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第二节　发酵工程的无菌技术
第1课时　发酵工程的灭菌方法、灭菌设备、无菌操作器具及微生物接种和传代的无菌技术
课时概念解析　本课时的概念为“无菌技术是在操作过程中，保持物品与操作区域不被微生物污染的技术”“发酵工程中灭菌是获得纯净的微生物培养物的前提”，这两个概念的建构需要以下基本概念或证据的支持：
1.灭菌是获得纯净的微生物培养物的前提，根据操作对象的不同，可选择相应的灭菌设备、灭菌方法杀灭或去除设备和相关材料中的微生物。
2.对发酵工程中的无菌操作器具进行灭菌并掌握其正确使用方法，才能保证发酵工程所需的无菌条件。
3.斜面接种是保存菌种的常用方法。
一、发酵工程的灭菌方法
1.无菌技术
在操作过程中，保持物品与操作区域的________状态并________________的技术，其核心是________。
2.灭菌方法
灭菌方法 灭菌原理 应用
化学方法 化学试剂灭菌法 一些化学试剂如________、氯、________，能破坏微生物的________或细胞结构，具有杀菌作用 由于灭菌剂可能会与培养基中的一些成分发生作用，因此一般不用于________的灭菌
物理方法 射线灭菌法 利用________等产生的________或X射线和γ射线等进行灭菌 紫外线一般用于____________的灭菌
干热灭菌法(包括________灭菌法和________法等) 高温干热使微生物的结构被破坏、____________变性 ①干热空气灭菌的条件一般是140～160 ℃，2～3 h，主要用于要求________的实验器具(如培养皿、________和移液管)的灭菌；②火焰灼烧法常用于________等操作过程
物理方法 湿热灭菌法(一般在温度为________、气压约____ kPa的条件下维持15～20 min) 蒸汽与较低温的物体表面接触凝结为水时可放出________，吸收了蒸汽水分和热量的菌体蛋白质易________ 适用于耐高温、耐湿热的物品，如对培养基的灭菌，在相同温度下湿热灭菌比干热灭菌________
过滤除菌法 通过________阻留微生物从而达到除菌目的 制备________；在产品提取过程中处理料液，获得无菌产品
提醒：①以上灭菌方法有时可以结合使用，灭菌效果更显著。
②实验操作者应形成有菌意识，避免已经灭菌处理的材料用具与周围物品接触。
[微思考]
所有的操作对象都可以进行灭菌处理吗？
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[辨正误]
(1)灭菌是获得纯净的微生物培养物的前提。(　　)
(2)培养基最常用的灭菌方法是湿热灭菌法。(　　)
(3)相同温度下，干热灭菌比湿热灭菌更有效。(　　)
(4)工业生产中制备无菌空气常用过滤除菌法。(　　)
1.下图为接种环的灼烧灭菌的示意图，请据图回答：
(1)酒精灯火焰A、B代表充分燃烧层的是________。灭菌先后的正常顺序是____________(用序号和箭头表示)。
(2)除火焰灼烧法外，干热灭菌法还包括____________法。该方法主要用于____________的实验器具。
2.无菌技术内容包括灭菌、消毒、操作规则和管理制度。灭菌是指用物理或化学等方法，杀灭或除去所有致病和非致病微生物繁殖体和芽孢的方法。消毒则是指杀灭病原微生物和其他有害微生物，但并不要求杀灭所有微生物(如芽孢等)。
(1)请判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。
①培养细菌用的培养基与培养皿。②玻璃棒、试管、锥形瓶和移液管。③实验操作者的双手。
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(2)培养基灭菌为什么采用高压蒸汽灭菌而不采用干热灭菌？______________________________________________________________________
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【学以致用】
1.(2024·江苏淮安阶段练习)无菌技术是发酵工程的重要技术。使用的接种针、接种环，最好采用的灭菌方法是(　　)
A.紫外线等射线灭菌法
B.干热空气灭菌法
C.湿热灭菌法
D.火焰灼烧法
2.(多选)(2023·江苏盐城模拟预测)无菌技术在微生物培养中至关重要，下列相关叙述正确的是(　　)
A.培养基高压蒸汽灭菌后，再将培养基的pH调整为中性或微碱性
B.吸管、培养皿、金属用具等可放入干热灭菌箱进行灭菌
C.使用后的培养基应立即丢弃，以免污染实验室其他培养物
D.空气过滤除菌并不能杀死空气中的微生物
二、发酵工程的灭菌设备和无菌操作器具
1.发酵工程的灭菌设备
(1)电热鼓风干燥箱
①应用：常用于________的玻璃器皿(如________、离心管、移液管)、________用具(如镊子、手术刀)和其他耐高温的物品(如菌种保藏采用的沙土管、石蜡油、碳酸钙)的灭菌。
②优点：使灭菌器皿保持________。
③局限：带有________或________的物品、液体及固体________一般不能采用电热鼓风干燥箱干热灭菌。
④彻底灭菌的标准及灭菌条件
标准：一般以能否杀死____________作为彻底灭菌的标准。
灭菌条件：温度提高到约________，加热2～3 h。
(2)高压蒸汽灭菌锅
①灭菌原理：在一个密闭的锅内，水的________随蒸汽压力的增高而________，加压的同时提高蒸汽的________，使锅内的待灭菌物品在一定压力和温度等条件下，杀死其中________微生物的营养体及其________。
②类型：有________高压蒸汽灭菌锅和________高压蒸汽灭菌锅两类。
③使用步骤：
④注意事项：操作人员必须在现场规范操作，严格控制________维持灭菌时的________。锅内压力过高，不仅培养基的营养________会被破坏，而且高压锅超过耐压范围后可能会发生________，造成伤人事故等。
[微思考]
使用高压蒸汽灭菌锅时，务必待压力表指针降至“0”点，才能打开排气阀，开盖。如何理解压力表指针显示的压力“0”？
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(3)空气除菌设备
①空气除菌原因：通常在空气中含有灰尘颗粒和各种________，在阴雨天气或环境污染比较严重的情况下，空气中会悬浮大量的微生物。这些微生物一旦进入营养丰富的培养基中，会很快繁殖，影响________过程。
②空气除菌方法：常采用____________的方法，即让含菌空气通过无菌干燥的过滤介质，以________空气中所含微生物。
提醒：空气过滤除菌后，空气含菌量会降低到一个极低的比例，达到几乎无菌的程度。
2.发酵工程的无菌操作器具
(1)接种器具
①接种：在________条件下将微生物接入____________的操作过程。
②常用的接种器具：玻璃涂布器、________、接种环等。
③应用：玻璃涂布器常用于____________接种，接种针用于________接种，接种环用于________接种或在平板培养基上________接种。
(2)转移器具
①移液管：用来准确移取一定体积的溶液或________化学试剂的量器。一般用于转移部分________培养物、________微生物或________化学试剂。
②刻度移液管：具有________的直形玻璃管，在需要控制试剂加入量时使用。
③移液管的使用要点
a.以拇指及中指捏住管颈标线________的地方，将移液管插入待取溶液液面下约1 cm。
b.移液管不应伸入太多，以免管尖外壁粘有________溶液；也不应伸入太少，以免液面下降后而________。
④操作步骤
⑤微量取液器：取液量____________时(如0.1 mL)使用。分为固定容量的和________容量的两种。
(3)超净工作台
①概念：超净工作台是一种经过________净化而形成高洁净操作环境的设备。
②净化原理：利用工作台内________的杀菌作用，并通过____________过滤确保工作台内空气的无菌、无污染。
③注意事项：超净工作台开机杀菌30 min后，需先关掉________，约________后方可使用。
[辨正误]
(1)菌体蛋白质的变性温度与含水量相关，一般来说含水量越低，变性温度越高。(　　)
(2)不得将易腐、易燃、易爆物品放入电热鼓风干燥箱内干燥灭菌。(　　)
(3)当高压蒸汽灭菌锅的压力表指针降至“0”点时，即可出锅。(　　)
(4)制备氨基酸、抗生素等的发酵过程，所需的微生物对空气无菌的要求较低。(　　)
(5)斜面接种和穿刺接种用到的接种器具都是接种环。(　　)
(6)将移液管移入准备接受溶液的容器时，为避免污染，移液管不能接触器壁。(　　)
高压蒸汽灭菌锅利用电热丝加热水产生蒸汽，并能维持一定压力的装置。主要由一个可以密封的桶体，压力表，排气阀，安全阀，电热丝等组成。利用高压蒸汽灭菌锅进行湿热灭菌是应用广泛的一种灭菌方法。
(1)某同学在使用高压蒸汽灭菌锅时，若压力达到设定要求，而锅内并没有达到相应温度，最可能的原因是什么？
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(2)某同学从高压蒸汽灭菌锅内拿出培养基后发现，培养基已经溅满了锥形瓶的瓶壁，最可能的原因是什么？
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【学以致用】
3.(多选)如图是灭菌锅及其局部剖面示意图，下列相关叙述正确的是(　　)
A.甲、乙、丙分别是排气阀、安全阀和压力表
B.使用时应在锅内水煮沸并排出全部冷空气后再关闭乙
C.灭菌结束后应立即打开乙，放出锅内热蒸汽
D.将器皿放入灭菌锅之前通常用牛皮纸或报纸包扎，避免灭菌后的再次污染
4.(多选)接种的方法不同，所采用的接种器具也有区别。下图所示接种工具常用于(　　)
A.穿刺接种
B.斜面接种
C.平板稀释涂布接种
D.平板划线接种
三、微生物接种和传代的无菌技术
1.菌种的传代和保存的原理
让菌种在人工创造的条件下，________细胞的代谢水平，使细胞基本处于________状态，即微生物的生长繁殖受到抑制但又不至于________。
2.菌种保存的重要条件
____________。
3.接种方法
(1)厌氧微生物接触氧气会受到抑制、损伤甚至死亡，常采用________接种。
(2)________是常用的菌种传代和低温下保存菌种的方法。
4.斜面接种和培养酵母菌
准备接种→接种环________→试管口________→挑取菌体→________→培养。
[微思考]
酒精灯在酵母菌的接种和培养实验中有何作用？
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5.菌种保存
挑选典型菌落→接种在斜面培养基上→培养使其________生长→试管用牛皮纸包扎→置于________左右的冰箱中保藏→通常每隔________个月重新接种一次，再继续保存。
[微思考]
菌种为何要在低温条件下保存？
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[辨正误]
(1)穿刺接种是常用的菌种传代和低温下保存菌种的方法。(　　)
(2)厌氧微生物常采用穿刺接种的方法将其保护在培养基中。(　　)
(3)对接种环进行灼烧灭菌时，只需要在酒精灯火焰上灼烧环状部分。(　　)
(4)将含有新鲜菌种的试管放在－4 ℃的冰箱中保藏有利于延长保存时间。(　　)
如图A、B是两种常见的微生物接种方法，请分析回答下列问题：
(1)A、B两种接种方法分别是____________________，采用的接种器具分别是________________。
(2)实验室培养、保存厌氧菌应采用图中的________方法。教材P20酵母菌的接种和培养采用的是图中的________方法。
斜面接种和培养酵母菌的无菌操作
【学以致用】
5.下列斜面接种划线示意图正确的是(　　)
6.(2024·江苏淮安阶段练习)下列是关于“斜面接种和培养酵母菌”实验操作的叙述，错误的是(　　)
A.将接种环的环端和可能伸入试管的部分在火焰上来回灼烧多次，以达到彻底灭菌的目的
B.灼烧的接种环在酒精灯火焰旁冷却后，伸入菌种管轻挑少许菌体
C.从菌种管抽出接种环时，不能让其带菌部位触及管壁
D.接种环在斜面接种后，需多次灼烧以保证无菌，冷却后放回原处
1.(2023·江苏淮安月考)消毒与灭菌是两个不同的概念，灭菌就是指彻底杀灭微生物使其永远丧失生长繁殖的能力，消毒仅指杀死一部分对人体有害的病原菌而对被消毒的物体基本无害，下列哪些事物适用于消毒处理(　　)
①皮肤　②饮用水　③牛奶　④注射器
⑤培养皿　⑥接种环　⑦培养基　⑧果汁　⑨酱油　⑩手术刀
A.①②③⑧⑨ B.④⑤⑥⑦⑩
C.①②④⑤⑥⑧ D.以上全部
2.如图是实验室用的一种高压蒸汽灭菌锅。下列有关其结构和使用的说法，正确的是(　　)
A.在灭菌桶内装入待灭菌物品时，不要装得太挤，以免影响灭菌效果
