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(共54张PPT)
重点突破练(三)
第三章 基因工程
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题组一　基因工程的基本工具
1.限制酶和DNA连接酶是基因工程的工具酶，以下说法正确的是
A.DNA连接酶能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段上形成磷酸二酯键
B.限制酶只能切割双链DNA片段，不能切割烟草花叶病毒的核酸
C.E.coli DNA连接酶既能连接黏性末端，也能连接平末端
D.限制酶主要从原核生物中分离纯化而来，所以也能剪切自身的DNA
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DNA连接酶连接的是两个DNA片段，A错误；
烟草花叶病毒的核酸为RNA，限制酶只能切割双链DNA片段而不能切割RNA，B正确；
E.coli DNA连接酶只能连接黏性末端，不能连接平末端，C错误；
限制酶主要从原核生物中分离纯化而来，但是因为原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰，所以不能剪切自身的DNA，D错误。
2.(2024·扬州高二质检)用XhoⅠ和SalⅠ两种限制性内切核酸酶分别处理同一DNA片段(限制酶在对应切点一定能切开)，酶切位点及酶切产物分离结果如图。下列叙述错误的是
A.图1中两种酶识别的核苷酸序
列不同
B.图1中酶作用的化学键是氢键
C.图2中②可能是用XhoⅠ处理得到的酶切产物
D.用XhoⅠ和SalⅠ同时处理该DNA，电泳后得到6种产物
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图1中酶用来切割DNA，作用的化学键是磷酸二酯键，B错误；
分析图1，限制酶XhoⅠ有2处切割位点，切割后产生3个DNA片段，泳道②中是用XhoⅠ处理得到的酶切产物，C正确；
分析图1，限制酶XhoⅠ和SalⅠ有5处切割位点，切割后产生6个DNA片段，即用XhoⅠ和SalⅠ同时处理该DNA，电泳后得到6种产物，D正确。
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3.(2024·扬州高二期中)某细菌DNA分子上有4个Sau3AⅠ的酶切位点，经Sau3AⅠ处理后会形成4个大小不同的DNA片段。若是用BamHⅠ处理，则只会形成2个大小不同的DNA片段。Sau3AⅠ和BamHⅠ的识别序列及切割位点如表所示。下列叙述不正确的是
限制酶名称 识别序列及切割位点
BamHⅠ G↓GATCC
Sau3AⅠ ↓GATC
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A.上述两种限制酶切割后可形成相同的黏性末端
B.该DNA分子上有2个BamHⅠ的酶切位点
C.黏性末端能通过T4 DNA连接酶连接
D.若用两种酶共同处理，会形成6个大小不同的DNA片段
限制酶名称5 识别序列及切割位点
BamHⅠ G↓GATCC
Sau3AⅠ ↓GATC
√
BamHⅠ和Sau3AⅠ两种限制酶切割后形成的黏性末端均为GATC－，A正确；
由题意“DNA分子上有4个Sau3AⅠ的酶切位点，经Sau3AⅠ处理后形成4个DNA片段”可知，该DNA分子为环状DNA，用BamHⅠ处理后，得到2个DNA片段，说明该DNA分子上有2个BamHⅠ的酶切位点，B正确；
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T4 DNA连接酶能连接互补的黏性末端，也可以连接平末端，但连接平末端时的效率比较低，C正确；
该DNA分子上有4个Sau3AⅠ的酶切位点，有2个BamHⅠ的酶切位点，但是BamHⅠ识别序列中包含Sau3AⅠ的识别序列，所以同时用两种酶共同处理，不会形成6个大小不同的DNA片段，D错误。
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4.基因工程中，需使用特定的限制性内切核酸酶切割目的基因和质粒，便于重组和筛选。已知限制性内切核酸酶Ⅰ的识别序列和切点是—G↓GATCC—，限制性内切核酸酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—。根据图示判断，下列叙述错误的是
A.用限制性内切核酸酶切割获得目的基因时，
有4个磷酸二酯键被水解
B.质粒用限制性内切核酸酶Ⅱ切割，目的基因用限制性内切核酸酶Ⅰ切割
C.限制性内切核酸酶Ⅰ和限制性内切核酸酶Ⅱ切割后获得的黏性末端相同
D.质粒中的标记基因便于对重组DNA进行鉴定和选择
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由图示分析可知，在限制性内切核酸酶Ⅰ的识别序列内部含有限制性内切核酸酶Ⅱ的识别序列和切点，若用限制性内切核酸酶Ⅱ切割获得目的基因时，则目的基因的前后各有一个该限制酶的识别序列和切割位点，因此会有4个磷酸二酯键被水解，A正确；
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若用限制性内切核酸酶Ⅱ切割质粒，两个标记基因都会被破坏，若用限制性内切核酸酶Ⅰ切割目的基因只能切开一端，无法获取目的基因，因此质粒用限制性内切核酸酶Ⅰ切割，目的基因用限制性内切核酸酶Ⅱ切割，B错误。
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题组二　PCR技术
5.PCR是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。下列有关PCR过程的叙述，正确的是
A.待扩增的DNA两条链的解旋过程需要酶的催化
B.所用引物的长度越短，与模板链结合的特异性越强
C.在子链的形成过程中，dNTP可以提供原料和能量
D.与细胞内DNA复制相比，PCR所需要的酶对高温比较敏感
