指(　　)
A．用于检测疾病的医疗器械
B．带标记的含目的基因的DNA片段
C．带标记的蛋白质分子
D．人工合成的免疫球蛋白
7．将鱼的抗冻蛋白基因导入番茄，有效地提高了番茄的耐寒能力。能最终鉴定转基因番茄培育是否成功的方法是(　　)
A．在试验田中观察番茄的耐寒能力
B．检测番茄的体细胞中是否存在鱼的抗冻蛋白
C．检测鱼的抗冻蛋白基因是否转录出了mRNA
D．检测番茄体细胞中是否有鱼的抗冻蛋白基因
8．为增强玉米植株的抗旱性，研究者构建含有某微生物抗旱基因E的重组质粒，用农杆菌转化法转入玉米幼胚组织细胞中，获得抗旱的转基因玉米。下列相关叙述不正确的是(　　)
A．可通过分子杂交技术检测目的基因是否转录出mRNA
B．将重组质粒置于经CaCl2溶液处理的农杆菌悬液中，可以获得转化的农杆菌
C．用农杆菌转化法将E基因转入玉米幼胚组织细胞需要严格进行无菌操作
D．用E蛋白的抗体进行抗原—抗体杂交，可在个体水平检测转基因玉米的抗旱性状
9．为了增加菊花花色类型，研究者从其他植物中克隆出花色基因C(图1)，拟将其与质粒(图2)重组，再借助农杆菌导入菊花中。下列操作与实验目的不符的是(　　)
A．用限制酶EcoRⅠ和DNA连接酶构建重组质粒
B．用含C基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织，将C基因导入细胞
C．在培养基中添加卡那霉素，筛选被转化的菊花细胞
D．用DNA分子杂交方法检测C基因是否整合到菊花染色体上
10．(2024·南通高二质检)人体内的t－PA蛋白能高效降解由纤维蛋白凝聚而成的血栓，是急性心肌梗死和脑血栓的急救药，改造后的t－PA蛋白能显著降低出血副作用。如图表示构建含t－PA改良基因重组质粒的过程示意图。下列相关说法错误的是(　　)
A．构建重组质粒时，选用的限制酶是XmaⅠ和BglⅡ
B．需要DNA聚合酶将t－PA改良基因与质粒连接
C．新霉素抗性基因的作用是便于将导入质粒的大肠杆菌筛选出来
D．在加入新霉素的培养基中选择呈白色的菌落选育工程菌株
11．(多选)利用基因工程技术生产羧酸酯酶(CarE)制剂的流程如图所示，下列有关叙述正确的是(　　)
A．过程①需使用逆转录酶
B．过程②利用PCR技术扩增CarE基因需使用解旋酶和热稳定的DNA聚合酶
C．过程③可用NaCl溶液处理大肠杆菌，使之成为感受态细胞
D．过程④可利用DNA分子杂交技术鉴定目的基因是否已导入受体细胞
12．(多选)研究者从某微生物中提取出抗旱基因，将其与载体DNA重组，再导入玉米中增加玉米的抗旱性，如图表示该转基因玉米的培育过程，其中字母a、b表示具体的结构，数字①～④表示具体的过程。下列叙述错误的是(　　)
A．从微生物细胞中获取的基因需要加工后才能作为目的基因导入玉米细胞中
B．基因表达载体构建的过程需要DNA聚合酶、DNA连接酶、限制酶
C．图中b是愈伤组织，③与④过程中所需植物激素的含量、比例相同
D．用抗原—抗体杂交的方法检测没有杂交带出现，说明目的基因导入不成功
13．(多选)(2024·盐城高二月考)盐害是全球水稻减产的重要原因之一，专家通过农杆菌中的质粒将CMO基因、BADH基因、mtld基因、gutD基因和SAMDC基因5个耐盐基因导入水稻，获得了一批耐盐转基因植株。有关耐盐转基因水稻培育的分析，正确的是(　　)
A．该转基因水稻与原野生型水稻不存在生殖隔离
B．该基因工程所需的限制性内切核酸酶可能有多种
C．只要目的基因进入水稻细胞，水稻就会表现出抗盐性状
D．可通过将水稻种植到有农杆菌的土壤中观察目的基因是否表达