B.1是安全阀，其下方有软管通入灭菌筒内，用于排出灭菌筒内的冷空气
C.在压力103 kPa、温度121 ℃条件下15～20 min后，可以立即打开排气阀放气
D.盖上灭菌锅盖后，应按顺时针方向依次拧紧螺栓，以确保锅盖密封
3.下列关于发酵工程的灭菌设备和无菌操作器具的叙述，错误的是(　　)
A.杀死霉菌孢子所需的温度比霉菌的营养细胞高
B.在高压蒸汽灭菌锅内的压力没有降到“0”点前不能打开高压蒸汽灭菌锅的锅盖
C.空气过滤除菌法能杀死空气中的微生物
D.臭氧分子有很强的杀菌作用，但也对操作人员的健康有害
4.(2023·江苏淮安阶段练习)将微生物接入培养基的操作过程称为接种。下列是关于接种方法的叙述，错误的是(　　)
A.用玻璃涂布器可进行平板稀释涂布接种
B.用接种针可进行穿刺接种
C.用接种环在平板培养基上划线接种
D.用接种针在试管里做斜面接种
5.(多选)下列关于酵母菌斜面接种操作过程的叙述，错误的是(　　)
A.接种环灼烧灭菌后，要立即挑取菌种划线接种，以减少污染的机会
B.在火焰附近取下盛有菌种的试管塞后要将试管口通过火焰2～3次
C.将接种环伸入盛有菌种的试管内，先接触带菌部位
D.接种完成后要将试管口与试管塞分别灭菌，然后塞紧试管
第二节　发酵工程的无菌技术
第1课时　发酵工程的灭菌方法、灭菌设备、无菌操作器具及微生物接种和传代的无菌技术
一、
自主梳理
1.无菌　不被微生物污染　灭菌
2.甲醛　高锰酸钾　蛋白质　培养基　紫外线　高能粒子　表面和空气　干热空气　火焰灼烧　蛋白质、核酸　保持干燥　接种针　接种　121 ℃　100　大量能量　变性　更有效　过滤　无菌空气
微思考
提示：一般情况下，对能灭菌的对象进行灭菌处理，如培养基、培养皿以及接种工具；对不能灭菌的对象进行消毒处理，如操作者的衣着和手等。
辨正误
(1)√　(2)√　(3)×　提示：相同温度下，湿热灭菌比干热灭菌更有效。
(4)√
合作探究
1.(1)A　③→①→②　(2)干热空气灭菌　要求保持干燥
2.(1)提示：①培养基要湿热灭菌，培养皿要干热灭菌。②玻璃器皿要干热灭菌。③双手要酒精消毒。
(2)提示：干热灭菌箱内的高温会导致培养基的水分散失，而高压蒸汽锅内的湿度较大，不会导致培养基的水分散失。
学以致用
1.D　[紫外线等射线灭菌法适用于接种室、接种箱或超净工作台，A不符合题意；干热空气灭菌法适用于耐高温的和需要保持干燥的物品，如玻璃器皿(如吸管、培养皿等)、金属用具等，B不符合题意；湿热灭菌法是一种利用沸水、流通蒸汽或高压蒸汽灭菌的方法，一般培养基的灭菌常用该方法，C不符合题意；灼烧灭菌法是指将微生物的接种工具，如涂布器、接种环、接种针或其他金属用具，直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧，可以迅速彻底的灭菌，D符合题意。]
2.BD　[应将培养基的pH调整为中性或微碱性，再对培养基进行高压蒸汽灭菌，以免杂菌污染，A错误；吸管、培养皿、金属用具等可以使用干热灭菌法，将灭菌物品放入干热灭菌箱进行灭菌，B正确；使用后的培养基应灭菌处理后置于回收桶中，以免污染环境，C错误；空气过滤除菌是通过过滤阻留微生物从而达到除菌目的，微生物并没有被杀死，D正确。]
二、
自主梳理
1.(1)①空　培养皿　金属　②干燥　③胶皮　塑料　培养基
④细菌的芽孢　160 ℃　(2)①沸点　上升　温度　所有　芽孢　②手动式　全自动　③水位标记线　1/3　排气阀　冷空气　103　121　15～20　0　温度　④热源　压力　成分　爆炸
微思考
提示：压力表指针显示的压力“0”指的是锅内外的压力差是0 ，而不是锅内的压力是0。
(3)①杂菌　发酵　②空气过滤除菌　阻截
2.(1)①无菌　培养基　②接种针　③平板稀释涂布　穿刺　斜面　划线　(2)①分装　液体　系列稀释　分装　②刻度　③以上　过多　吸空　④液面　1 cm　下端外壁　垂直　缓缓　下端　顺壁　⑤很少　可调　(3)①空气　②紫外线灯　空气过滤器　③紫外线灯　10 min
辨正误
(1)√　(2)√
(3)×　提示：待温度下降后，才能打开排气阀。
(4)×　提示：对空气无菌的要求较高。
(5)×　提示：穿刺接种用到的接种器具是接种针。
(6)×　提示：将移液管移入准备接受溶液的容器时，移液管出口尖端接触器壁。
合作探究
(1)提示：加热后未排出锅内残留的冷空气。
(2)提示：高压蒸汽灭菌锅的压力表指针还未降至“0”点，就提前打开了高压蒸汽灭菌锅，导致锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出锥形瓶。
学以致用
3.BD　[甲、乙、丙分别是安全阀、排气阀和压力表，A错误；灭菌结束后，应切断热源，当压力表指针降至“0”点，待温度下降后，再打开排气阀，以防止提前打开排气阀，锅内压力突然下降，导致灭菌容器内的液体冲出容器，造成污染或安全事故，C错误。]
4.BD　[图示接种工具是接种环。穿刺接种采用的是接种针，平板稀释涂布接种采用的是玻璃涂布器，斜面接种和平板划线接种采用的是接种环。]
三、
自主梳理
1.降低　休眠　死亡
2.低温、干燥、真空
3.(1)穿刺　(2)斜面接种
4.灭菌　灭菌　接种
微思考
提示：①对接种环、试管口、试管塞进行灼烧灭菌；②酒精灯火焰周围形成一个无菌区域，提供无菌操作环境。
5.充分　4 ℃　2～3
微思考
提示：减缓培养基的水分蒸发，延长保存时间。
辨正误
(1)×　提示：斜面接种是常用的菌种传代和低温下保存菌种的方法。
(2)√
(3)×　提示：接种环的环端和接种时可能进入试管的部分都需要灼烧灭菌。
(4)×　提示：将含有新鲜菌种的试管放在4 ℃的冰箱中保藏有利于延长保存时间。
合作探究
(1)提示：穿刺接种、斜面接种　接种针、接种环
(2)提示：A　B
学以致用
5.A　[正确的接种方法是将带菌的接种环伸入待接种的试管中，在培养基斜面上由底部向上轻划“Z”型折线，将菌种接种到培养基上。]
6.B　[为避免杂菌污染，可将接种环的环端和可能伸入试管的部分在火焰上来回灼烧多次，A正确；将灭过菌的接种环伸入菌种管，先将环部接触培养基斜面顶端或其他无菌体的培养基部位使其冷却，再轻轻挑取少许菌体，在抽出接种环时，注意其带菌部位不要触及管壁或通过火焰，B错误，C正确；接种后灼烧是为了杀死残留的菌体，接种环在斜面接种后，需多次灼烧以保证无菌，冷却后放回原处，D正确。]
随堂检测
1.A　[消毒指用比较温和的方法杀死微生物的营养细胞，适用于那些不耐高温的液体，如③牛奶、⑧果汁、⑨酱油，这样可以使其中的营养成分不被破坏；对要求不是很严格的①皮肤、②饮用水也用消毒的方法处理；而对于严格要求的④注射器、⑤培养皿、⑥接种环、⑦培养基、⑩手术刀等必须进行灭菌处理。所以，①②③⑧⑨应该用消毒的方法处理，A正确，B、C、D错误。]
2.A　[1是安全阀，排气阀的下方有软管通入灭菌筒内，用于排出灭菌筒内的冷空气，B错误；在压力103 kPa、温度121 ℃条件下15～20 min后，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至“0”时，打开排气阀，C错误；盖上灭菌锅盖后，以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，以确保锅盖密封，D错误。]
3.C　[空气过滤除菌法是让含菌空气通过无菌干燥的过滤介质，以阻截空气中所含微生物，并不能杀死空气中的微生物，C错误。]
4.D　[玻璃涂布器是常用的接种工具，平板稀释涂布接种采用的是玻璃涂布器，A正确；穿刺接种采用的是接种针，B正确；平板划线法用接种环在平板培养基上划线接种，C正确；斜面接种采用的是接种环，D错误。]
5.AC　[接种环灼烧灭菌后，立即挑取菌种会杀死菌种，应冷却后再挑取菌种，A错误；接种环伸入盛有菌种的试管内，要先接触培养基斜面顶端或其他无菌体的培养基部位，待接种环冷却后再轻轻挑取少许菌种，C错误。](共56张PPT)
第一章　发酵工程 第二节　发酵工程的无菌技术　
第1课时　发酵工程的灭菌方法、灭菌设备、无菌操作器具及微生物接种和传代的无菌技术
本课时的概念为“无菌技术是在操作过程中，保持物品与操作区域不被微生物污染的技术”“发酵工程中灭菌是获得纯净的微生物培养物的前提”，这两个概念的建构需要以下基本概念或证据的支持：
1.灭菌是获得纯净的微生物培养物的前提，根据操作对象的不同，可选择相应的灭菌设备、灭菌方法杀灭或去除设备和相关材料中的微生物。
2.对发酵工程中的无菌操作器具进行灭菌并掌握其正确使用方法，才能保证发酵工程所需的无菌条件。
3.斜面接种是保存菌种的常用方法。
课时概念解析
目录 CONTENTS
1.发酵工程的灭菌方法
2.发酵工程的灭菌设备
和无菌操作器具
4.随堂检测
自主梳理
合作探究
合作探究
自主梳理
3.微生物接种和传代的
无菌技术
合作探究
思维导图
自主梳理
1.无菌技术
在操作过程中，保持物品与操作区域的______状态并________________的技术，其核心是______。
无菌
不被微生物污染
灭菌
2.灭菌方法
灭菌方法 灭菌原理 应用
化学方法 化学试剂灭菌法 一些化学试剂如甲醛、氯、高锰酸钾，能破坏微生物的蛋白质或细胞结构，具有杀菌作用 由于灭菌剂可能会与培养基中的一些成分发生作用，因此一般不用于培养基的灭菌
物理方法 射线灭菌法 利用________等产生的_________或X射线和γ射线等进行灭菌 紫外线一般用于____________的灭菌
干热灭菌法(包括__________灭菌法和__________法等) 高温干热使微生物的结构被破坏、______________变性 ①干热空气灭菌的条件一般是140～160 ℃，2～3 h，主要用于要求___________的实验器具
(如培养皿、________和移液管)的灭菌；②火焰灼烧法常用于______等操作过程
紫外线
高能粒子
表面和空气
干热空气
火焰灼烧
蛋白质、核酸
保持干燥
接种针
接种
物理方法 湿热灭菌法(一般在温度为________、气压约________ kPa的条件下维持15～20 min) 蒸汽与较低温的物体表面接触凝结为水时可放出__________，吸收了蒸汽水分和热量的菌体蛋白质易______ 适用于耐高温、耐湿热的物品，如对培养基的灭菌，在相同温度下湿热灭菌比干热灭菌________
过滤除菌法 通过______阻留微生物从而达到除菌目的 制备__________；在产品提取过程中处理料液，获得无菌产品
121 ℃
100
大量能量
变性
更有效
过滤
无菌空气
提醒：①以上灭菌方法有时可以结合使用，灭菌效果更显著。
②实验操作者应形成有菌意识，避免已经灭菌处理的材料用具与周围物品接触。
[微思考]
所有的操作对象都可以进行灭菌处理吗？
提示：一般情况下，对能灭菌的对象进行灭菌处理，如培养基、培养皿以及接种工具；对不能灭菌的对象进行消毒处理，如操作者的衣着和手等。
×
√
[辨正误]
(1)灭菌是获得纯净的微生物培养物的前提。( )
(2)培养基最常用的灭菌方法是湿热灭菌法。( )
(3)相同温度下，干热灭菌比湿热灭菌更有效。( )
提示：相同温度下，湿热灭菌比干热灭菌更有效。
(4)工业生产中制备无菌空气常用过滤除菌法。( )
√
√
1.下图为接种环的灼烧灭菌的示意图，请据图回答：
(1)酒精灯火焰A、B代表充分燃烧层的是____。灭菌先后的正常顺序是____________ (用序号和箭头表示)。
(2)除火焰灼烧法外，干热灭菌法还包括______________法。该方法主要用于______________的实验器具。
A
③→①→②
干热空气灭菌
要求保持干燥
2.无菌技术内容包括灭菌、消毒、操作规则和管理制度。灭菌是指用物理或化学等方法，杀灭或除去所有致病和非致病微生物繁殖体和芽孢的方法。消毒则是指杀灭病原微生物和其他有害微生物，但并不要求杀灭所有微生物(如芽孢等)。
(1)请判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。
①培养细菌用的培养基与培养皿。②玻璃棒、试管、锥形瓶和移液管。③实验操作者的双手。
提示：①培养基要湿热灭菌，培养皿要干热灭菌。②玻璃器皿要干热灭菌。③双手要酒精消毒。
(2)培养基灭菌为什么采用高压蒸汽灭菌而不采用干热灭菌？
提示：干热灭菌箱内的高温会导致培养基的水分散失，而高压蒸汽锅内的湿度较大，不会导致培养基的水分散失。
●消毒和灭菌的区别
消毒 灭菌
条件 使用较为温和的物理、化学或生物等方法 使用强烈的理化因素
原理 杀死物体表面或内部一部分的微生物，不包括芽孢和孢子 杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子
适用范围 实验操作的空间、操作者的衣物和手 微生物的培养皿、接种用具和培养基等
常用方法 煮沸消毒法、巴氏消毒法、紫外线消毒法和酒精消毒等 干热灭菌法、湿热灭菌法等
【 学以致用 】
D
1.(2024·江苏淮安阶段练习)无菌技术是发酵工程的重要技术。使用的接种针、接种环，最好采用的灭菌方法是(　　)
A.紫外线等射线灭菌法 B.干热空气灭菌法
C.湿热灭菌法 D.火焰灼烧法
解析：紫外线等射线灭菌法适用于接种室、接种箱或超净工作台，A不符合题意；