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PCR扩增DNA时，DNA两条链的解旋过程是通过高温来实现的，A错误；
合理范围内引物越长，能够配对的概率越低，与模板链结合的特异性越强，B错误；
dNTP包括dATP、dGTP、dCTP和dTTP，在子链的形成过程中，可以提供原料和能量，C正确；
PCR所需要的酶为热稳定的DNA聚合酶，耐高温，D错误。
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6.将水稻耐盐碱基因OsMYB56导入不耐盐碱水稻品种吉粳88中，培育耐盐碱海水稻新品种。如图PCR扩增OsMYB56时需要添加引物，应选用的引物组合为
A.5′－CTTGGATGAT－3′和5′－TCTGTTGAAT－3′
B.5′－CTTGGATGAT－3′和5′－TAAGTTGTCT－3′
C.5′－ATTCAACAGA－3′和5′－ATCATCCAAG－3′
D.5′－ATTCAACAGA－3′和5′－GAACCTACTA－3′
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磷酸端为DNA链的5′端，羟基端为
DNA链的3′端。进行PCR时，引物
与模板链的3′端结合，因此在扩增
OsMYB56时需要添加的引物是5′—CTTGGATGAT—3′和5′—TCTGTTGAAT—3′，A符合题意。
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7.(多选)聚合酶链式反应(PCR)是一种用于扩增特定DNA片段的分子生物学技术。下列关于PCR的叙述，正确的是
A.为保证模板链与引物结合的效率，两种引物之间尽量避免存在互补序列
B.引物与模板链结合后，引导子链从引物的5′端开始延伸
C.两种引物上设计加入不同限制酶的识别序列，主要目的是使目的基因
定向插入载体
D.退火所需的温度、时长和延伸所需的温度、时长均与引物有关
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引物之间不应存在互补序列，否则会出现引物与引物配对的情况，降低PCR的效率，A正确；
DNA复制时，引物先与模板链配对结合，然后从引物的3′端延伸子链，B错误；
为了便于扩增的DNA片段与载体连接，常在两条引物上设计加入不同的限制酶识别序列，使目的基因能定向插入表达载体，避免目的基因自身环化，C正确；
退火所需的温度、时长与引物有关，而延伸所需的温度、时长与引物无关，D错误。
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题组三　基因工程的基本操作程序
8.某研究小组为了研制预防H7N9禽流感病毒的疫苗，开展了前期研究工作，其简要的操作流程如图所示。下列有关叙述错误的是
A.步骤①所代表的过程是逆转录
B.步骤②需使用限制酶和DNA连
接酶
C.步骤③可用显微注射法将表达载体导入受体细胞
D.检验Q蛋白的免疫反应特性，可用Q蛋白与患禽流感康复的鸡的血清进
行抗原—抗体特异性反应实验
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步骤③可用Ca2＋处理法，即用一定浓度的CaCl2溶液处理大肠杆菌，使其成为感受态细胞，C错误。
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9.用于判断目的基因是否转移成功的方法中，不属于分子检测的是
A.通过害虫食用棉花的叶子观察其是否死亡
B.转基因生物基因组DNA与DNA探针能否形成杂交带
C.转基因生物中提取的蛋白质能否与抗体形成杂交带
D.转基因生物中提取的mRNA与DNA探针能否形成杂交带
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通过害虫食用棉花的叶子观察其是否死亡，属于目的基因个体水平上的鉴定，A符合题意。
10.幽门螺杆菌(Hp)感染会引发胃炎、消化性溃疡等多种疾病。研究人员将Hp的Ipp20基因作为目的基因，用限制酶XhoⅠ和XbaⅠ切割，通过基因工程制备相应的疫苗，质粒及操作步骤如图所示。下列相关叙述错误的是
A.Ipp20基因整合到大肠杆菌的DNA中属于基因
重组
B.基因表达载体导入之前，可用Ca2＋处理大肠
杆菌
C.培养基A中添加了氯霉素，培养基B中添加了
潮霉素
D.能用来生产Hp疫苗的大肠杆菌在菌落3和5中
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该过程使用了限制酶XhoⅠ和XbaⅠ切割质粒和Ipp20基因，结合图示可知，在构建目的基因表达载体的过程中氯霉素抗性基因被切掉，保留了潮霉素抗性基因，不管是正常质粒还是重组质粒都含有潮霉素抗性基因，但只有正常质粒
才同时含有氯霉素抗性基因，因此，可以先用含有潮霉素的培养基A筛选出导入正常质粒、重组质粒的大肠杆菌，再采用同位影印接种到
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含有氯霉素的培养基B和含有潮霉素的培养基A中，此时含有重组质粒的大肠杆菌不能在含有氯霉素的培养基B上生长，从而与培养基A(对照)相比会消失一些菌落，对照两个平板上减少的菌落就是符合要求的大肠杆菌菌落，结合图
示可知，符合要求的大肠杆菌菌落是3和5，C错误，D正确。
11.(2024·苏州高二期中)Bt毒蛋白能破坏棉铃虫的消化系统，科研人员从苏云金杆菌体内获得了Bt毒蛋白基因，拟利用大肠杆菌生产Bt毒蛋白。如图是选用的质粒及几种相关限制酶的识别位点。下列叙述正确的是
A.Bt毒蛋白基因和青霉素抗性基因均为目的基因
B.可以选用EcoRⅤ和BglⅡ构建基因表达载体
C.图示启动子是DNA聚合酶识别和结合的位点，
是启动基因转录的位点
D.可以用相应的抗体进行抗原—抗体杂交，检测
Bt毒蛋白基因是否翻译
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苏云金杆菌中含有一种Bt毒蛋白基因，培
育抗虫棉时Bt毒蛋白基因为目的基因，青
