资源简介

第一节　基因工程及其技术
第1课时　基因工程的发展历程和基本工具
课时概念解析　本课时的概念为“基因工程是在遗传学、微生物学、生物化学和分子生物学等学科基础上发展而来的”“DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具”，这两个概念的建构需要以下基本概念或证据的支持：
1.基因工程是在多学科的基础上发展而来。
2.DNA重组技术的实现需要限制酶和DNA连接酶对DNA进行剪切和连接。
3.外源基因的导入、稳定遗传和表达离不开载体的作用。
1.基因工程的诞生和发展
2.基因工程的概念
3.基因工程的基本工具
(1)限制性内切核酸酶(又称限制酶)——“分子剪刀”
　　　　是一类酶而不是一种酶
【知识拓展】
1.回文序列
限制酶所识别的序列的特点：碱基反向互补对称，其识别序列无论是含奇数个碱基还是含偶数个碱基，都可以找到一条中轴线。中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的，称为回文序列。如：以中轴线为轴，两侧碱基反向互补对称；以中轴线为轴，两侧碱基反向互补对称。
2.同尾酶
切割不同的DNA片段但产生相同的黏性末端的一类限制性内切核酸酶。其特点是①识别的序列不同，但可以切割出相同的黏性末端，且切割出的黏性末端可以相互配对；②两个同尾酶切割的DNA片段连接后，一般情况下不能再被原来的限制酶识别。
如图：
BamHⅠ和BglⅡ识别序列不同，黏性末端均为GATC，因此二者为同尾酶。
对所连接的DNA片段两端的碱基序列没有专一性要求
(2)DNA连接酶——“分子黏合剂”
①作用　将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的________________。
②种类
(3)载体——“分子搬运工”
①概念：将外源基因导入________，并使其在受体细胞中稳定____________，还需要一定的“分子搬运工”，基因工程上将它们称为载体。
②常用载体——质粒
a.化学本质：质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的____________分子。
b.质粒作为载体所具备的条件及原因
③其他载体：λ噬菌体的衍生物、动物病毒等。
提醒：①基因工程用作载体的质粒一般都是经过人工改造过的。
②注意区分基因工程中的载体和细胞质膜上的载体蛋白，二者本质、功能均不相同。
[辨正误]
(1)基因工程是人工操作导致的染色体变异，变异是不定向的。(　　)
(2)限制酶和解旋酶的作用部位相同。(　　)
(3)E.coli DNA连接酶既能连接黏性末端，又能连接平末端。(　　)
(4)载体的作用是携带外源基因导入受体细胞中，使之稳定存在并表达。(　　)
(5)作为载体的质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因。(　　)
1.现有5种不同的限制酶①HindⅢ、②XbaⅠ、③EcoRⅤ、④SpeⅠ和⑤XhoⅠ，它们的识别序列和切割位点如图所示：
(1)尝试写出XbaⅠ和XhoⅠ切割DNA之后形成的末端。
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
(2)限制酶________切割某一DNA片段后产生的DNA片段能与SpeⅠ切割另一DNA片段产生的DNA片段相连接，原因是______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________。
这两个DNA片段连接后一般________(填“能”或“不能”)再被所用的限制酶识别。
2.如图所示为大肠杆菌及质粒的结构模式图，据图回答以下问题：
(1)将外源基因直接导入受体细胞可行吗？为什么？
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
(2)为使外源基因插入质粒中，质粒需具备什么条件？
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
载体上标记基因的标记原理
载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因，目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。原理如图所示：
【学以致用】
1.(2024·江苏扬州期中)下列有关限制酶的叙述，正确的是(　　)
A.限制酶识别序列越短，则该序列在DNA中出现的概率就越小
B.—CATG↓—和—G↓GATCC—序列被限制酶切出的黏性末端碱基数相同
C.只有用相同的限制酶处理含目的基因和质粒，才能形成重组质粒
D.用限制酶切割DNA分子中部，获得一个目的基因时被水解的磷酸二酯键有2个
2.(2024·江苏泰州月考)下图表示不同的限制酶在目的基因的提取和基因表达载体的构建中的作用，下列有关叙述错误的是(　　)
A.限制酶在识别序列的不同部位将DNA两条链切开
B.在图1和图2中将分别产生4个和2个黏性末端
C.限制酶切割的是特定核苷酸序列之间的磷酸二酯键和氢键
D.图示中酶1、酶2和酶3可以为不同种类的限制酶
与DNA相关的几种酶的比较
比较项目 DNA连接酶 限制酶 DNA聚合酶 解旋酶
作用部位 磷酸二酯键 磷酸二酯键 磷酸二酯键 氢键
作用对象 DNA片段 DNA 单个的脱氧核苷酸 DNA
作用结果 将两个DNA片段连接成完整的DNA分子 切割DNA 分子 将单个的脱氧核苷酸连接到DNA单链末端 将双链DNA分子局部解 旋为单链
3.(多选)下列有关基因工程中载体的说法，错误的是(　　)
A.在进行基因工程操作中，被用作载体的质粒都是天然质粒
B.所有的质粒都可以作为基因工程中的载体
C.质粒是一种独立于细菌染色体外的链状DNA分子
D.作为载体的质粒DNA分子上应有对重组DNA进行鉴定和选择的标记基因
1.(2023·南通高二期中)基因工程取得成功，是基础理论和技术发展共同推动的，下列不属于基因工程相关的技术发现的是(　　)
A.限制性内切核酸酶的发现
B.尼伦伯格等人对遗传密码的破译
C.基因转移载体——质粒的发现
D.DNA分子体外重组的实现
2.(2024·江苏泰州月考)下图是几种限制酶的切割位点，下列说法正确的是(　　)
A.限制酶SmaⅠ和EcoRⅤ切割形成的末端，可通过E.coli DNA连接酶相互连接
B.DNA连接酶、DNA聚合酶和RNA聚合酶均可催化磷酸二酯键的形成
C.所有限制酶的识别序列均由6个核苷酸组成
D.SmaⅠ切割后产生的是黏性末端
3.下列关于如图所示DNA分子片段的说法，正确的是(　　)
A.限制酶可作用于①部位，解旋酶作用于③部位
B.限制酶可作用于④部位，解旋酶作用于①部位
C.作用于①部位的限制酶同时也可以作用于④部位
D.作用于①部位的限制酶与作用于⑤部位的限制酶的碱基识别序列相反
4.(多选)载体作为基因工程中的“分子搬运工”，下列有关叙述正确的是(　　)
A.载体位于细胞质膜上，可以将目的基因送入细胞中
B.载体上应含有多种限制酶切割位点，以供外源DNA插入其中
C.载体上应含有一个或多个标记基因，以供重组DNA的鉴定和选择
D.可以用人工改造的λ噬菌体作为载体将抗虫基因送入棉花细胞
第1课时　基因工程的发展历程和基本工具
自主梳理
1.DNA聚合酶　质粒　DNA连接酶　逆转录酶　限制性内切核酸酶　体外重组　重组质粒　真核生物　原核生物　核苷酸排列顺序
2.DNA分子
3.(1)脱氧核苷酸序列　黏性末端　平末端　(2)①磷酸二酯键　②T4噬菌体　黏性末端　(3)①受体细胞　遗传和表达　②环状DNA　复制原点　限制酶切割位点　标记基因　鉴定和选择
辨正误
(1)×　提示：基因工程是人工操作导致的基因重组。
(2)×　提示：限制酶作用于DNA中的磷酸二酯键，解旋酶作用于氢键。
(3)×　提示：E.coli DNA连接酶可连接黏性末端，不能连接平末端。
(4)√
(5)×　提示：质粒中的标记基因通常为抗生素抗性基因。
合作探究
1.(1)提示：XbaⅠ：和
XhoⅠ：和
(2)XbaⅠ　这两种限制酶切割DNA片段后形成的DNA片段的黏性末端可以互补配对的　不能
2.(1)提示：不可行。直接把外源基因导入受体细胞，外源基因在细胞内不能进行复制、转录和稳定保存。
(2)提示：质粒应有多个限制性内切核酸酶的切割位点，供外源基因插入其中。
学以致用
1.B　[限制酶识别序列越短，则该序列在DNA中出现的概率就越大，A错误；－CATG↓－和－G↓GATCC－序列被限制酶切出的黏性末端碱基数相同，都是4个，B正确；用不同的限制酶处理含目的基因的片段和质粒，也可能形成相同的黏性末端，再用DNA连接酶也可能形成重组质粒，C错误；用限制酶从一个DNA分子中部获取一个目的基因时，需要切开两个切口，水解4个磷酸二酯键，D错误。]
2.C　[由图可知，产生的是黏性末端，所以可知限制酶在它识别序列的不同部位将DNA的两条链分别切开的，A正确；由图可知，图1中用酶1和酶2切割，能产生4个黏性末端，图2中用酶3切割，能产生2个黏性末端，B正确；限制酶切割的是特定核苷酸序列之间的磷酸二酯键，不会切割氢键，C错误；限制酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开，图示中酶1、酶2和酶3可以为不同种类的限制酶，D正确。]
3.ABC　[天然的质粒不能直接作为载体，基因工程中用到的质粒一般都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的，A错误；作为基因工程的载体，必须具备一定的条件，而自然界中的质粒不一定具备相应的条件，因此不一定都可以作为基因工程中的载体，B错误；质粒是一种独立于细菌拟核外的环状DNA分子，C错误；作为载体的质粒DNA分子上应有标记基因，便于对重组DNA进行鉴定和选择，D正确。]
随堂检测
1.B　[工具酶的发现属于基因工程相关的技术发现，A不符合题意；1967年，罗思和海林斯基发现基因转移载体——质粒，属于基因工程相关的技术发现，C不符合题意；1972年，伯格及其科研团队完成了世界上首次DNA分子体外重组，DNA分子体外重组的实现属于基因工程相关的技术发现，D不符合题意。]
2.B　[限制酶SmaⅠ和EcoRⅤ切割形成的是平末端，E.coli DNA连接酶只能连接黏性末端T4 DNA连接酶可连接黏性末端和平末端，A、D错误；DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键；DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸加到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键；RNA聚合酶将单个核糖核苷酸加到已有的RNA片段上形成磷酸二酯键，B正确；并不是所有的限制酶的识别序列都是由6个核苷酸组成，有些限制酶的识别序列由4个或8个核苷酸组成，C错误。]
3.A　[分析图示可知，①②④⑤为磷酸二酯键，③为氢键，限制酶作用于①部位，解旋酶作用于③部位，A正确，B错误；作用于①部位的限制酶同时也可以作用于⑤部位，C错误；作用于①部位的限制酶与作用于⑤部位的限制酶的碱基识别序列相同，都是—GAATTC—，D错误。]
4.BC　[作为基因工程中的“分子搬运工”的载体包括质粒、λ噬菌体的衍生物、动物病毒等，与存在于细胞质膜上的载体蛋白不同，A错误；噬菌体是细菌病毒，只能感染细菌细胞，可以利用质粒或植物病毒作为抗虫基因的载体，送入棉花细胞，D错误。](共42张PPT)
第三章　基因工程 第一节　基因工程及其技术　
第1课时　基因工程的发展历程和基本工具
本课时的概念为“基因工程是在遗传学、微生物学、生物化学和分子生物学等学科基础上发展而来的”“DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具”，这两个概念的建构需要以下基本概念或证据的支持：
1.基因工程是在多学科的基础上发展而来。
2.DNA重组技术的实现需要限制酶和DNA连接酶对DNA进行剪切和连接。
3.外源基因的导入、稳定遗传和表达离不开载体的作用。
课时概念解析
目录 CONTENTS
随堂检测
合作探究
思维导图
自主梳理
1.基因工程的诞生和发展
DNA聚合酶
质粒
DNA连接酶
逆转录酶
限制性内切核酸酶
体外重组
重组质粒
真核生物
原核生物
核苷酸排列
顺序
2.基因工程的概念
DNA分
子
3.基因工程的基本工具
(1)限制性内切核酸酶(又称限制酶)——“分子剪刀”　　　　
是一类酶而不是一种酶
脱氧核苷酸
序列
黏性末端
平末端
【知识拓展】
1.回文序列
限制酶所识别的序列的特点：碱基反向互补对称，其识别序列无论是含奇数个碱基还是含偶数个碱基，都可以找到一条中轴线。中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的，称为回文序列。如： 以中轴线为轴，两侧碱基反向互补对称； 以中轴线为轴，两侧碱基反向互补对称。
2.同尾酶
切割不同的DNA片段但产生相同的黏性末端的一类限制性内切核酸酶。其特点是①识别的序列不同，但可以切割出相同的黏性末端，且切割出的黏性末端可以相互配对；②两个同尾酶切割的DNA片段连接后，一般情况下不能再被原来的限制酶识别。
如图：
BamHⅠ和BglⅡ识别序列不同，黏性末端均为GATC，因此二者为同尾酶。
对所连接的DNA片段两端的碱基序列没有专一性要求
(2)DNA连接酶——“分子黏合剂”
①作用　将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的____________。
②种类
磷酸二酯键
T4噬菌体
黏性末端
(3)载体——“分子搬运工”
①概念：将外源基因导入__________，并使其在受体细胞中稳定____________，还需要一定的“分子搬运工”，基因工程上将它们称为载体。
②常用载体——质粒
a.化学本质：质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的____________分子。
受体细胞
遗传和表达
环状DNA
b.质粒作为载体所具备的条件及原因
③其他载体：λ噬菌体的衍生物、动物病毒等。
复制原点
限制酶切割位点
标记基因
鉴定和选择
提醒：①基因工程用作载体的质粒一般都是经过人工改造过的。
②注意区分基因工程中的载体和细胞质膜上的载体蛋白，二者本质、功能均不相同。
×
√
[辨正误]
(1)基因工程是人工操作导致的染色体变异，变异是不定向的。( )
提示：基因工程是人工操作导致的基因重组。
(2)限制酶和解旋酶的作用部位相同。( )
提示：限制酶作用于DNA中的磷酸二酯键，解旋酶作用于氢键。
(3)E.coli DNA连接酶既能连接黏性末端，又能连接平末端。( )
提示：E.coli DNA连接酶可连接黏性末端，不能连接平末端。
(4)载体的作用是携带外源基因导入受体细胞中，使之稳定存在并表达。( )
(5)作为载体的质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因。( )
提示：质粒中的标记基因通常为抗生素抗性基因。
×
×
×
1.现有5种不同的限制酶①HindⅢ、②XbaⅠ、③EcoRⅤ、④SpeⅠ和⑤XhoⅠ，它们的识别序列和切割位点如图所示：
●限制酶主要存在于原核生物中，推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么？
提示：限制酶是原核生物的一种防御工具，用来切割侵入细胞的外源DNA，以保证自身安全。
●为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？
提示：含某种限制酶的细菌的DNA分子不具备这种限制酶的识别序列，或者甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。
●请结合下图，推断限制酶切割一次可断开几个磷酸二酯键？产生多少游离的磷酸基团？产生几个黏性末端？消耗几分子水？
提示：断开2个磷酸二酯键。产生2个游离的磷酸
基团。产生2个黏性末端。消耗2分子水。　　　
(1)尝试写出XbaⅠ和XhoⅠ切割DNA之后形成的末端。
(2)限制酶__________切割某一DNA片段后产生的DNA片段能与SpeⅠ切割另一DNA片段产生的DNA片段相连接，原因是________________________________
____________________________________。这两个DNA片段连接后一般不能(填“能”或“不能”)再被所用的限制酶识别。
XbaⅠ
这两种限制酶切割DNA片段后形成的DNA片段的黏性末端可以互补配对的
2.如图所示为大肠杆菌及质粒的结构模式图，据图回答以下问题：
(1)将外源基因直接导入受体细胞可行吗？为什么？
提示：不可行。直接把外源基因导入受体细胞，
外源基因在细胞内不能进行复制、转录和稳定保存。
(2)为使外源基因插入质粒中，质粒需具备什么条件？
提示：质粒应有多个限制性内切核酸酶的切割位点，
供外源基因插入其中。
●要使携带的外源基因在受体细胞中稳定存在，质粒需要具备什么条件？
提示：能在细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。
●为了筛选出含有重组DNA的受体细胞，质粒需要具备什么条件？
提示：含有适合的标记基因，便于重组DNA分子的筛选。如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因等。　　　
●基因工程的理论基础
●DNA连接酶与限制性内切核酸酶的关系
(1)区别
(2)两者的关系
载体上标记基因的标记原理
载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因，目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。原理如图所示：
【 学以致用 】
B
1.(2024·江苏扬州期中)下列有关限制酶的叙述，正确的是(　　)
A.限制酶识别序列越短，则该序列在DNA中出现的概率就越小
B.—CATG↓—和—G↓GATCC—序列被限制酶切出的黏性末端碱基数相同
C.只有用相同的限制酶处理含目的基因和质粒，才能形成重组质粒
D.用限制酶切割DNA分子中部，获得一个目的基因时被水解的磷酸二酯键有2个
解析：限制酶识别序列越短，则该序列在DNA中出现的概率就越大，A错误；
－CATG↓－和－G↓GATCC－序列被限制酶切出的黏性末端碱基数相同，都是4个，B正确；
用不同的限制酶处理含目的基因的片段和质粒，也可能形成相同的黏性末端，再用DNA连接酶也可能形成重组质粒，C错误；
用限制酶从一个DNA分子中部获取一个目的基因时，需要切开两个切口，水解4个磷酸二酯键，D错误。
C
2.(2024·江苏泰州月考)下图表示不同的限制酶在目的基因的提取和基因表达载体的构建中的作用，下列有关叙述错误的是(　　)
A.限制酶在识别序列的不同部位
将DNA两条链切开
B.在图1和图2中将分别产生4个和
2个黏性末端
C.限制酶切割的是特定核苷酸序列之间的磷酸二酯键和氢键
D.图示中酶1、酶2和酶3可以为不同种类的限制酶
解析：由图可知，产生的是黏性末端，所以可知限制酶在它识别序列的不同部位将DNA的两条链分别切开的，A正确；
由图可知，图1中用酶1和酶2切割，能产生4个黏性末端，图2中用酶3切割，能产生2个黏性末端，B正确；
限制酶切割的是特定核苷酸序列之间的磷酸二酯键，不会切割氢键，C错误；
限制酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开，图示中酶1、酶2和酶3可以为不同种类的限制酶，D正确
A.限制酶在识别序列的不同部位将DNA两条链切开
B.在图1和图2中将分别产生4个和2个黏性末端
C.限制酶切割的是特定核苷酸序列之间的磷酸二酯键和氢键
D.图示中酶1、酶2和酶3可以为不同种类的限制酶
DNA相关的几种酶的比较
比较项目 DNA连接酶 限制酶 DNA聚合酶 解旋酶
作用部位 磷酸二酯键 磷酸二酯键 磷酸二酯键 氢键
作用对象 DNA片段 DNA 单个的脱氧核苷酸 DNA
作用结果 将两个DNA片段连接成完整的DNA分子 切割DNA 分子 将单个的脱氧核苷酸连接到DNA单链末端 将双链DNA分子局部解 旋为单链
ABC
3.(多选)下列有关基因工程中载体的说法，错误的是(　 　)
A.在进行基因工程操作中，被用作载体的质粒都是天然质粒
B.所有的质粒都可以作为基因工程中的载体
C.质粒是一种独立于细菌染色体外的链状DNA分子
D.作为载体的质粒DNA分子上应有对重组DNA进行鉴定和选择的标记基因