干热空气灭菌法适用于耐高温的和需要保持干燥的物品，如玻璃器皿(如吸管、培养皿等)、金属用具等，B不符合题意；
湿热灭菌法是一种利用沸水、流通蒸汽或高压蒸汽灭菌的方法，一般培养基的灭菌常用该方法，C不符合题意；
灼烧灭菌法是指将微生物的接种工具，如涂布器、接种环、接种针或其他金属用具，直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧，可以迅速彻底的灭菌，D符合题意。
BD
2.(多选)(2023·江苏盐城模拟预测)无菌技术在微生物培养中至关重要，下列相关叙述正确的是(　　)
A.培养基高压蒸汽灭菌后，再将培养基的pH调整为中性或微碱性
B.吸管、培养皿、金属用具等可放入干热灭菌箱进行灭菌
C.使用后的培养基应立即丢弃，以免污染实验室其他培养物
D.空气过滤除菌并不能杀死空气中的微生物
解析：应将培养基的pH调整为中性或微碱性，再对培养基进行高压蒸汽灭菌，以免杂菌污染，A错误；
吸管、培养皿、金属用具等可以使用干热灭菌法，将灭菌物品放入干热灭菌箱进行灭菌，B正确；
使用后的培养基应灭菌处理后置于回收桶中，以免污染环境，C错误；
空气过滤除菌是通过过滤阻留微生物从而达到除菌目的，微生物并没有被杀死，D正确。
1.发酵工程的灭菌设备
(1)电热鼓风干燥箱
①应用：常用于____的玻璃器皿(如________、离心管、移液管)、______用具(如镊子、手术刀)和其他耐高温的物品(如菌种保藏采用的沙土管、石蜡油、碳酸钙)的灭菌。
②优点：使灭菌器皿保持______。
③局限：带有______或______的物品、液体及固体________一般不能采用电热鼓风干燥箱干热灭菌。
空
培养皿
金属
干燥
胶皮
塑料
培养基
④彻底灭菌的标准及灭菌条件
标准：一般以能否杀死____________作为彻底灭菌的标准。
灭菌条件：温度提高到约_______，加热2～3 h。
(2)高压蒸汽灭菌锅
①灭菌原理：在一个密闭的锅内，水的沸点随蒸汽压力的增高而______，加压的同时提高蒸汽的______，使锅内的待灭菌物品在一定压力和温度等条件下，杀死其中所有微生物的营养体及其______。
②类型：有________高压蒸汽灭菌锅和________高压蒸汽灭菌锅两类。
细菌的芽孢
160 ℃
上升
温度
芽孢
手动式
全自动
③使用步骤：
水位标记线
1/3
排气
阀
冷空气
103
121
15～20
0
温度
④注意事项：操作人员必须在现场规范操作，严格控制______维持灭菌时的______。锅内压力过高，不仅培养基的营养______会被破坏，而且高压锅超过耐压范围后可能会发生______，造成伤人事故等。
热源
压力
成分
爆炸
[微思考]
使用高压蒸汽灭菌锅时，务必待压力表指针降至“0”点，才能打开排气阀，开盖。如何理解压力表指针显示的压力“0”？
提示：压力表指针显示的压力“0”指的是锅内外的压力差是0 ，而不是锅内的压力是0。
(3)空气除菌设备
①空气除菌原因：通常在空气中含有灰尘颗粒和各种______，在阴雨天气或环境污染比较严重的情况下，空气中会悬浮大量的微生物。这些微生物一旦进入营养丰富的培养基中，会很快繁殖，影响______过程。
②空气除菌方法：常采用______________的方法，即让含菌空气通过无菌干燥的过滤介质，以______空气中所含微生物。
提醒：空气过滤除菌后，空气含菌量会降低到一个极低的比例，达到几乎无菌的程度。
杂菌
发酵
空气过滤除菌
阻截
2.发酵工程的无菌操作器具
(1)接种器具
①接种：在______条件下将微生物接入________的操作过程。
②常用的接种器具：玻璃涂布器、________、接种环等。
③应用：玻璃涂布器常用于______________接种，接种针用于______接种，接种环用于______接种或在平板培养基上______接种。
无菌
培养基
接种针
平板稀释涂布
穿刺
斜面
划线
(2)转移器具
①移液管：用来准确移取一定体积的溶液或______化学试剂的量器。一般用于转移部分______培养物、__________微生物或______化学试剂。
②刻度移液管：具有______的直形玻璃管，在需要控制试剂加入量时使用。
③移液管的使用要点
a.以拇指及中指捏住管颈标线________的地方，将移液管插入待取溶液液面下约1 cm。
b.移液管不应伸入太多，以免管尖外壁粘有______溶液；也不应伸入太少，以免液面下降后而______。
分装
液体
系列稀释
分装
刻度
以上
过多
吸空
④操作步骤
液面
1 cm
下端外壁
垂直
缓缓
下端
顺壁
⑤微量取液器：取液量______时(如0.1 mL)使用。分为固定容量的和______容量的两种。
(3)超净工作台
①概念：超净工作台是一种经过______净化而形成高洁净操作环境的设备。
②净化原理：利用工作台内__________的杀菌作用，并通过____________过滤确保工作台内空气的无菌、无污染。
③注意事项：超净工作台开机杀菌30 min后，需先关掉__________，约________后方可使用。
很少
可调
空气
紫外线灯
空气过滤器
紫外线灯
10 min
×
√
[辨正误]
(1)菌体蛋白质的变性温度与含水量相关，一般来说含水量越低，变性温度越高。( )
(2)不得将易腐、易燃、易爆物品放入电热鼓风干燥箱内干燥灭菌。( )
(3)当高压蒸汽灭菌锅的压力表指针降至“0”点时，即可出锅。( )
提示：待温度下降后，才能打开排气阀。
(4)制备氨基酸、抗生素等的发酵过程，所需的微生物对空气无菌的要求较低。( )
提示：对空气无菌的要求较高。
√
×
(5)斜面接种和穿刺接种用到的接种器具都是接种环。( )
提示：穿刺接种用到的接种器具是接种针。
(6)将移液管移入准备接受溶液的容器时，为避免污染，移液管不能接触器壁。( )
提示：将移液管移入准备接受溶液的容器时，移液管出口尖端接触器壁。
×
×
高压蒸汽灭菌锅利用电热丝加热水产生蒸汽，并能维持一定压力的装置。主要由一个可以密封的桶体，压力表，排气阀，安全阀，电热丝等组成。利用高压蒸汽灭菌锅进行湿热灭菌是应用广泛的一种灭菌方法。
(1)某同学在使用高压蒸汽灭菌锅时，若压力达到设定
要求，而锅内并没有达到相应温度，最可能的原因是
什么？
提示：加热后未排出锅内残留的冷空气。
(2)某同学从高压蒸汽灭菌锅内拿出培养基后发现，培养基已经溅满了锥形瓶的瓶壁，最可能的原因是什么？
提示：高压蒸汽灭菌锅的压力表指针还未降至“0”点，就提前打开了高压蒸汽灭菌锅，导致锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出锥形瓶。
●高压蒸汽灭菌锅的使用及注意事项
(1)首先将内层灭菌桶取出，再向外层锅内加入适量的水，水量达到水位标记线即可。
(2)放回灭菌桶，并装入待灭菌物品。注意不要装得太挤，以免妨碍蒸汽流通而影响灭菌效果。锥形瓶与试管口不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包裹瓶口的纸而透入棉塞。
(3)加盖，并将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的排气槽内。拧紧固定螺栓，注意要对称地旋紧锅盖四周的固定螺栓，使固定螺栓松紧一致，不漏气。
(4)加热灭菌锅，打开排气阀，使水沸腾，排出锅内的冷空气。等冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐步上升。当锅内压力升到所需压力时，控制热源，按照灭菌所要求的时间，维持压力。
(5)到灭菌时间后，切断热源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降到“0”点时，打开排气阀，旋开固定螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。如果提前打开排气阀，锅内压力突然下降，灭菌容器内的液体会冲出容器，造成污染。
【 学以致用 】
BD
3.(多选)如图是灭菌锅及其局部剖面示意图，下列相关叙述正确的是(　　)
A.甲、乙、丙分别是排气阀、安全阀和压力表
B.使用时应在锅内水煮沸并排出全部冷空气后再关闭乙
C.灭菌结束后应立即打开乙，放出锅内热蒸汽
D.将器皿放入灭菌锅之前通常用牛皮纸或报纸包扎，
避免灭菌后的再次污染
解析：甲、乙、丙分别是安全阀、排气阀和压力表，A错误；
灭菌结束后，应切断热源，当压力表指针降至“0”点，待温度下降后，再打开排气阀，以防止提前打开排气阀，锅内压力突然下降，导致灭菌容器内的液体冲出容器，造成污染或安全事故，C错误。
BD
4.(多选)接种的方法不同，所采用的接种器具也有区别。下图所示接种工具常用于(　　)
A.穿刺接种
B.斜面接种
C.平板稀释涂布接种
D.平板划线接种
解析：图示接种工具是接种环。穿刺接种采用的是接种针，平板稀释涂布接种采用的是玻璃涂布器，斜面接种和平板划线接种采用的是接种环。
1.菌种的传代和保存的原理
让菌种在人工创造的条件下，______细胞的代谢水平，使细胞基本处于______状态，即微生物的生长繁殖受到抑制但又不至于______。
2.菌种保存的重要条件
__________________。
降低
休眠
死亡
低温、干燥、真空
3.接种方法
(1)厌氧微生物接触氧气会受到抑制、损伤甚至死亡，常采用______接种。
(2)__________ 是常用的菌种传代和低温下保存菌种的方法。
4.斜面接种和培养酵母菌
准备接种→接种环______→试管口______→挑取菌体→______→培养。
穿刺
斜面接种
灭菌
灭菌
接种
[微思考]
酒精灯在酵母菌的接种和培养实验中有何作用？
提示：①对接种环、试管口、试管塞进行灼烧灭菌；②酒精灯火焰周围形成一个无菌区域，提供无菌操作环境。
5.菌种保存
挑选典型菌落→接种在斜面培养基上→培养使其______生长→试管用牛皮纸包扎→置于_______左右的冰箱中保藏→通常每隔________个月重新接种一次，再继续保存。
充分
4 ℃
2～3
[微思考]
菌种为何要在低温条件下保存？
提示：减缓培养基的水分蒸发，延长保存时间。
×
√
[辨正误]
(1)穿刺接种是常用的菌种传代和低温下保存菌种的方法。( )
提示：斜面接种是常用的菌种传代和低温下保存菌种的方法。
(2)厌氧微生物常采用穿刺接种的方法将其保护在培养基中。( )
(3)对接种环进行灼烧灭菌时，只需要在酒精灯火焰上灼烧环状部分。( )
提示：接种环的环端和接种时可能进入试管的部分都需要灼烧灭菌。
(4)将含有新鲜菌种的试管放在－4 ℃的冰箱中保藏有利于延长保存时间。( )
提示：将含有新鲜菌种的试管放在4 ℃的冰箱中保藏有利于延长保存时间。
×
×
如图A、B是两种常见的微生物接种方法，请分析回答下列问题：
(1)A、B两种接种方法分别是____________________，采用的接种器具分别是________________。
(2)实验室培养、保存厌氧菌应采用图中的________方法。教材P20酵母菌的接种和培养采用的是图中的________方法。
穿刺接种、斜面接种
接种针、接种环
A
B
●酵母菌的接种和培养过程中，划线前后两次灼烧接种器具的目的分别是什么？
提示：划线前灼烧接种器具的目的是杀死接种器具上可能存在的微生物，划线后灼烧接种器具的目的是杀死接种器具上残存的菌种，避免菌种污染环境和感染操作者。　　　
斜面接种和培养酵母菌的无菌操作
【 学以致用 】
A
5.下列斜面接种划线示意图正确的是(　　)
解析：正确的接种方法是将带菌的接种环伸入待接种的试管中，在培养基斜面上由底部向上轻划“Z”型折线，将菌种接种到培养基上。
B
6.(2024·江苏淮安阶段练习)下列是关于“斜面接种和培养酵母菌”实验操作的叙述，错误的是(　　)
A.将接种环的环端和可能伸入试管的部分在火焰上来回灼烧多次，以达到彻底灭菌的目的
B.灼烧的接种环在酒精灯火焰旁冷却后，伸入菌种管轻挑少许菌体
C.从菌种管抽出接种环时，不能让其带菌部位触及管壁
D.接种环在斜面接种后，需多次灼烧以保证无菌，冷却后放回原处
解析：为避免杂菌污染，可将接种环的环端和可能伸入试管的部分在火焰上来回灼烧多次，A正确；
将灭过菌的接种环伸入菌种管，先将环部接触培养基斜面顶端或其他无菌体的培养基部位使其冷却，再轻轻挑取少许菌体，在抽出接种环时，注意其带菌部位不要触及管壁或通过火焰，B错误，C正确；
接种后灼烧是为了杀死残留的菌体，接种环在斜面接种后，需多次灼烧以保证无菌，冷却后放回原处，D正确。
A
1.(2023·江苏淮安月考)消毒与灭菌是两个不同的概念，灭菌就是指彻底杀灭微生物使其永远丧失生长繁殖的能力，消毒仅指杀死一部分对人体有害的病原菌而对被消毒的物体基本无害，下列哪些事物适用于消毒处理(　　)
①皮肤　②饮用水　③牛奶　④注射器 ⑤培养皿　⑥接种环　⑦培养基　⑧果汁　⑨酱油　⑩手术刀
A.①②③⑧⑨ B.④⑤⑥⑦⑩
C.①②④⑤⑥⑧ D.以上全部
解析：消毒指用比较温和的方法杀死微生物的营养细胞，适用于那些不耐高温的液体，如③牛奶、⑧果汁、⑨酱油，这样可以使其中的营养成分不被破坏；对要求不是很严格的①皮肤、②饮用水也用消毒的方法处理；而对于严格要求的④注射器、⑤培养皿、⑥接种环、⑦培养基、⑩手术刀等必须进行灭菌处理。所以，①②③⑧⑨应该用消毒的方法处理，A正确，B、C、D错误。