霉素抗性基因作为标记基因检测Bt毒蛋白
基因是否导入大肠杆菌细胞，A错误；
不能选用EcoRⅤ酶切质粒，否则会破坏青
霉素抗性基因(唯一的标记基因)，影响筛
选目标细胞，B错误；
启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，用于启动基因的转录，C错误。
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12.(多选)如图是将人的生长激素基因导入细菌B细胞内制造“工程菌”的示意图。已知细菌B细胞内不含质粒A，也不含质粒A上的基因。下列说法正确的是
A.将重组质粒导入细菌B常用的方法是Ca2＋处理法
B.将完成导入过程后的细菌涂布在含有氨苄青霉
素的培养基上，能生长的都是导入了重组质粒
的细菌
C.将完成导入过程后的细菌涂布在含有四环素的
培养基上，能生长的就是导入了质粒A的细菌
D.目的基因成功表达的标志是受体细胞能在含有氨苄青霉素的培养基上生长
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将重组质粒导入细菌B之前，一般要先用
Ca2＋处理细菌，使之处于感受态，从而
能够更好地吸收重组质粒，A正确；
质粒A中含有四环素抗性基因和氨苄青霉
素抗性基因，而重组质粒中四环素抗性基因被破坏，只含氨苄青霉素抗性基因，则在含有氨苄青霉素的培养基上能生长的是导入质粒A或重组质粒的细菌，B错误；
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能在含有四环素的培养基上生长的是导入了质粒A的细菌，C正确；
目的基因(人的生长激素基因)成功表达的标志是受体细胞能产生人的生长激素，D错误。
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13.土壤盐渍化影响水稻生长发育。科研人员将水稻耐盐基因OsMYB56导入不耐盐碱水稻品种吉粳88中，培育出了4株耐盐碱水稻新品种。其操作流程及相关限制酶识别序列和切割位点如图，图中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ为限制酶的酶切位点，bar为抗除草剂基因，Kanr为卡那霉素抗性基因。请分析回答相关问题：
限制酶 识别序列和切割位点
EcoRⅠ G↓AATTC
BamHⅠ G↓GATCC
HindⅢ A↓AGCTT
SacⅠ GAGCT↓C
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(1)过程②构建表达载体的作用是_____
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的基因进入受体细胞并有效表达，而且能稳定存在并遗传给后代
使目
过程②是构建基因表达载体，这是基因工程的核心，其目的是使目的基因进入受体细胞并有效表达，而且能稳定存在并遗传给后代。
(2)为了便于耐盐基因OsMYB56与质粒
连接，常在两条引物上设计加入不同
的限制酶的酶切位点，主要目的是
________________________________
______________。过程①所用的一对
引物如下，则过程②使用的限制酶是
________________。
5′－CGCGGATCCATGAGAAAGGGCCCGTGG－3′
5′－CGAGCTCCTATCCCCAGAGAGGTAGCGA－3′
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使DNA片段能定向插入表达载体，减少自身连接
BamHⅠ、SacⅠ
限制酶 识别序列和切割位点
EcoRⅠ G↓AATTC
BamHⅠ G↓GATCC
HindⅢ A↓AGCTT
SacⅠ GAGCT↓C
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分析引物的序列发现存在GGATCC和GAGCTC的序列，结合表格中不同限制酶的识别序列和切割位点可知，这两个序列可以分别被BamHⅠ和SacⅠ识别，故选用限制酶BamHⅠ和SacⅠ。
限制酶 识别序列和切割位点
EcoRⅠ G↓AATTC
BamHⅠ G↓GATCC
HindⅢ A↓AGCTT
SacⅠ GAGCT↓C
(3)进行扩增时，反应的温度和时间需根据具体情况进行设定，下列选项中_______(填序号，下同)的设定与引物有关，______的设定与扩增片段的长度有关。
①变性温度　②退火温度
③延伸温度　④变性时间
⑤退火时间　⑥延伸时间
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⑥
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进行扩增时，②退火温度、⑤退火时间的设定与引物有关，⑥延伸时间的设定与扩增片段的长度有关，一般扩增片段越长，延伸时间越长。
(4)花椰菜病毒启动子含有___________识别和结合的核苷酸序列，本研究中设计两个相同启动子分别连接bar和目的基因，其目的是_________________
__________________。
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RNA聚合酶
依据bar表达推测
目的基因同时表达
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花椰菜病毒启动子位于基因的上游，是一段特殊的DNA片段，是RNA聚合酶识别和结合的部位。有了启动子才能驱动基因的转录，最终获得相关表达产物，本研究中设计两
个相同启动子分别连接bar和目的基因，可以保证这两种基因的同时表达，故其目的是依据bar表达推测目的基因同时表达。
(5)过程④选择愈伤组织细胞来转化的主
要原因是__________________________
__________，图中⑤属于组织培养中的
________过程。经检测，科研人员发现
部分获得耐盐基因OsMYB56的水稻幼苗