解析：天然的质粒不能直接作为载体，基因工程中用到的质粒一般都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的，A错误；
作为基因工程的载体，必须具备一定的条件，而自然界中的质粒不一定具备相应的条件，因此不一定都可以作为基因工程中的载体，B错误；
质粒是一种独立于细菌拟核外的环状DNA分子，C错误；
作为载体的质粒DNA分子上应有标记基因，便于对重组DNA进行鉴定和选择，D正确。
B
1.(2023·南通高二期中)基因工程取得成功，是基础理论和技术发展共同推动的，下列不属于基因工程相关的技术发现的是(　　)
A.限制性内切核酸酶的发现
B.尼伦伯格等人对遗传密码的破译
C.基因转移载体——质粒的发现
D.DNA分子体外重组的实现
解析：工具酶的发现属于基因工程相关的技术发现，A不符合题意；
1967年，罗思和海林斯基发现基因转移载体——质粒，属于基因工程相关的技术发现，C不符合题意；
1972年，伯格及其科研团队完成了世界上首次DNA分子体外重组，DNA分子体外重组的实现属于基因工程相关的技术发现，D不符合题意。
B
2.(2024·江苏泰州月考)下图是几种限制酶的切割位点，下列说法正确的是(　　)
A.限制酶SmaⅠ和EcoRⅤ切割
形成的末端，可通过E.coli DNA
连接酶相互连接
B.DNA连接酶、DNA聚合酶和RNA聚合酶均可催化磷酸二酯键的形成
C.所有限制酶的识别序列均由6个核苷酸组成
D.SmaⅠ切割后产生的是黏性末端
A.限制酶SmaⅠ和EcoRⅤ切割形成的末端，可通过E.coli DNA连接酶相互连接
B.DNA连接酶、DNA聚合酶和RNA聚合酶均可催化磷酸二酯键的形成
C.所有限制酶的识别序列均由6个核苷酸组成
D.SmaⅠ切割后产生的是黏性末端
解析：限制酶SmaⅠ和EcoRⅤ切割形成的是平末端，E.coli DNA连接酶只能连接黏性末端T4 DNA连接酶可连接黏性末端和平末端，A、D错误；
DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键；DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸加到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键；RNA聚合酶将单个核糖核苷酸加到已有的RNA片段上形成磷酸二酯键，B正确；
并不是所有的限制酶的识别序列都是由6个核苷酸组成，有些限制酶的识别序列由4个或8个核苷酸组成，C错误。
A
3.下列关于如图所示DNA分子片段的说法，正确的是(　　)
A.限制酶可作用于①部位，解旋酶作用于③部位
B.限制酶可作用于④部位，解旋酶作用于①部位
C.作用于①部位的限制酶同时也可以作用于④部位
D.作用于①部位的限制酶与作用于⑤部位的限制酶的碱基识别序列相反
解析：分析图示可知，①②④⑤为磷酸二酯键，③为氢键，限制酶作用于①部位，解旋酶作用于③部位，A正确，B错误；
作用于①部位的限制酶同时也可以作用于⑤部位，C错误；
作用于①部位的限制酶与作用于⑤部位的限制酶的碱基识别序列相同，都是—GAATTC—，D错误。
BC
4.(多选)载体作为基因工程中的“分子搬运工”，下列有关叙述正确的是(　　)
A.载体位于细胞质膜上，可以将目的基因送入细胞中
B.载体上应含有多种限制酶切割位点，以供外源DNA插入其中
C.载体上应含有一个或多个标记基因，以供重组DNA的鉴定和选择
D.可以用人工改造的λ噬菌体作为载体将抗虫基因送入棉花细胞
解析：作为基因工程中的“分子搬运工”的载体包括质粒、λ噬菌体的衍生物、动物病毒等，与存在于细胞质膜上的载体蛋白不同，A错误；
噬菌体是细菌病毒，只能感染细菌细胞，可以利用质粒或植物病毒作为抗虫基因的载体，送入棉花细胞，D错误。
●根据基因工程的有关知识，据下图回答下列问题：
(1)a代表的物质和质粒的化学本质都是________。
(2)质粒载体用EcoRⅠ切割后产生的片段如下：
AATTC……G
G……CTTAA
为使载体与目的基因相连，含有目的基因的DNA除可用EcoRⅠ切割外，还可用另一种限制性内切核酸酶切割，该酶必须具有的特点是_____________________________________
________。
DNA
切割产生的DNA片段末端与EcoRⅠ切割产生
的相同
(3)基因工程中除质粒外，________________和________也可作为载体；其作为运载体的必备条件____________________________________
_______________________________(至少两个)。载体与目的基因连接时，DNA连接酶催化形成的化学键是____________。
(4)氨苄青霉素抗性基因在质粒DNA上被称为________，其作用是______________________。
(5)不同生物的基因可以拼接的结构基础是____________________。　　　
λ噬菌体的衍生物
动物病毒
多个限制酶切割位点、适合的标记基因、复
制原点、能稳定遗传并表达(至少两个)
磷酸二酯键
标记基因
鉴定和选择重组DNA分子
DNA结构基本相同
解析：(1)a代表的物质是大肠杆菌的拟核，化学本质是裸露的DNA。质粒是一种具有自我复制能力的环状DNA分子。故a代表的物质和质粒的化学本质都是DNA。
(2)为了便于相连，两种不同限制酶切割之后所产生的黏性末端必须相同，即切割产生的DNA片段末端与EcoRⅠ切割产生的相同。
(3)基因工程中常见的载体有质粒、λ噬菌体的衍生物和动物病毒等。作为载体的必备条件：多个限制酶切割位点、适合的标记基因、复制原点、能稳定遗传并表达。DNA连接酶将两个DNA片段进行连接，催化形成的是磷酸二酯键。
(4)氨苄青霉素抗性基因在质粒DNA上称为标记基因，其作用是鉴定和选择重组DNA分子。
(5)基因是具有遗传效应的DNA片段，不同生物的基因可以拼接的结构基础是DNA结构基本相同。第2课时　PCR技术和利用PCR技术扩增DNA片段并完成电泳鉴定
课时概念解析　本课时的概念为“利用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增DNA片段并完成电泳鉴定，或运用软件进行虚拟PCR实验”，这个概念的建构需要以下基本概念或证据的支持：
1.聚合酶链式反应(PCR)是目的DNA片段(目的基因)的体外扩增技术。
2.利用琼脂糖凝胶电泳技术可以检测PCR的扩增产物。
一、聚合酶链式反应(PCR)技术
1.概念　是目的DNA片段(________)的体外扩增技术。
2.条件　在向PCR管中加入一定量的______________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
等后，设置好反应程序，启动PCR仪，它会自动完成反应步骤。
3.步骤
每一次循环包括____________三个步骤。
[微思考]
1.PCR技术的原理是什么？
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
2.PCR过程中DNA是如何解开双链的？是否是边解旋边复制？
_____________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
4.应用
(1)广泛应用于医学及分子生物学等领域，如：____________、____________、免疫学研究、癌基因探索及某些疾病治疗等方面。
(2)在古生物学、法医学等方面也有广泛的应用。
[辨正误]
(1)PCR反应需提供DNA模板、引物对、4种核糖核苷三磷酸和热稳定的DNA聚合酶。(　　)
(2)用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列。(　　)
(3)PCR的每一次循环都包括变性→退火→延伸三个步骤，延伸后的产物又可以作为下一次循环的模板。(　　)
(4)DNA聚合酶能够从引物的5′端开始连接脱氧核苷酸。(　　)
(5)每一次循环后目的基因的量可以增加一倍，呈指数形式扩增。(　　)
图1、图2分别是PCR扩增技术相关过程，请思考回答下列问题：
(1)请完善图1中的信息。
(2)高温变性的目的是使________________________________________________。
(3)PCR所需引物是依据________的一段已知序列设计而成的，图1中引物A与引物B________(填“相同”或“不同”)，其在PCR过程中________(填“能”或“不能”)重复利用。
(4)DNA复制时为什么需要引物？
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
【学以致用】
1.下列有关PCR技术的说法，错误的是(　　)
A.PCR是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术
B.PCR技术的原理是DNA分子半保留复制
C.退火过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则
D.PCR过程中只需要用到模板DNA、两种引物分子、4种脱氧核苷三磷酸原料
2.(多选)(2024·江苏盐城期中)如图为PCR扩增过程示意图，下列相关叙述错误的是(　　)
A.PCR反应的缓冲液中一般需添加Mg2＋以激活DNA聚合酶
B.PCR扩增DNA分子过程中子链合成的方向是从3′到5′
C.高温加热的目的是使DNA受热变性打开双螺旋变为单链
D.第3轮PCR产物中含有和目的基因等长的DNA分子占1/8
二、利用PCR技术扩增DNA片段并完成电泳鉴定
1.实验原理
(1)扩增DNA片段的过程包括________、________和________等步骤的多次循环。
(2)理论上，每经过一个循环，样本中DNA片段的数量增加________，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过n个循环后，DNA片段数量可扩增至原先的________倍。
(3)典型的PCR反应体系包括：DNA模板、____________、dNTP(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)、人工合成的________引物对、________酶等。
(4)在不同阶段，还需要控制PCR仪反应系统的________温度。
(5)PCR和体内DNA复制的差异
比较项目 PCR 细胞核内DNA复制
场所 试管中 细胞内
方式 半保留______局部区域复制 半保留________全链复制
起始位点 引物____端 复制起始位点
酶 仅一种DNA聚合酶(____酶) 多种酶
反应条件 温度变幅大 温和
解旋 ____解旋 ________解旋
引物 ______片段，______在复制的子链中 ________片段，________在复制的子链中
产物 引物界定的片段 核基因组
循环次数 人为设置 与细胞分裂同步
2.实验器材和试剂
(1)仪器：PCR仪、琼脂糖凝胶电泳系统、凝胶成像仪或紫外透射仪、微孔加热器(微量恒温仪)等。
(2)试剂：DNA模板、dNTP混合物、Taq酶、双蒸水、10×PCR缓冲液等。
3.实验步骤
(1)PCR扩增目的基因
①配制反应体系。
②按下述程序进行扩增。
a.94 ℃________5 min→b.94 ℃变性1 min→c.55 ℃________1 min→d.72 ℃延伸2 min→e.重复步骤b～d，30个循环→f.72 ℃________7～10 min。
(2)电泳分析
①电泳：维持恒压________ 1.5～2 h。
②电泳鉴定：采用凝胶成像仪或____________观察和记录电泳结果。
【知识拓展】　琼脂糖凝胶电泳的原理与操作
(1)原理
①DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动。
②在凝胶中，DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。电泳时，DNA分子的相对分子质量越大，受到的阻力越大，迁移速率越慢；反之，迁移速率越快。
(2)过程
[辨正误]
(1)PCR的引物为DNA片段并保留在子链中，细胞核内DNA复制所需引物为RNA片段，并且不保留在子链中。(　　)
(2)PCR循环之前，通常要进行一次预变性，预变性的目的是增加大分子模板DNA彻底变性的概率。(　　)
(3)利用PCR扩增DNA片段时，在每一次循环的变性之前，通常要用94 ℃的高温处理反应液5 min进行预变性。(　　)
(4)PCR实验中使用的PCR管、枪头和蒸馏水等在使用前没必要进行高压灭菌处理。(　　)
聚合酶链式反应(PCR)是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。无论是化石中的古生物、历史人物的残骸，还是几十年前凶杀案中凶手所遗留的毛发、皮肤或血液，只要能分离出极少量的DNA，就能用PCR加以放大，进行比对。
(1)试分析PCR反应中变性时温度低、时间短和退火时的温度过低对实验结果分别产生什么影响？
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
(2)在电泳鉴定中，如何判断DNA片段扩增是否成功？
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
(1)影响DNA分子迁移速率的因素有：凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象。在PCR技术扩增DNA片段的实验中主要考虑DNA分子的迁移速率与其大小成反比。
(2)未出现扩增条带的原因主要有：
①Taq酶失活。
②引物出现质量问题。
③Mg2＋浓度过低。
④变性时的温度低，变性时间短。
(3)出现非特异性扩增条带的原因主要有：
①模板DNA出现污染。
②引物特异性不强或形成引物二聚体。
③Mg2＋浓度过高。
④退火时的温度过低等。
【学以致用】
3.(2023·江苏盐城高二期中)某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带(引物与模板完全配对)外，还有2条非特异性条带(引物和模板不完全配对)。为了减少非特异性条带的产生，以下措施中有效的是(　　)
A.增加模板DNA的量　B.延长热变性的时间
C.延长延伸的时间 D.提高退火的温度
4.用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到以下电泳图谱，其中1号为DNA标准样液(Marker)，10号为蒸馏水，PCR时加入的模板DNA如图所示。据此作出的分析，不合理的是(　　)
A.PCR产物的分子大小在250～500 bp之间
B.3号样品为不含目的基因的载体DNA
C.9号样品对应植株不是所需的转基因植株
D.10号确定反应体系等对结果没有干扰
1.下列关于PCR的叙述错误的是(　　)
A.用PCR方法扩增目的基因时需要知道基因的部分序列
B.设计的引物序列必须全部能够和模板DNA碱基互补
C.退火温度过高可能导致PCR反应得不到任何扩增产物
D.第四轮循环产物中含有两种引物的DNA片段所占比例为7/8
2.(2024·江苏南通阶段练习)下列关于PCR过程及结果的叙述，错误的是(　　)
A.相比细胞内DNA复制，PCR过程不需要解旋酶、DNA连接酶等
B.退火的温度设定与引物有关，延伸时间的设定与扩增片段的长度有关
C.若酶和引物都正常，但是未出现扩增带，其原因可能是核酸模板变性不彻底
D.理论上推测，经n轮循环后的产物中只含1种引物的DNA片段占比为
1/(2n－1)
3.(2024·江苏泰州月考)PCR引物的3′端为结合模板DNA的关键，5′端无严格限制，可用于添加限制酶切点等序列，dNTP是DNA合成的原料，还可供能。下列相关说法错误的是(　　)
A.图示环节所需的温度比上一个环节的低
B.引物的设计要有一段已知目的基因的核苷酸序列
C.Taq酶只能从引物的3′端开始延伸DNA链
D.1个循环后，子代DNA双链的脱氧核苷酸数量相同
4.(2024·江苏扬州期末)关于“利用PCR技术扩增DNA片段并完成电泳鉴定”实验，下列说法正确的是(　　)
A.PCR中DNA双链的解聚与结合利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA复制
B.PCR反应体系中需要加入大肠杆菌中的DNA聚合酶
C.在凝胶中DNA分子的迁移速率只与DNA分子的大小有关
D.DNA分子在一定的pH下带电，在电场的作用下会向着与它所带电荷相同的电极移动
5.(多选)下列关于核酸片段的扩增及电泳鉴定的相关叙述，正确的是(　　)
A.PCR反应缓冲液中一般要添加ATP，以激活热稳定的DNA聚合酶
B.mRNA也是核酸，因此可直接用PCR扩增仪扩增
C.PCR产物常通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定
D.电泳结果可采用凝胶成像仪或紫外透射仪观察和记录
第2课时　PCR技术和利用PCR技术扩增DNA片段并完成电泳鉴定
一、
自主梳理
1.目的基因
2.模板DNA、引物对、4种脱氧核苷三磷酸(dNTP)、缓冲液和热稳定的DNA聚合酶(Taq酶)、Mg2＋
3.变性、退火、延伸
微思考
1.提示：DNA半保留复制。
2.提示：高温变性后DNA解开双链。PCR过程中DNA是全解旋再复制。
4.(1)病原体鉴定　遗传病诊断
辨正误
(1)×　提示：PCR反应需在一定的缓冲液中才能进行，需要提供DNA模板，引物对，4种脱氧核苷三磷酸和热稳定的DNA聚合酶。
(2)√　(3)√
(4)×　提示：DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。
(5)√
合作探究
(1)变性　退火　延伸
(2)双链DNA解旋为单链
(3)目的基因　不同　不能
(4)提示：在DNA扩增时，DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从引物的3′端延伸DNA链，因此DNA复制时应加入两种引物。
学以致用
1.D　[PCR过程中需要模板DNA、两种引物分子、4种脱氧核苷三磷酸、缓冲液和热稳定的DNA聚合酶、Mg2＋等，D错误。]
2.BD　[PCR是体外进行DNA复制的过程，DNA复制需要DNA聚合酶，真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活，因此进行PCR扩增时通常在反应缓冲液中添加Mg2＋，A正确；DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸，B错误；高温加热的目的是使DNA受热变性使氢键断裂，打开双螺旋，变为单链，作为复制的模板，C正确；第3轮PCR结束后，含有和目的基因等长的DNA分子有2个，而子代DNA有23＝8(个)，故含有和目的基因等长的DNA分子占1/4，D错误。]
二、
自主梳理
1.(1)变性　退火　延伸　(2)一倍　2n　(3)反应缓冲液　DNA　Taq　(4)不同　(5)全连续　半不连续　3′　Taq　高温　解旋酶　DNA　保留　RNA　不保留
3.(1)②预变性　退火　延伸　(2)①80 V　②紫外透射仪
辨正误
(1)√　(2)√
(3)×　提示：仅第一次循环需要预变性。
(4)×　提示：为避免外源DNA等的污染，PCR实验中使用的PCR管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压蒸汽灭菌处理。
合作探究
(1)提示：变性时温度低、时间短可能导致未出现扩增条带；退火时的温度过低可能导致出现非特异性扩增条带。
(2)提示：可以通过凝胶成像仪或紫外透射仪直接观察DNA条带的分布及粗细程度。
学以致用
3.D　[增加模板DNA的量可以提高反应速度，但不能有效减少非特异性条带的产生，A错误；延长热变性的时间和延长延伸的时间会影响变性和延伸过程，但对于延伸中的配对影响不大，故不能有效减少产生非特异性条带，B、C错误；非特异性条带增加的原因可能是退火温度过低而造成引物与模板的错配，故可通过提高退火的温度来减少非特异性条带的产生，D正确。]
4.B　[PCR过程中，可以通过设计特定的引物来扩增特定的DNA片段，4～9号是转基因植株，理论上应包含目的基因，结合2号野生型和10号蒸馏水组的结果，推测包含目的基因的片段大小应为250～500 bp，A合理；3号PCR结果包含250～500 bp片段，应包含目的基因，B不合理；9号PCR结果不包含250～500 bp片段，所以不是所需转基因植株，C合理；10号放入蒸馏水，可排除反应体系等对结果的干扰，D合理。]