A
2.如图是实验室用的一种高压蒸汽灭菌锅。下列有关其结构和使用的说法，正确的是(　　)
A.在灭菌桶内装入待灭菌物品时，不要装得太挤，以免影响
灭菌效果
B.1是安全阀，其下方有软管通入灭菌筒内，用于排出灭菌筒
内的冷空气
C.在压力103 kPa、温度121 ℃条件下15～20 min后，可以立即
打开排气阀放气
D.盖上灭菌锅盖后，应按顺时针方向依次拧紧螺栓，以确保锅盖密封
解析：1是安全阀，排气阀的下方有软管通入灭菌筒内，用于排出灭菌筒内的冷空气，B错误；
在压力103 kPa、温度121 ℃条件下15～20 min后，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至“0”时，打开排气阀，C错误；
盖上灭菌锅盖后，以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，以确保锅盖密封，D错误。
A.在灭菌桶内装入待灭菌物品时，不要装得太挤，以免影响灭菌效果
B.1是安全阀，其下方有软管通入灭菌筒内，用于排出灭菌筒内的冷空气
C.在压力103 kPa、温度121 ℃条件下15～20 min后，可以立即打开排气阀放气
D.盖上灭菌锅盖后，应按顺时针方向依次拧紧螺栓，以确保锅盖密封
C
3.下列关于发酵工程的灭菌设备和无菌操作器具的叙述，错误的是(　　)
A.杀死霉菌孢子所需的温度比霉菌的营养细胞高
B.在高压蒸汽灭菌锅内的压力没有降到“0”点前不能打开高压蒸汽灭菌锅的锅盖
C.空气过滤除菌法能杀死空气中的微生物
D.臭氧分子有很强的杀菌作用，但也对操作人员的健康有害
解析：空气过滤除菌法是让含菌空气通过无菌干燥的过滤介质，以阻截空气中所含微生物，并不能杀死空气中的微生物，C错误。
D
4.(2023·江苏淮安阶段练习)将微生物接入培养基的操作过程称为接种。下列是关于接种方法的叙述，错误的是(　　)
A.用玻璃涂布器可进行平板稀释涂布接种
B.用接种针可进行穿刺接种
C.用接种环在平板培养基上划线接种
D.用接种针在试管里做斜面接种
解析：玻璃涂布器是常用的接种工具，平板稀释涂布接种采用的是玻璃涂布器，A正确；
穿刺接种采用的是接种针，B正确；
平板划线法用接种环在平板培养基上划线接种，C正确；
斜面接种采用的是接种环，D错误。
AC
5.(多选)下列关于酵母菌斜面接种操作过程的叙述，错误的是(　　)
A.接种环灼烧灭菌后，要立即挑取菌种划线接种，以减少污染的机会
B.在火焰附近取下盛有菌种的试管塞后要将试管口通过火焰2～3次
C.将接种环伸入盛有菌种的试管内，先接触带菌部位
D.接种完成后要将试管口与试管塞分别灭菌，然后塞紧试管
解析：接种环灼烧灭菌后，立即挑取菌种会杀死菌种，应冷却后再挑取菌种，A错误；
接种环伸入盛有菌种的试管内，要先接触培养基斜面顶端或其他无菌体的培养基部位，待接种环冷却后再轻轻挑取少许菌种，C错误。第2课时　微生物分离、纯化和培养的无菌技术
课时概念解析　本课时的概念为“平板划线法和稀释涂布平板法是实验室中进行微生物分离和纯化的常用方法”“稀释涂布平板法是测定微生物数量的常用方法”，这两个概念的建构需要以下基本概念或证据的支持：
1.平板划线法和稀释涂布平板法可以分离和纯化微生物。
2.单菌落是由一个细胞分裂形成的、肉眼可见的、有一定形态构造的子细胞集团。
3.稀释涂布平板法中，在高度稀释的条件下，通过对菌落数的统计，可以计算样品中的含菌数。
一、平板划线法分离和纯化微生物
1.平板划线法
提醒：划线操作时，接种环只蘸一次菌液，但要在培养基的不同位置连续划线多次。
2.通过平板划线法获得纯化的酵母菌菌落
(1)酵母菌
①酵母菌是________真菌，可以进行________生殖，也可以进行________生殖。
②培养的最适pH为________，最适生长温度一般为________。
③可以用液体培养基培养，也可以用固体培养基培养，但要获得纯化的酵母菌菌落，则需要通过________培养基培养。
(2)实验原理
①________________培养基能满足酵母菌生长、繁殖的营养需要。
②____________是实验室中进行微生物分离和纯化的常用方法之一。
(3)实验步骤
[微思考]
在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
(4)结果分析
①酵母菌被纯化的标准：培养24 h后，在划线的________出现________________。
②纯化失败的原因
a.接种环灭菌后未____________直接在斜面上挑取菌体，菌体可能因为接触高温接种环而________。
b.第一次划线前挑取的菌体________，则也有可能无法获得由一个酵母菌形成的单个菌落。
[辨正误]
(1)倒平板时，应将打开的皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上。(　　)
(2)倒平板操作后再进行高压蒸汽灭菌。(　　)
(3)平板划线法接种时，每一次划线前都要挑取菌体。(　　)
(4)倒平板后，待平板冷凝之后需将其倒置。(　　)
(5)通过培养未接种的培养基，可以判断是否存在着杂菌污染。(　　)
1.下图为倒平板部分操作过程，据图分析回答下列问题：
(1)如图一所示，为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
(2)倒平板时，为什么在酒精灯火焰旁操作？
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
(3)平板冷凝后为何要倒置？
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
2.下图是平板划线操作的示意图，据图回答下列问题：
(1)用字母和箭头表示平板划线操作的正确步骤：
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
(2)为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？请完善下方的表格。
灼烧时期 目的
取菌种前 杀死接种环上____________
每次划线前 杀死上次划线时残留的菌种，使下一次划线的菌种直接来源于________________，从而使__________________，直至得到____________
接种结束后 杀死接种环上残留的菌种，避免微生物污染环境和感染操作者
(3)在第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？
_____________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
【学以致用】
1.(2024·江苏盐城期末)下列有关微生物纯培养的叙述正确的是(　　)
A.接种后，在培养皿皿底做标记再将平板倒置于恒温培养箱中培养
B.在酒精灯火焰附近将冷却至室温的培养基倒入培养皿
C.可用平板划线法对微生物进行分离和计数
D.配制好的培养基转移到锥形瓶后，可采用高压蒸汽灭菌或干热灭菌
2.(多选)(2023·江苏南京调研)下图为实验室培养和纯化大肠杆菌过程中的部分操作步骤，下列说法正确的是(　　)
A.步骤①后需将培养基灭菌并调节pH
B.步骤①②③操作时需要在酒精灯火焰附近进行
C.步骤③到④的过程中，接种环共灼烧处理了6次
D.图中步骤①结束后需倒置平板，④结束后不需要
二、稀释涂布平板法分离和纯化微生物
1.稀释涂布平板法
提醒：平板划线法不能用于计数，稀释涂布平板法可以用于微生物的计数。
2.混合平板法
将稀释的少量菌悬液与________左右的培养基混合均匀后倒入无菌培养皿中，再将培养皿置于合适温度下培养，这样在培养基____________均可长出单个菌落
3.分离土壤中分解尿素的细菌并进行计数
(1)实验原理
①利用________培养基可以筛选和分离某种微生物。
②在________的条件下，于固体培养基上培养该微生物，形成________菌落。单个菌落即为____________，通过对菌落数量的统计，可以计算出样品中的含菌数。
[微思考]
通常1 g土壤中有几亿到几百亿个土壤微生物，能分解尿素的细菌是其中的一部分。如何设计培养基的配方，从而将能分解尿素的细菌分离出来？______________________________________________________________________
(2)实验步骤
提醒：微生物培养物不可随意丢弃，应对其进行灭菌处理后置于回收桶中，以免造成环境污染。
(3)结果与分析
菌落数目在________的一组平板上一般可以获得单个分解尿素的细菌菌落。
[辨正误]
(1)稀释涂布平板法既能用于分离细菌，也能计数。(　　)
(2)所有稀释倍数的稀释菌液涂布成的培养基，都能观察到和分离出单菌落。(　　)
(3)当菌落数目稳定时，选取菌落数为30～300的平板进行计数。(　　)
(4)统计菌落数目时，统计的菌落数就是活菌的实际数目。(　　)
(5)采用混合平板法分离和纯化微生物时，仅在培养基的表面长出菌落。(　　)
(6)脲酶能催化尿素分解产生N2，N2可作为细菌生长的氮源。(　　)
甲、乙两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。
(1)甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230，该同学的统计结果是否可靠？为什么？__________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
(2)某同学在三种稀释度下吸取0.1 mL的菌液涂布平板，统计菌落数，得到以下的数据，试计算1 g样品的活菌数。
_____________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
1.微生物分离和纯化方法的比较
方法 平板划线法 稀释涂布平板法 混合平板法
主要步骤 接种环在固体培养基表面连续划线 系列梯度稀释操作和涂布平板操作 取稀释的少量菌悬液与50 ℃左右的培养基混合均匀倒入无菌培养皿中
接种工具 接种环 涂布器 －
能否用于计数 不能计数 可以计数，但是操作复杂，需涂布多个平板 可以计数
培养结果 菌落仅在平板表面 菌落出现在平板表面和内部
共同点 都能获得单细胞菌落，达到分离纯化微生物的目的，也可用于观察菌落特征
2.分离尿素分解菌操作中的注意事项
(1)在实验操作中，每个步骤都要注意无菌操作，以防培养基被污染，影响实验效果。
(2)样品稀释液的最佳浓度为培养后每个平板上有30～300个菌落的浓度。
(3)每一稀释倍数的菌液都至少要涂布3个平板，作为重复实验，求其平均值。
【学以致用】
3.(2024·江苏淮安阶段练板接种常用在微生物培养中。下列说法正确的是(　　)
A.平板涂布时需在酒精灯火焰旁，打开皿盖放在一边，用灭菌后的涂布器进行涂布
B.空白平板使用前需进行无菌鉴定，接种后未长出菌落的平板可以直接丢弃
C.采用稀释涂布平板计数时，统计结果往往多于实际的活菌数
D.利用以尿素为唯一氮源的平板能分离出合成脲酶的微生物
4.(多选)(2024·江苏宿迁一模)某生物活动小组为探究当地农田土壤中分解尿素的细菌的数量，进行了取样、系列梯度稀释、涂布平板、培养、计数等步骤，实验操作过程如下，下列说法正确的是(　　)
A.图中接种的培养基是以尿素为唯一氮源的固体培养基，能生长的微生物都能合成脲酶
B.若每支试管稀释10倍，则图中a的数值应为2.7，5号试管共稀释了106倍
C.图中左上角培养基菌落连成一片，可能是涂布不均匀造成的
D.若仅以4号试管接种培养基计数，5g该土壤中含分解尿素菌的估算数目是1.4×108个
1.(2019·江苏卷，12)下列关于微生物实验操作的叙述，错误的是(　　)
A.培养微生物的试剂和器具都要进行高压蒸汽灭菌
B.接种前后，接种环都要在酒精灯火焰上进行灼烧
C.接种后的培养皿要倒置，以防培养污染
D.菌种分离和菌落计数都可以使用固体培养基
2.如图是纯化微生物时采用的两种接种方法接种后培养的效果图，下列相关叙述正确的是(　　)
A.图甲三个平板中所用培养液的稀释倍数相同
B.图甲、乙均适合分离微生物，但乙不适合对微生物进行计数
C.图甲、图乙所用的接种工具分别是接种环和涂布器
D.图乙每次划线应从同一起点开始，以便使聚集的菌种逐步稀释获得单菌落
3.(2024·江苏南京阶段练习)为纯化菌种，在鉴别培养基上接种尿素分解细菌，培养结果如图所示。下列叙述正确的是(　　)
A.图示采用的接种方法为平板划线法和稀释涂布平板法
B.培养基中的尿素被分解后，可使酚红指示剂变为红色
C.该实验结果因单菌落太多，不能达到菌种纯化的目的
D.可用干热灭菌法对盛有培养基的培养皿和试管等进行灭菌
4.(多选)下列关于稀释涂布平板法和平板划线法的操作，正确的是(　　)
A.两次划线之间灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种