不具有耐盐能力，原因可能是________
______________________________________________________。
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水稻愈伤组织细胞分裂旺盛，全能性高
再分化
耐盐基
因OsMYB56转录或翻译异常(或耐盐基因OsMYB56表达异常)
过程④是转化，选择愈伤组织细胞来转化的主要原因是水稻愈伤组织细胞分裂旺盛，全能性高，通过植物组织培养可以获得转基因植株。图中⑤属于组织培养中的愈伤组织再分化为小植株的过程。经检测，科研人员发现
部分获得耐盐基因OsMYB56的水稻幼苗不具有耐盐能力，原因可能是虽然获得了相应的基因，但耐盐基因OsMYB56转录或翻译异常(或耐盐基因OsMYB56表达异常)。
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14.巢式PCR是一种特殊的聚合酶链式反应，使用两组不同的引物实现目标DNA片段的扩增。第一组外引物扩增出的DNA片段(中间产物)长度超出目标区域，第二组内引物称为巢式引物，其结合部位在中间产物内部的目标区域，从而扩增出目标产物，具
体过程如图1所示。请回答下列问题：
(1)巢式PCR反应体系中需加入模板、___
_______________________、__________
________________、引物对、Mg2＋、缓冲液等。
酶(热稳定的DNA聚合酶)
dNTP(4种
Taq
脱氧核苷三磷酸)
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(2)巢式PCR过程中反应温度最低的一步是______。巢式PCR中外引物的第一阶段扩增和内引物的第二阶段扩增通常在不同的离心管中进行，可防止________在第一阶段PCR中与模板结合。
(3)若直接用图1中的内引物对模板DNA
扩增，则内引物与模板的非目标区域进
行碱基互补配对的概率会_____(填“上
升”或“下降”)，不易得到目标产物。
巢式PCR获得的产物特异性_____(填
“高”或“低”)。
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退火
内引物
上升
高
(4)家畜胚胎性别鉴定对畜牧业发展具有重要意义，科研人员利用多重巢式PCR技术同时扩增奶牛Y染色体上雄性决定基因(SRY)和常染色体上的酪蛋白基因(CSN1S1)，进行早期胚胎性别鉴定和胚胎移植，获得高产奶牛。请完成下表相关内容。
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实验目的 方法步骤要点
囊胚样品DNA提取 选取①________细胞提取DNA
PCR引物的设计和合成 根据牛的SRY和CSN1S1基因序列设计合成4对引物
PCR扩增 预变性→变性→退火→延伸
滋养层
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实验目的 方法步骤要点
鉴定分析 ②______________________________________
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③______________ 对受体奶牛注射前列腺素
胚胎移植 将符合要求的胚胎移植到受体奶牛的子宫内
采用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定，确定胚胎性别
同期发情处理
(5)巢式PCR产物鉴定结果如图2所示，1～5号为取自不同胚胎的DNA样品，其中符合要求的胚胎是___________。下列方法也可用于奶牛胚胎性别的鉴定的是_________。
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1、2、4号
①②④
①染色体核型分析法　②核酸探针杂交法　③差速离心法　④抗HY血清免疫学法(HY抗原编码基因位于Y染色体上)
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题中利用多重巢式PCR技术同时扩增Y染色体上雄性决定基因(SRY)和常染色体上的酪蛋白基因(CSN1S1)进行电泳，雌性个体没有SRY，只有一条带，雄性有两条带，因此1、2、4号是雌性，3、5号是雄性，其中符合要求的胚胎是1、2、4号。 X、Y染色体形态不同，
因此①染色体核型分析法可用于进行性别鉴定；可将Y染色体上雄性决定基因(SRY)制成探针，因此可用核酸探针杂交法鉴定性别；③差速离心法是分离各种细胞器的方法，不能鉴定性别；④抗HY血清免疫学法(HY抗原编码基因位于Y染色体上)也可用于鉴定性别。
15.降钙素是一种多肽类激素，临床上用于治疗骨质疏松症等。人体内合成的降钙素活性很低，半衰期较短。某科研机构为了研发一种活性高、半衰期长的新型降钙素，将能人工合成降钙素的DNA与大肠杆菌的DNA分子进行重组，并成功地在大肠杆菌中得以表达。请分析回答下列问题：
1
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3
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5
6
7
8
9
10
11
12
13
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15
(1)图1表示人工合成降钙素DNA的过程。从预期新型降钙素的功能出发，推测相应的脱氧核苷酸序列，并人工合成了两条72个碱基的DNA单链，两条链通过18个碱基对形成部分双链DNA片段，再利用Klenow酶补平，获得双链DNA。从功能看，Klenow酶是一种__________酶，合成的双链DNA有_____个碱基对。
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DNA聚合
126