随堂检测
1.B　[用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列，只需要知道一段已知目的基因的核苷酸序列，从而根据这段序列合成引物，A正确；设计引物时需要避免引物之间形成碱基互补配对而造成引物自连，不需全部能够和模板DNA碱基互补，B错误；退火的目的是引物与模板DNA结合，故退火温度过高可能导致引物与模板DNA不能结合，因而使得PCR反应得不到任何扩增产物，C正确；DNA复制为半保留复制，DNA复制n次，共形成2n个DNA，其中两个DNA含有母链和子链(含引物A或引物B)，(2n－2)个DNA都含有子链(含有引物A和引物B)，第四轮循环即DNA复制4次，共形成16个DNA，产物中同时含有引物A和引物B的DNA片段所占的比率为(16－2)/16＝7/8，D正确。]
2.D　[PCR与细胞内DNA复制破坏氢键的原理不同，其中PCR通过高温破坏氢键，PCR过程不需要解旋酶、DNA连接酶等，A正确；退火的温度设定与引物有关，当其中G－C碱基对多时，温度较高，而延伸时间的设定与扩增片段的长度有关，长度越大，则时间越长，B正确；PCR扩增的过程包括变性→退火→延伸过程，其中变性是在高温条件下将DNA双链解开，作为模板，若酶和引物都正常，但是不出现扩增带，其原因可能是核酸模板变性不彻底，C正确；DNA进行半保留复制，每次复制都需要两种引物结合在DNA的两端，经过n轮循环产物共2n个DNA分子，仅含有其中一种引物的DNA片段为2个，故理论上推测，经过n轮循环产物中只含有一种引物的DNA片段所占比例为2/2n＝1/2n－1，D错误。]
3.D　[图示环节为引物与模板碱基互补配对，表示的是退火环节，退火的上一环节为变性，退火的温度比变性的温度低，A正确；引物的设计要有一段已知目的基因的核苷酸序列，保证其与已知模板碱基互补配对，在后续扩增的过程中才能进行子链的延伸，B正确；子链是从5′→3′端延伸的Taq酶只能从引物的3′端开始延伸DNA链，C正确；由于两个引物均不在该片段的端点，因此一个循环后，子代DNA双链的脱氧核苷酸数量不相同，D错误。]
4.A　[在PCR技术的过程中包括：变性(解链)→退火→延伸三个步骤，因此DNA两条链的解旋过程不需要解旋酶的催化，而是利用了DNA在高温下变性的原理，通过调节温度来控制双链的解聚与结合，进而控制DNA复制，A正确；PCR反应体系中需要加入热稳定的DNA聚合酶，B错误；DNA分子在凝胶中的迁移速率除了与DNA分子大小有关外、还与DNA分子构象、凝胶的浓度等有关，C错误；根据电荷同性相斥、异性相吸引可知，DNA分子进行电泳时，会向着与其所带电荷相反的电极移动，D错误。]
5.CD　[PCR时不需添加ATP，热稳定的DNA聚合酶不需要添加ATP激活，A错误；mRNA是核酸，但不能直接用PCR扩增仪扩增，需要先反转录为cDNA再用PCR扩增仪扩增，B错误。](共44张PPT)
第三章　基因工程 第一节　基因工程及其技术　
第2课时　PCR技术和利用PCR技术扩增DNA片段并完成电泳鉴定
本课时的概念为“利用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增DNA片段并完成电泳鉴定，或运用软件进行虚拟PCR实验”，这个概念的建构需要以下基本概念或证据的支持：
1.聚合酶链式反应(PCR)是目的DNA片段(目的基因)的体外扩增技术。
2.利用琼脂糖凝胶电泳技术可以检测PCR的扩增产物。
课时概念解析
目录 CONTENTS
1.聚合酶链式反应(PCR)技术
2.利用PCR技术扩增DNA
片段并完成电泳鉴定
3.随堂检测
自主梳理
合作探究
合作探究
思维导图
自主梳理
1.概念　是目的DNA片段(__________)的体外扩增技术。
2.条件　在向PCR管中加入一定量的______________________________________
__________________________________________________________________等后，设置好反应程序，启动PCR仪，它会自动完成反应步骤。
目的基因
模板DNA、引物对、4种脱氧核苷三磷酸(dNTP)、缓冲液和热稳定的DNA聚合酶(Taq酶)、Mg2＋
3.步骤
每一次循环包括__________________三个步骤。
变性、退火、延伸
[微思考]
1.PCR技术的原理是什么？
提示：DNA半保留复制。
2.PCR过程中DNA是如何解开双链的？是否是边解旋边复制？
提示：高温变性后DNA解开双链。PCR过程中DNA是全解旋再复制。
4.应用
(1)广泛应用于医学及分子生物学等领域，如：____________、____________、免疫学研究、癌基因探索及某些疾病治疗等方面。
(2)在古生物学、法医学等方面也有广泛的应用。
病原体鉴定
遗传病诊断
×
√
[辨正误]
(1)PCR反应需提供DNA模板、引物对、4种核糖核苷三磷酸和热稳定的DNA聚合酶。( )
提示：PCR反应需在一定的缓冲液中才能进行，需要提供DNA模板，引物对，4种脱氧核苷三磷酸和热稳定的DNA聚合酶。
(2)用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列。( )
(3)PCR的每一次循环都包括变性→退火→延伸三个步骤，延伸后的产物又可以作为下一次循环的模板。( )
(4)DNA聚合酶能够从引物的5′端开始连接脱氧核苷酸。( )
提示：DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。
(5)每一次循环后目的基因的量可以增加一倍，呈指数形式扩增。( )
√
×
√
图1、图2分别是PCR扩增技术相关过程，请思考回答下列问题：
变性
退火
延伸
(1)请完善图1中的信息。
(2)高温变性的目的是使______________________。
(3)PCR所需引物是依据__________的一段已知序列设计而成的，图1中引物A与引物B______ (填“相同”或“不同”)，其在PCR过程中______ (填“能”或“不能”)重复利用。
(4)DNA复制时为什么需要引物？
提示：在DNA扩增 合成DNA，只能从引物的3′端延伸DNA链，因此DNA复制时应加入两种引物。
双链DNA解旋为单链
目的基因
不同
不能
●图2是某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理，请分别说明理由。
提示：第1组：引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效。第2组：引物Ⅰ′自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效。
●要保证目的基因能与载体相连接，还要对引物进行什么操作？
提示：要在两种引物的5′端分别添加上限制酶的识别序列。
●图1所示利用PCR技术扩增目的基因，从第几轮循环才会产生完整的目的基因(可用相关图示解释)
提示：第3轮，如图所示：
●如果循环n次，则共需消耗多少对引物？
提示：共需消耗(2n－1)对引物。　　　
●PCR反应的过程
条件 作用
一定量的模板DNA 作为DNA复制的模板
引物对(两段单链DNA) 分别与两条模板链的3′端结合，使DNA聚合酶能从引物3′端开始连接脱氧核苷酸
4种脱氧核苷三磷酸(dNTP) 作为合成DNA子链的原料
缓冲液 提供相对稳定的pH环境
热稳定的DNA聚合酶(Taq酶) 催化合成DNA子链
Mg2＋ 真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活
●PCR中的数量关系
复制次数 1 2 3 n
DNA分子数 2 4 8 2n
含引物的DNA分子数 2 4 8 2n
含其中一种引物的DNA分子数 1＝21－1 3＝22－1 7＝23－1 2n－1
同时含两种引物的DNA分子数 0＝21－2 2＝22－2 6＝23－2 2n－2
共消耗引物的对数 1＝21－1 3＝22－1 7＝23－1 2n－1
含脱氧核苷酸链等长的DNA分子数 0＝21－2 0＝22－4 2＝23－6 2n－2n
【 学以致用 】
D
1.下列有关PCR技术的说法，错误的是(　　)
A.PCR是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术
B.PCR技术的原理是DNA分子半保留复制
C.退火过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则
D.PCR过程中只需要用到模板DNA、两种引物分子、4种脱氧核苷三磷酸原料
解析：PCR过程中需要模板DNA、两种引物分子、4种脱氧核苷三磷酸、缓冲液和热稳定的DNA聚合酶、Mg2＋等，D错误。
BD
2.(多选)(2024·江苏盐城期中)如图为PCR扩增过程示意图，下列相关叙述错误的是(　　)
A.PCR反应的缓冲液中一般需添加Mg2＋以激活
DNA聚合酶
B.PCR扩增DNA分子过程中子链合成的方向是
从3′到5′
C.高温加热的目的是使DNA受热变性打开双螺
旋变为单链
D.第3轮PCR产物中含有和目的基因等长的DNA分子占1/8
解析：PCR是体外进行DNA复制的过程，DNA复制需要DNA聚合酶，真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活，因此进行PCR扩增时通常在反应缓冲液中添加Mg2＋，A正确；
DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸，B错误；
高温加热的目的是使DNA受热变性使氢键断裂，打开双螺旋，变为单链，作为复制的模板，C正确；
第3轮PCR结束后，含有和目的基因等长的DNA分子有2个，而子代DNA有23＝8(个)，故含有和目的基因等长的DNA分子占1/4，D错误。
A.PCR反应的缓冲液中一般需添加Mg2＋以激活DNA聚合酶
B.PCR扩增DNA分子过程中子链合成的方向是从3′到5′
C.高温加热的目的是使DNA受热变性打开双螺旋变为单链
D.第3轮PCR产物中含有和目的基因等长的DNA分子占1/8
1.实验原理
(1)扩增DNA片段的过程包括______、______和______等步骤的多次循环。
(2)理论上，每经过一个循环，样本中DNA片段的数量增加______，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过n个循环后，DNA片段数量可扩增至原先的______倍。
(3)典型的PCR反应体系包括：DNA模板、____________、dNTP(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)、人工合成的________引物对、________酶等。
(4)在不同阶段，还需要控制PCR仪反应系统的______温度。
变性
退火
延伸
一倍
2n
反应缓冲液
DNA
Taq
不同
(5)PCR和体内DNA复制的差异
比较项目 PCR 细胞核内DNA复制
场所 试管中 细胞内
方式 半保留________局部区域复制 半保留__________全链复制
起始位点 引物3′端 复制起始位点
酶 仅一种DNA聚合酶(________酶) 多种酶
反应条件 温度变幅大 温和
全连续
半不连续
Taq
解旋 ______解旋 ________解旋
引物 ________片段，______在复制的子链中 ________片段，________在复制的子链中
产物 引物界定的片段 核基因组
循环次数 人为设置 与细胞分裂同步
高温
解旋酶
DNA
保留
RNA
不保留
2.实验器材和试剂
(1)仪器：PCR仪、琼脂糖凝胶电泳系统、凝胶成像仪或紫外透射仪、微孔加热器(微量恒温仪)等。
(2)试剂：DNA模板、dNTP混合物、Taq酶、双蒸水、10×PCR缓冲液等。
3.实验步骤
(1)PCR扩增目的基因
①配制反应体系。
②按下述程序进行扩增。
a.94 ℃________5 min→b.94 ℃变性1 min→c.55 ℃______1 min→d.72 ℃延伸2 min→e.重复步骤b～d，30个循环→f.72 ℃______7～10 min。
(2)电泳分析
①电泳：维持恒压________ 1.5～2 h。
②电泳鉴定：采用凝胶成像仪或____________观察和记录电泳结果。
预变性
退火
延伸
80 V
紫外透射仪
【知识拓展】　琼脂糖凝胶电泳的原理与操作
(1)原理
①DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动。
②在凝胶中，DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。电泳时，DNA分子的相对分子质量越大，受到的阻力越大，迁移速率越慢；反之，迁移速率越快。
(2)过程
×
√
[辨正误]
(1)PCR的引物为DNA片段并保留在子链中，细胞核内DNA复制所需引物为RNA片段，并且不保留在子链中。( )
(2)PCR循环之前，通常要进行一次预变性，预变性的目的是增加大分子模板DNA彻底变性的概率。( )
(3)利用PCR扩增DNA片段时，在每一次循环的变性之前，通常要用94 ℃的高温处理反应液5 min进行预变性。( )
提示：仅第一次循环需要预变性。
√
(4)PCR实验中使用的PCR管、枪头和蒸馏水等在使用前没必要进行高压灭菌处理。( )
提示：为避免外源DNA等的污染，PCR实验中使用的PCR管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压蒸汽灭菌处理。
×
聚合酶链式反应(PCR)是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。无论是化石中的古生物、历史人物的残骸，还是几十年前凶杀案中凶手所遗留的毛发、皮肤或血液，只要能分离出极少量的DNA，就能用PCR加以放大，进行比对。
(1)试分析PCR反应中变性时温度低、时间短和退火时的温度过低对实验结果分别产生什么影响？
提示：变性时温度低、时间短可能导致未出现扩增条带；退火时的温度过低可能导致出现非特异性扩增条带。
(2)在电泳鉴定中，如何判断DNA片段扩增是否成功？
提示：可以通过凝胶成像仪或紫外透射仪直接观察DNA条带的分布及粗细程度。
(1)影响DNA分子迁移速率的因素有：凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象。在PCR技术扩增DNA片段的实验中主要考虑DNA分子的迁移速率与其大小成反比。
(2)未出现扩增条带的原因主要有：
①Taq酶失活。
②引物出现质量问题。
③Mg2＋浓度过低。
④变性时的温度低，变性时间短。
(3)出现非特异性扩增条带的原因主要有：
①模板DNA出现污染。
②引物特异性不强或形成引物二聚体。
③Mg2＋浓度过高。
④退火时的温度过低等。
【 学以致用 】
D
3.(2023·江苏盐城高二期中)某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带(引物与模板完全配对)外，还有2条非特异性条带(引物和模板不完全配对)。为了减少非特异性条带的产生，以下措施中有效的是(　　)
A.增加模板DNA的量
B.延长热变性的时间
C.延长延伸的时间
D.提高退火的温度
解析：增加模板DNA的量可以提高反应速度，但不能有效减少非特异性条带的产生，A错误；
延长热变性的时间和延长延伸的时间会影响变性和延伸过程，但对于延伸中的配对影响不大，故不能有效减少产生非特异性条带，B、C错误；
非特异性条带增加的原因可能是退火温度过低而造成引物与模板的错配，故可通过提高退火的温度来减少非特异性条带的产生，D正确。
B
4.用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到以下电泳图谱，其中1号为DNA标准样液(Marker)，10号为蒸馏水，PCR时加入的模板DNA如图所示。据此作出的分析，不合理的是(　　)
A.PCR产物的分子大小在250～500 bp之间
B.3号样品为不含目的基因的载体DNA
C.9号样品对应植株不是所需的转基因植株
D.10号确定反应体系等对结果没有干扰
解析：PCR过程中，可以通过设计特定的引物来扩增特定的DNA片段，4～9号是转基因植株，理论上应包含目的基因，结合2号野生型和10号蒸馏水组的结果，推测包含目的基因的片段大小应为250～500 bp，A合理；
3号PCR结果包含250～500 bp片段，应包含目的基因，B不合理；
9号PCR结果不包含250～500 bp片段，所以不是所需转基因植株，C合理；
10号放入蒸馏水，可排除反应体系等对结果的干扰，D合理。
A.PCR产物的分子大小在250～500 bp之间
B.3号样品为不含目的基因的载体DNA
C.9号样品对应植株不是所需的转基因植株
D.10号确定反应体系等对结果没有干扰
B
1.下列关于PCR的叙述错误的是(　　)
A.用PCR方法扩增目的基因时需要知道基因的部分序列
B.设计的引物序列必须全部能够和模板DNA碱基互补
C.退火温度过高可能导致PCR反应得不到任何扩增产物
D.第四轮循环产物中含有两种引物的DNA片段所占比例为7/8
解析：用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列，只需要知道一段已知目的基因的核苷酸序列，从而根据这段序列合成引物，A正确；
设计引物时需要避免引物之间形成碱基互补配对而造成引物自连，不需全部能够和模板DNA碱基互补，B错误；
退火的目的是引物与模板DNA结合，故退火温度过高可能导致引物与模板DNA不能结合，因而使得PCR反应得不到任何扩增产物，C正确；
DNA复制为半保留复制，DNA复制n次，共形成2n个DNA，其中两个DNA含有母链和子链(含引物A或引物B)，(2n－2)个DNA都含有子链(含有引物A和引物B)，第四轮循环即DNA复制4次，共形成16个DNA，产物中同时含有引物A和引物B的DNA片段所占的比率为(16－2)/16＝7/8，D正确。
D
2.(2024·江苏南通阶段练习)下列关于PCR过程及结果的叙述，错误的是(　　)
A.相比细胞内DNA复制，PCR过程不需要解旋酶、DNA连接酶等
B.退火的温度设定与引物有关，延伸时间的设定与扩增片段的长度有关
C.若酶和引物都正常，但是未出现扩增带，其原因可能是核酸模板变性不彻底
D.理论上推测，经n轮循环后的产物中只含1种引物的DNA片段占比为1/(2n－1)
解析：PCR与细胞内DNA复制破坏氢键的原理不同，其中PCR通过高温破坏氢键，PCR过程不需要解旋酶、DNA连接酶等，A正确；
退火的温度设定与引物有关，当其中G－C碱基对多时，温度较高，而延伸时间的设定与扩增片段的长度有关，长度越大，则时间越长，B正确；
PCR扩增的过程包括变性→退火→延伸过程，其中变性是在高温条件下将DNA双链解开，作为模板，若酶和引物都正常，但是不出现扩增带，其原因可能是核酸模板变性不彻底，C正确；
DNA进行半保留复制，每次复制都需要两种引物结合在DNA的两端，经过n轮循环产物共2n个DNA分子，仅含有其中一种引物的DNA片段为2个，故理论上推测，经过n轮循环产物中只含有一种引物的DNA片段所占比例为2/2n＝1/2n－1，D错误。
D
3.(2024·江苏泰州月考)PCR引物的3′端为结合模板DNA的关键，5′端无严格限制，可用于添加限制酶切点等序列，dNTP是DNA合成的原料，还可供能。下列相关说法错误的是(　　)
A.图示环节所需的温度比上一个环节
的低
B.引物的设计要有一段已知目的基因的核苷酸序列
C.Taq酶只能从引物的3′端开始延伸DNA链
D.1个循环后，子代DNA双链的脱氧核苷酸数量相同
A.图示环节所需的温度比上一个环节的低
B.引物的设计要有一段已知目的基因的核苷酸序列
C.Taq酶只能从引物的3′端开始延伸DNA链
D.1个循环后，子代DNA双链的脱氧核苷酸数量相同
解析：图示环节为引物与模板碱基互补配对，表示的是退火环节，退火的上一环节为变性，退火的温度比变性的温度低，A正确；
引物的设计要有一段已知目的基因的核苷酸序列，保证其与已知模板碱基互补配对，在后续扩增的过程中才能进行子链的延伸，B正确；
子链是从5′→3′端延伸的Taq酶只能从引物的3′端开始延伸DNA链，C正确；
由于两个引物均不在该片段的端点，因此一个循环后，子代DNA双链的脱氧核苷酸数量不相同，D错误。
A
4.(2024·江苏扬州期末)关于“利用PCR技术扩增DNA片段并完成电泳鉴定”实验，下列说法正确的是(　　)
A.PCR中DNA双链的解聚与结合利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA复制
B.PCR反应体系中需要加入大肠杆菌中的DNA聚合酶