14．(16分)(2024·苏州高二检测)人的血清蛋白(HSA)具有重要的医用价值，研究人员欲用转基因牛来大量生产HSA。如图1为HSA基因片段和人工构建的大肠杆菌质粒pBR322，图中Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Neor表示新霉素抗性基因，箭头表示切割形成末端完全不同的4种限制酶的切割位点。请据图回答问题：
(1)人工构建pBR322质粒除了含特定限制酶切割位点、标记基因、复制原点外，还必须有________________________________(答出两点)等。
(2)(2分)若选用牛作为受体动物，可用____________作为受体细胞，通过____________方法将目的基因导入受体细胞中。
(3)据图分析，在构建基因表达载体时，选择____________________作为切割质粒和目的基因的限制酶可提高目的基因和载体的正确连接效率，原因是___________________________。
(4)为了排除普通受体细胞(未导入质粒)、空质粒受体细胞(导入pBR322质粒而非重组质粒)的干扰，目的基因导入后，进行了进一步筛选：制备甲、乙两种培养基，甲培养基含新霉素，乙培养基含新霉素和氨苄青霉素，含重组质粒的受体细胞在甲培养基上________(填“能”或“不能”)生存，在乙培养基上________(填“能”或“不能”)生存。
(5)据图2分析，利用PCR技术获取HSA基因时，应选择甲、乙、丙、丁四种引物中的______________，若扩增4次，共需要引物________个。
15.(18分)我国科学家经过长达10年不懈努力，从野生玉米“大刍草”中，成功找回玉米人工驯化过程中丢失的一个控制高蛋白含量的优良基因THP9，将此高蛋白基因克隆出来并转移到玉米细胞内，获得转基因高蛋白玉米新品种。请回答相关问题：
EcoRⅠ BamHⅠ KpnⅠ MfeⅠ HindⅢ
(1)THP9基因游离的磷酸基团侧为________(填“5′端”或“3′端”)，已知图中THP9基因转录方向为从左往右，则TPH9基因转录时的模板链是______链。
(2)构建基因表达载体时，若科研人员需将THP9基因整合到如图质粒上，应使用限制酶__________________切割图中质粒，使用限制酶____________________切割图中含THP9基因的DNA片段，以获得能正确表达THP9基因的重组质粒。这些限制酶一般来源于原核生物，它们不会切割其本身的DNA分子，原因可能是其DNA分子中不存在该酶的识别序列或____________________________。
(3)为了筛选出含重组质粒的受体细胞，应在添加__________________的选择培养基上培养，培养后获得的菌落不能判定是否含有重组质粒，原因是___________________________。
(4)科研人员常用DNA分子杂交技术检测THP9基因有没有整合到受体细胞的染色体DNA上。检测时常使用________________标记的目的基因单链片段作为探针。
(5)为了检测转基因玉米新品种的培育是否成功，科研人员在个体水平上的检测方法是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
答案精析
1．B　[将目的基因导入植物细胞的方法主要是农杆菌转化法，农杆菌转化法就是将目的基因插到农杆菌Ti质粒的T－DNA特定区段上，再通过T－DNA将其插入植物细胞染色体的DNA上，使目的基因得到稳定的遗传和表达，故选B。]
2．A　[将目的基因导入植物细胞常用的方法是农杆菌转化法，该方法适用于双子叶植物和裸子植物，大多数单子叶植物不适用，A错误，D正确；大肠杆菌最常用的转化方法是用一定浓度的CaCl2溶液处理细胞，使细胞的生理状态发生改变，C正确。]