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由图1可知，Klenow酶能催化DNA的合成，应为DNA聚合酶；合成的双链DNA含有(72－18)×2＋18＝126(个)碱基对。
(2)若利用PCR技术对人工合成降钙素DNA进行扩增，在PCR反应体系中需要加入模板序列、Taq酶、原料及_____种引物。设计引物时需要避免引物之间存在___________，而造成引物之间连接。
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2
互补序列
若利用PCR技术对人工合成的降钙素DNA进行扩增，在PCR反应体系中需要加入模板序列、Taq酶、原料及2种引物。引物是一小段DNA片段，PCR扩增目的基因时，引物之间不能存在互补序列，否则会引起引物之间连接。
(3)研究者利用4种限制酶切割目的基因和质粒，各限制酶的识别序列和切割位点如图所示。
1
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研究者使用不同的限制酶切割目的基因能
有效防止目的基因出现__________现象。
酶切后的产物连接时，目的基因上SalⅠ切割产生的末端应与质粒上_______切割产生的末端相连接。连接完成后，该连接点______(填“能”或“不能”)被这两种限制酶中的某一种切割。
自身环化
XhoⅠ
不能
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同种限制酶切割目的基因，目的基因两端的黏性末端是相同的，可能出现自身环化现象，所以研究者使用不同的限制酶切割目的基因能有效防止目的基因出现自身环化现象。
1
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15
根据图示中4种限制酶的识别序列和切割位点可知，限制酶NstⅠ与限制酶PstⅠ切割形成的黏性末端相同，限制酶SalⅠ与限制酶XhoⅠ切割形成的黏性末端相同，因此将酶切后的产物连接时，目的基因上SalⅠ切割产生的末端应与质粒上XhoⅠ
切割产生的末端相连接。连接完成后，
该连接点的脱氧核苷酸序列与原来的
不同，所以不能被这两种限制酶中的
某一种切割。
1
2
3
4
5
6
7
8
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12
13
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15
(4)大肠杆菌是理想的受体细胞，因为它具有__________________________
_____________等优点。
(5)要进行重组质粒的鉴定和选择，质粒还需要含有________。若人工合成的降钙素基因在大肠杆菌细胞内正常表达，合成降钙素的场所是________。
繁殖快、为单细胞生物、遗传
标记基因
物质相对较少
核糖体
1
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要进行重组质粒的鉴定和选择，质粒需要含有标记基因，标记基因的作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。降钙素是一种多肽类激素，若人工合成的降钙素基因在大肠杆菌细胞内正常表达，合成降钙素的场所是核糖体。作业21　重点突破练(三)
(分值：100分)
第1～6题，每题3分；第7～12题，每题4分，共42分。
题组一　基因工程的基本工具
1．限制酶和DNA连接酶是基因工程的工具酶，以下说法正确的是(　　)
A．DNA连接酶能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段上形成磷酸二酯键
B．限制酶只能切割双链DNA片段，不能切割烟草花叶病毒的核酸
C．E.coli DNA连接酶既能连接黏性末端，也能连接平末端
D．限制酶主要从原核生物中分离纯化而来，所以也能剪切自身的DNA
2．(2024·扬州高二质检)用XhoⅠ和SalⅠ两种限制性内切核酸酶分别处理同一DNA片段(限制酶在对应切点一定能切开)，酶切位点及酶切产物分离结果如图。下列叙述错误的是(　　)
A．图1中两种酶识别的核苷酸序列不同
B．图1中酶作用的化学键是氢键
C．图2中②可能是用XhoⅠ处理得到的酶切产物
D．用XhoⅠ和SalⅠ同时处理该DNA，电泳后得到6种产物
3．(2024·扬州高二期中)某细菌DNA分子上有4个Sau3AⅠ的酶切位点，经Sau3AⅠ处理后会形成4个大小不同的DNA片段。若是用BamHⅠ处理，则只会形成2个大小不同的DNA片段。Sau3AⅠ和BamHⅠ的识别序列及切割位点如表所示。下列叙述不正确的是(　　)
限制酶名称 识别序列及切割位点
BamHⅠ G↓GATCC
Sau3AⅠ ↓GATC
A.上述两种限制酶切割后可形成相同的黏性末端
B．该DNA分子上有2个BamHⅠ的酶切位点
C．黏性末端能通过T4 DNA连接酶连接
D．若用两种酶共同处理，会形成6个大小不同的DNA片段
4．基因工程中，需使用特定的限制性内切核酸酶切割目的基因和质粒，便于重组和筛选。已知限制性内切核酸酶Ⅰ的识别序列和切点是—G↓GATCC—，限制性内切核酸酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—。根据图示判断，下列叙述错误的是(　　)
A．用限制性内切核酸酶切割获得目的基因时，有4个磷酸二酯键被水解
B．质粒用限制性内切核酸酶Ⅱ切割，目的基因用限制性内切核酸酶Ⅰ切割
C．限制性内切核酸酶Ⅰ和限制性内切核酸酶Ⅱ切割后获得的黏性末端相同
D．质粒中的标记基因便于对重组DNA进行鉴定和选择
题组二　PCR技术
5．PCR是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。下列有关PCR过程的叙述，正确的是(　　)
A．待扩增的DNA两条链的解旋过程需要酶的催化
B．所用引物的长度越短，与模板链结合的特异性越强
C．在子链的形成过程中，dNTP可以提供原料和能量
D．与细胞内DNA复制相比，PCR所需要的酶对高温比较敏感