B.不同浓度的菌液经涂布后均可在固体培养基表面形成单菌落
C.在获取菌种前和接种完毕后均要将试管口通过火焰
D.同一浓度的稀释液应至少涂布三个平板用来计数
第2课时　微生物分离、纯化和培养的无菌技术
一、
自主梳理
1.划线稀释　单个菌落　“由点到线”的稀释划线　单个微生物　单个微生物　皿底　第1　第2　过火灭菌　由点到线　倒置　菌落
2.(1)①单细胞　出芽　孢子　②4.5～5.0　28～30 ℃　③固体　(2)①马铃薯葡萄糖琼脂　②平板划线法　(3)高压蒸汽　火焰　大于锥形瓶瓶口的缝隙
微思考
提示：不能用这个平板培养微生物。因为空气中的微生物可能会在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。
(4)①末端　不连续的单个菌落　②冷却　死亡　过多
辨正误
(1)×　提示：皿盖完全打开会加大杂菌污染的风险。
(2)×　提示：培养基高压蒸汽灭菌后再倒平板。
(3)×　提示：平板划线接种时，只需第一次划线前挑取菌体。
(4)√　(5)√
合作探究
1.(1)提示：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。
(2)提示：酒精灯火焰旁是无菌区域，可以避免周围环境中的微生物的污染。
(3)提示：防止皿盖上的冷凝水珠落入培养基，避免培养基中的水分过快蒸发。
2.(1)提示：d→b→f→a→e→c→h→g。
(2)原有的微生物　上次划线的末端　每次划线时菌种数目逐渐减少　单个微生物
(3)提示：划线后，线条末端微生物的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使微生物的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细胞繁殖而来的菌落。
学以致用
1.A　[接种后进行纯化培养时，对培养皿皿底做标记，培养皿应倒置放在恒温培养箱内培养，A正确；在酒精灯火焰附近将冷却至50 ℃左右的培养基倒入培养皿，B错误；平板划线法都能对微生物进行分离纯化，但平板划线法不能用于计数，C错误；配制好的培养基转移到锥形瓶后，采用高压蒸汽灭菌，D错误。]
2.BC　[步骤①表示倒平板，培养基需要先调节pH后灭菌，冷却后倒平板，A错误；接种环在每次接种前和接种结束后都要通过灼烧来灭菌，所以步骤③到步骤④的过程中5次划线操作前都要灼烧灭菌，接种结束后还需灼烧灭菌1次，防止造成污染，由此可见，步骤③到步骤④的过程中共需灼烧接种环6次，C正确；步骤④操作结束后需在培养皿的底上做好标记并倒置后放入培养箱中进行培养，D错误。]
二、
自主梳理
1.梯度稀释　涂布平板　涂布器　充分　0.1　酒精　冷却　恒温培养箱
2.50 ℃　表面和内部
3.(1)①选择　②高度稀释　单个　纯化培养物
微思考
提示：设计一种选择培养基，以尿素作为唯一氮源，可以将分解尿素的细菌分离出来。
(2)3～5　无菌水　氮源　无菌水　污染　最低　3　倒置　24　30～300　稀释　体积　(3)30～300
辨正误
(1)√
(2)×　提示：稀释度足够高时才能观察到和分离出单菌落。
(3)√
(4)×　提示：由于当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，所以统计的菌落数往往比活菌的实际数目少。
(5)×　提示：在培养基表面和内部均可长出菌落。
(6)×　提示：脲酶将尿素降解为氨，作为其生长的氮源。
合作探究
(1)提示：不可靠。为增加实验的说服力与准确性，应设置重复实验，在同一稀释度下至少涂布3个平板，统计结果后计算平均值。
(2)提示：105的稀释度下取0.1 mL的菌液涂布的三个平板上的菌落数在30～300之间，计算其平均值为(212＋234＋287)/3≈244。进一步可以换算出1 g样品中活菌数为(244÷0.1)×105＝2.44×108(个)。
学以致用
3.D　[倒平板时，在火焰旁用拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，将锥形瓶中的培养基倒入培养皿中，A错误；接种后未长出菌落的培养基，也可能有少量微生物，为避免污染环境，不能直接丢弃，B错误；采用稀释涂布平板计数法获得的菌落有可能是由多个细胞聚集在一起繁殖形成的，所以往往少于实际的活菌数，C错误；在以尿素为唯一氮源的平板上，若微生物可以产生脲酶，则可以利用脲酶分解尿素而获得氮源生长，其他不能产生脲酶的微生物则不能生长，可以把合成脲酶的微生物分离出来，D正确。]
4.BC　[本实验是探究当地农田土壤中分解尿素的细菌的数量，因此图中接种的培养基是以尿素为唯一氮源的固体培养基，但在此培养基上能生长的微生物不一定都能合成脲酶，如固氮菌也能生存，A错误；若每支试管稀释10倍，则将0.3 mL与a mL无菌水混合稀释10倍，需要a的数值为2.7，5 g土壤溶于定溶剂形成50 mL溶液被稀释了10倍，故5号试管共稀释了106倍，B正确；若仅以4号试管接种培养基计数，5 g该土壤中含分解尿素菌的估算数目是(275＋285＋280)÷3÷0.2×105×5＝7×108(个)，D错误。]
随堂检测
1.A　[培养微生物的培养基一般用高压蒸汽灭菌法灭菌，微生物的接种工具，如接种针、接种环或其他金属用具一般通过酒精灯火焰灼烧来灭菌，A错误；接种前，接种环要在酒精灯火焰上进行灼烧，防止接种环上附着的微生物对实验结果造成干扰，接种后灼烧可以防止微生物扩散，对人造成危害，B正确；接种后的培养皿要倒置，防止冷凝水落入培养基造成污染，C正确；在固体培养基表面可形成单菌落，故菌种的分离和菌落的计数都可以使用固体培养基，D正确。]
2.B　[根据图甲中三个平板的菌落密度可知，三个平板中所用培养液的稀释倍数不同，A错误；图甲、乙中若均为选择培养基，均可用于分离微生物，图乙是平板划线法接种后的结果，不适合对微生物进行计数，B正确；稀释涂布平板法接种使用涂布器，平板划线法接种使用接种环，C错误；图乙每次划线应从上一次划线的末端开始，以便使聚集的菌种逐步稀释获得单菌落，D错误。]
3.B　[据图可知，图中的微生物接种方法是平板划线法，A错误；培养基中的尿素被分解后呈碱性，可使酚红指示剂变为红色，B正确；该接种方法中随着划线次数增加，菌落数目减少，该实验Ⅲ区有单菌落，可以达到菌种纯化目的，C错误；可用湿热灭菌法对盛有培养基的培养皿和试管等进行灭菌，D错误。]
4.ACD　[两次划线之间灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种，使得下次划线的菌种来自上次划线的末端，A正确；若菌液浓度过大，形成的菌落就连在一起，则得不到单个的菌落，在菌液稀释度足够高的情况下，菌液经涂布后可在固体培养基表面形成单菌落，B错误；在获取菌种前和接种完毕后均要将试管口通过火焰，进行灼烧灭菌，目的是防止杂菌污染，C正确；同一浓度的稀释液应至少涂布三个平板计数，取平均值，以减小误差，D正确。](共54张PPT)
第一章　发酵工程　第二节　发酵工程的无菌技术
第2课时　微生物分离、纯化和培养的无菌技术
本课时的概念为“平板划线法和稀释涂布平板法是实验室中进行微生物分离和纯化的常用方法”“稀释涂布平板法是测定微生物数量的常用方法”，这两个概念的建构需要以下基本概念或证据的支持：
1.平板划线法和稀释涂布平板法可以分离和纯化微生物。
2.单菌落是由一个细胞分裂形成的、肉眼可见的、有一定形态构造的子细胞集团。
3.稀释涂布平板法中，在高度稀释的条件下，通过对菌落数的统计，可以计算样品中的含菌数。
课时概念解析
目录 CONTENTS
1.平板划线法分离和纯化微生物
2.稀释涂布平板法分离和
纯化微生物
3.随堂检测
自主梳理
合作探究
合作探究
思维导图
自主梳理
1.平板划线法
划线稀释
单个菌落
“由
点到线”的稀释划线
单个微生物
单个微生物
提醒：划线操作时，接种环只蘸一次菌液，但要在培养基的不同位置连续划线多次。
皿底
第1
第2
过火灭菌
由点到线
倒置
菌落
2.通过平板划线法获得纯化的酵母菌菌落
(1)酵母菌
①酵母菌是________真菌，可以进行______生殖，也可以进行______生殖。
②培养的最适pH为__________，最适生长温度一般为___________。
③可以用液体培养基培养，也可以用固体培养基培养，但要获得纯化的酵母菌菌落，则需要通过______培养基培养。
(2)实验原理
①__________________培养基能满足酵母菌生长、繁殖的营养需要。
②____________是实验室中进行微生物分离和纯化的常用方法之一。
单细胞
出芽
孢子
4.5～5.0
28～30 ℃
固体
马铃薯葡萄糖琼脂
平板划线法
(3)实验步骤
高压蒸汽
火
焰
大于锥形
瓶瓶口的缝隙
[微思考]
在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？
提示：不能用这个平板培养微生物。因为空气中的微生物可能会在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。
(4)结果分析
①酵母菌被纯化的标准：培养24 h后，在划线的______出现__________________。
②纯化失败的原因
a.接种环灭菌后未______直接在斜面上挑取菌体，菌体可能因为接触高温接种环而______。
b.第一次划线前挑取的菌体______，则也有可能无法获得由一个酵母菌形成的单个菌落。
末端
不连续的单个菌落
冷却
死亡
过多
×
√
[辨正误]
(1)倒平板时，应将打开的皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上。( )
提示：皿盖完全打开会加大杂菌污染的风险。
(2)倒平板操作后再进行高压蒸汽灭菌。( )
提示：培养基高压蒸汽灭菌后再倒平板。
(3)平板划线法接种时，每一次划线前都要挑取菌体。( )
提示：平板划线接种时，只需第一次划线前挑取菌体。
(4)倒平板后，待平板冷凝之后需将其倒置。( )
(5)通过培养未接种的培养基，可以判断是否存在着杂菌污染。( )
×
×
√
1.下图为倒平板部分操作过程，据图分析回答下列问题：
(1)如图一所示，为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？
提示：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。
(2)倒平板时，为什么在酒精灯火焰旁操作？
提示：酒精灯火焰旁是无菌区域，可以避免周围环境中的微生物的污染。
(3)平板冷凝后为何要倒置？
提示：防止皿盖上的冷凝水珠落入培养基，避免培养基中的水分过快蒸发。
2.下图是平板划线操作的示意图，据图回答下列问题：
(1)用字母和箭头表示平板划线操作的正确步骤：
提示：d→b→f→a→e→c→h→g。
(2)为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？请完善下方的表格。
灼烧时期 目的
取菌种前 杀死接种环上______________
每次划线前 杀死上次划线时残留的菌种，使下一次划线的菌种直接来源于________________，从而使____________________________，直至得到____________
接种结束后 杀死接种环上残留的菌种，避免微生物污染环境和感染操作者
原有的微生物
上次划线的末端
每次划线时菌种数目逐渐减少
单个微生物
(3)在第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？
提示：划线后，线条末端微生物的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使微生物的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细胞繁殖而来的菌落。
●为什么最后一次的划线与第一次的划线不能相连？
提示：最后一次的划线已经将微生物稀释成单个的细胞，如果与第一次的划线相连则增加了微生物的数目，得不到纯化的效果。
●接种结束后，为什么要将一个未接种的培养基和一个已接种的培养基放在一起培养，未接种的培养基表面如果有菌落生长，说明了什么？
提示：培养未接种培养基的作用是对照，若未接种的培养基在恒温箱中保温1～2 d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的。若有菌落形成，说明培养基灭菌不彻底，或培养基被污染了，需要重新制备。　　　
●倒平板成功关键点
(1)待培养基冷却到50 ℃左右时进行倒平板操作。
(2)要使锥形瓶的瓶口通过酒精灯火焰，通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。
(3)倒平板时，要用拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，不要完全打开，以免杂菌污染培养基。
(4)整个操作过程要在酒精灯火焰旁进行，避免杂菌污染。