3．B　[PCR技术可在体外大量扩增目的基因，A正确；改变后的NR2B基因作为目的基因，需要与载体结合后才可导入小鼠受精卵内，B错误；将目的基因导入动物细胞常采用显微注射法，C正确。]
4．C　[基因表达载体中的启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，可用于驱动基因的转录，A错误；哺乳动物的成熟红细胞中没有细胞核和核糖体等结构，所以不能利用小鼠的成熟红细胞提取mRNA，B错误；标记基因的作用是初步筛选含有目的基因的受体细胞，用含有四环素的培养基筛选出的大肠杆菌导入的可能是普通质粒或重组质粒，不一定含有β 珠蛋白基因，D错误。]
5．C　[分析题图可知，idgS基因插入Ti质粒的位置在限制酶SpeⅠ和SacⅠ的识别序列之间，因此需要用限制酶SpeⅠ和SacⅠ对目的基因即idgS基因和Ti质粒进行酶切，A正确；sfp基因的启动子是启动子1，idgS基因的启动子是启动子2，sfp基因是idgS基因的激活基因，因此前者调控后者的表达，B正确；sfp基因启动子在其右侧，终止子在其左侧，因此该基因转录是自右向左进行；idgS基因启动子在其左侧，终止子在其右侧，因此该基因转录是自左向右进行，由于转录时生成RNA的方向只能是5′→3′，因此可推知这两种基因必定不是以DNA的同一条链为模板进行转录的，C错误；由于农杆菌侵染植物细胞时，可将其Ti质粒上的T－DNA整合到宿主细胞的染色体DNA上，因此可以将目的基因插入T－DNA中，然后即可整合到白玫瑰染色体的DNA上，D正确。]
6．B　[含有目的基因的DNA片段用放射性同位素或荧光等作标记后可以作为基因探针。]
7．A　[在试验田中观察番茄的耐寒能力是在个体水平上的鉴定，也是最终鉴定转基因番茄培育是否成功的方法，A符合题意；检测番茄的体细胞中是否存在鱼的抗冻蛋白，是检测目的基因是否翻译，B不符合题意；检测鱼的抗冻蛋白基因是否转录出了mRNA，是检测目的基因是否转录，C不符合题意；检测番茄体细胞中是否有鱼的抗冻蛋白基因，是检测目的基因是否导入受体细胞，D不符合题意。]
8．D　[用E蛋白的抗体进行抗原—抗体杂交，属于分子水平的检测，D错误。]
9．C　[根据目的基因两侧的限制酶切割位点可知，用限制酶EcoRⅠ和DNA连接酶构建重组质粒，A正确；将目的基因导入植物细胞常用农杆菌转化法，即用含C基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织，将C基因导入细胞，B正确；图2中显示标记基因是潮霉素抗性基因，因此可在培养基中添加潮霉素来筛选被转化的菊花细胞，C错误。]
10．B　[根据图中目的基因两端的黏性末端以及各种限制酶的切割位点可知，在构建重组质粒时，选用限制酶XmaⅠ和BglⅡ切割质粒，才能与目的基因t－PA改良基因高效连接，A正确；将t－PA改良基因与质粒连接的酶是DNA连接酶，不是DNA聚合酶，B错误；在构建重组质粒时，其中的新霉素抗性基因没有被破坏，因此可以根据对新霉素的抗性将成功导入质粒的大肠杆菌筛选出来，即该基因的作用是便于将成功导入质粒的大肠杆菌筛选出来，C正确；重组质粒已经破坏了mlacZ基因，其不会表达产物，即细胞呈白色，所以，在加入新霉素的培养基中选择呈白色的菌落选育工程菌株，D正确。]
11．AD　[过程②表示目的基因的获取，利用PCR技术对目的基因进行扩增的过程中，不需要使用解旋酶，解旋是通过高温解链实现的，B错误；过程③表示将重组表达载体(目的基因)导入受体细胞，若受体细胞为大肠杆菌细胞，则需要用一定浓度的CaCl2溶液处理，使之成为感受态细胞，C错误。]
12．BCD　[基因表达载体构建的过程需要DNA连接酶、限制酶，不需要DNA聚合酶，B错误；③④分别表示脱分化、再分化过程，这两个过程中都需要生长素和细胞分裂素，但二者的含量、比例不相同，C错误；用抗原—抗体杂交的方法检测没有出现杂交带，只能说明目的基因没有表达，但不能说明目的基因导入不成功，D错误。]