6．将水稻耐盐碱基因OsMYB56导入不耐盐碱水稻品种吉粳88中，培育耐盐碱海水稻新品种。如图PCR扩增OsMYB56时需要添加引物，应选用的引物组合为(　　)
A．5′－CTTGGATGAT－3′和5′－TCTGTTGAAT－3′
B．5′－CTTGGATGAT－3′和5′－TAAGTTGTCT－3′
C．5′－ATTCAACAGA－3′和5′－ATCATCCAAG－3′
D．5′－ATTCAACAGA－3′和5′－GAACCTACTA－3′
7．(多选)聚合酶链式反应(PCR)是一种用于扩增特定DNA片段的分子生物学技术。下列关于PCR的叙述，正确的是(　　　　)
A．为保证模板链与引物结合的效率，两种引物之间尽量避免存在互补序列
B．引物与模板链结合后，引导子链从引物的5′端开始延伸
C．两种引物上设计加入不同限制酶的识别序列，主要目的是使目的基因定向插入载体
D．退火所需的温度、时长和延伸所需的温度、时长均与引物有关
题组三　基因工程的基本操作程序
8．某研究小组为了研制预防H7N9禽流感病毒的疫苗，开展了前期研究工作，其简要的操作流程如图所示。下列有关叙述错误的是(　　)
A．步骤①所代表的过程是逆转录
B．步骤②需使用限制酶和DNA连接酶
C．步骤③可用显微注射法将表达载体导入受体细胞
D．检验Q蛋白的免疫反应特性，可用Q蛋白与患禽流感康复的鸡的血清进行抗原—抗体特异性反应实验
9．用于判断目的基因是否转移成功的方法中，不属于分子检测的是(　　)
A．通过害虫食用棉花的叶子观察其是否死亡
B．转基因生物基因组DNA与DNA探针能否形成杂交带
C．转基因生物中提取的蛋白质能否与抗体形成杂交带
D．转基因生物中提取的mRNA与DNA探针能否形成杂交带
10．幽门螺杆菌(Hp)感染会引发胃炎、消化性溃疡等多种疾病。研究人员将Hp的Ipp20基因作为目的基因，用限制酶XhoⅠ和XbaⅠ切割，通过基因工程制备相应的疫苗，质粒及操作步骤如图所示。下列相关叙述错误的是(　　)
A．Ipp20基因整合到大肠杆菌的DNA中属于基因重组
B．基因表达载体导入之前，可用Ca2＋处理大肠杆菌
C．培养基A中添加了氯霉素，培养基B中添加了潮霉素
D．能用来生产Hp疫苗的大肠杆菌在菌落3和5中
11．(2024·苏州高二期中)Bt毒蛋白能破坏棉铃虫的消化系统，科研人员从苏云金杆菌体内获得了Bt毒蛋白基因，拟利用大肠杆菌生产Bt毒蛋白。如图是选用的质粒及几种相关限制酶的识别位点。下列叙述正确的是(　　)
A．Bt毒蛋白基因和青霉素抗性基因均为目的基因
B．可以选用EcoRⅤ和BglⅡ构建基因表达载体
C．图示启动子是DNA聚合酶识别和结合的位点，是启动基因转录的位点
D．可以用相应的抗体进行抗原—抗体杂交，检测Bt毒蛋白基因是否翻译
12．(多选)如图是将人的生长激素基因导入细菌B细胞内制造“工程菌”的示意图。已知细菌B细胞内不含质粒A，也不含质粒A上的基因。下列说法正确的是(　　　　)
A．将重组质粒导入细菌B常用的方法是Ca2＋处理法
B．将完成导入过程后的细菌涂布在含有氨苄青霉素的培养基上，能生长的都是导入了重组质粒的细菌
C．将完成导入过程后的细菌涂布在含有四环素的培养基上，能生长的就是导入了质粒A的细菌
D．目的基因成功表达的标志是受体细胞能在含有氨苄青霉素的培养基上生长
13．(20分)土壤盐渍化影响水稻生长发育。科研人员将水稻耐盐基因OsMYB56导入不耐盐碱水稻品种吉粳88中，培育出了4株耐盐碱水稻新品种。其操作流程及相关限制酶识别序列和切割位点如图，图中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ为限制酶的酶切位点，bar为抗除草剂基因，Kanr为卡那霉素抗性基因。请分析回答相关问题：
限制酶 识别序列和切割位点
EcoRⅠ G↓AATTC
BamHⅠ G↓GATCC
HindⅢ A↓AGCTT
SacⅠ GAGCT↓C
(1)过程②构建表达载体的作用是______________________________。
(2)为了便于耐盐基因OsMYB56与质粒连接，常在两条引物上设计加入不同的限制酶的酶切位点，主要目的是__________________________________________________。过程①所用的一对引物如下，则过程②使用的限制酶是____________________。
5′－CGCGGATCCATGAGAAAGGGCCCGTGG－3′
5′－CGAGCTCCTATCCCCAGAGAGGTAGCGA－3′
(3)进行扩增时，反应的温度和时间需根据具体情况进行设定，下列选项中__________(填序号，下同)的设定与引物有关，__________的设定与扩增片段的长度有关。
①变性温度　②退火温度　③延伸温度　④变性时间　⑤退火时间　⑥延伸时间
(4)花椰菜病毒启动子含有____________________识别和结合的核苷酸序列，本研究中设计两个相同启动子分别连接bar和目的基因，其目的是_____________________________。
(5)过程④选择愈伤组织细胞来转化的主要原因是__________________________________，
图中⑤属于组织培养中的____________________过程。经检测，科研人员发现部分获得耐盐基因OsMYB56的水稻幼苗不具有耐盐能力，原因可能是________________________。
14．(18分)巢式PCR是一种特殊的聚合酶链式反应，使用两组不同的引物实现目标DNA片段的扩增。第一组外引物扩增出的DNA片段(中间产物)长度超出目标区域，第二组内引物称为巢式引物，其结合部位在中间产物内部的目标区域，从而扩增出目标产物，具体过程如图1所示。请回答下列问题：
(1)(2分)巢式PCR反应体系中需加入模板、________________________、_________________、引物对、Mg2＋、缓冲液等。
(2)(2分)巢式PCR过程中反应温度最低的一步是________________。巢式PCR中外引物的第一阶段扩增和内引物的第二阶段扩增通常在不同的离心管中进行，可防止__________在第一阶段PCR中与模板结合。