C.在凝胶中DNA分子的迁移速率只与DNA分子的大小有关
D.DNA分子在一定的pH下带电，在电场的作用下会向着与它所带电荷相同的电极移动
解析：在PCR技术的过程中包括：变性(解链)→退火→延伸三个步骤，因此DNA两条链的解旋过程不需要解旋酶的催化，而是利用了DNA在高温下变性的原理，通过调节温度来控制双链的解聚与结合，进而控制DNA复制，A正确；
PCR反应体系中需要加入热稳定的DNA聚合酶，B错误；
DNA分子在凝胶中的迁移速率除了与DNA分子大小有关外、还与DNA分子构象、凝胶的浓度等有关，C错误；
根据电荷同性相斥、异性相吸引可知，DNA分子进行电泳时，会向着与其所带电荷相反的电极移动，D错误。
CD
5.(多选)下列关于核酸片段的扩增及电泳鉴定的相关叙述，正确的是(　　)
A.PCR反应缓冲液中一般要添加ATP，以激活热稳定的DNA聚合酶
B.mRNA也是核酸，因此可直接用PCR扩增仪扩增
C.PCR产物常通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定
D.电泳结果可采用凝胶成像仪或紫外透射仪观察和记录
解析：PCR时不需添加ATP，热稳定的DNA聚合酶不需要添加ATP激活，A错误；
mRNA是核酸，但不能直接用PCR扩增仪扩增，需要先反转录为cDNA再用PCR扩增仪扩增，B错误。第3课时　基因工程的基本操作程序之目的基因的获取、基因表达载体的构建
课时概念解析　本课时的概念为“基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测鉴定等步骤”，这个概念的建构需要以下基本概念或证据的支持：
1.基因工程基本程序的第一步是获取目的基因。
2.基因工程基本程序的第二步是构建基因表达载体。
3.DNA的粗提取和鉴定是基因工程中的基本方法。
一、目的基因的获取
1.基因工程的基本操作程序
基因工程的基本操作程序包括________________、________________________、________________________，以及________________________________等步骤。
2.目的基因的获取
(1)通过化学合成法直接人工合成
(2)通过基因文库获取目的基因
①基因组文库
②cDNA文库
(3)获得基因组DNA或mRNA的基本过程
细胞使核酸分子释放出来
↓
从释放出来的细胞成分中____核酸分子
↓
获得核酸分子
(4)质粒DNA的提取：先用________获取质粒，再提取质粒DNA。
(5)纯化DNA的原理：通常利用了DNA与RNA、蛋白质等物质在________方面的差异。
[辨正误]
(1)对于核苷酸序列已知且比较小的基因可通过化学合成法直接人工合成。(　　)
(2)Klenow酶是一种能将双链DNA的突出5′端补平的DNA聚合酶。(　　)
(3)基因组文库构建完成后，每个受体菌均含有该生物的所有基因。(　　)
(4)一般采用核酸探针杂交的方法从基因组文库中筛选目的基因。(　　)
资料　如图，基因在结构上分为编码区和非编码区，非编码区位于编码区的上游和下游，在对基因的表达调控中发挥重要作用(如启动子和终止子)，不编码蛋白质。真核生物基因的编码区一般是不连续的，由外显子和内含子相间排列组成，整个编码区转录的产物为不成熟的mRNA，然后，不成熟的mRNA中的内含子转录的片段被剪切掉，外显子转录的片段拼接起来，形成成熟的mRNA；原核生物基因的编码区是连续的，转录的产物即为成熟的mRNA。
根据以上资料和教材相关内容，分析回答下列问题：
(1)cDNA文库是从某种生物的某一细胞中提取出mRNA，经逆转录过程获得的基因文库，为什么该基因文库仅含有该生物的部分基因？
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
(2)推测从cDNA文库中获取的人胰岛素基因与从基因组文库中获取的人胰岛素基因，结构上有什么不同？
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
【学以致用】
1.如图表示从细菌中获取目的基因的两种方法，下列说法中错误的是(　　)
A.甲方法可建立基因组文库
B.乙方法可建立cDNA文库
C.甲方法要以核苷酸为原料
D.乙方法需要逆转录酶参与
2.(2024·江苏扬州开学考试)下列关于基因文库的叙述，错误的是(　　)
A.cDNA文库中的基因可以在不同物种间进行交流
B.水稻基因组文库中的每个受体菌都含有水稻全部的基因
C.可从牛垂体细胞的cDNA文库中获取生长激素基因
D.构建基因组文库时需要使用限制酶和DNA连接酶
二、DNA的粗提取和鉴定
1.DNA的粗提取
提醒：①过滤含DNA的黏稠物时不能用滤纸代替纱布，否则会因DNA被吸附到滤纸上，而导致DNA大量损失。
②用玻璃棒搅拌时，动作要缓慢且沿同一方向进行，目的是防止DNA被破坏，但使细胞破裂时应快速搅拌。
[微思考]
1.能用猪血作为实验材料提取DNA吗？为什么？
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
2.若选用植物组织作为实验材料，需对组织进行充分研磨，目的是什么？
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
2.DNA的鉴定
[辨正误]
(1)植物组织也可以采用加蒸馏水使细胞涨破的方法。(　　)
(2)实验中加入2(mol·L－1)的NaCl的目的是析出DNA。(　　)
(3)用玻璃棒搅拌时，动作要缓慢且沿同一方向进行，目的是防止DNA被破坏，但细胞破裂时应快速搅拌。(　　)
(4)DNA溶液中加入二苯胺试剂就会变蓝色。(　　)
资料1　DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度曲线
资料2　DNA与蛋白质等物质的物理和化学性质有差异，如DNA不溶于乙醇，但某些蛋白质溶于乙醇。
(1)根据资料1回答，在DNA的粗提取中，两次加入蒸馏水的目的相同吗？如不相同，分别分析其目的。________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
(2)根据资料2中DNA和蛋白质在酒精中的溶解度的特点，分析如何将DNA和蛋白质进一步分离？______________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
DNA粗提取和鉴定实验中不同试剂的作用
试剂 作用
蒸馏水 加到鸡血细胞液中，使鸡血细胞吸水涨破
加到含DNA的2(mol·L－1)的NaCl溶液中，使其浓度下降析出DNA
NaCl溶液 2(mol·L－1)的NaCl溶液可以溶解DNA
0.14(mol·L－1)的NaCl溶液可以析出DNA
乙醇 冷却的、体积分数为95%的乙醇可以除去杂质以提纯DNA
柠檬酸钠 抗凝剂，防止血液凝固
二苯胺 鉴定DNA的试剂
【学以致用】
3.(多选)(2023·江苏盐城阶段练习)下列关于“DNA的粗提取和鉴定”实验叙述，错误的是(　　)
A.酵母和菜花均可作为提取DNA的材料
B.DNA既溶于2(mol·L－1)NaCl溶液也溶于蒸馏水
C.向鸡血细胞液中加蒸馏水搅拌，可见玻璃棒上有白色丝状物
D.DNA溶液加入二苯胺试剂沸水浴加热，冷却后变紫
4.下图1、2分别为“DNA的粗提取和鉴定”实验中部分操作示意图，下列叙述错误的是(　　)
A.图1中完成过滤后应向滤液中加入一定量的柠檬酸钠溶液
B.图2完成后要将玻璃棒上丝状物重新溶解到2(mol·L－1)的NaCl溶液中进行后续鉴定
C.图1、2中加入蒸馏水的目的不同
D.图1、2中搅拌的目的不同
三、基因表达载体的构建
1.基因表达载体的构建
[微思考]
启动子、终止子和起始密码子、终止密码子有何区别？______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
【知识拓展】　启动子的类型
组成型启动子：能够调控基因表达，使其基本恒定在一定程度上，从而使基因在不同部位或组织中的表达水平不存在明显差异。
诱导型启动子：在某些特定的物理或化学信号刺激后，基因转录水平在该类启动子的调控下大幅度地提升或降低。
组织特异性启动子：其调控作用使得基因往往只在某些特定器官或组织中表达，且表现出发育调节的特性。
2.载体的种类
(2)有些载体兼有克隆载体和表达载体的特点。
[辨正误]
(1)构建基因表达载体需用到限制酶和DNA连接酶。(　　)
(2)基因表达载体中有的含有启动子和终止密码子。(　　)
(3)目的基因必须插入启动子和终止子之间才能正确表达。(　　)
构建基因表达载体时，可以选择用同一种限制酶或两种能产生相同末端的限制酶分别切割载体和目的基因所在的DNA分子，此外，还可以选择用两种能产生不同黏性末端的限制酶分别同时切割载体和含有目的基因的DNA分子，这种新的方法被称为“双酶同时切割法”。
注：Ampr表示氨苄青霉素抗性基因。
由图示可知，质粒经BamHⅠ和EcoRⅠ切割后，分别形成黏性末端1与2，目的基因所在的DNA分子经BamHⅠ和EcoRⅠ切割后，分别形成黏性末端3与4。
请结合上述内容回答下列问题：
(1)已知限制酶BamHⅠ和EcoRⅠ识别的核苷酸序列和切割位点分别为：
则DNA分子经BamHⅠ和EcoRⅠ切割后所形成的末端是否互补(相同)
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
(2)黏性末端1与2能否经DNA连接酶连接？3与4呢？为什么？这说明“双酶同时切割法”具有什么优点？
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
(3)黏性末端1与4、2与3能否经DNA连接酶连接？这说明“双酶同时切割法”具有什么优点？
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
限制酶的选择技巧
(1)根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类
①应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。
②不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。
③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点)。
(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类
【学以致用】
5.(2023·江苏南通期中)基因表达载体的构建是基因工程的核心。图示为某基因工程中构建基因表达载体(P3)的过程，其中tetr为四环素抗性基因，ampr为氨苄青霉素抗性基因，EcoRⅤ为限制酶。下列有关基因表达载体(P3)的叙述，错误的是(　　)
A.构建过程需要限制性内切核酸酶、DNA连接酶等
B.还应具有启动子、终止子、复制原点等组成部分
C.可采用PCR和电泳技术进行进一步的鉴定与验证
D.可在含氨苄青霉素的选择培养基上大量复制并表达
6.(多选)(2023·江苏宿迁期末)番茄在较低温度下运输或储存的过程中容易出现冻伤的现象。科学家利用基因工程技术培育出抗冻的转基因番茄。下图为外源DNA和质粒上标出的酶切位点及相关基因，其中AFPs基因为抗冻基因。下列相关叙述正确的是(　　)
A.基因工程中常用的工具酶有限制酶、DNA连接酶和质粒
B.获得的AFPs基因应插入质粒上的启动子与终止子之间
C.应用BamHⅠ和HindⅢ切割目的基因和质粒以避免目的基因反向连接
D.能在含青霉素的培养基上生长的受体细胞中一定都含有AFPs基因
1.在目的基因比较小、核苷酸序列又已知的情况下，获取目的基因最方便的方法是(　　)
A.化学合成法
B.基因组文库法
C.DNA文库法
D.聚合酶链式反应法
2.下图为人胰岛素基因结构模式图，下列叙述正确的是(　　)
A.启动子是RNA聚合酶结合的部位
B.cDNA文库和基因组文库的基因中均含有内含子
C.人胰岛A细胞的cDNA文库中可找到该基因
D.细胞内DNA复制时，只对编码区进行复制
3.(多选)根据用途可将基因工程中常用的载体分为克隆载体和表达载体两种，克隆载体的目的是复制出更多的目的基因，而表达载体的目的是使外源基因在受体中高效表达。下列有关叙述错误的是(　　)
A.克隆载体必须具备的元件是复制原点、启动子和终止子
B.重组克隆载体导入后，可利用受体细胞的DNA聚合酶等进行复制
C.表达载体的元件中必须含有标记基因，不一定有复制原点
D.质粒、动植物病毒、噬菌体均可作为克隆载体或表达载体
4.菊花是重要的观赏花卉，为增加菊花花色类型，某科研小组从植物A的基因文库中选出花色基因C(图1)，并将其与质粒(图2)重组，再借助农杆菌导入菊花中。图3表示EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三种限制酶的识别序列与切割位点。请分析并回答下列问题：
(1)利用PCR技术可扩增花色基因C，该技术的原理是____________，此过程使用的酶是________________。
(2)切割基因C用____________，切割质粒用____________。切割后用DNA连接酶连接基因C和质粒，DNA连接酶催化形成的化学键是____________。
(3)筛选含有重组质粒的受体细胞时，要在含有________的培养基上进行。
第3课时　基因工程的基本操作程序之目的基因的获取、基因表达载体的构建
一、
自主梳理
1.目的基因的获取　基因表达载体的构建　将目的基因导入受体细胞　目的基因及其表达产物的检测鉴定
2.(1)脱氧核苷酸序列　3′末端具有10～14个互补碱基　模板—引物　K1enow酶　DNA连接酶　(2)①全部　限制酶　DNA连接酶　转染　核酸探针杂交　某基因的已知片段　②全部mRNA信息　逆转录酶　DNA连接酶　转染　(3)裂解　分离　纯化　(4)碱裂解法　(5)理化性质
辨正误
(1)√　(2)√
(3)×　提示：基因组文库的整个菌群含有该生物的所有基因。
(4)√
合作探究
(1)提示：由于基因的选择性表达，某种生物的某一细胞中仅有部分基因可以转录出mRNA，所以由该细胞中的mRNA逆转录得到的基因文库(cDNA文库)仅含有该生物的部分基因。
(2)提示：从cDNA文库中获取的人胰岛素基因不含有启动子、终止子、内含子等结构。从基因组文库中获取的人胰岛素基因结构完整。
学以致用
1.C　[甲图获取的是该细菌的全部DNA分子，因此用限制酶切割后可用于构建基因组文库，A正确；乙图表示用逆转录法获得的DNA分子，只包含该生物的部分基因，因此可建立该细菌的cDNA文库，B正确；甲方法中，只需要利用限制酶将其原有的DNA切断即可，不需要以核苷酸为原料，C错误；乙方法中d为逆转录过程，需要逆转录酶参与，D正确。]
2.B　[cDNA文库是用逆转录法形成的，即以mRNA为模板逆转录形成的DNA，其中不含有内含子和终止子等，可以在不同物种间进行信息交流，A正确；水稻基因组文库中的每个受体菌只含有部分水稻基因，B错误；牛垂体细胞能合成生长激素，因此该细胞含有相应的mRNA，所以能从垂体细胞的cDNA文库中获取生长激素基因，C正确；构建基因组文库时，首先需用限制酶切割DNA和质粒，然后用DNA连接酶将两者连接起来形成重组质粒，经体外包装、转染宿主细菌，得到一组含有不同DNA片段的重组DNA分子群体，形成基因组文库，D正确。]
二、
自主梳理
1.柠檬酸钠　蒸馏水　蒸馏水　DNA
微思考
1.提示：不能。猪属于哺乳动物，哺乳动物成熟的红细胞不含有细胞核和各种细胞器，不含有DNA。
2.提示：破碎细胞壁，使细胞核中的物质更容易溶解在NaCl溶液中。
2.酸性　二苯胺　蓝色　2(mol·L－1)　二苯胺试剂　沸水浴　蓝色
辨正误
(1)×　提示：植物细胞有细胞壁，不会吸水涨破。
(2)×　提示：2(mol·L－1)的NaCl溶液中DNA的溶解度较大。
(3)√
(4)×　提示：DNA溶液中加入二苯胺试剂后，需沸水浴加热数分钟后出现蓝色。
合作探究
(1)提示：实验中两次加入蒸馏水的目的不相同；第一次加入的目的是使鸡血细胞吸水涨破，释放出核物质，第二次加入的目的是稀释NaCl溶液，从而析出DNA。
(2)提示：向溶解有DNA和蛋白质的溶液中加入适量冷却的、体积分数为95%的乙醇溶液，溶液中会出现白色絮状物即DNA，而部分蛋白质会溶解在乙醇溶液中，这样可以对DNA起到进一步的分离纯化作用。
学以致用
3.CD　[理论上只要含有DNA的生物组织均可作为该实验的材料，因此酵母和菜花均可作为提取DNA的材料，A正确；DNA既可溶于2(mol·L－1)NaCl溶液也溶于蒸馏水，B正确；向鸡血细胞液中加蒸馏水搅拌，可使细胞吸水涨破，释放DNA，但不会观察到玻璃棒上有白色丝状物，C错误；DNA溶液加入二苯胺试剂沸水浴加热，冷却后变蓝，D错误。]
4.A　[在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液，完成过滤后不需要向滤液中加入一定量的柠檬酸钠溶液，A错误；图2完成后另取烧杯加2(mol·L－1)NaCl溶液使丝状物重新溶解，进行后续鉴定，B正确；图1加入蒸馏水的目的是使细胞吸水涨破，释放DNA，图2加入蒸馏水的目的是析出DNA，C正确；图1搅拌是为了破碎鸡血细胞，图2用玻璃棒沿一个方向轻轻搅拌，获得丝状物，即含有一定杂质的DNA，图1、2中搅拌的目的不同，D正确。]
三、
自主梳理
1.有效表达　遗传　上游　RNA聚合酶　下游　转录　标记　筛选　受体细胞　复制并遗传
微思考
提示：
位置 作用
启动子 位于DNA分子上 RNA聚合酶识别并结合的位点，启动转录过程
起始密码子 位于mRNA分子上 决定翻译的开始
终止子 位于DNA分子上 决定转录的结束
终止密码子 位于mRNA分子上 决定翻译的结束
2.(1)克隆　表达　调控元件
辨正误
(1)√
(2)×　提示：终止密码子位于mRNA上。
(3)√
合作探究
(1)提示：不互补(不相同)。
(2)提示：均不能；因为这两种限制酶切割后形成的黏性末端不互补(不相同)；这说明“双酶同时切割法”能够避免载体和目的基因的自身环化。
(3)提示：均不能；这说明“双酶同时切割法”能够避免载体与目的基因的反向连接。
学以致用
5.D　[基因表达载体构建过程需要限制性内切核酸酶(切割目的基因和载体)、DNA连接酶(连接切割后的目的基因和载体)等，A正确；图示基因表达载体包括目的基因、标记基因，此外还应具有启动子、终止子、复制原点等组成部分，B正确；可采用PCR对目的基因的插入进行进一步鉴定，通过电泳技术也可对表达产物进行鉴定，C正确；据图可知，构建过程中四环素抗性基因被破坏，故可用氨苄青霉素抗性基因做标记基因，但该基因表达载体需要在受体细胞中才能大量复制并表达，D错误。]
6.BC　[基因工程中常用的工具酶有限制酶、DNA连接酶，质粒属于基因工程中的常见工具，但不属于工具酶，A错误；启动子和终止子分别控制基因转录的开始和结束，获得的AFPs基因应插入质粒上的启动子与终止子之间，以保证目的基因能够正确的表达，B正确；为了防止目的基因和质粒自连或反向连接，应该选择两种限制酶进行切割，在目的基因两端、质粒上分别形成两种黏性末端，结合题图可知应用BamHⅠ和HindⅢ，C正确；导入了重组DNA的细胞具有青霉素抗性，但仅导入了质粒等情况下细胞也具有青霉素抗性，故能在含青霉素的培养基上生长的受体细胞中不一定含有AFPs基因，D错误。]
随堂检测
1.A　[获取目的基因的方法有：通过基因文库获取目的基因，通过化学合成法直接人工合成。在目的基因的序列未知的情况下，可以采用从基因文库中获取目的基因；在目的基因比较小、核苷酸序列已知的情况下常采用化学合成法。所以在已知某小片段基因核苷酸序列的情况下，获得该基因的最佳方法是以4种脱氧核苷酸为原料，利用DNA合成仪直接人工合成，A符合题意，B、C、D不符合题意。]
2.A　[启动子位于基因的非编码区，是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因的转录，A正确；cDNA文库是以成熟mRNA为模板逆转录合成的，故cDNA文库中的基因没有内含子，而基因组文库的基因中含有内含子，B错误；人胰岛A细胞不表达胰岛素基因，故人胰岛A细胞的cDNA文库中找不到该基因，C错误；细胞内DNA复制时，DNA分子中所有序列均被复制，即不管是编码区还是非编码区均被复制，D错误。]
3.AC　[克隆载体的目的是复制出更多的目的基因，克隆载体必须具备的元件是复制原点、标记基因，而启动子和终止子是参与转录过程中的，A错误；重组克隆载体导入后，可利用受体细胞的原料，能量、DNA聚合酶进行复制，B正确；表达载体的目的是使外源基因在受体中高效表达，包括转录和翻译，因此表达载体的元件中必须含有标记基因(用来筛选表达载体)，也需要复制原点，保证表达载体能在受体细胞中自我复制，C错误；质粒、动植物病毒、噬菌体都能将外源基因导入受体细胞，故质粒、动植物病毒、噬菌体均可作为克隆载体或表达载体，D正确。]