(5)在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，那么这个平板不能用来培养微生物，因为空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。
●平板划线法成功关键点
(1)划线力度要大小适当，防止用力过大将培养基划破。
(2)第一次划线之前和每次划线之后都需要灼烧接种环。如进行5次划线时接种环共灼烧6次，接种和划线操作需要在酒精灯火焰附近进行。
(3)灼烧接种环之后，要等其冷却后才能挑取菌体，以免温度太高杀死菌种。
(4)在做第二次以及其后的划线操作时，总是从上一次划线的末端开始划线，使微生物的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终得到由单个细胞繁殖而来的菌落。
(5)多次划线时最后一区域不要与第一区域相连。　　　
【 学以致用 】
A
1.(2024·江苏盐城期末)下列有关微生物纯培养的叙述正确的是(　　)
A.接种后，在培养皿皿底做标记再将平板倒置于恒温培养箱中培养
B.在酒精灯火焰附近将冷却至室温的培养基倒入培养皿
C.可用平板划线法对微生物进行分离和计数
D.配制好的培养基转移到锥形瓶后，可采用高压蒸汽灭菌或干热灭菌
解析：接种后进行纯化培养时，对培养皿皿底做标记，培养皿应倒置放在恒温培养箱内培养，A正确；
在酒精灯火焰附近将冷却至50 ℃左右的培养基倒入培养皿，B错误；
平板划线法都能对微生物进行分离纯化，但平板划线法不能用于计数，C错误；
配制好的培养基转移到锥形瓶后，采用高压蒸汽灭菌，D错误。
BC
2.(多选)(2023·江苏南京调研)下图为实验室培养和纯化大肠杆菌过程中的部分操作步骤，下列说法正确的是(　　)
A.步骤①后需将培养基灭菌并调节pH
B.步骤①②③操作时需要在酒精灯火焰附近进行
C.步骤③到④的过程中，接种环共灼烧处理了6次
D.图中步骤①结束后需倒置平板，④结束后不需要
解析：步骤①表示倒平板，培养基需要先调节pH后灭菌，冷却后倒平板，A错误；
接种环在每次接种前和接种结束后都要通过灼烧来灭菌，所以步骤③到步骤④的过程中5次划线操作前都要灼烧灭菌，接种结束后还需灼烧灭菌1次，防止造成污染，由此可见，步骤③到步骤④的过程中共需灼烧接种环6次，C正确；
步骤④操作结束后需在培养皿的底上做好标记并倒置后放入培养箱中进行培养，D错误。
A.步骤①后需将培养基灭菌并调节pH
B.步骤①②③操作时需要在酒精灯火焰附近进行
C.步骤③到④的过程中，接种环共灼烧处理了6次
D.图中步骤①结束后需倒置平板，④结束后不需要
1.稀释涂布平板法
梯度稀释
提醒：平板划线法不能用于计数，稀释涂布平板法可以用于微生物的计数。
涂布平板
涂布器
充分
0.1
酒精
冷却
恒温培养箱
2.混合平板法
将稀释的少量菌悬液与________左右的培养基混合均匀后倒入无菌培养皿中，再将培养皿置于合适温度下培养，这样在培养基______________均可长出单个菌落
50 ℃
表面和内部
3.分离土壤中分解尿素的细菌并进行计数
(1)实验原理
①利用______培养基可以筛选和分离某种微生物。
②在__________的条件下，于固体培养基上培养该微生物，形成______菌落。单个菌落即为____________，通过对菌落数量的统计，可以计算出样品中的含菌数。
选择
高度稀释
单个
纯化培养物
[微思考]
通常1 g土壤中有几亿到几百亿个土壤微生物，能分解尿素的细菌是其中的一部分。如何设计培养基的配方，从而将能分解尿素的细菌分离出来？
提示：设计一种选择培养基，以尿素作为唯一氮源，可以将分解尿素的细菌分离出来。
(2)实验步骤
3～5
无菌水
氮源
无菌水
污染
提醒：微生物培养物不可随意丢弃，应对其进行灭菌处理后置于回收桶中，以免造成环境污染。
最低
3
倒置
24
30～300
稀释
体积
(3)结果与分析
菌落数目在__________的一组平板上一般可以获得单个分解尿素的细菌菌落。
30～300
×
√
[辨正误]
(1)稀释涂布平板法既能用于分离细菌，也能计数。( )
(2)所有稀释倍数的稀释菌液涂布成的培养基，都能观察到和分离出单菌落。( )
提示：稀释度足够高时才能观察到和分离出单菌落。
(3)当菌落数目稳定时，选取菌落数为30～300的平板进行计数。( )
(4)统计菌落数目时，统计的菌落数就是活菌的实际数目。( )
提示：由于当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，所以统计的菌落数往往比活菌的实际数目少。
√
×
(5)采用混合平板法分离和纯化微生物时，仅在培养基的表面长出菌落。( )
提示：在培养基表面和内部均可长出菌落。
(6)脲酶能催化尿素分解产生N2，N2可作为细菌生长的氮源。( )
提示：脲酶将尿素降解为氨，作为其生长的氮源。
×
×
●如图为用不同方法接种的培养结果，判断哪个为稀释涂布平板法接种培养？为什么稀释涂布平板法可以用于细菌计数而平板划线法不能进行计数？
提示：图B为稀释涂布平板法接种培养。稀释涂布平板法会进行等比稀释，在合适的稀释倍数下，均匀涂布得到的菌落互不接触，可以确定菌落的密度，再通过计算可以得知原菌液的微生物数量。而平板划线法最开始的划线很可能菌类会长成一片，导致无法计数，此外灼烧接种环时也会杀死一部分微生物。　　　
甲、乙两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。
(1)甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230，该同学的统计结果是否可靠？为什么？
提示：不可靠。为增加实验的说服力与准确性，应设置重复实验，在同一稀释度下至少涂布3个平板，统计结果后计算平均值。
(2)某同学在三种稀释度下吸取0.1 mL的菌液涂布平板，统计菌落数，得到以下的数据，试计算1 g样品的活菌数。
提示：105的稀释度下取0.1 mL的菌液涂布的三个平板上的菌落数在30～300之间，计算其平均值为(212＋234＋287)/3≈244。进一步可以换算出1 g样品中活菌数为(244÷0.1)×105＝2.44×108(个)。
●有人说，采用稀释涂布平板法培养和计算得到的微生物的数量比稀释液中实际微生物的数量要少。你同意这样的观点吗？为什么？
提示：同意这个观点。稀释涂布平板法计数是根据微生物在平板表面上所形成的单个菌落来计数的，一个菌落代表一个单细胞。实际计数时，往往会出现菌落聚合在一起的情况，因为两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，稀释涂布平板法统计的菌落数往往比活菌的实际数目低。
●除了上述方法，还可以使用细菌计数板、显微镜等工具对土壤中细菌进行计数，该计数方法获得的数据比实际微生物数量多还是少？分析原因。
提示：多。该方法无法区分活菌、死菌，计数结果为活菌和死菌之和。　　　
1.微生物分离和纯化方法的比较
方法 平板划线法 稀释涂布平板法 混合平板法
主要步骤 接种环在固体培养基表面连续划线 系列梯度稀释操作和涂布平板操作 取稀释的少量菌悬液与50 ℃左右的培养基混合均匀倒入无菌培养皿中
接种工具 接种环 涂布器 －
能否用于计数 不能计数 可以计数，但是操作复杂，需涂布多个平板 可以计数
培养结果 菌落仅在平板表面 菌落出现在平板表面和内部
共同点 都能获得单细胞菌落，达到分离纯化微生物的目的，也可用于观察菌落特征
2.分离尿素分解菌操作中的注意事项
(1)在实验操作中，每个步骤都要注意无菌操作，以防培养基被污染，影响实验效果。
(2)样品稀释液的最佳浓度为培养后每个平板上有30～300个菌落的浓度。
(3)每一稀释倍数的菌液都至少要涂布3个平板，作为重复实验，求其平均值。
【 学以致用 】
D
3.(2024·江苏淮安阶段练板接种常用在微生物培养中。下列说法正确的是(　　)
A.平板涂布时需在酒精灯火焰旁，打开皿盖放在一边，用灭菌后的涂布器进行涂布
B.空白平板使用前需进行无菌鉴定，接种后未长出菌落的平板可以直接丢弃
C.采用稀释涂布平板计数时，统计结果往往多于实际的活菌数
D.利用以尿素为唯一氮源的平板能分离出合成脲酶的微生物
解析：倒平板时，在火焰旁用拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，将锥形瓶中的培养基倒入培养皿中，A错误；
接种后未长出菌落的培养基，也可能有少量微生物，为避免污染环境，不能直接丢弃，B错误；
采用稀释涂布平板计数法获得的菌落有可能是由多个细胞聚集在一起繁殖形成的，所以往往少于实际的活菌数，C错误；
在以尿素为唯一氮源的平板上，若微生物可以产生脲酶，则可以利用脲酶分解尿素而获得氮源生长，其他不能产生脲酶的微生物则不能生长，可以把合成脲酶的微生物分离出来，D正确。
BC
4.(多选)(2024·江苏宿迁一模)某生物活动小组为探究当地农田土壤中分解尿素的细菌的数量，进行了取样、系列梯度稀释、涂布平板、培养、计数等步骤，实验操作过程如下，下列说法正确的是(　　)
A.图中接种的培养基是以尿素
为唯一氮源的固体培养基，能
生长的微生物都能合成脲酶
B.若每支试管稀释10倍，则图
中a的数值应为2.7，5号试管共稀释了106倍
C.图中左上角培养基菌落连成一片，可能是涂布不均匀造成的
D.若仅以4号试管接种培养基计数，5g该土壤中含分解尿素菌的估算数目是1.4×108个
A.图中接种的培养基是以尿素为唯一氮源的固体培养基，能生长的微生物都能合成脲酶
B.若每支试管稀释10倍，则图中a的数值应为2.7，5号试管共稀释了106倍
C.图中左上角培养基菌落连成一片，可能是涂布不均匀造成的
D.若仅以4号试管接种培养基计数，5g该土壤中含分解尿素菌的估算数目是1.4×108个
解析：本实验是探究当地农田土壤中分解尿素的细菌的数量，因此图中接种的培养基是以尿素为唯一氮源的固体培养基，但在此培养基上能生长的微生物不一定都能合成脲酶，如固氮菌也能生存，A错误；
若每支试管稀释10倍，则将0.3 mL与a mL无菌水混合稀释10倍，需要a的数值为2.7，5 g土壤溶于定溶剂形成50 mL溶液被稀释了10倍，故5号试管共稀释了106倍，B正确；
若仅以4号试管接种培养基计数，5 g该土壤中含分解尿素菌的估算数目是(275＋285＋280)÷3÷0.2×105×5＝7×108(个)，D错误。
A
1.(2019·江苏卷，12)下列关于微生物实验操作的叙述，错误的是(　　)
A.培养微生物的试剂和器具都要进行高压蒸汽灭菌
B.接种前后，接种环都要在酒精灯火焰上进行灼烧
C.接种后的培养皿要倒置，以防培养污染
D.菌种分离和菌落计数都可以使用固体培养基
解析：培养微生物的培养基一般用高压蒸汽灭菌法灭菌，微生物的接种工具，如接种针、接种环或其他金属用具一般通过酒精灯火焰灼烧来灭菌，A错误；
接种前，接种环要在酒精灯火焰上进行灼烧，防止接种环上附着的微生物对实验结果造成干扰，接种后灼烧可以防止微生物扩散，对人造成危害，B正确；
接种后的培养皿要倒置，防止冷凝水落入培养基造成污染，C正确；
在固体培养基表面可形成单菌落，故菌种的分离和菌落的计数都可以使用固体培养基，D正确。
B
2.如图是纯化微生物时采用的两种接种方法接种后培养的效果图，下列相关叙述正确的是(　　)
A.图甲三个平板中所用培养液的
稀释倍数相同
B.图甲、乙均适合分离微生物，但乙不适合对微生物进行计数
C.图甲、图乙所用的接种工具分别是接种环和涂布器
D.图乙每次划线应从同一起点开始，以便使聚集的菌种逐步稀释获得单菌落
A.图甲三个平板中所用培养液的稀释倍数相同
B.图甲、乙均适合分离微生物，但乙不适合对微生物进行计数
C.图甲、图乙所用的接种工具分别是接种环和涂布器
D.图乙每次划线应从同一起点开始，以便使聚集的菌种逐步稀释获得单菌落
解析：根据图甲中三个平板的菌落密度可知，三个平板中所用培养液的稀释倍数不同，A错误；
图甲、乙中若均为选择培养基，均可用于分离微生物，图乙是平板划线法接种后的结果，不适合对微生物进行计数，B正确；
稀释涂布平板法接种使用涂布器，平板划线法接种使用接种环，C错误；
图乙每次划线应从上一次划线的末端开始，以便使聚集的菌种逐步稀释获得单菌落，D错误。
B
3.(2024·江苏南京阶段练习)为纯化菌种，在鉴别培养基上接种尿素分解细菌，培养结果如图所示。下列叙述正确的是(　　)
A.图示采用的接种方法为平板划线法和稀释涂布平板法
B.培养基中的尿素被分解后，可使酚红指示剂变为红色
C.该实验结果因单菌落太多，不能达到菌种纯化的目的
D.可用干热灭菌法对盛有培养基的培养皿和试管等进行灭菌
A.图示采用的接种方法为平板划线法和稀释涂布平板法
B.培养基中的尿素被分解后，可使酚红指示剂变为红色
C.该实验结果因单菌落太多，不能达到菌种纯化的目的
D.可用干热灭菌法对盛有培养基的培养皿和试管等进行灭菌
解析：据图可知，图中的微生物接种方法是平板划线法，A错误；
培养基中的尿素被分解后呈碱性，可使酚红指示剂变为红色，B正确；
该接种方法中随着划线次数增加，菌落数目减少，该实验Ⅲ区有单菌落，可以达到菌种纯化目的，C错误；
可用湿热灭菌法对盛有培养基的培养皿和试管等进行灭菌，D错误。
C
●(2024·江苏南通模拟)南通某中学兴趣小组从垃圾堆放点的土壤中分离出一株分解柴油的芽孢杆菌。相关叙述正确的是(　　)