(3)若直接用图1中的内引物对模板DNA扩增，则内引物与模板的非目标区域进行碱基互补配对的概率会________(填“上升”或“下降”)，不易得到目标产物。巢式PCR获得的产物特异性________(填“高”或“低”)。
(4)家畜胚胎性别鉴定对畜牧业发展具有重要意义，科研人员利用多重巢式PCR技术同时扩增奶牛Y染色体上雄性决定基因(SRY)和常染色体上的酪蛋白基因(CSN1S1)，进行早期胚胎性别鉴定和胚胎移植，获得高产奶牛。请完成下表相关内容。
实验目的 方法步骤要点
囊胚样品DNA提取 选取①______细胞提取DNA
PCR引物的设计和合成 根据牛的SRY和CSN1S1基因序列设计合成4对引物
PCR扩增 预变性→变性→退火→延伸
鉴定分析 ②____________________ ____________________
③________________ 对受体奶牛注射前列腺素
胚胎移植 将符合要求的胚胎移植到受体奶牛的子宫内
(5)巢式PCR产物鉴定结果如图2所示，1～5号为取自不同胚胎的DNA样品，其中符合要求的胚胎是____________。下列方法也可用于奶牛胚胎性别的鉴定的是______________。
①染色体核型分析法　　②核酸探针杂交法　　③差速离心法　　④抗HY血清免疫学法(HY抗原编码基因位于Y染色体上)
15．(20分)降钙素是一种多肽类激素，临床上用于治疗骨质疏松症等。人体内合成的降钙素活性很低，半衰期较短。某科研机构为了研发一种活性高、半衰期长的新型降钙素，将能人工合成降钙素的DNA与大肠杆菌的DNA分子进行重组，并成功地在大肠杆菌中得以表达。请分析回答下列问题：
(1)图1表示人工合成降钙素DNA的过程。从预期新型降钙素的功能出发，推测相应的脱氧核苷酸序列，并人工合成了两条72个碱基的DNA单链，两条链通过18个碱基对形成部分双链DNA片段，再利用Klenow酶补平，获得双链DNA。从功能看，Klenow酶是一种____________酶，合成的双链DNA有__________个碱基对。
(2)若利用PCR技术对人工合成降钙素DNA进行扩增，在PCR反应体系中需要加入模板序列、Taq酶、原料及__________种引物。设计引物时需要避免引物之间存在_______________，而造成引物之间连接。
(3)研究者利用4种限制酶切割目的基因和质粒，各限制酶的识别序列和切割位点如图所示。
研究者使用不同的限制酶切割目的基因能有效防止目的基因出现__________现象。酶切后的产物连接时，目的基因上SalⅠ切割产生的末端应与质粒上____________切割产生的末端相连接。连接完成后，该连接点______(填“能”或“不能”)被这两种限制酶中的某一种切割。
(4)大肠杆菌是理想的受体细胞，因为它具有______________________________________等优点。
(5)要进行重组质粒的鉴定和选择，质粒还需要含有____________________。若人工合成的降钙素基因在大肠杆菌细胞内正常表达，合成降钙素的场所是____________________________。
答案精析
1．B　[DNA连接酶连接的是两个DNA片段，A错误；烟草花叶病毒的核酸为RNA，限制酶只能切割双链DNA片段而不能切割RNA，B正确；E.coli DNA连接酶只能连接黏性末端，不能连接平末端，C错误；限制酶主要从原核生物中分离纯化而来，但是因为原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰，所以不能剪切自身的DNA，D错误。]
2．B　[图1中酶用来切割DNA，作用的化学键是磷酸二酯键，B错误；分析图1，限制酶XhoⅠ有2处切割位点，切割后产生3个DNA片段，泳道②中是用XhoⅠ处理得到的酶切产物，C正确；分析图1，限制酶XhoⅠ和SalⅠ有5处切割位点，切割后产生6个DNA片段，即用XhoⅠ和SalⅠ同时处理该DNA，电泳后得到6种产物，D正确。]
3．D　[BamHⅠ和Sau3AⅠ两种限制酶切割后形成的黏性末端均为GATC－，A正确；由题意“DNA分子上有4个Sau3AⅠ的酶切位点，经Sau3AⅠ处理后形成4个DNA片段”可知，该DNA分子为环状DNA，用BamHⅠ处理后，得到2个DNA片段，说明该DNA分子上有2个BamHⅠ的酶切位点，B正确；T4 DNA连接酶能连接互补的黏性末端，也可以连接平末端，但连接平末端时的效率比较低，C正确；该DNA分子上有4个Sau3AⅠ的酶切位点，有2个BamHⅠ的酶切位点，但是BamHⅠ识别序列中包含Sau3AⅠ的识别序列，所以同时用两种酶共同处理，不会形成6个大小不同的DNA片段，D错误。]
4．B　[由图示分析可知，在限制性内切核酸酶Ⅰ的识别序列内部含有限制性内切核酸酶Ⅱ的识别序列和切点，若用限制性内切核酸酶Ⅱ切割获得目的基因时，则目的基因的前后各有一个该限制酶的识别序列和切割位点，因此会有4个磷酸二酯键被水解，A正确；若用限制性内切核酸酶Ⅱ切割质粒，两个标记基因都会被破坏，若用限制性内切核酸酶Ⅰ切割目的基因只能切开一端，无法获取目的基因，因此质粒用限制性内切核酸酶Ⅰ切割，目的基因用限制性内切核酸酶Ⅱ切割，B错误。]
5．C　[PCR扩增DNA时，DNA两条链的解旋过程是通过高温来实现的，A错误；合理范围内引物越长，能够配对的概率越低，与模板链结合的特异性越强，B错误；dNTP包括dATP、dGTP、dCTP和dTTP，在子链的形成过程中，可以提供原料和能量，C正确；PCR所需要的酶为热稳定的DNA聚合酶，耐高温，D错误。]
6．A　[磷酸端为DNA链的5′端，羟基端为DNA链的3′端。进行PCR时，引物与模板链的3′端结合，因此在扩增OsMYB56时需要添加的引物是5′—CTTGGATGAT—3′和5′—TCTGTTGAAT—3′，A符合题意。]
7．AC　[引物之间不应存在互补序列，否则会出现引物与引物配对的情况，降低PCR的效率，A正确；DNA复制时，引物先与模板链配对结合，然后从引物的3′端延伸子链，B错误；为了便于扩增的DNA片段与载体连接，常在两条引物上设计加入不同的限制酶识别序列，使目的基因能定向插入表达载体，避免目的基因自身环化，C正确；退火所需的温度、时长与引物有关，而延伸所需的温度、时长与引物无关，D错误。]