4.(1)DNA双链复制　热稳定的DNA聚合酶(Taq酶)　(2)BamHⅠ　Sau3AⅠ　磷酸二酯键　(3)四环素
解析　(1)利用PCR技术可扩增花色基因C，PCR技术扩增的原理是DNA双链复制，此过程使用的酶是热稳定的DNA聚合酶(Taq酶)。
(2)构建基因表达载体时，可用BamHⅠ和Sau3AⅠ分别处理基因C和质粒，产生相同黏性末端便于构建重组质粒；当基因C和质粒连接时，DNA连接酶催化形成的化学键是磷酸二酯键。(3)重组质粒上的四环素抗性基因为标记基因，故可在含有四环素的培养基上筛选含有重组质粒的受体细胞。(共62张PPT)
第三章　基因工程 第一节　基因工程及其技术　
第3课时　基因工程的基本操作程序之目的基因的获取、基因表达载体的构建
本课时的概念为“基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测鉴定等步骤”，这个概念的建构需要以下基本概念或证据的支持：
1.基因工程基本程序的第一步是获取目的基因。
2.基因工程基本程序的第二步是构建基因表达载体。
3.DNA的粗提取和鉴定是基因工程中的基本方法。
课时概念解析
目录 CONTENTS
1.目的基因的获取
2. DNA的粗提取和鉴定
4.随堂检测
自主梳理
合作探究
合作探究
自主梳理
3.基因表达载体的构建
合作探究
思维导图
自主梳理
1.基因工程的基本操作程序
基因工程的基本操作程序包括________________、____________________、________________________，以及________________________________等步骤。
目的基因的获取
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
目的基因及其表达产物的检测鉴定
2.目的基因的获取
(1)通过化学合成法直接人工合成
脱氧核
苷酸序列
3′末端具有10～14个互补碱基
模板—引物
K1enow酶
DNA连接酶
(2)通过基因文库获取目的基因
①基因组文库
全部
限制酶
DNA
连接酶
转
染
核酸探针杂交
某基
因的已知片段
②cDNA文库
全部mRNA信息
逆转
录酶
DNA
连接酶
转
染
(3)获得基因组DNA或mRNA的基本过程
______细胞使核酸分子释放出来
↓
从释放出来的细胞成分中______核酸分子
↓
______获得核酸分子
裂解
分离
纯化
(4)质粒DNA的提取：先用__________获取质粒，再提取质粒DNA。
(5)纯化DNA的原理：通常利用了DNA与RNA、蛋白质等物质在__________方面的差异。
碱裂解法
理化性质
×
√
[辨正误]
(1)对于核苷酸序列已知且比较小的基因可通过化学合成法直接人工合成。( )
(2)Klenow酶是一种能将双链DNA的突出5′端补平的DNA聚合酶。( )
(3)基因组文库构建完成后，每个受体菌均含有该生物的所有基因。( )
提示：基因组文库的整个菌群含有该生物的所有基因。
(4)一般采用核酸探针杂交的方法从基因组文库中筛选目的基因。( )
√
√
资料　如图，基因在结构上分为编码区和非编码区，非编码区位于编码区的上游和下游，在对基因的表达调控中发挥重要作用(如启动子和终止子)，不编码蛋白质。真核生物基因的编码区一般是不连续的，由外显子和内含子相间排列组成，整个编码区转录的产物为不成熟的mRNA，然后，不成熟的mRNA中的内含子转录的片段被剪切掉，外显子转录的片段拼接起来，形成成熟的mRNA；原核生物基因的编码区是连续的，转录的产物即为成熟的mRNA。
根据以上资料和教材相关内容，分析回答下列问题：
(1)cDNA文库是从某种生物的某一细胞中提取出mRNA，经逆转录过程获得的基因文库，为什么该基因文库仅含有该生物的部分基因？
提示：由于基因的选择性表达，某种生物的某一细胞中仅有部分基因可以转录出mRNA，所以由该细胞中的mRNA逆转录得到的基因文库(cDNA文库)仅含有该生物的部分基因。
(2)推测从cDNA文库中获取的人胰岛素基因与从基因组文库中获取的人胰岛素基因，结构上有什么不同？
提示：从cDNA文库中获取的人胰岛素基因不含有启动子、终止子、内含子等结构。从基因组文库中获取的人胰岛素基因结构完整。
●将从基因组文库中获取的人胰岛素基因导入大肠杆菌细胞，能否成功表达？为什么？
提示：不能。从基因组文库中获取的人胰岛素基因含有内含子，而大肠杆菌是原核生物，细胞内缺乏剪切内含子转录片段的系统，不能形成成熟的mRNA。　　　
●基因组文库与cDNA文库的比较
种类 基因组文库 cDNA文库
含义 含有某种生物体全部基因片段的重组DNA的克隆群体 包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合
特点 含有某种生物的全部基因，基因结构完整 含有某种生物的部分基因，基因中不含有启动子、终止子、内含子等
构建方法 提纯的原核生物或真核生物的基因组DNA
【 学以致用 】
C
1.如图表示从细菌中获取目的基因的两种方法，下列说法中错误的是(　　)
A.甲方法可建立基因组文库
B.乙方法可建立cDNA文库
C.甲方法要以核苷酸为原料
D.乙方法需要逆转录酶参与
解析：甲图获取的是该细菌的
全部DNA分子，因此用限制酶切割后可用于构建基因组文库，A正确；
乙图表示用逆转录法获得的DNA分子，只包含该生物的部分基因，因此可建立该细菌的cDNA文库，B正确；
甲方法中，只需要利用限制酶将其原有的DNA切断即可，不需要以核苷酸为原料，C错误；
乙方法中d为逆转录过程，需要逆转录酶参与，D正确。
B
2.(2024·江苏扬州开学考试)下列关于基因文库的叙述，错误的是(　　)
A.cDNA文库中的基因可以在不同物种间进行交流
B.水稻基因组文库中的每个受体菌都含有水稻全部的基因
C.可从牛垂体细胞的cDNA文库中获取生长激素基因
D.构建基因组文库时需要使用限制酶和DNA连接酶
解析：cDNA文库是用逆转录法形成的，即以mRNA为模板逆转录形成的DNA，其中不含有内含子和终止子等，可以在不同物种间进行信息交流，A正确；
水稻基因组文库中的每个受体菌只含有部分水稻基因，B错误；
牛垂体细胞能合成生长激素，因此该细胞含有相应的mRNA，所以能从垂体细胞的cDNA文库中获取生长激素基因，C正确；
构建基因组文库时，首先需用限制酶切割DNA和质粒，然后用DNA连接酶将两者连接起来形成重组质粒，经体外包装、转染宿主细菌，得到一组含有不同DNA片段的重组DNA分子群体，形成基因组文库，D正确。
1.DNA的粗提取
柠檬酸
钠
蒸馏水
蒸馏水
DNA
提醒：①过滤含DNA的黏稠物时不能用滤纸代替纱布，否则会因DNA被吸附到滤纸上，而导致DNA大量损失。
②用玻璃棒搅拌时，动作要缓慢且沿同一方向进行，目的是防止DNA被破坏，但使细胞破裂时应快速搅拌。
[微思考]
1.能用猪血作为实验材料提取DNA吗？为什么？
提示：不能。猪属于哺乳动物，哺乳动物成熟的红细胞不含有细胞核和各种细胞器，不含有DNA。
2.若选用植物组织作为实验材料，需对组织进行充分研磨，目的是什么？
提示：破碎细胞壁，使细胞核中的物质更容易溶解在NaCl溶液中。
2.DNA的鉴定
酸性
二苯胺
蓝色
2(mol·L－1)
二苯胺试剂
沸水浴
蓝色
×
√
[辨正误]
(1)植物组织也可以采用加蒸馏水使细胞涨破的方法。( )
提示：植物细胞有细胞壁，不会吸水涨破。
(2)实验中加入2(mol·L－1)的NaCl的目的是析出DNA。( )
提示：2(mol·L－1)的NaCl溶液中DNA的溶解度较大。
(3)用玻璃棒搅拌时，动作要缓慢且沿同一方向进行，目的是防止DNA被破坏，但细胞破裂时应快速搅拌。( )
(4)DNA溶液中加入二苯胺试剂就会变蓝色。( )
提示：DNA溶液中加入二苯胺试剂后，需沸水浴加热数分钟后出现蓝色。
×
×
资料1　DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度曲线
资料2　DNA与蛋白质等物质的物理和化学性质有差异，如DNA不溶于乙醇，但某些蛋白质溶于乙醇。
(1)根据资料1回答，在DNA的粗提取中，两次加入蒸馏水的目的相同吗？如不相同，分别分析其目的。
提示：实验中两次加入蒸馏水的目的不相同；第一次加入的目的是使鸡血细胞吸水涨破，释放出核物质，第二次加入的目的是稀释NaCl溶液，从而析出DNA。
(2)根据资料2中DNA和蛋白质在酒精中的溶解度的特点，分析如何将DNA和蛋白质进一步分离？
提示：向溶解有DNA和蛋白质的溶液中加入适量冷却的、体积分数为95%的乙醇溶液，溶液中会出现白色絮状物即DNA，而部分蛋白质会溶解在乙醇溶液中，这样可以对DNA起到进一步的分离纯化作用。
DNA粗提取和鉴定实验中不同试剂的作用
试剂 作用
蒸馏水 加到鸡血细胞液中，使鸡血细胞吸水涨破
加到含DNA的2(mol·L－1)的NaCl溶液中，使其浓度下降析出DNA
NaCl溶液 2(mol·L－1)的NaCl溶液可以溶解DNA
0.14(mol·L－1)的NaCl溶液可以析出DNA
乙醇 冷却的、体积分数为95%的乙醇可以除去杂质以提纯DNA
柠檬酸钠 抗凝剂，防止血液凝固
二苯胺 鉴定DNA的试剂
【 学以致用 】
CD
3.(多选)(2023·江苏盐城阶段练习)下列关于“DNA的粗提取和鉴定”实验叙述，错误的是(　　)
A.酵母和菜花均可作为提取DNA的材料
B.DNA既溶于2(mol·L－1)NaCl溶液也溶于蒸馏水
C.向鸡血细胞液中加蒸馏水搅拌，可见玻璃棒上有白色丝状物
D.DNA溶液加入二苯胺试剂沸水浴加热，冷却后变紫
解析：理论上只要含有DNA的生物组织均可作为该实验的材料，因此酵母和菜花均可作为提取DNA的材料，A正确；
DNA既可溶于2(mol·L－1)NaCl溶液也溶于蒸馏水，B正确；
向鸡血细胞液中加蒸馏水搅拌，可使细胞吸水涨破，释放DNA，但不会观察到玻璃棒上有白色丝状物，C错误；
DNA溶液加入二苯胺试剂沸水浴加热，冷却后变蓝，D错误。
A
4.下图1、2分别为“DNA的粗提取和鉴定”实验中部分操作示意图，下列叙述错误的是(　　)
A.图1中完成过滤后应向滤液中
加入一定量的柠檬酸钠溶液
B.图2完成后要将玻璃棒上丝状
物重新溶解到2(mol·L－1)的NaCl
溶液中进行后续鉴定
C.图1、2中加入蒸馏水的目的不同
D.图1、2中搅拌的目的不同
A.图1中完成过滤后应向滤液中加入一定量的柠檬酸钠溶液
B.图2完成后要将玻璃棒上丝状物重新溶解到2(mol·L－1)的NaCl溶液中进行后续鉴定
C.图1、2中加入蒸馏水的目的不同
D.图1、2中搅拌的目的不同
解析：在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液，完成过滤后不需要向滤液中加入一定量的柠檬酸钠溶液，A错误；
图2完成后另取烧杯加2(mol·L－1)NaCl溶液使丝状物重新溶解，进行后续鉴定，B正确；
图1加入蒸馏水的目的是使细胞吸水涨破，释放DNA，图2加入蒸馏水的目的是析出DNA，C正确；
图1搅拌是为了破碎鸡血细胞，图2用玻璃棒沿一个方向轻轻搅拌，获得丝状物，即含有一定杂质的DNA，图1、2中搅拌的目的不同，D正确。
1.基因表达载体的构建
有效表达
遗传
上游
RNA聚合酶
下游
转录
标记
筛选
受体细胞
复制并遗传
[微思考]
启动子、终止子和起始密码子、终止密码子有何区别？
提示：
位置 作用
启动子 位于DNA分子上 RNA聚合酶识别并结合的位点，启动转录过程
起始密码子 位于mRNA分子上 决定翻译的开始
终止子 位于DNA分子上 决定转录的结束
终止密码子 位于mRNA分子上 决定翻译的结束
【知识拓展】　启动子的类型
组成型启动子：能够调控基因表达，使其基本恒定在一定程度上，从而使基因在不同部位或组织中的表达水平不存在明显差异。
诱导型启动子：在某些特定的物理或化学信号刺激后，基因转录水平在该类启动子的调控下大幅度地提升或降低。
组织特异性启动子：其调控作用使得基因往往只在某些特定器官或组织中表达，且表现出发育调节的特性。
2.载体的种类
(2)有些载体兼有克隆载体和表达载体的特点。
克隆
表达
调控
元件
×
√
[辨正误]
(1)构建基因表达载体需用到限制酶和DNA连接酶。( )
(2)基因表达载体中有的含有启动子和终止密码子。( )
提示：终止密码子位于mRNA上。
(3)目的基因必须插入启动子和终止子之间才能正确表达。( )
√
●观察分析下列基因表达载体的构建过程图，结合教材相关知识，思考回答：
(1)结合基因表达载体的组成，说明构建基因表达载体的必要性。
提示：基因表达载体除了目的基因外，还包括复制原点、启动子、终止子和标记基因等结构。复制原点、启动子、终止子可以调控目的基因的复制、转录等过程，目的基因只有和载体结合成基因表达载体才能使目的基因在受体细胞中有效表达，稳定存在且遗传给后代。标记基因的作用是初步筛选出接受了目的基因的受体细胞。
(2)构建基因表达载体时目的基因插入的位置应该在哪里？为什么？
提示：启动子下游和终止子上游。因为只有插入在启动子和终止子之间，目的基因才可以正常表达。
(3)构建基因表达载体时往往用两种限制酶分别切割目的基因的两端以及载体，有什么好处？
提示：如果用一种限制酶切割，目的基因两端的黏性末端以及载体切口的两个黏性末端均相同，DNA片段则会自身环化、片段之间则会随意连接。而用两种限制酶分别切割目的基因的两端以及载体，则可避免目的基因、载体的自身环化，避免目的基因与载体的反向连接。
(4)结合基因表达载体的组成，切割载体时对选用的限制酶有哪些要求？
提示：不能破坏所有的标记基因或使其均丢失、不能破坏复制原点或使其丢失、切割位点应位于启动子与终止子之间等。　　　
构建基因表达载体时，可以选择用同一种限制酶或两种能产生相同末端的限制酶分别切割载体和目的基因所在的DNA分子，此外，还可以选择用两种能产生不同黏性末端的限制酶分别同时切割载体和含有目的基因的DNA分子，这种新的方法被称为“双酶同时切割法”。
注：Ampr表示氨苄青霉素抗性基因。
由图示可知，质粒经BamHⅠ和EcoRⅠ切割后，分别形成黏性末端1与2，目的基因所在的DNA分子经BamHⅠ和EcoRⅠ切割后，分别形成黏性末端3与4。
请结合上述内容回答下列问题：
(1)已知限制酶BamHⅠ和EcoRⅠ识别的核苷酸序列和切割位点分别为：
则DNA分子经BamHⅠ和EcoRⅠ切割后所形成的末端是否互补(相同)
提示：不互补(不相同)。
(2)黏性末端1与2能否经DNA连接酶连接？3与4呢？为什么？这说明“双酶同时切割法”具有什么优点？
提示：均不能；因为这两种限制酶切割后形成的黏性末端不互补(不相同)；这说明“双酶同时切割法”能够避免载体和目的基因的自身环化。
(3)黏性末端1与4、2与3能否经DNA连接酶连接？这说明“双酶同时切割法”具有什么优点？
提示：均不能；这说明“双酶同时切割法”能够避免载体与目的基因的反向连接。
限制酶的选择技巧
(1)根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类
①应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。
②不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。
③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点)。
(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类
【 学以致用 】
D
5.(2023·江苏南通期中)基因表达载体的构建是基因工程的核心。图示为某基因工程中构建基因表达载体(P3)的过程，其中tetr为四环素抗性基因，ampr为氨苄青霉素抗性基因，EcoRⅤ为限制酶。下列有关基因表达载体(P3)的叙述，错误的是(　　)
A.构建过程需要限制性内切核酸酶、DNA
连接酶等
B.还应具有启动子、终止子、复制原点等
组成部分
C.可采用PCR和电泳技术进行进一步的鉴
定与验证
D.可在含氨苄青霉素的选择培养基上大量复制并表达
A.构建过程需要限制性内切核酸酶、DNA连接酶等
B.还应具有启动子、终止子、复制原点等组成部分
C.可采用PCR和电泳技术进行进一步的鉴定与验证
D.可在含氨苄青霉素的选择培养基上大量复制并表达
解析：基因表达载体构建过程需要限制性内切核酸酶(切割目的基因和载体)、DNA连接酶(连接切割后的目的基因和载体)等，A正确；
图示基因表达载体包括目的基因、标记基因，此外还应具有启动子、终止子、复制原点等组成部分，B正确；
可采用PCR对目的基因的插入进行进一步鉴定，通过电泳技术也可对表达产物进行鉴定，C正确；
据图可知，构建过程中四环素抗性基因被破坏，故可用氨苄青霉素抗性基因做标记基因，但该基因表达载体需要在受体细胞中才能大量复制并表达，D错误。
BC
6.(多选)(2023·江苏宿迁期末)番茄在较低温度下运输或储存的过程中容易出现冻伤的现象。科学家利用基因工程技术培育出抗冻的转基因番茄。下图为外源DNA和质粒上标出的酶切位点及相关基因，其中AFPs基因为抗冻基因。下列相关叙述正确的是(　　)
A.基因工程中常用的工具酶有
限制酶、DNA连接酶和质粒
B.获得的AFPs基因应插入质粒
上的启动子与终止子之间
C.应用BamHⅠ和HindⅢ切割目的基因和质粒以避免目的基因反向连接
D.能在含青霉素的培养基上生长的受体细胞中一定都含有AFPs基因
A.基因工程中常用的工具酶有限制酶、DNA连接酶和质粒
B.获得的AFPs基因应插入质粒上的启动子与终止子之间
C.应用BamHⅠ和HindⅢ切割目的基因和质粒以避免目的基因反向连接
D.能在含青霉素的培养基上生长的受体细胞中一定都含有AFPs基因
解析：基因工程中常用的工具酶有限制酶、DNA连接酶，质粒属于基因工程中的常见工具，但不属于工具酶，A错误；
启动子和终止子分别控制基因转录的开始和结束，获得的AFPs基因应插入质粒上的启动子与终止子之间，以保证目的基因能够正确的表达，B正确；
为了防止目的基因和质粒自连或反向连接，应该选择两种限制酶进行切割，在目的基因两端、质粒上分别形成两种黏性末端，结合题图可知应用BamHⅠ和HindⅢ，C正确；
导入了重组DNA的细胞具有青霉素抗性，但仅导入了质粒等情况下细胞也具有青霉素抗性，故能在含青霉素的培养基上生长的受体细胞中不一定含有AFPs基因，D错误。
A
1.在目的基因比较小、核苷酸序列又已知的情况下，获取目的基因最方便的方法是(　　)
A.化学合成法 B.基因组文库法
C.DNA文库法 D.聚合酶链式反应法
解析：获取目的基因的方法有：通过基因文库获取目的基因，通过化学合成法直接人工合成。在目的基因的序列未知的情况下，可以采用从基因文库中获取目的基因；在目的基因比较小、核苷酸序列已知的情况下常采用化学合成法。所以在已知某小片段基因核苷酸序列的情况下，获得该基因的最佳方法是以4种脱氧核苷酸为原料，利用DNA合成仪直接人工合成，A符合题意，B、C、D不符合题意。
A
2.下图为人胰岛素基因结构模式图，下列叙述正确的是(　　)
A.启动子是RNA聚合酶结合的部位
B.cDNA文库和基因组文库的基因
中均含有内含子
C.人胰岛A细胞的cDNA文库中可
找到该基因
D.细胞内DNA复制时，只对编码区进行复制
解析：启动子位于基因的非编码区，是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因的转录，A正确；
cDNA文库是以成熟mRNA为模板逆转录合成的，故cDNA文库中的基因没有内含子，而基因组文库的基因中含有内含子，B错误；
人胰岛A细胞不表达胰岛素基因，故人胰岛A细胞的cDNA文库中找不到该基因，C错误；
细胞内DNA复制时，DNA分子中所有序列均被复制，即不管是编码区还是非编码区均被复制，D错误。
A.启动子是RNA聚合酶结合的部位
B.cDNA文库和基因组文库的基因中均含有内含子
C.人胰岛A细胞的cDNA文库中可找到该基因
D.细胞内DNA复制时，只对编码区进行复制
D
●(2024·江苏盐城月考)关于“DNA的粗提取和鉴定”实验， 下列说法错误的是(　　)
A.过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解
B.DNA既溶于2(mol·L－1)NaCl溶液也溶于蒸馏水
C.粗提取的DNA 中含有核蛋白、多糖等杂质
D.将粗提取的DNA溶于2(mol·L－1)NaCl溶液中， 加入二苯胺试剂DNA被染成蓝色
解析：低温时DNA酶的活性较低，过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解，A正确；