A.配制培养基时应以柴油为唯一氮源，并加入琼脂
B.配制好的培养基应先分装，再用湿热灭菌法灭菌
C.土壤样液可先进行富集培养，再进行涂布筛选
D.选择平板中的菌落数必须在30～300之间
解析：应以柴油为唯一碳源，A错误；
培养基灭菌采用湿热灭菌法，培养皿采用干热灭菌法，配制好的培养基应先灭菌，再分装，B错误；
对于微生物的计数可以采用稀释涂布平板法，计数时一般选择菌落数在30～300之间的平板进行，D错误。　　　
ACD
4.(多选)下列关于稀释涂布平板法和平板划线法的操作，正确的是(　 　)
A.两次划线之间灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种
B.不同浓度的菌液经涂布后均可在固体培养基表面形成单菌落
C.在获取菌种前和接种完毕后均要将试管口通过火焰
D.同一浓度的稀释液应至少涂布三个平板用来计数
解析：两次划线之间灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种，使得下次划线的菌种来自上次划线的末端，A正确；
若菌液浓度过大，形成的菌落就连在一起，则得不到单个的菌落，在菌液稀释度足够高的情况下，菌液经涂布后可在固体培养基表面形成单菌落，B错误；
在获取菌种前和接种完毕后均要将试管口通过火焰，进行灼烧灭菌，目的是防止杂菌污染，C正确；
同一浓度的稀释液应至少涂布三个平板计数，取平均值，以减小误差，D正确。课时精练2　发酵工程的灭菌方法、灭菌设备、无菌操作器具及微生物接种和传代的无菌技术
(时间：30分钟　分值：50分)
选择题：第1～13题，每小题2分，共26分。
【基础对点】
知识点1　发酵工程的灭菌方法、灭菌设备、无菌操作器具
1.下列有关发酵工程的灭菌方法的叙述，正确的是(　　)
一些化学试剂能破坏微生物的蛋白质或细胞结构，所以可用于培养基的灭菌
紫外线穿透力弱，一般用于表面和空气的灭菌
保持干燥的实验器具的灭菌，如移液管等，常采用射线灭菌法
过滤杀死微生物而达到除菌目的的方法称为过滤除菌法
2.(2023·连云港高二调研)消毒和灭菌是微生物培养中常用的操作方法。下列说法正确的是(　　)
发酵工程的生产过程只有在没有杂菌污染的情况下才能正常进行
在100 ℃条件下煮沸5～6分钟属于灭菌方法，该方法可杀死微生物细胞和一部分芽孢
无菌技术中，若处理对象为液体，则只能消毒，不能灭菌
消毒和灭菌的原理是完全不同的
3.下列关于灭菌设备的使用错误的是(　　)
不得将易腐、易燃、易爆物品放入电热鼓风干燥箱内干燥灭菌
使用高压蒸汽灭菌锅时，操作人员应严格控制热源维持灭菌时的压力
高压蒸汽灭菌锅内的物品太多，摆放太挤，会降低灭菌效果
在使用高压蒸汽灭菌锅时，一旦加热就不能打开排气阀
4.无菌技术是发酵工程的重要技术之一。实验室通常使用电热鼓风干燥箱作为干热灭菌设备，下列关于其用法和原理的叙述，错误的是(　　)
对于空的玻璃器皿和其他耐高温的物品可以采用此法来保持干燥
不同菌体由于含水量不同，灭菌温度、时间都不同
使用干燥箱时必须将风机开关打开，否则会导致电机或传感器烧坏
由于放线菌及霉菌孢子含水量较低，在80～90 ℃条件下，加热10 min即可杀菌
5.(2024·江苏连云港期中)下列关于高压蒸汽灭菌锅的使用叙述正确的是(　　)
加水是指使用前在灭菌桶内加适量的水，水达到水位标记线即可
装锅是指将待灭菌物品装满灭菌桶，盖好锅盖，依次旋紧锅盖四周的螺栓
加热后，随着锅内压力逐渐增加，须打开排气阀，排出锅内残留的冷空气
出锅是指关闭电源后，旋开固定螺栓，开盖取出灭菌物品
6.发酵工程中的培养基含丰富的营养物质，对于液体培养物一般选用移液管转移液体，下列对于移液管的使用，正确的是(　　)
使用移液管时，拇指和食指捏住管颈标线以上的地方
移液管插入待取溶液液面时不应伸入太多也不应伸入太少
吸取液体时，当液面上升到刻度标线以上约1 cm处时，迅速用另一只手的拇指堵住管口
将移液管移入准备接受溶液的容器中时，将移液管倾斜，使其尖端接触器壁
知识点2　微生物接种和传代的无菌技术
7.(2023·无锡高二检测)接种是微生物培养和微生物选择的必要步骤之一。下列关于接种的叙述，错误的是(　　)
接种通常在酒精灯火焰附近进行
接种之前要对接种环进行灼烧灭菌
接种指无菌条件下将微生物接入培养基的操作
接种时接种环要将培养基的表面划破
8.下列关于微生物接种和传代的描述，错误的是(　　)
抽出接种环时，其带菌部位不要触及管壁或通过火焰，以免菌种沾于管壁或被杀死
用斜面培养基保存菌种通常每隔2～3个月重新接种一次
休眠状态即微生物的生长繁殖受抑制但又不至于死亡
穿刺接种用到的接种器具是接种环
9.在斜面培养基上接种时，其正确的操作顺序是(　　)
①用一只手的拇指和其他四指夹住菌种试管和待接种的斜面试管，管口并齐，使斜面向上保持水平状态
②在火焰附近用握有接种环的手的小拇指、无名指、中指和掌心拔去两支试管上的试管塞，并迅速将试管口通过火焰2～3次
③将接种环伸入菌种管内，让环先接触培养基上未长菌的部位，使环冷却，然后轻轻挑取少许菌体，立即将接种环抽出
④手拿接种环，在酒精灯火焰上来回灼烧多次
⑤在火焰旁迅速将沾有菌体的接种环伸到斜面培养基的底部，然后向上轻轻划“Z”型折线
⑥抽出接种环，将试管口与试管塞分别通过火焰2～3次，迅速塞紧试管
①②③④⑤⑥ ①④②③⑤⑥
①②③④⑥⑤ ②①③④⑤⑥
【综合提升】
10.生物指示剂常用于对医疗器械高压蒸汽灭菌的质量监测。将某批次的多支生物指示剂(如图)与医疗器械一并放入压力锅中，待灭菌完成后，挤破安瓿瓶，让含芽孢的菌片(嗜热脂肪芽孢杆菌)与培养液接触，培养并检测结果。下列说法错误的是(　　)
安瓿瓶内培养液的成分应适于嗜热脂肪芽孢杆菌的生长
制备生物指示剂时，安瓿瓶内的培养液需要进行灭菌处理
嗜热脂肪芽孢杆菌的热耐受性大于已知污染菌的热耐受性
当压力锅中的生物指示剂培养结果为阴性时说明医疗器械灭菌合格
11.含硫蛋白质在某些微生物的作用下产生硫化氢导致生活污水发臭。硫化氢可以与硫酸亚铁铵结合形成黑色沉淀。为探究发臭水体中甲、乙菌是否产生硫化氢及两种菌的运动能力，用穿刺接种的方法，分别将两种菌接种在含有硫酸亚铁铵的培养基上进行培养，如图所示。若两种菌繁殖速度相等，下列说法错误的是(　　)
乙菌的运动能力比甲菌强
为不影响菌的运动需选用液体培养基
该实验不能比较出两种菌产生硫化氢的量
穿刺接种等接种技术的核心是防止杂菌的污染
12.(多选)(2024·江苏扬州期中)微生物的实验室培养，获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌入侵。下列无菌操作中正确的是(　　)
对实验用的培养基，常用电热鼓风干燥箱进行湿热灭菌
对培养皿、接种环和移液管等，常用干热灭菌法进行灭菌
对操作者的双手、衣着以及操作空间等，采用紫外线进行消毒
对试管口、锥形瓶口等部位，可通过酒精灯火焰进行灼烧灭菌
13.(多选)穿刺接种是指用接种针挑取少量的菌种，自培养基的中心垂直地刺入半固体培养基中，然后沿原穿刺线将针拔出的微生物接种方法。下列有关叙述错误的是(　　)
该接种方法可用于厌氧菌种的接种
灭菌后待培养基冷却到0 ℃时，在酒精灯火焰附近将其倒入培养装置
在火焰上灼烧接种针后要立即接种，防止空气中杂菌污染接种针
接种过程中为杀灭试管口上沾染的微生物要对试管口进行灭菌
14.(10分)在生产、生活和科研实践中，经常通过消毒和灭菌来避免杂菌的污染。回答下列问题：
(1)(2分)在实验室中，玻璃和金属材质的实验器具________(填“可以”或“不可以”)放入密闭容器如电热鼓风干燥箱中进行干热灭菌。
(2)(6分)密闭空间内的空气可采用紫外线照射消毒，其原因是紫外线能________。工业生产上一般利用________法大量地制备无菌空气。
(3)(2分)水厂供应的自来水通常是经过________(填“氯气”“乙醇”或“高锰酸钾”)消毒的。
15.(14分)“掌心对掌心，手心压手背，十指交叉摩，手握关节搓，拇指围轴转，指尖掌心揉，手腕别放过。”七步洗手法可以清除手部的污物和微生物，是预防病原体感染的有效措施之一，某生物实验小组设计了“比较洗手前后手上细菌分布情况”的探究活动：各小组成员分别将拇指在培养基甲上轻轻按一下，然后用肥皂将该手洗干净，再将洗净后的拇指在培养基乙上轻轻按一下。将这两个培养基放入恒温培养箱中，在适宜温度下培养24小时后，统计两组培养基中菌落数目，请回答下列问题：
(1)(3分)该实验中用到的培养基中加入了牛肉膏、蛋白胨、NaCl和水，蛋白胨可以为微生物的生长提供________和维生素等营养物质，为了使配制的溶液呈固体状态，还需要加入________；为了防止外来杂菌的入侵，可以将培养基放入盛有适量________的高压蒸汽灭菌锅内灭菌15～20 min。
(2)(4分)实验中“将拇指在培养基上轻轻按一下”相当于微生物培养操作中的________，该操作应该在酒精灯火焰附近进行，原因是______________________________________________________________________
______________________________________________________________________。
(3)(3分)统计甲、乙两组培养皿中的菌落，乙组中菌落数比甲组少得多，实验结果说明肥皂洗手不能彻底清除手上的微生物。为避免手上微生物在无菌操作中污染培养基，洗过的手还应用________________(答出1种即可)等方法处理。
(4)(4分)有同学认为乙组中也有菌落产生，是因为培养过程受到杂菌污染，请你在本实验的基础上设计一个简单的方案验证他的猜想是否正确。
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________。
课时精练2　发酵工程的灭菌方法、灭菌设备、无菌操作器具及微生物接种和传代的无菌技术
1.B　[由于化学试剂可能会与培养基中一些成分发生作用，因此不能用于培养基的灭菌，A错误；保持干燥的实验器具的灭菌，常采用干热灭菌法，C错误；过滤除菌法是通过过滤阻留微生物达到除菌目的的方法，D错误。]
2.A　[在100 ℃条件下煮沸5～6分钟属于消毒，B错误；无菌技术中，若处理对象为液体，可以用湿热灭菌法灭菌，C错误。]
3.D　[加热后，须打开排气阀，排出锅内残留的冷空气。]
4.D　[由于放线菌及霉菌孢子含水量较低，在80～90 ℃条件下，加热30 min方可杀菌。]
5.C　[加水是指使用前在外层锅内加入适量的水，A错误；灭菌桶不应装得过满，以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气，B错误；加热后，打开排气阀，排出锅内的冷空气，C正确；当压力表指针降至“0点”，待温度下降后打开排气阀，开启锅盖，D错误。]
6.B　[使用移液管时，拇指和中指捏住管颈标线以上的地方，A错误；移液管插入待取溶液液面时不应伸入太多，以免管尖外壁粘有过多溶液，也不应伸入太少，以免液面下降后而吸空，B正确；吸取液体时，当液面上升到刻度标线以上约1 cm处时，迅速用另一只手的食指堵住管口，C错误；将移液管移入准备接受溶液的容器中时，使其出口尖端接触器壁，将容器倾斜，而使移液管直立，D错误。]
7.D　[接种时接种环不能划破培养基的表面，D错误。]
8.D　[接种针用于穿刺接种，接种环用于斜面接种或划线接种。]
9.B
10.D　[生物指示剂待灭菌完成后，挤破安瓿瓶，让嗜热脂肪芽孢杆菌与培养液接触，培养并检测结果，则安瓿瓶内培养液的成分应适于嗜热脂肪芽孢杆菌的生长，A正确；制备生物指示剂时，为了防止污染，安瓿瓶内的培养液需要进行灭菌处理，B正确；芽孢是细菌的休眠体，芽孢壁厚，含水量极低，代谢缓慢，抗逆性强，能经受高温紫外线、电离辐射以及多种化学物质灭杀，可以帮助细菌度过不良环境。因此菌片中芽孢的热耐受性大于器械上的可能污染菌，C正确；若灭菌与未灭菌的生物指示剂均不出现阳性变化，则说明灭菌前无有活性芽孢，也就无法说明灭菌效果，D错误。]
11.B　[从图中可以看出甲菌在试管中分布范围小于乙菌，说明了乙菌的运动能力比甲菌强，A正确；穿刺接种采用的是半固体培养基，B错误；黑色区域的面积大小及颜色深浅能代表产生硫化氢的多少，乙菌黑色区域的面积大于甲菌，但颜色比甲菌浅，无法比较出两种菌产生硫化氢的量，C正确；微生物接种技术的核心是防止杂菌的污染，D正确。]
12.BD　[培养基灭菌常用高压蒸汽灭菌锅进行湿热灭菌，A错误；对培养皿、接种环和移液管等玻璃器皿，常用干热灭菌法进行灭菌，B正确；对操作者的双手采用酒精进行消毒，C错误；对试管口、锥形瓶口等部位，通过火焰灼烧进行灭菌，D正确。]
13.BC　[待培养基冷却到50 ℃左右时再倒入，温度过低培养基会出现凝固的现象，B错误；在火焰上灼烧接种针后要待接种针冷却后才能进行接种，这样能够防止接种针温度过高杀死菌种，C错误。]
14.(1)可以　(2)破坏DNA结构　过滤除菌　(3)氯气
15.(1)碳源、氮源　琼脂(凝固剂)　水
(2)接种　避免周围环境中的微生物污染培养基
(3)酒精棉球擦拭双手、戴消毒手套