8．C　[步骤③可用Ca2＋处理法，即用一定浓度的CaCl2溶液处理大肠杆菌，使其成为感受态细胞，C错误。]
9．A　[通过害虫食用棉花的叶子观察其是否死亡，属于目的基因个体水平上的鉴定，A符合题意。]
10．C　[该过程使用了限制酶XhoⅠ和XbaⅠ切割质粒和Ipp20基因，结合图示可知，在构建目的基因表达载体的过程中氯霉素抗性基因被切掉，保留了潮霉素抗性基因，不管是正常质粒还是重组质粒都含有潮霉素抗性基因，但只有正常质粒才同时含有氯霉素抗性基因，因此，可以先用含有潮霉素的培养基A筛选出导入正常质粒、重组质粒的大肠杆菌，再采用同位影印接种到含有氯霉素的培养基B和含有潮霉素的培养基A中，此时含有重组质粒的大肠杆菌不能在含有氯霉素的培养基B上生长，从而与培养基A(对照)相比会消失一些菌落，对照两个平板上减少的菌落就是符合要求的大肠杆菌菌落，结合图示可知，符合要求的大肠杆菌菌落是3和5，C错误，D正确。]
11．D　[苏云金杆菌中含有一种Bt毒蛋白基因，培育抗虫棉时Bt毒蛋白基因为目的基因，青霉素抗性基因作为标记基因检测Bt毒蛋白基因是否导入大肠杆菌细胞，A错误；不能选用EcoRⅤ酶切质粒，否则会破坏青霉素抗性基因(唯一的标记基因)，影响筛选目标细胞，B错误；启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，用于启动基因的转录，C错误。]
12．AC　[将重组质粒导入细菌B之前，一般要先用Ca2＋处理细菌，使之处于感受态，从而能够更好地吸收重组质粒，A正确；质粒A中含有四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因，而重组质粒中四环素抗性基因被破坏，只含氨苄青霉素抗性基因，则在含有氨苄青霉素的培养基上能生长的是导入质粒A或重组质粒的细菌，B错误；能在含有四环素的培养基上生长的是导入了质粒A的细菌，C正确；目的基因(人的生长激素基因)成功表达的标志是受体细胞能产生人的生长激素，D错误。]
13．(1)使目的基因进入受体细胞并有效表达，而且能稳定存在并遗传给后代　(2)使DNA片段能定向插入表达载体，减少自身连接　BamHⅠ、SacⅠ　(3)②⑤　⑥　(4)RNA聚合酶　依据bar表达推测目的基因同时表达　(5)水稻愈伤组织细胞分裂旺盛，全能性高　再分化　耐盐基因OsMYB56转录或翻译异常(或耐盐基因OsMYB56表达异常)
解析　(1)过程②是构建基因表达载体，这是基因工程的核心，其目的是使目的基因进入受体细胞并有效表达，而且能稳定存在并遗传给后代。(2)分析引物的序列发现存在GGATCC和GAGCTC的序列，结合表格中不同限制酶的识别序列和切割位点可知，这两个序列可以分别被BamHⅠ和SacⅠ识别，故选用限制酶BamHⅠ和SacⅠ。(3)进行扩增时，②退火温度、⑤退火时间的设定与引物有关，⑥延伸时间的设定与扩增片段的长度有关，一般扩增片段越长，延伸时间越长。(4)花椰菜病毒启动子位于基因的上游，是一段特殊的DNA片段，是RNA聚合酶识别和结合的部位。有了启动子才能驱动基因的转录，最终获得相关表达产物，本研究中设计两个相同启动子分别连接bar和目的基因，可以保证这两种基因的同时表达，故其目的是依据bar表达推测目的基因同时表达。(5)过程④是转化，选择愈伤组织细胞来转化的主要原因是水稻愈伤组织细胞分裂旺盛，全能性高，通过植物组织培养可以获得转基因植株。图中⑤属于组织培养中的愈伤组织再分化为小植株的过程。经检测，科研人员发现部分获得耐盐基因OsMYB56的水稻幼苗不具有耐盐能力，原因可能是虽然获得了相应的基因，但耐盐基因OsMYB56转录或翻译异常(或耐盐基因OsMYB56表达异常)。
14．(1)Taq酶(热稳定的DNA聚合酶)　dNTP(4种脱氧核苷三磷酸)　(2)退火　内引物　(3)上升　高　(4)①滋养层
②采用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定，确定胚胎性别　③同期发情处理　(5)1、2、4号　①②④
解析　(5)题中利用多重巢式PCR技术同时扩增Y染色体上雄性决定基因(SRY)和常染色体上的酪蛋白基因(CSN1S1)进行电泳，雌性个体没有SRY，只有一条带，雄性有两条带，因此1、2、4号是雌性，3、5号是雄性，其中符合要求的胚胎是1、2、4号。X、Y染色体形态不同，因此①染色体核型分析法可用于进行性别鉴定；可将Y染色体上雄性决定基因(SRY)制成探针，因此可用核酸探针杂交法鉴定性别；③差速离心法是分离各种细胞器的方法，不能鉴定性别；④抗HY血清免疫学法(HY抗原编码基因位于Y染色体上)也可用于鉴定性别。
15．(1)DNA聚合　126　(2)2　互补序列　(3)自身环化　XhoⅠ　不能　(4)繁殖快、为单细胞生物、遗传物质相对较少　(5)标记基因　核糖体
解析　(1)由图1可知，Klenow酶能催化DNA的合成，应为DNA聚合酶；合成的双链DNA含有(72－18)×2＋18＝126(个)碱基对。(2)若利用PCR技术对人工合成的降钙素DNA进行扩增，在PCR反应体系中需要加入模板序列、Taq酶、原料及2种引物。引物是一小段DNA片段，PCR扩增目的基因时，引物之间不能存在互补序列，否则会引起引物之间连接。(3)同种限制酶切割目的基因，目的基因两端的黏性末端是相同的，可能出现自身环化现象，所以研究者使用不同的限制酶切割目的基因能有效防止目的基因出现自身环化现象。根据图示中4种限制酶的识别序列和切割位点可知，限制酶 NstⅠ与限制酶PstⅠ切割形成的黏性末端相同，限制酶SalⅠ与限制酶XhoⅠ切割形成的黏性末端相同，因此将酶切后的产物连接时，目的基因上SalⅠ切割产生的末端应与质粒上XhoⅠ切割产生的末端相连接。连接完成后，该连接点的脱氧核苷酸序列与原来的不同，所以不能被这两种限制酶中的某一种切割。(5)要进行重组质粒的鉴定和选择，质粒需要含有标记基因，标记基因的作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。降钙素是一种多肽类激素，若人工合成的降钙素基因在大肠杆菌细胞内正常表达，合成降钙素的场所是核糖体。

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