DNA既溶于2(mol·L－1)NaCl 溶液也溶于蒸馏水，且溶解度较高，B正确；
粗提取的DNA中含有核蛋白、多糖等杂质，因此为了获得纯度较高的DNA需要进一步提纯，C正确；
将粗提取的DNA溶于2(mol·L－1)NaCl溶液中， 加入二苯胺试剂后经过沸水浴加热可发现DNA被染成蓝色，D错误。　　　
AC
3.(多选)根据用途可将基因工程中常用的载体分为克隆载体和表达载体两种，克隆载体的目的是复制出更多的目的基因，而表达载体的目的是使外源基因在受体中高效表达。下列有关叙述错误的是(　　)
A.克隆载体必须具备的元件是复制原点、启动子和终止子
B.重组克隆载体导入后，可利用受体细胞的DNA聚合酶等进行复制
C.表达载体的元件中必须含有标记基因，不一定有复制原点
D.质粒、动植物病毒、噬菌体均可作为克隆载体或表达载体
解析：克隆载体的目的是复制出更多的目的基因，克隆载体必须具备的元件是复制原点、标记基因，而启动子和终止子是参与转录过程中的，A错误；
重组克隆载体导入后，可利用受体细胞的原料，能量、DNA聚合酶进行复制，B正确；
表达载体的目的是使外源基因在受体中高效表达，包括转录和翻译，因此表达载体的元件中必须含有标记基因(用来筛选表达载体)，也需要复制原点，保证表达载体能在受体细胞中自我复制，C错误；
质粒、动植物病毒、噬菌体都能将外源基因导入受体细胞，故质粒、动植物病毒、噬菌体均可作为克隆载体或表达载体，D正确。
4.菊花是重要的观赏花卉，为增加菊花花色类型，某科研小组从植物A的基因文库中选出花色基因C(图1)，并将其与质粒(图2)重组，再借助农杆菌导入菊花中。图3表示EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三种限制酶的识别序列与切割位点。请分析并回答下列问题：
(1)利用PCR技术可扩增花色基因C，该技术的原理是____________，此过程使用的酶是____________________________。
(2)切割基因C用________，切割质粒用________。切割后用DNA连接酶连接基因C和质粒，DNA连接酶催化形成的化学键是____________。
(3)筛选含有重组质粒的受体细胞时，要在含有________的培养基上进行。
DNA双链复制
热稳定的DNA聚合酶(Taq酶)
BamHⅠ
Sau3AⅠ
磷酸二酯键
四环素
解析：(1)利用PCR技术可扩增花色基因C，PCR技术扩增的原理是DNA双链复制，此过程使用的酶是热稳定的DNA聚合酶(Taq酶)。
(2)构建基因表达载体时，可用BamHⅠ和Sau3AⅠ分别处理基因C和质粒，产生相同黏性末端便于构建重组质粒；当基因C和质粒连接时，DNA连接酶催化形成的化学键是磷酸二酯键。
(3)重组质粒上的四环素抗性基因为标记基因，故可在含有四环素的培养基上筛选含有重组质粒的受体细胞。第4课时　基因工程的基本操作程序之将目的基因导入受体细胞、目的基因及其表达产物的检测鉴定
课时概念解析　本课时的概念为“基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测鉴定”，这个概念的建构需要以下基本概念或证据的支持：
1.基因工程基本程序的第三步是将目的基因导入受体细胞。
2.基因工程基本程序的第四步是检测和鉴定目的基因及其表达产物。
一、将目的基因导入受体细胞
受体细胞不同，导入目的基因的方法不同：
细胞类型 转化方法 转化过程
植物细胞 ____________(主要) 将目的基因插到Ti质粒的________特定区段上→转入农杆菌→导入植物细胞→插入植物细胞____________上→目的基因的遗传和表达
哺乳动物细胞 ____________(主要) 受精卵→显微注射→受精卵移植到处于____________的母畜子宫内→受精卵发育→获得一定数量的转基因动物
病毒感染法 用________________一起构建的载体，去感染受体动物细胞，也能使目的基因导入动物细胞内
微生物细胞 Ca2＋处理法 Ca2＋处理微生物细胞→感受态细胞→将重组的________________________混合于缓冲液中→在适宜的温度下完成转化
提醒：①将目的基因导入受体细胞的过程中没有涉及碱基互补配对。
②农杆菌转化法中，能够转移到植物受体细胞的是T－DNA区段，而非整个Ti质粒。
③CaCl2溶液对微生物细胞的作用是增加其细胞质膜对DNA的通透性，从而促进重组DNA分子进入受体细胞。
[微思考]
1.在制备转基因动物的过程中常用受精卵作为受体细胞的原因是什么？
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
2.若制备转基因动物过程中用体细胞作受体细胞，如何得到转基因个体？
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
[辨正误]
(1)农杆菌转化过程中，含有目的基因的重组Ti质粒可转移到植物细胞内。(　　)
(2)将重组表达载体导入动物受精卵常用显微注射法。(　　)
(3)可利用噬菌体DNA与目的基因一起构建的载体感染动物细胞。(　　)
(4)将目的基因导入原核细胞时，通常用大肠杆菌作为受体细胞，并需要用Ca2＋处理大肠杆菌，使其处于感受态。(　　)
下面为利用农杆菌转化法制备转基因植物的过程图，据图回答下列问题：
(1)在利用农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞的过程中，一定要将目的基因插入到Ti质粒的T－DNA上的原因是什么？
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
(2)将基因表达载体导入农杆菌时，应怎样处理农杆菌？
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
(3)将目的基因导入植物细胞后，如何获取转基因植物？
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
(4)若获取的转基因植物(雌雄同体植物)中只导入了一个目的基因，如何获取转基因纯合子？
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
农杆菌转化法中两次拼接、两次导入的辨析
(1)两次拼接：第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T－DNA上；第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基因的T－DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上。
(2)两次导入：第一次导入是将含目的基因的重组Ti质粒导入农杆菌；第二次导入(非人工操作)是将含目的基因的T－DNA导入受体细胞。
【学以致用】
1.(多选)下列关于将目的基因导入受体细胞的说法中，正确的是(　　)
A.农杆菌在自然条件下感染双子叶植物或裸子植物，不会感染大多数单子叶植物
B.将目的基因导入哺乳动物细胞可采用显微注射法或病毒感染法
C.将用Ca2＋处理的大肠杆菌和目的基因混合于缓冲液，适宜温度下便可完成转化
D.在显微注射法中，可将目的基因直接注射进动物受精卵中实现转化
2.(2023·江苏徐州期中)土壤农杆菌侵染植物细胞时，Ti质粒上的T－DNA片段转入植物的基因组。利用农杆菌以Ti质粒作为载体进行转基因，下列相关叙述正确的是(　　)
A.T－DNA片段有利于介导外源DNA整合到植物的染色体DNA上
B.用Ca2＋处理农杆菌，以利于其侵染植物细胞
C.Ti质粒是一种环状DNA分子，属于细菌的拟核DNA
D.目的基因应插入T－DNA片段外，以防止破坏T－DNA
二、目的基因及其表达产物的检测鉴定
1.检测与鉴定的原因
基因导入受体细胞后，能否有效地________目的基因并产生相应的性状，需要进一步做筛选和鉴定。
2.分子水平的检测
(1)从DNA方面进行检测
①检测方法：DNA分子杂交法。
②检测原理：具有一定________的两条DNA单链，在一定条件下(适宜的温度等)可以按照____________原则形成双链。
③基因探针：用放射性________或________标记的已知DNA片段。
④结果分析：若待测DNA中有能与基因探针________的特异性DNA片段，用于________的放射性同位素标记或荧光标记会指示出其所在的________，表明目的基因已经插入转基因生物的________分子中。
⑤检测过程
(2)从RNA方面进行检测
①检测目的：检测目的基因是否能发挥其________，即是否________出相应的mRNA分子。
②检测方法：____________。
③检测过程：从待测转基因生物细胞中提取________分子，用已标记的________片段作为探针与mRNA杂交，如果有________出现，表明目的基因转录出相应的mRNA分子。
(3)从蛋白质方面进行检测
①检测方法：____________法。
②检测过程：从待测转基因生物中提取蛋白质，再用相应的抗体进行____________杂交。
③结果分析：如果有________出现，说明目的基因已经表达出相应的蛋白质。
3.个体水平的检测
(1)检测目的：对生物的某些________进行鉴定。
(2)实例：对于导入某种鱼的抗冻蛋白基因的转基因番茄进行个体检测，需要栽培转基因番茄获得果实后，再与________比较，确定其是否具有了抗冻性状。
[辨正误]
(1)基因探针是用放射性同位素或荧光标记的已知DNA片段。(　　)
(2)应用DNA探针技术，可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其是否完全表达。(　　)
(3)检测目的基因是否成功表达可用抗原—抗体杂交法。(　　)
(4)基因工程是否成功需进行个体水平的鉴定。(　　)
1.若经基因工程第三步获得的受体细胞培育而成的转基因生物没有表现出目的基因所控制的特定性状，可能的原因有哪些？
______________________________________________________________________
2.检测目的基因是否插入到了受体细胞的染色体DNA上，所用的探针是什么？应从转基因生物中提取核DNA还是全部DNA进行检测？为什么？
______________________________________________________________________
【学以致用】
3.目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持并表达其遗传特性，只有通过鉴定和检测才能知道。下列属于目的基因的检测和鉴定的是(　　)
①检测受体细胞的染色体上是否有目的基因
②检测受体细胞是否有致病基因　③检测目的基因是否转录出了 mRNA　④检测目的基因是否翻译出了蛋白质
A.①②③ B.②③④
C.①③④ D.①②④
4.(多选)(2024·江苏盐城阶段练习)盐害是全球水稻减产的重要原因之一，中国水稻研究所等单位的专家通过农杆菌中的质粒将CMO基因、BADH基因、mtld基因、gutD基因和SAMDC基因5个耐盐基因导入水稻，获得了一批耐盐转基因植株。有关耐盐转基因水稻培育的分析正确的是(　　)
A.该转基因水稻与原野生型水稻不存在生殖隔离
B.该基因工程所需的限制性内切核酸酶可能有多种
C.只要目的基因进入水稻细胞，水稻就会表现出抗盐性状
D.可通过将水稻种植到有农杆菌的土壤中观察目的基因是否表达
1.(2024·江苏盐城月考)在基因工程的基本操作程序中，不进行碱基互补配对的是(　　)
A.人工合成目的基因
B.目的基因与载体结合
C.将目的基因导入受体细胞
D.目的基因的检测和表达
2.(2024·江苏镇江开学考试)Ti质粒是根癌农杆菌拟核外的遗传物质，常作为植物基因工程的载体。下列关于Ti质粒的叙述，正确的是(　　)
A.每个脱氧核糖均与2个磷酸基团和1个碱基相连
B.Ti质粒复制时具有多起点和双向复制特点
C.用Ca2＋处理植物细胞有利于重组Ti质粒的导入
D.Ti质粒可随机整合到农杆菌的拟核DNA上
3.(2023·江苏盐城高二期末)利用外源基因在受体细胞中表达，可生产人类所需要的产品。下列各项中能说明目的基因在受体细胞中完成了表达的是(　　)
A.从酵母菌细胞中提取到人干扰素蛋白
B.山羊乳腺细胞中检测到人生长激素DNA序列
C.大肠杆菌中检测到人胰岛素基因及其mRNA
D.棉花二倍体细胞中检测到细菌的抗虫基因
4.对一只老鼠不同组织细胞中物质检测的结果，下列叙述错误的是(　　)
A.用某种基因作探针检测时，可能在某些部位的细胞中检测不到有该基因的存在
B.用某组织细胞中提取的mRNA作探针检测发现不同组织细胞中存在一些不同的mRNA
C.用某组织细胞中提取的mRNA作探针检测发现不同组织细胞中会存在相同的mRNA
D.抗原—抗体杂交的结果发现不同组织细胞中不存在有相同的蛋白质分子
5.(多选)某种荧光蛋白(GFP)在紫外光下会发出绿色荧光，该特性可用于检测细胞中目的基因的表达。研究人员将某病毒外壳蛋白(L1)基因连接在GFP基因的5′末端，获得了L1－GFP融合基因(简称为甲)，并将其插入质粒中构建了重组表达载体，重组表达载体的部分结构和酶切位点如图所示，图中E1～E4四种限制酶产生的黏性末端不相同。下列说法错误的是(　　)
A.用E.coli DNA连接酶能将平末端或黏性末端的DNA片段连接在一起
B.用E1和E4进行酶切，能保证甲的完整，也有利于甲与载体正确连接
C.若受体细胞中观察到了绿色荧光，说明GFP基因已经完成了表达
D.若要培育获得转GFP基因牛，一般选用成纤维细胞作为受体细胞
第4课时　基因工程的基本操作程序之将目的基因导入受体细胞、目的基因及其表达产物的检测鉴定
一、
自主梳理
农杆菌转化法　T－DNA　染色体的DNA　显微注射法　相同发情周期　病毒DNA与目的基因　基因表达载体与感受态细胞
微思考
1.提示：因为受精卵具有全能性。
2.提示：可利用核移植技术。
辨正误
(1)×　提示：农杆菌转化过程中，将目的基因插到农杆菌Ti质粒的T－DNA特定区段上，再通过T－DNA将其插入植物细胞染色体的DNA上。
(2)√
(3)×　提示：噬菌体不能感染动物细胞。
(4)√
合作探究
(1)提示：农杆菌中的Ti质粒上的T－DNA(转移DNA)可转移至被侵染的细胞，并且整合到该细胞染色体的DNA上。
(2)提示：基因表达载体导入农杆菌时，要用Ca2＋处理农杆菌，细胞质膜的通透性改变，使其处于感受态，利于基因表达载体的导入。
(3)提示：对植物细胞进行植物组织培养。
(4)提示：转基因植物自交，选取子代中具有转基因性状的个体，单株自交，后代不发生性状分离的为转基因纯合子。
学以致用
1.AB　[导入受体细胞的不只是目的基因，而是目的基因与载体构建的基因表达载体，C、D错误。]
2.A　[Ti质粒上的T－DNA片段能转入植物的基因组中，因此T－DNA片段有利于介导外源DNA整合到植物的染色体DNA上，A正确；农杆菌转化法中不需要用Ca2＋处理农杆菌，应直接利用土壤农杆菌感染植物细胞，B错误；Ti质粒是一种环状DNA分子，是存在于细菌细胞质中的拟核之外的DNA，C错误；在农杆菌转化法中，需要将目的基因插入到T－DNA特定区段上，D错误。]
二、
自主梳理
1.表达
2.(1)②同源性　碱基互补配对　③同位素　荧光　④互补　示踪　位置　DNA　⑤放射性　荧光　(2)①功能　转录　②分子杂交技术　③mRNA　目的基因　杂交带　(3)①抗原－抗体杂交　②抗原－抗体　③杂交带
3.(1)特定性状　(2)天然产品
辨正误
(1)√
(2)×　提示：利用DNA探针技术可检测目的基因是否导入到受体细胞，利用抗原－抗体杂交法可检测目的基因是否表达出来。
(3)√　(4)√
合作探究
1.提示：目的基因未导入受体细胞；导入受体细胞的目的基因未整合到受体细胞的基因组DNA上，在复制遗传的过程中丢失；目的基因未转录出mRNA；目的基因的mRNA未翻译出蛋白质；翻译出的蛋白质没有活性等。
2.提示：检测目的基因的探针是用放射性同位素或荧光标记的目的基因。应提取核DNA。因为若提取全部DNA，即使检测结果呈阳性，也不能判断目的基因是插入到了染色体DNA上，还是插入到了细胞质DNA上。
学以致用
3.C　[①检测受体细胞的染色体上是否有目的基因，可以利用DNA分子杂交技术，①正确；②致病基因一般不属于目的基因，②错误；③检测目的基因是否转录出了mRNA可以利用分子杂交技术，③正确；④检测目的基因是否翻译出了蛋白质可以利用抗原－抗体杂交技术， ④正确。综上，①③④表述符合题意，C正确。]
4.AB　[转基因属于基因重组，未产生新物种，该转基因水稻与原野生型水稻不存在生殖隔离，A正确；不同的目的基因可能需要不同的限制酶进行切割，因此该基因工程所需的限制性内切核酸酶可能有多种，B正确；目的基因进入水稻细胞后，还要检测目的基因是否表达以及个体水平的检测，如果不表达水稻不会表现出抗盐性状，C错误；可通过将水稻种植到盐碱地观察水稻是否表现出抗盐性状，D错误。]
随堂检测
1.C　[人工合成目的基因形成双链时，需要进行碱基互补配对，A不符合题意；目的基因与载体结合时，黏性末端之间的连接进行碱基互补配对，B不符合题意；将目的基因导入受体细胞时不进行碱基互补配对，C符合题意；检测目的基因时需要用到基因探针，进行碱基互补配对；目的基因的表达包括转录和翻译，也进行碱基互补配对，D不符合题意。]
2.A　[Ti质粒是双链环状DNA分子，每个脱氧核糖均与2个磷酸基团和1个碱基相连，A正确；Ti质粒通常具有单起点复制特点，在宿主细胞中，质粒能够自主复制，一般只含有一个复制起始点，构成一个独立的复制子，B错误；用Ca2＋处理农杆菌有利于重组Ti质粒的导入，C错误；Ti质粒的T－DNA片段可随机整合到受体细胞染色体的DNA上，D错误。]
3.A　[基因表达的产物是蛋白质，因此，只有在受体细胞中检测或提取到了相应蛋白质才能证明目的基因在受体细胞中完成了表达，B、D项只能说明完成了目的基因的导入，C项只能说明完成了目的基因的导入和目的基因的转录。]
4.D　[哺乳动物成熟的红细胞无细胞核和众多细胞器，可能检测不到有该基因的存在，A正确；由于基因的选择性表达，mRNA存在明显差别，不同组织细胞中部分mRNA不同，B正确；同一个个体组织细胞中遗传物质相同，虽然基因的表达具有选择性，但在不同的细胞中也有共同表达的基因，因此用某组织细胞中提取的mRNA作探针可检测发现不同组织细胞中会存在相同的mRNA，C正确；抗原－抗体杂交技术可用于检测细胞中某种蛋白质分子的存在。虽然基因的表达具有选择性，但不同的细胞中依然存在部分相同的蛋白质分子，D错误。]
5.AD　[用E.coli DNA连接酶只能将黏性末端的DNA片段连接在一起，A错误；选用产生不同黏性末端的两种限制酶E1和E4进行切割，保证了甲的完整，并且保证融合基因和载体正确连接，B正确；若要培育获得转GFP基因牛，一般选用受精卵作为受体细胞，D错误。](共40张PPT)
第三章　基因工程 第一节　基因工程及其技术　
第4课时　基因工程的基本操作程序之将目的基因导入受体细胞、目的基因及其表达产物的检测鉴定
本课时的概念为“基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测鉴定”，这个概念的建构需要以下基本概念或证据的支持：
1.基因工程基本程序的第三步是将目的基因导入受体细胞。
2.基因工程基本程序的第四步是检测和鉴定目的基因及其表达产物。
课时概念解析
目录 CONTENTS
1.将目的基因导入受体细胞
2.目的基因及其表达产物的
检测鉴定
3.随堂检测
自主梳理
合作探究
合作探究
思维导图
自主梳理
受体细胞不同，导入目的基因的方法不同：
细胞类型 转化方法 转化过程
植物细胞 ______________(主要) 将目的基因插到Ti质粒的____________特定区段上→转入农杆菌→导入植物细胞→插入植物细胞________________上→目的基因的遗传和表达
农杆菌转化法
T－DNA
染色体的DNA
哺乳动物细胞 ____________ (主要) 受精卵→显微注射→受精卵移植到处于___________的母畜子宫内→受精卵发育→获得一定数量的转基因动物
病毒感染法 用______________________一起构建的载体，去感染受体动物细胞，也能使目的基因导入动物细胞内
微生物细胞 Ca2＋处理法 Ca2＋处理微生物细胞→感受态细胞→将重组的__________________________混合于缓冲液中→在适宜的温度下完成转化
显微注射法
相同发情周期
病毒DNA与目的基因
基因表达载体与感受态细胞
提醒：①将目的基因导入受体细胞的过程中没有涉及碱基互补配对。
②农杆菌转化法中，能够转移到植物受体细胞的是T－DNA区段，而非整个Ti质粒。