(4)再加一个不接种的相同培养基(空白培养基)，与甲、乙在相同条件下培养，若该培养基上没有生长菌落，说明培养过程未被杂菌污染，猜想错误；若该培养基上有生长菌落，说明培养过程被杂菌污染，猜想正确
解析　(1)该实验中用到的培养基中加入了牛肉膏、蛋白胨、NaCl和水，蛋白胨来源于动物原料，含有糖、维生素和有机氮等营养物质，故蛋白胨可以为微生物的生长提供碳源、氮源和维生素等营养物质；为了使配制的溶液呈固体状态，还需要加入凝固剂，如琼脂；为了防止外来杂菌的入侵，可以对培养基采用高压蒸汽灭菌：将培养基放入盛有适量水的高压蒸汽灭菌锅内灭菌15～20min。(2)实验中“将拇指在培养基上轻轻按一下”相当于微生物培养操作中的接种；该操作应该在酒精灯火焰附近进行，这样能够保证接种时处于一个无菌的环境，防止周围环境中的微生物污染培养基。(3)为避免手上微生物在无菌操作中污染培养基，洗过的手还应用酒精棉球擦拭双手、戴消毒手套等方法处理。(4)若要验证乙培养基是否被污染，需要再加一个不接种的相同培养基作为对照，与甲、乙在相同条件下培养，若该培养基上没有生长菌落，说明培养过程中未被杂菌污染，故猜想错误；若该培养基上生长菌落，则说明猜想正确。课时精练3　微生物分离、纯化和培养的无菌技术
(时间：30分钟　分值：50分)
选择题：第1～9题，每小题4分，共36分。答案P172
【基础对点】
知识点1　平板划线法分离和纯化微生物
1.(2024·江苏阶段练习)下列有关纯培养酵母菌实验的叙述，正确的是(　　)
配制好的培养基转移到锥形瓶中，加棉塞并用皮筋扎紧后，放入高压灭菌锅中灭菌
灭菌后的培养基在酒精灯火焰附近倒入培养皿，待冷却 5～10 s后将培养皿倒置
通过接种环在固体培养基表面连续划线，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面
划线完成后，待菌液被培养基吸收，将平板倒置于适宜条件下培养，观察并计数
2.(2024·江苏扬州期中)平板划线法是一种常用的微生物接种方法，某研究小组进行了纯化大肠杆菌实验，图1为部分实验器材，图2为平板划线示意图。有关说法正确的是(　　)
为获得图2的平板，需要使用图1中器材①②③④
完成图2操作，接种环需经过5次灼烧灭菌
图2的第4次划线区域中也可以得到所需菌落
图2中第5区域的划线应与第1区域的划线相连
3.(2024·江苏南通期中)某生物兴趣小组同学开展了酵母菌纯培养实验，部分操作步骤如下图。相关叙述正确的是(　　)
步骤①中待培养基冷却至室温后缓慢倒入培养皿，凝固后倒置
步骤②中为防止杂菌污染，接种环灼烧后立即蘸取一环菌液
步骤③中不能划破培养基，以免影响菌落的分离与观察
步骤④划线后需将平板倒置培养以防止影响菌落的计数
知识点2　稀释涂布平板法分离和纯化微生物
4.如图是从土壤中筛选具有较强降解磷能力菌株过程中的一些操作。下列相关叙述错误的是(　　)
倒平板后的培养皿需进行灭菌
培养时培养皿的放置应如图乙中a所示
在火焰旁操作，可以防止杂菌污染
进行菌落计数时，一般选择菌落数在30～300的平板
5.(2022·江苏卷)下列是某同学分离产脲酶菌的实验设计，不合理的是(　　)
选择农田或公园土壤作为样品分离目的菌株
在选择培养基中需添加尿素作为唯一氮源
适当稀释样品是为了在平板上形成单菌落
可分解酚红指示剂使其褪色的菌株是产脲酶菌
6.(2024·江苏南通阶段练习)研究者将含有一定浓度A菌的少量培养基倾倒在固体培养基上，凝固后形成薄层，培养A菌至该薄层变浑浊(如图)，然后接种某湖泊水样，尝试从湖水中分离出有溶菌特性的细菌。下列叙述错误的是(　　)
含A菌的少量培养基中含有琼脂和蛋白胨，为细菌提供碳源和氮源
若湖泊水样的含菌量较高，需稀释后再依次涂布于不同的浑浊薄层上
待接种的水样被充分吸收后，将平板倒置于恒温培养箱中培养
接种水样后，在能溶解A菌的菌落周围会出现溶菌圈
7.(2024·江苏南京阶段练习)某种物质A(一种含有C、H、N的有机物)难以降解，会对环境造成污染，只有某些细菌能降解A。研究人员按照如图所示流程从淤泥中分离得到能高效降解A的细菌菌株。实验过程中需要甲、乙两种培养基，甲的组分为无机盐、水和A，乙的组分为无机盐、水、A和B，下列表述正确的是(　　)
乙组分的B物质为琼脂，为了提高准确度，实验需设平行重复实验，无需另外设置空白对照
实验时，淤泥及盛有培养基的摇瓶通常采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌
步骤③的接种工具是接种环，菌落数目稳定时，大小不同的菌落形成的起始时间一般不同
实验中初步估测摇瓶M中细菌细胞数为1.5×107个/mL，若要在每个平板上涂布0.1mL稀释后的菌液，且保证每个平板上长出的菌落数不超过150个，则至少应将摇瓶M中的菌液稀释104倍
【综合提升】
8.(多选)(2023·江苏泰州模拟预测)某地土壤有机物X污染严重，为改善土壤环境，研究人员从土壤中分离出可高效降解有机物X的细菌菌株。以下是研究人员分离细菌菌株的示意图。下列说法错误的是(　　)
制备降解X的细菌初筛平板时，调节pH、湿热灭菌后分装到培养皿
实验结果显示E是降解X较理想的菌株，可将其进一步划线纯化
接种后未长出菌落的培养基可以直接丢弃
纯化培养时应用涂布器从盛有菌液的试管中蘸取菌液均匀涂布于平板上
9.(多选)下图所示为分离某种以尿素为氮源的细菌实验过程，下列叙述正确的是(　　)
土样从有哺乳动物尿液的地方取，获得目的菌种的概率很高
为验证尿素固体培养基具有选择作用，可用牛肉膏蛋白胨固体培养基做对照
将实验组和对照组37 ℃恒温培养24～48 h时，需将平板倒置
在尿素固体培养基上生长的细菌都是以尿素为氮源的细菌
10.(14分)(2024·江苏宿迁期中)牛奶是适合微生物生长的良好培养基。牛奶在饮用前都要用巴氏消毒法消毒，以杀死有害微生物。某小组为检测自制酸奶是否被杂菌污染，进行了如图所示操作。请回答下列问题。
(1)(3分)在配制图1培养基过程中，常用________________法对培养基进行灭菌，灭菌操作应在分装到培养皿________(填“之前”或“之后”)。
(2)(2分)图1所示方法为________，若取最终的牛奶稀释液0.1 mL在培养基上进行涂布，应选择的工具是图2中的________(填字母)。
(3)(2分)理想情况下，培养一段时间后可在培养基表面形成菌落。若用该方法培养设置了3个培养皿，菌落数分别为60、59、61，则可以推测每毫升酸奶中所含细菌数为________。运用这种方法统计的结果往往较实际值偏________(填“大”或“小”)。
(4)(5分)接种操作完成后，需将平板________(填“正立”或“倒置”)放入培养箱中培养。如果培养基上出现形状、大小、颜色不同的菌落，说明______________________________________________________________________
____________________________。
(5)(2分)要进一步分离纯化菌种，应采用图3中________(填字母)所示的划线分离操作，其正确操作过程中，划线工具至少要灼烧________次。
图3
课时精练3　微生物分离、纯化和培养的无菌技术
1.C　[将配制好的培养基转移到锥形瓶中，加棉塞，包上牛皮纸，并用皮筋勒紧，再放入高压蒸汽灭菌锅中，灭菌15～20 min，A错误；灭菌后的培养基在酒精灯火焰附近倒入培养皿，等待平板冷却凝固5～10 min，将平板倒过来放置，使皿盖在下，皿底在上，B错误；平板划线法是通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，从而将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面，C正确；平板划线法不能用于计数，D错误。]
2.C　[图②为平板划线法，为获得图2的平板，需要使用图1中器材①②③，A错误；接种环在每次划线前后均需灼烧，图中显示有5个划线区，所以接种环需要经过6次灼烧灭菌，B错误；由题图可知，5区域是最后一个区域，有可能在5区域获得所需要的菌落，在4区域也有可能得到所需要的菌落，C正确；划线时要避免最后一区域的划线与第一区域线连，因为最后一区域是细菌最稀少的，而第一区域是细菌最致密的，如果连在一起则有可能影响单个菌落的分离效果，D错误。]
3.C　[步骤①中培养基冷却至50 ℃(而非室温)左右时，在酒精灯火焰附近倒平板，A错误；步骤②中接种环灼烧后应等接种环冷却后再接种，避免杀死菌种，B错误；划线时应避免划破培养基表面，以免影响菌落的分离与观察，C正确；步骤④划线接种后需将平板倒置培养，防止冷凝水落入培养基造成污染，平板划线法不能用于计数，D错误。]
4.A　[培养基灭菌后倒平板，倒平板后的培养皿不再进行灭菌，A错误；等待平板冷却凝固后，应将平板倒过来放置，如图a所示，B正确；操作时为避免杂菌污染，应在火焰旁操作，C正确；进行菌落计数时，应选择菌落数在30～300之间的平板进行计数，D正确。]
5.D　[农田或公园土壤中含有较多的产脲酶的微生物，A正确；为了筛选可分解尿素的细菌，配制的培养基应选择尿素作为唯一氮源，产脲酶的微生物在该培养基上能生长，B正确；当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，C正确；在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将尿素分解成氨，氨会使培养基的pH升高，酚红指示剂将变红，因此在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，能对分离的菌种做进一步鉴定，D错误。]
6.A　[琼脂是凝固剂，不为细菌提供碳源和氮源，蛋白胨主要来源于动物原料，蛋白胨主要为细菌提供碳源、氮源，A错误；为分离出具有溶菌作用的细菌，需要合适的菌落密度，因此应将含菌量较高的湖泊水样稀释后，依次分别涂布于不同的浑浊薄层上，B正确；为防止皿盖上的水珠落入培养基造成污染，故待接种的水样被充分吸收后，将平板倒置于恒温培养箱中培养，C正确；接种水样培养一段时间后，能溶解A菌的菌落周围不会出现菌体(菌体被破坏)，则其周围会出现透明圈(溶菌圈)，D正确。]
7.D　[根据图示和题意可知，③(稀释涂布平板法)接种到以A为唯一碳源和氮源的选择培养基上，乙的组分为无机盐、水、A和B，在乙培养基上要得到单菌落，则其中B为琼脂，为了提高准确度，实验需设平行重复实验，且需要另外设置空白对照，检测培养基配制是否合格，A错误；淤泥中有菌种，因此不能进行灭菌处理，盛有培养基的摇瓶通常采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌，B错误；据图分析可知，③(稀释涂布平板法)接种到以A为唯一碳源和氮源的选择培养基上，因此步骤③的接种工具是涂布器，且大小不同的菌落是分解菌分解能力不同导致的，C错误；利用稀释涂布平板法对细菌进行计数，要保证每个平板上长出的菌落数不超过150，假设稀释倍数为a，在每个平板上涂布0.1 mL稀释后的菌液，则有150×a÷0.1＝1.5×107，则稀释倍数a＝104，D正确。]
8.CD　[制备降解X的细菌初筛平板时，先调节pH，再湿热灭菌，最后进行倒平板分装到培养皿中，A正确；据图可知，实验结果显示A～E五种菌株中，E菌株的透明圈面积最大，说明其水解有机物X的能力最强，故E是降解X最理想的菌株，可将其进一步划线纯化，B正确；接种后未长出菌落的培养基，也可能有少量微生物，所以不能直接丢弃，C错误；用稀释涂布平板法进行纯化培养时，应该用无菌移液管从盛有菌液的试管中取0.1 mL菌液，再用涂布器涂布，D错误。]
9.ABC　[在含哺乳动物尿液的土壤中有较多以尿素为氮源的细菌，因此土样从有哺乳动物尿液的地方取，获得目的菌种的概率很高，A正确；取不同稀释倍数的土壤稀释液各0.1 mL，分别涂布于牛肉膏蛋白胨固体培养基、尿素固体培养基上，其中牛肉膏蛋白胨固体培养基是对照，B正确；在尿素固体培养基上生长的细菌大多数是以尿素为氮源的细菌，可能还有一些可以利用空气中氮气的微生物等，D错误。]
10.(1)高压蒸汽灭菌　之前　(2)稀释涂布平板法　B　(3)6×107个　小　(4)倒置　有杂菌污染　(5)B　5
解析　(1)对培养基灭菌常采用高压蒸汽灭菌法，应先灭菌，再分装到培养皿，故灭菌操作应在分装到培养皿之前。(2)图1为梯度稀释操作，即稀释涂布平板法，取最终的牛奶稀释液0.1 mL在培养基上进行涂布，应选择图2中的B(涂布器)进行操作。(3)据图1可知，酸奶稀释了105倍，在恒温培养箱中培养一段时间后，3个平板上菌落数分别为60、59、61，则可以推测酸奶中每毫升含菌数＝(60＋59＋61) ÷3÷0.1×105＝6×107(个)。由于有的菌落可能是由2个或多个菌体形成的，因此运用这种方法统计的结果往往较实际值偏小。(4)培养时，一般将接种后的培养皿倒置培养，以防止皿盖上的水滴流入培养基造成污染，如果培养基上出现形状、大小、颜色不同的菌落，说明有杂菌污染。(5)平板划线法时，每次从上次划线的末端开始划线，B符合题意。第一次划线之前需要灼烧，每次划线之后需要灼烧，则共需要5次。

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