13．AB　[转基因属于基因重组，未产生新物种，该转基因水稻与原野生型水稻不存在生殖隔离，A正确；不同的目的基因可能需要不同的限制酶进行切割，因此该基因工程所需的限制性内切核酸酶可能有多种，B正确；目的基因进入水稻细胞后，还要检测目的基因是否表达，如果不表达，水稻不会表现出抗盐性状，C错误；可通过将水稻种植到盐碱地观察水稻是否表现出抗盐性状，D错误。]
14．(1)启动子、终止子　(2)受精卵　显微注射　(3)EcoRⅠ和PstⅠ　这两种酶能切割质粒和目的基因，能得到不同的黏性末端，避免质粒和目的基因自连及反接(或这两种酶切割DNA形成不同的黏性末端，可避免质粒和目的基因的自身环化和反向连接)　(4)能　不能　(5)乙、丙　30
解析　(3)据图1可知，用BamHⅠ切割会破坏目的基因，用TthⅢ1切割会破坏质粒中的复制原点，而EcoRⅠ和PstⅠ这两种酶能切割质粒和目的基因，不破坏目的基因和复制原点等，且能得到不同的黏性末端，避免质粒和目的基因自连及反接，因此在构建基因表达载体时，选择EcoRⅠ和PstⅠ作为切割质粒和目的基因的限制酶可提高目的基因和载体的正确连接效率。(4)分析图1可知，PstⅠ破坏了氨苄青霉素抗性基因(Ampr)，构建的重组质粒对氨苄青霉素无抗性，但具有新霉素抗性基因，而甲培养基中含有新霉素，因此，含重组质粒的受体细胞能在甲培养基上生存，不能在乙培养基中生存。(5)PCR时，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3′端开始延伸子链，即DNA的合成方向是从子链的5′端向3′端，因此据图2分析，利用PCR技术获取HSA基因时，应选择乙、丙作为引物。若扩增4次，会产生16个DNA(32条链)，其中有2条链是模板链，不需要引物，所以共需要引物30个。
15．(1)5′端　乙　(2)MfeⅠ、HindⅢ　EcoRⅠ、HindⅢ　识别序列已经被修饰　(3)氨苄青霉素　含未重组质粒(或普通质粒)的受体细胞也能正常生长　(4)放射性同位素(或荧光)　(5)将转基因玉米田间种植后收获玉米籽粒，检测其蛋白质含量
解析　(1)THP9基因游离的磷酸基团侧为5′端，已知图中THP9基因转录方向为从左往右，RNA聚合酶沿着子链的5′端向3′端延伸，即图中的乙链是模板链。(2)图中THP9基因转录方向为从左往右，即启动子位于左端，终止子位于右端，因为该基因右侧只有一个酶切位点，故一定用HindⅢ切割质粒和目的基因，不能用EcoRⅠ切割质粒(含两个切割位点，切成片段了)，也不能用BamHⅠ切割质粒(会切断启动子)，那么在HindⅢ的左侧只有MfeⅠ序列，而目的基因不能用该酶切割，与MfeⅠ能形成相同黏性末端的是EcoRⅠ，故质粒用MfeⅠ、HindⅢ切割，目的基因用EcoRⅠ、HindⅢ切割。限制酶一般来源于原核生物，其DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰，故不会切割本身的DNA分子。(3)为了筛选出含重组质粒的受体细胞，应在添加氨苄青霉素的选择培养基上培养，培养后获得的菌落不能判定是否含有重组质粒，原因是含未重组质粒(或普通质粒)的受体细胞也能正常生长。(4)用DNA分子杂交技术检测THP9基因有没有整合到受体细胞的染色体DNA上，该过程常使用放射性同位素或荧光标记的目的基因单链片段作为探针。(5)为了检测转基因技术是否成功，可进行分子水平、个体水平的检测，个体水平上的检测方法是将转基因玉米田间种植后收获玉米籽粒，检测其蛋白质含量。

展开更多......

收起↑