③CaCl2溶液对微生物细胞的作用是增加其细胞质膜对DNA的通透性，从而促进重组DNA分子进入受体细胞。
[微思考]
1.在制备转基因动物的过程中常用受精卵作为受体细胞的原因是什么？
提示：因为受精卵具有全能性。
2.若制备转基因动物过程中用体细胞作受体细胞，如何得到转基因个体？
提示：可利用核移植技术。
×
√
[辨正误]
(1)农杆菌转化过程中，含有目的基因的重组Ti质粒可转移到植物细胞内。( )
提示：农杆菌转化过程中，将目的基因插到农杆菌Ti质粒的T－DNA特定区段上，再通过T－DNA将其插入植物细胞染色体的DNA上。
(2)将重组表达载体导入动物受精卵常用显微注射法。( )
(3)可利用噬菌体DNA与目的基因一起构建的载体感染动物细胞。( )
提示：噬菌体不能感染动物细胞。
(4)将目的基因导入原核细胞时，通常用大肠杆菌作为受体细胞，并需要用Ca2＋处理大肠杆菌，使其处于感受态。( )
×
√
下面为利用农杆菌转化法制备转基因植物的过程图，据图回答下列问题：
(1)在利用农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞的过程中，一定要将目的基因插入到Ti质粒的T－DNA上的原因是什么？
提示：农杆菌中的Ti质粒上的T－DNA(转移DNA)可转移至被侵染的细胞，并且整合到该细胞染色体的DNA上。
(2)将基因表达载体导入农杆菌时，应怎样处理农杆菌？
提示：基因表达载体导入农杆菌时，要用Ca2＋处理农杆菌，细胞质膜的通透性改变，使其处于感受态，利于基因表达载体的导入。
(3)将目的基因导入植物细胞后，如何获取转基因植物？
提示：对植物细胞进行植物组织培养。
(4)若获取的转基因植物(雌雄同体植物)中只导入了一个目的基因，如何获取转基因纯合子？
提示：转基因植物自交，选取子代中具有转基因性状的个体，单株自交，后代不发生性状分离的为转基因纯合子。
农杆菌转化法中两次拼接、两次导入的辨析
(1)两次拼接：第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T－DNA上；第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基因的T－DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上。
(2)两次导入：第一次导入是将含目的基因的重组Ti质粒导入农杆菌；第二次导入(非人工操作)是将含目的基因的T－DNA导入受体细胞。
【 学以致用 】
AB
1.(多选)下列关于将目的基因导入受体细胞的说法中，正确的是(　　)
A.农杆菌在自然条件下感染双子叶植物或裸子植物，不会感染大多数单子叶植物
B.将目的基因导入哺乳动物细胞可采用显微注射法或病毒感染法
C.将用Ca2＋处理的大肠杆菌和目的基因混合于缓冲液，适宜温度下便可完成转化
D.在显微注射法中，可将目的基因直接注射进动物受精卵中实现转化
解析：导入受体细胞的不只是目的基因，而是目的基因与载体构建的基因表达载体，C、D错误。
A
2.(2023·江苏徐州期中)土壤农杆菌侵染植物细胞时，Ti质粒上的T－DNA片段转入植物的基因组。利用农杆菌以Ti质粒作为载体进行转基因，下列相关叙述正确的是(　　)
A.T－DNA片段有利于介导外源DNA整合到植物的染色体DNA上
B.用Ca2＋处理农杆菌，以利于其侵染植物细胞
C.Ti质粒是一种环状DNA分子，属于细菌的拟核DNA
D.目的基因应插入T－DNA片段外，以防止破坏T－DNA
解析：Ti质粒上的T－DNA片段能转入植物的基因组中，因此T－DNA片段有利于介导外源DNA整合到植物的染色体DNA上，A正确；
农杆菌转化法中不需要用Ca2＋处理农杆菌，应直接利用土壤农杆菌感染植物细胞，B错误；
Ti质粒是一种环状DNA分子，是存在于细菌细胞质中的拟核之外的DNA，C错误；
在农杆菌转化法中，需要将目的基因插入到T－DNA特定区段上，D错误。
1.检测与鉴定的原因
基因导入受体细胞后，能否有效地______目的基因并产生相应的性状，需要进一步做筛选和鉴定。
表达
2.分子水平的检测
(1)从DNA方面进行检测
①检测方法：DNA分子杂交法。
②检测原理：具有一定________的两条DNA单链，在一定条件下(适宜的温度等)可以按照______________原则形成双链。
③基因探针：用放射性________或______标记的已知DNA片段。
④结果分析：若待测DNA中有能与基因探针______的特异性DNA片段，用于______的放射性同位素标记或荧光标记会指示出其所在的______，表明目的基因已经插入转基因生物的________分子中。
同源性
碱基互补配对
同位素
荧光
互补
示踪
位置
DNA
⑤检测过程
放射性
荧光
(2)从RNA方面进行检测
①检测目的：检测目的基因是否能发挥其______，即是否______出相应的mRNA分子。
②检测方法：______________。
③检测过程：从待测转基因生物细胞中提取__________分子，用已标记的__________片段作为探针与mRNA杂交，如果有________出现，表明目的基因转录出相应的mRNA分子。
功能
转录
分子杂交技术
mRNA
目的基因
杂交带
(3)从蛋白质方面进行检测
①检测方法：________________法。
②检测过程：从待测转基因生物中提取蛋白质，再用相应的抗体进行____________杂交。
③结果分析：如果有________出现，说明目的基因已经表达出相应的蛋白质。
抗原－抗体杂交
抗原－抗体
杂交带
3.个体水平的检测
(1)检测目的：对生物的某些__________进行鉴定。
(2)实例：对于导入某种鱼的抗冻蛋白基因的转基因番茄进行个体检测，需要栽培转基因番茄获得果实后，再与____________比较，确定其是否具有了抗冻性状。
特定性状
天然产品
×
√
[辨正误]
(1)基因探针是用放射性同位素或荧光标记的已知DNA片段。( )
(2)应用DNA探针技术，可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其是否完全表达。( )
提示：利用DNA探针技术可检测目的基因是否导入到受体细胞，利用抗原－抗体杂交法可检测目的基因是否表达出来。
(3)检测目的基因是否成功表达可用抗原—抗体杂交法。( )
(4)基因工程是否成功需进行个体水平的鉴定。( )
√
√
1.若经基因工程第三步获得的受体细胞培育而成的转基因生物没有表现出目的基因所控制的特定性状，可能的原因有哪些？
提示：目的基因未导入受体细胞；导入受体细胞的目的基因未整合到受体细胞的基因组DNA上，在复制遗传的过程中丢失；目的基因未转录出mRNA；目的基因的mRNA未翻译出蛋白质；翻译出的蛋白质没有活性等。
2.检测目的基因是否插入到了受体细胞的染色体DNA上，所用的探针是什么？应从转基因生物中提取核DNA还是全部DNA进行检测？为什么？
提示：检测目的基因的探针是用放射性同位素或荧光标记的目的基因。应提取核DNA。因为若提取全部DNA，即使检测结果呈阳性，也不能判断目的基因是插入到了染色体DNA上，还是插入到了细胞质DNA上。
●从抗虫棉中提取蛋白质，若利用抗原—抗体杂交法检测结果呈阳性，是否能够说明基因工程已获成功？
提示：检测结果呈阳性只是说明了抗虫基因已表达形成了蛋白质，但形成的蛋白质是否具有生物活性仍需进一步进行个体水平的鉴定。
●如果目的基因是抗虫基因，在个体水平上怎么检测？如果目的基因是耐盐基因呢？
提示：如果目的基因是抗虫基因，则要进行抗虫接种实验。如果目的基因是耐盐基因，则要用一定浓度的盐水浇灌。　　　
●目的基因及其表达产物的
检测鉴定的方法汇总
●个体水平上检测转基因生物的常用方法
转基因生物 检测生物 观察目标
抗虫植物 害虫吞食 害虫是否死亡
抗病植物 病毒(菌)感染 是否出现病斑
抗盐植物 盐水浇灌 是否正常生长
抗除草剂植物 喷洒除草剂 是否正常生长
为获取特定产物培育的转基因生物 提取细胞产物，与天然产品进行功能、活性比较 细胞产物的功能、活性是否正常
【 学以致用 】
C
3.目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持并表达其遗传特性，只有通过鉴定和检测才能知道。下列属于目的基因的检测和鉴定的是(　　)
①检测受体细胞的染色体上是否有目的基因 ②检测受体细胞是否有致病基因　③检测目的基因是否转录出了 mRNA　④检测目的基因是否翻译出了蛋白质
A.①②③ B.②③④
C.①③④ D.①②④
解析：①检测受体细胞的染色体上是否有目的基因，可以利用DNA分子杂交技术，①正确；②致病基因一般不属于目的基因，②错误；③检测目的基因是否转录出了mRNA可以利用分子杂交技术，③正确；④检测目的基因是否翻译出了蛋白质可以利用抗原－抗体杂交技术，④正确。综上，①③④表述符合题意，C正确。
AB
4.(多选)(2024·江苏盐城阶段练习)盐害是全球水稻减产的重要原因之一，中国水稻研究所等单位的专家通过农杆菌中的质粒将CMO基因、BADH基因、mtld基因、gutD基因和SAMDC基因5个耐盐基因导入水稻，获得了一批耐盐转基因植株。有关耐盐转基因水稻培育的分析正确的是(　　)
A.该转基因水稻与原野生型水稻不存在生殖隔离
B.该基因工程所需的限制性内切核酸酶可能有多种
C.只要目的基因进入水稻细胞，水稻就会表现出抗盐性状
D.可通过将水稻种植到有农杆菌的土壤中观察目的基因是否表达
解析：转基因属于基因重组，未产生新物种，该转基因水稻与原野生型水稻不存在生殖隔离，A正确；
不同的目的基因可能需要不同的限制酶进行切割，因此该基因工程所需的限制性内切核酸酶可能有多种，B正确；
目的基因进入水稻细胞后，还要检测目的基因是否表达以及个体水平的检测，如果不表达水稻不会表现出抗盐性状，C错误；
可通过将水稻种植到盐碱地观察水稻是否表现出抗盐性状，D错误。
C
1.(2024·江苏盐城月考)在基因工程的基本操作程序中，不进行碱基互补配对的是(　　)
A.人工合成目的基因 B.目的基因与载体结合
C.将目的基因导入受体细胞 D.目的基因的检测和表达
解析：人工合成目的基因形成双链时，需要进行碱基互补配对，A不符合题意；
目的基因与载体结合时，黏性末端之间的连接进行碱基互补配对，B不符合题意；
将目的基因导入受体细胞时不进行碱基互补配对，C符合题意；
检测目的基因时需要用到基因探针，进行碱基互补配对；目的基因的表达包括转录和翻译，也进行碱基互补配对，D不符合题意。
A
2.(2024·江苏镇江开学考试)Ti质粒是根癌农杆菌拟核外的遗传物质，常作为植物基因工程的载体。下列关于Ti质粒的叙述，正确的是(　　)
A.每个脱氧核糖均与2个磷酸基团和1个碱基相连
B.Ti质粒复制时具有多起点和双向复制特点
C.用Ca2＋处理植物细胞有利于重组Ti质粒的导入
D.Ti质粒可随机整合到农杆菌的拟核DNA上
解析：Ti质粒是双链环状DNA分子，每个脱氧核糖均与2个磷酸基团和1个碱基相连，A正确；
Ti质粒通常具有单起点复制特点，在宿主细胞中，质粒能够自主复制，一般只含有一个复制起始点，构成一个独立的复制子，B错误；
用Ca2＋处理农杆菌有利于重组Ti质粒的导入，C错误；
Ti质粒的T－DNA片段可随机整合到受体细胞染色体的DNA上，D错误。
A
3.(2023·江苏盐城高二期末)利用外源基因在受体细胞中表达，可生产人类所需要的产品。下列各项中能说明目的基因在受体细胞中完成了表达的是(　　)
A.从酵母菌细胞中提取到人干扰素蛋白
B.山羊乳腺细胞中检测到人生长激素DNA序列
C.大肠杆菌中检测到人胰岛素基因及其mRNA
D.棉花二倍体细胞中检测到细菌的抗虫基因
解析：基因表达的产物是蛋白质，因此，只有在受体细胞中检测或提取到了相应蛋白质才能证明目的基因在受体细胞中完成了表达，B、D项只能说明完成了目的基因的导入，C项只能说明完成了目的基因的导入和目的基因的转录。
D
4.对一只老鼠不同组织细胞中物质检测的结果，下列叙述错误的是(　　)
A.用某种基因作探针检测时，可能在某些部位的细胞中检测不到有该基因的存在
B.用某组织细胞中提取的mRNA作探针检测发现不同组织细胞中存在一些不同的mRNA
C.用某组织细胞中提取的mRNA作探针检测发现不同组织细胞中会存在相同的mRNA
D.抗原—抗体杂交的结果发现不同组织细胞中不存在有相同的蛋白质分子
解析：哺乳动物成熟的红细胞无细胞核和众多细胞器，可能检测不到有该基因的存在，A正确；
由于基因的选择性表达，mRNA存在明显差别，不同组织细胞中部分mRNA不同，B正确；
同一个个体组织细胞中遗传物质相同，虽然基因的表达具有选择性，但在不同的细胞中也有共同表达的基因，因此用某组织细胞中提取的mRNA作探针可检测发现不同组织细胞中会存在相同的mRNA，C正确；
抗原－抗体杂交技术可用于检测细胞中某种蛋白质分子的存在。虽然基因的表达具有选择性，但不同的细胞中依然存在部分相同的蛋白质分子，D错误。
AD
5.(多选)某种荧光蛋白(GFP)在紫外光下会发出绿色荧光，该特性可用于检测细胞中目的基因的表达。研究人员将某病毒外壳蛋白(L1)基因连接在GFP基因的5′末端，获得了L1－GFP融合基因(简称为甲)，并将其插入质粒中构建了重组表达载体，重组表达载体的部分结构和酶切位点如图所示，图中E1～E4四种限制酶产生的黏性末端不相同。下列说法错误的是(　　)
A.用E.coli DNA连接酶能将平末端或
黏性末端的DNA片段连接在一起
B.用E1和E4进行酶切，能保证甲的完
整，也有利于甲与载体正确连接
C.若受体细胞中观察到了绿色荧光，说明GFP基因已经完成了表达
D.若要培育获得转GFP基因牛，一般选用成纤维细胞作为受体细胞
A.用E.coli DNA连接酶能将平末端或黏性末端的DNA片段连接在一起
B.用E1和E4进行酶切，能保证甲的完整，也有利于甲与载体正确连接
C.若受体细胞中观察到了绿色荧光，说明GFP基因已经完成了表达
D.若要培育获得转GFP基因牛，一般选用成纤维细胞作为受体细胞
解析：用E.coli DNA连接酶只能将黏性末端的DNA片段连接在一起，A错误；
选用产生不同黏性末端的两种限制酶E1和E4进行切割，保证了甲的完整，并且保证融合基因和载体正确连接，B正确；
若要培育获得转GFP基因牛，一般选用受精卵作为受体细胞，D错误。课时精练13　基因工程的发展历程和基本工具
(时间：30分钟　分值：50分)
选择题：第1～12题，每小题3分，共36分。
【基础对点】
知识点1　基因工程是在多学科基础上发展而来的
1.美国科学家将萤火虫的荧光素基因转入烟草植物细胞，获得高水平的表达。长成的植物通体光亮，堪称自然界的奇迹。这一研究成果表明(　　)
①萤火虫与烟草植物的DNA结构基本相同
②萤火虫与烟草植物共用一套遗传密码
③烟草植物体内合成了荧光素
①和③ ②和③
①和② ①②③
2.下列各项科学研究成果，不能作为基因工程直接理论基础的是(　　)
DNA双螺旋结构模型的建立
孟德尔遗传规律的发现
遗传密码的破译
中心法则的确立
知识点2　基因工程的工具酶
3.(2023·江苏扬州期中)限制酶BamHⅠ和BglⅠ是两种常见的工具酶，它们的识别序列及切割位点依次为G↓GATCC和A↓GATCT。研究中用BamHⅠ切割DNA获得目的基因，用BglⅠ切割质粒，并连接得到重组质粒。相关叙述正确的是(　　)
酶切过程中，需控制好酶浓度、温度和反应时间等因素
目的基因经BamHⅠ切割后形成的黏性末端是－CTAGG
分别用两种限制酶切割，保证了目的基因定向插入质粒
经两种酶处理得到的重组质粒能再被这两种酶所识别
4.下图为不同限制酶识别的序列及切割位点(箭头所指)，下列叙述错误的是(　　)
若DNA上的碱基随机排列，理论上每4 096个碱基对会有一个BamH Ⅰ限制酶的切割位点
若DNA上的碱基随机排列，Not Ⅰ限制酶切割位点出现频率较其他三种限制酶低
作为基因工程的通用载体，质粒上通常会有多种限制酶的切割位点
BamHⅠ限制酶切割的DNA无法连接到用Bgl Ⅱ切割的载体DNA中
5.(2024·江苏泰州月考)T4 DNA连接酶可将任意2个具有相同黏性末端的DNA片段连接在一起。该反应过程需消耗ATP，其水解产生的腺苷一磷酸(AMP)通过共价键与酶相连，随后AMP转移至DNA片段，进而完成连接反应。下列叙述正确的是(　　)
T4 DNA连接酶的底物种类较多，故其无专一性
T4 DNA连接酶催化反应后，其组成成分已改变
ATP在该反应过程中可能打开两个磷酐键
T4 DNA连接酶需保存于最适温度和pH条件下
6.从图1酶切结果分析，图2中目的基因(长度为2.0 kb)插入方向正确的重组质粒序号和作出该判断所用的限制酶是(　　)
②，BamHⅠ
①，EcoRⅠ
①，EcoRⅠ和HindⅢ
②，EcoRⅠ和HindⅢ
知识点3　基因工程的载体
7.下列关于质粒的叙述，正确的是(　　)
质粒是广泛存在于细菌细胞中的一种颗粒状细胞器
质粒是独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外且能够自我复制的环状双链DNA分子
细菌质粒和真核细胞DNA的基本组成单位不同
质粒的复制过程一定是在细胞外独立进行的
8.(2023·南师大附中高二模拟)下列有关基因工程工具的叙述，正确的是(　　)
载体的作用只是携带目的基因进入受体细胞
质粒载体通常采用抗生素合成基因作为鉴定和筛选的标记基因
限制酶、DNA连接酶和质粒是基因工程中常用的三种工具酶
基因工程中常用的载体除质粒外，还有λ噬菌体的衍生物、动物病毒等
9.(2024·江苏扬州月考)下列有关基因工程中载体的说法，正确的是(　　)
基因工程的操作中最常用的载体是来自细菌的天然质粒
质粒是一种独立于细菌染色体外的双链环状DNA分子
具有某些标记基因，以便为目的基因的表达提供条件
能够在宿主细胞中复制并稳定保存，以便提供大量的目的基因
【综合提升】
10.(多选)基因工程需要特定的工具，下列叙述错误的是(　　)
基因工程所需载体有质粒、细菌拟核等，至少要有一个限制酶识别位点
限制酶主要从原核生物中分离纯化而来，能够识别双链DNA分子中的某种特定的核苷酸序列
限制酶、DNA连接酶和解旋酶作用的化学键都是两个核苷酸之间的磷酸二酯键
限制酶有数千种，而DNA连接酶只有两种
11.(多选)限制酶和DNA连接酶是重组DNA技术常用的工具酶，限制酶通常将DNA分子切割成带有黏性末端的DNA片段，而DNA连接酶可缝合带有黏性末端的DNA片段。据图分析，下列叙述错误的是(　　)
图示三个黏性末端可由两种或三种不同的限制酶切割产生
图示中共有三种黏性末端，其中甲与乙黏性末端可以互补配对
a处和b处的核苷酸之间均需要DNA连接酶连接
催化甲形成的限制酶有可能不识别由甲、乙形成的重组DNA分子
12.(多选)下图为基因工程中构建重组质粒的过程示意图，下列有关说法正确的是(　　)
EcoRⅤ切割出来的载体P1为平末端
T4 DNA连接酶既可以连接平末端又可以连接黏性末端
构建基因表达载体用到的工具酶有限制酶、DNA连接酶和载体等
天然质粒具备限制酶切割位点、标记基因，即可作为载体
13.(14分)(江苏经典高考题)图1表示含有目的基因D的DNA片段长度(bp即碱基对)和部分碱基序列，图2表示一种质粒的结构和部分碱基序列。现有MspⅠ、BamHⅠ、MboⅠ、SmaⅠ4种限制性内切核酸酶切割的碱基序列和酶切位点分别为C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG。请回答下列问题：
(1)(2分)图1的一条脱氧核苷酸链中相邻两个碱基之间依次由____________________连接。
(2)(3分)若用限制酶SmaⅠ完全切割图1中DNA片段，产生的末端是________末端，其产物长度为____________。
(3)(1分)若图1中虚线方框内的碱基对被T－A碱基对替换，那么基因D就突变为基因d。从杂合子分离出图1及其对应的DNA片段，用限制酶SmaⅠ完全切割，产物中共有________种不同DNA片段。
(4)(8分)若将图2中质粒和目的基因D通过同种限制酶处理后进行，形成重组质粒，那么应选用的限制酶是________。在导入重组质粒后，为了筛选出含重组质粒的大肠杆菌，一般需要用添加________的培养基进行培养。经检测，部分含有重组质粒的大肠杆菌菌株中目的基因D不能正确表达，其最可能的原因是______________________________________________________________________
______________________________________________________________________。
课时精练13　基因工程的发展历程和基本工具
1.D　[萤火虫与烟草的DNA能连接在一起，说明萤火虫与烟草植物的DNA结构基本相同，①正确；荧光素基因转入烟草植物细胞后能成功表达，说明萤火虫与烟草植物共用一套遗传密码，②正确；长成的植物通体光亮，说明烟草植物体内合成了荧光素，③正确。]
2.B　[DNA双螺旋结构模型的建立属于基因工程直接理论基础，A不符合题意；孟德尔遗传规律的发现不属于基因工程直接理论基础，B符合题意；遗传密码的破译属于基因工程直接理论基础，C不符合题意；中心法则的确立明确了生物界共用一套遗传密码，是基因工程直接理论基础，D不符合题意。]
3.A　[影响酶促反应的因素有温度、pH、酶浓度、底物浓度等，因此酶切过程中，需控制好酶浓度、温度和反应时间等因素，A正确；目的基因经BamHⅠ切割后形成的黏性末端是和，B错误；分别用两种限制酶切割，由于形成的黏性末端可以互补配对，因此并不能保证目的基因定向插入质粒，C错误；经两种酶处理得到的重组质粒不能再被这两种酶所识别，D错误。]
4.D　[BamH Ⅰ限制酶的识别序列具有6个碱基对，若DNA上的碱基随机排列，理论上每46＝4 096(个)碱基对会有一个BamHⅠ限制酶的切割位点，A正确；Not Ⅰ限制酶的识别序列具有8个碱基对，而其他三种限制酶的识别序列均为6个碱基对，故若DNA上的碱基随机排列，Not Ⅰ限制酶切割位点出现频率较其他三种限制酶低，B正确；BamH Ⅰ限制酶切割的DNA产生的黏性末端和用Bgl Ⅱ切割的载体DNA产生的黏性末端可以互补配对，故BamH Ⅰ限制酶切割的DNA可以连接到用Bgl Ⅱ切割的载体DNA中，D错误。]
5.C　[T4 DNA连接酶有专一性，A错误；酶在催化反应前后性质不变，故T4 DNA连接酶催化反应后，其组成成分不变，B错误；ATP水解产生AMP需要打开两个磷酐键，结合题干“该反应过程需消耗ATP，其水解产生的腺苷一磷酸(AMP)通过共价键与酶相连”可推测ATP在该反应过程中可能打开两个磷酐键，C正确；T4 DNA连接酶需在低温和最适pH条件下保存，D错误。]
6.C　[分析图1可知，重组质粒被EcoRⅠ酶切后，得到5.8 kb的片段，说明重组质粒中只有一个EcoRⅠ的酶切位点；重组质粒被BamHⅠ酶切后产生3.8 kb和2.0 kb两种片段，说明重组质粒中有2个BamHⅠ的酶切位点；重组质粒被EcoRⅠ和HindⅢ酶切后，产生4.5 kb和1.3 kb两种片段，说明重组质粒中有EcoRⅠ和HindⅢ的酶切位点，且两种酶切位点之间的片段为4.5 kb和1.3 kb。结合图2分析可知，重组质粒①符合上述分析的结果，重组质粒②中EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点之间的片段为2.3 kb和3.5 kb，不符合图1酶切的结果。综上所述，C正确，A、B、D错误。]
7.B　[质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子，不是细胞器，A错误，B正确；细菌质粒是环状DNA分子，和真核细胞DNA的基本组成单位相同，均为脱氧核苷酸，C错误；质粒能在细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制，D错误。]
8.D　[载体的作用是携带目的基因进入受体细胞，并使其在受体细胞中稳定遗传和表达，A错误；标记基因通常采用抗生素抗性基因，B错误；质粒不属于工具酶，C错误。]
9.D　[基因工程的操作中最常用的载体是人工改造后的质粒，A错误；细菌是原核生物，没有染色体，B错误；标记基因用于鉴定和选择重组DNA分子，与目的基因的表达无关，C错误；载体能将目的基因导入到受体细胞，作为载体的条件之一是能够在宿主细胞中复制并稳定保存，以便提供大量的目的基因，D正确。]
10.ACD　[基因工程所需载体有质粒、动物病毒和λ噬菌体的衍生物等，载体需有多个限制酶切割位点，以便连接不同的目的基因，细菌拟核不能作为载体，A错误；限制酶主要从原核生物中分离纯化而来，能够识别双链DNA分子中的某种特定的核苷酸序列，并在特定位点进行切割，B正确；限制酶、DNA连接酶作用的化学键都相同，都是DNA一条链中相邻两个核苷酸之间的磷酸二酯键，而解旋酶的作用部位是氢键，C错误；早期用于基因工程的DNA连接酶主要源于大肠杆菌和T4噬菌体，即E.coli DNA连接酶和T4DNA连接酶，DNA连接酶并非只有两种，D错误。]
11.ABC　[切割产生甲的限制酶的识别序列为：GAATTC//CTTAAG，切割产生乙的限制酶的识别序列为： CAATTG//GTTAAC，切割产生丙的限制酶的识别序列为：CTTAAG//GAATTC，由此可见，图示三个黏性末端是由三种不同的限制酶切割产生的，A错误；由图可知，甲、乙的黏性末端相同，均为AATT—，丙的黏性末端为TTAA—，因此图示中共有两种黏性末端，其中甲与乙黏性末端可以互补配对，B错误；DNA连接酶能催化磷酸二酯键的形成，a处的核苷酸之间需要DNA连接酶连接，但b处(氢键)不需要，C错误；切割甲的限制酶的识别序列为：GAATTC//CTTAAG，而甲、乙片段形成的重组DNA分子的序列可为：GAATTG//CTTAAC，故催化甲形成的限制酶有可能不识别由甲、乙形成的重组DNA分子，D正确。]
12.AB　[分析题图可知，EcoRⅤ切割出来的载体P1为平末端，经过酶处理之后才形成了黏性末端，A正确；构建基因表达载体用到的工具酶有限制酶(切割目的基因和载体)、DNA连接酶(连接目的基因和载体)，C错误；天然质粒除具备限制酶切割位点、标记基因外还需要具备启动子和终止子等，不可直接作为载体，D错误。]
13.(1)脱氧核糖、磷酸、脱氧核糖　(2)平　537 bp、790 bp、661 bp　(3)4　(4)BamHⅠ　抗生素B　同种限制酶切割形成的末端相同，部分目的基因D与质粒反向连接
解析　(1)脱氧核苷酸链相邻两碱基之间依次是脱氧核糖、磷酸、脱氧核糖。(2)SmaⅠ酶切割位点是CCC↓GGG，所以产生末端是平末端，根据图1中的酶切割位点，可判断用限制酶SmaⅠ完全切割该DNA片段，产生左边534＋3＝537(bp)，中间796－6＝790(bp)，右边658＋3＝661(bp)三个片段。(3)由图可知目的基因D有2个酶切位点，杂合子D可以切成3种不同的DNA片段，突变后的d只有1个酶切位点可以切成2种不同的DNA片段，其中有1种是和D相同，故共产生4种不同的DNA片段。(4)由图可知目的基因要完全切割下来可以用BamHⅠ酶，用MboⅠ酶也可以，同样质粒上也都有该酶切位点，但用MboⅠ酶切后会将质粒上的2个抗性基因都破坏掉无法进行筛选，用BamHⅠ酶切后质粒的抗生素A抗性基因被破坏，故只能用含抗生素B的培养基培养。目的基因D进入但不能正确表达最可能的原因是同种限制酶切割形成的末端相同，部分目的基因D与质粒反向连接。课时精练14　PCR技术和利用PCR技术扩增DNA片段并完成电泳鉴定
(时间：30分钟　分值：50分)
选择题：第1～9题，每小题4分，共36分。
【基础对点】
知识点1　聚合酶链式反应(PCR)技术
1.(2024·江苏扬州月考)在基因工程中，常用PCR特异性地快速扩增目的基因。下列叙述正确的是(　　)
PCR的变性是通过解旋酶将 DNA 的两条模板链分开的过程
PCR的退火是目的基因的两条模板链相互结合的过程
在PCR的延伸过程中，DNA聚合酶将脱氧核苷酸加到引物的5′端
PCR过程中每循环一次会使目的基因的数目增加一倍
2.科研人员利用PCR技术扩增X基因片段，需加入两种引物，引物结合位置如图甲所示。PCR循环后产生五种DNA分子，如图乙所示。下列叙述正确的是(　　)
利用DNA聚合酶和DNA连接酶才能完成PCR扩增过程
如果加入大量引物1和引物2，会干扰正常的PCR扩增过程
在第四轮复制后，会出现8个⑤片段
经过第二轮PCR后会出现①②③④⑤五种DNA分子
3.(2024·江苏高邮月考)荧光定量PCR技术是在常规PCR的基础上，加入与模板DNA某条链互补的荧光探针(一类两端经过特殊基团修饰的单链DNA片段)，当子链延伸至探针处时DNA聚合酶会水解掉探针一端并生成荧光分子，使荧光监测系统接收到荧光信号，即DNA每扩增一次，就有一个荧光分子生成，原理如图所示。下列有关叙述正确的是(　　)
该项技术可用来直接检测样本中新冠病毒核酸的含量
1个双链DNA分子经过3轮循环一共会生成8个荧光分子
1个双链DNA分子经过5轮循环一共需要消耗15对引物
该PCR技术中DNA聚合酶既催化形成磷酸二酯键，又催化断裂磷酸二酯键
4.(2024·江苏连云港阶段练习)数字PCR技术通过将一个样本分成几十到几万份，分配到不同的反应单元，每个单元最多包含一个拷贝的目标分子(DNA模板)，在每个反应单元中分别对目标分子进行PCR扩增，扩增结束后对各个反应单元的荧光信号进行统计学分析，如下图所示。下列相关叙述错误的是(　　)
PCR每一循环包括变性、退火和延伸三步
数字PCR可以在常温下进行，降低了检测成本
每个反应单元有无荧光取决于是否含有目标分子
数字PCR可实现对样品中目标分子的绝对定量分析
知识点2　利用PCR技术扩增DNA片段并完成电泳鉴定
5.(2024·江苏盐城月考)PCR扩增仪的温度、时间和循环次数等参数设定不当会影响到基因的扩增结果。下图是PCR扩增目的基因时的参数设定，图中线上、线下分别为温度和时间设定。下列叙述错误的是(　　)
步骤2的温度及时间设定主要依据目的基因的G、C含量
步骤3的温度及时间设定主要依据引物的长度及G、C含量
步骤4延伸时间的设定主要依据目的基因的碱基数目
步骤5除设定循环次数(25次)外，还应将“GOTO”设定为步骤3
6.PCR技术是对体内DNA复制过程的模仿，在基因诊断等许多方面发挥重要作用。其机理模式如图所示，①②③表示DNA上的相关区段，a、b、c、d分别为引物的两端。现利用该技术扩增片段②，下列描述中正确的是(　　)
图中b、d端为5′端，a、c端为3′端
设计相互容易发生互补配对的甲、乙两种引物，可以提高扩增效率
区段②中GC碱基对的比例大小会影响到退火过程，对变性和延伸影响不大
若扩增得到m个含有区段②的DNA分子，需要消耗m－1个引物甲
【综合提升】
7.(2024·江苏盐城阶段练习)常规PCR只能扩增两引物间的DNA区段，要扩增已知DNA序列两侧的未知DNA序列，可用反向PCR技术。反向PCR技术扩增的原理如图所示。下列叙述错误的是(　　)
酶切阶段，L中不能含有酶切时所选限制酶的识别序列
PCR技术的操作步骤依次是变性、退火、延伸
图中引物，应选择引物1和引物4，且二者间不能互补配对
PCR扩增，每轮循环前应加入限制酶将环状DNA切割成线状
8.(多选)(2024·江苏开学考试)RT－PCR是将RNA逆转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增反应相结合的技术，可利用此技术获取目的基因，具体过程如图所示，以下说法正确的是(　　)
设计扩增目的基因的引物时需考虑目的基因两端的碱基序列
G/C含量高的引物在与模板链结合时，退火的温度较高
该技术用于对某些微量RNA病毒的检测，可提高检测的灵敏度
过程Ⅰ需要加入缓冲液、原料、热稳定的DNA聚合酶和引物A等
9.(多选)PCR技术可用于遗传多样性的研究。如图是对跳虫A和跳虫B的DNA分析实验过程，下列有关叙述正确的是(　　)
蛋白酶可以分解组织中的蛋白质，在提取DNA时，加入蛋白酶有助于释放出DNA
Taq酶能够耐高温，常在PCR中用于DNA链的合成
将已知长度的DNA片段装到凝胶上作参照，可用于估测样本DNA片段的大小
阴性对照是加入DNA模板和PCR扩增过程中所需的其他混合物，以检测是否有污染
10.(14分)(2023·盐城实验高级中学高二期中)金属硫蛋白(MT)是一类广泛存在的金属结合蛋白，某研究小组计划通过聚合酶链式反应(PCR)扩增获得目的基因，构建转基因工程菌，用于重金属废水的净化处理。如图是PCR扩增过程的示意图，请回答下列问题：
(1)(4分)从高表达MT蛋白的生物组织中提取mRNA，通过____________________获得DNA用于PCR扩增。
(2)(4分)设计一对与MT基因两端序列互补配对的引物(引物1和引物2)，为方便构建重组质粒，在引物中需要增加适当的________________________识别序列。设计引物时需要避免引物之间形成____________，而造成引物自连。
(3)(2分)图中步骤1代表________，步骤2代表退火，步骤3代表________，这三个步骤组成一轮循环。
(4)(4分)PCR扩增时，退火温度的设定是成败的关键。退火温度过高会破坏____________的碱基配对。退火温度的设定与引物长度、碱基组成有关，长度相同但____________的引物需要设定更高的退火温度。
课时精练14　PCR技术和利用PCR技术扩增DNA片段并完成电泳鉴定
1.D　[PCR 的变性是通过高温将 DNA 的两条模板链分开的过程，A错误；PCR 的退火是降低温度使目的基因的DNA模板链与引物结合，为后续子链延伸做准备，B错误；PCR过程中，在DNA聚合酶的作用下将4种脱氧核苷酸加到引物的3′端，实现子链的延伸，C错误；PCR是一项体外扩增DNA的技术，PCR 过程中每循环一次会使目的基因的数目增加一倍，D正确。]
2.C　[利用PCR技术扩增X基因片段，利用热稳定的DNA聚合酶就能完成PCR扩增过程，A错误；由图甲可知，利用PCR技术扩增X基因片段需要引物1和引物2，如果加入大量引物1和引物2，不会干扰正常的PCR扩增过程，B错误； 第四次复制得到16个DNA分子：①复制得①和③，②复制得②和④，2个③复制得2个③和2个⑤，2个④复制得2个④和2个⑤，2个⑤复制得4个⑤，C正确；X基因第一次复制得到2个两种DNA分子：①和②；X基因第二次复制得到4个四种DNA分子：①复制得①和③，②复制得②和④。可见，经过第二轮PCR后会出现①②③④四种DNA分子，D错误。]
3.D　[利用荧光定量PCR技术可以进行DNA的含量测定，模板DNA越多，荧光信号越强，而新冠病毒的核酸为 RNA，无法直接用该技术检测，A错误；荧光探针只能跟模板DNA的某条链互补配对，DNA分子每扩增一次，就有一个荧光分子生成，3轮循环后得到8个DNA分子，即扩增形成了7个新DNA分子，一共会生成1＋2＋4＝7(个)荧光分子，B错误；1个双链DNA分子经过5轮循环一共会形成 32个 DNA分子，即形成64 条链，其中62条链都是新合成的，一共需要消耗31对引物，C错误；子链延伸时DNA聚合酶可在子链的3′端不断添加脱氧核苷三磷酸，从而形成磷酸二酯键，当子链延伸至探针处时 DNA 聚合酶会水解DNA单链探针的一端，使其有关基团出现荧光，D正确。]
4.B　[PCR过程：目的基因DNA受热变性后解为单链(变性)，降温后引物与单链相应互补序列结合(退火)，然后以单链DNA为模板，在DNA聚合酶作用下进行延伸(延伸)，直到完成一次复制。此后每一循环都包括这三步，A正确；数字PCR也是体外DNA复制，需要高温使DNA变性，提供单链做模板，所以数字PCR在高温下进行，B错误；每个单元最多包含一个拷贝的目标分子，如果反应单元中有目标分子，经PCR可以扩增大量目标分子，利用荧光检测时出现荧光信号。如果反应单元中没有分配到目标分子，反应单元不进行DNA复制，没有产物，利用荧光检测时不出现荧光信号，C正确；起始待测样品分配时，待分析PCR反应体系每个反应单元中最多分配有1个DNA分子，所以检测时，有多少单元有荧光信号，待测样品中起始就有多少DNA分子，所以数字PCR可实现对样品中目标分子的绝对定量分析，D正确。]
5.D　[步骤2是变性过程，是在高温条件下使DNA分子解旋的过程，由于G和C之间有3个氢键，热稳定性高，故步骤2的温度及时间设定主要依据目的基因的G、C含量，A正确；步骤3是退火过程，一般情况下，引物的长度越长，G和C比例越高，则退火步骤中的退火温度设定就越高，B正确；步骤4是延伸过程，时长的设置依据目的基因的长度，即主要依据目的基因的碱基数目，C正确；“GOTO”是设置返回的步骤序号，参数应设置为步骤“1”，D错误。]
6.D　[DNA聚合酶只能以5′→3′方向聚合子代DNA链，根据题意a、b、c、d分别为引物的两端，现利用该技术扩增片段②，根据子链的延伸方向可知a、d端为3′端，b、c端为5′端，A错误；两种引物之间不能发生碱基互补配对，以防止引物之间结合形成双链，影响引物与DNA模板链的结合，B错误；区段②中GC碱基对的比例越大，热稳定性越高，对变性和延伸都有影响，C错误；每扩增一个DNA分子需要一对引物(即一个甲和一个乙)，除去模板DNA分子，需要消耗m－1个引物甲，D正确。]
7.D　[在酶切阶段，已知序列L中不能含有酶切时所选限制酶的识别序列，不然会将已知序列L切断，造成序列识别混乱，A正确；PCR技术的操作步骤依次是高温使DNA变性、低温退火(使DNA单链与引物结合)、中温延伸，B正确；PCR过程需要两种引物，能分别与目的基因两条链的3′端通过碱基互补配对结合，为保证延伸的是已知序列两侧的未知序列，应该选择引物1和引物4，且二者间不能互补配对，C正确；PCR扩增只需要在第一次循环前加入足够的限制酶，并不需要每轮都加入，D错误。]
8.ABC　[利用PCR技术扩增目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物，因此需要考虑目的基因两端的碱基序列，A正确；G/C碱基对之间有三个氢键，G/C含量高时稳定性高，所以需要更高的退火温度，B正确；该技术可用于获取并大量扩增目的基因，因此当RNA病毒量较少时，可以利用此技术增加病毒核酸含量，提高检测的灵敏度，C正确；过程Ⅰ是逆转录过程，所以需要加入缓冲液、原料、逆转录酶和引物A等，D错误。]
9.ABC　[蛋白酶可以分解组织中的蛋白质，真核生物的DNA与蛋白质结合在一起，因此，在提取DNA时加入蛋白酶有助于释放出DNA，A正确；Taq酶能够耐高温，高温下不会变性，常在PCR中用于DNA链的合成，B正确；阴性对照是未加入DNA模板，但加入PCR扩增过程中所需的其他混合物，目的是检测试剂是否被污染，D错误。]
10.(1)逆转录　(2)限制性内切核酸酶(限制酶)　碱基互补配对　(3)变性　延伸
(4)引物与模板　G—C含量高　
解析　(1)PCR是在体外进行DNA扩增，提取的mRNA不能用于PCR扩增，需要经过逆转录获得DNA后才可用于PCR扩增。(2)设计一对与MT基因两端序列互补配对的引物(引物1和引物2)，需要在引物中增加适当的限制性内切核酸酶(限制酶)的识别序列，便于构建重组质粒。为了避免引物自连，设计引物时需要避免引物之间形成碱基互补配对。(3)根据PCR的过程可知，图中步骤1为变性，步骤2为退火，步骤3为延伸，这三个步骤构成一轮循环。(4)退火温度的设定与引物长度、碱基组成有关，退火温度过高会破坏引物与模板的碱基配对。因G、C之间氢键数多于A、T之间氢键数，故在使用G—C含量高的引物时需要设定更高的退火温度。课时精练15　基因工程的基本操作程序之目的基因的获取、基因表达载体的构建
(时间：30分钟　分值：50分)
选择题：第1～11题，每小题3分，共33分。
【基础对点】
知识点1　目的基因的获取
1.(2023·江苏镇江阶段检测)为了在大肠杆菌细胞中成功表达人胰岛素基因，首先需要提取细胞的mRNA，经逆转录等过程来获取目的基因。下列相关叙述，错误的是(　　)
用于逆转录的mRNA只能从胰岛B细胞中获取
逆转录过程需要四种游离的核糖核苷酸作为原料
经逆转录得到的目的基因不含启动子
逆转录获取目的基因时遵循碱基互补配对原则
2.观察分析下图，该图表示的过程是(　　)
构建基因组文库 构建cDNA文库
构建基因表达载体 构建转基因工程菌
3.(2024·江苏泰州月考)下图为采用“实时荧光定量RT－PCR(即将病毒RNA逆转录后再进行PCR扩增)”技术检测2019nCoV核酸的基本流程，1～2 h内即可得到检测结果。有关说法正确的是(　　)
过程①是逆转录过程，不属于中心法则的内容
过程②表示扩增DNA片段，需使用RNA聚合酶
荧光标记法还可以用于探究DNA的复制方式
RT－PCR反应体系中加入的原料是脱氧核苷三磷酸
知识点2　DNA的粗提取和鉴定
4.(2019·江苏卷，10)下列关于DNA粗提取和鉴定的叙述，错误的是(　　)
用同样方法从等体积兔血和鸡血中提取的DNA量相近
DNA析出过程中，搅拌操作要轻柔以防DNA断裂
预冷的乙醇可用来进一步纯化粗提的DNA
用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行水浴加热
5.(2023·江苏南通期中)南通某中学学生以新鲜花菜为实验材料开展了DNA的粗提取和鉴定实验，部分过程如下图。相关叙述错误的是(　　)
过程①中的研磨液具有瓦解细胞膜、使蛋白质变性的作用
过程②中应用滤纸进行过滤以提高滤液中DNA的含量
过程③依据的原理是蛋白质等杂质能溶于乙醇，而DNA不溶
过程④沸水浴后，试管a、b中溶液颜色分别为无色、蓝色
知识点3　基因表达载体的构建
6.在基因工程的操作过程中，获得重组质粒不需要(　　)
①DNA连接酶　②限制性内切核酸酶　③RNA聚合酶　④具有标记基因的质粒　⑤目的基因　⑥四种脱氧核苷酸
③⑥ ②④
①⑤ ①②④
7.(2023·辽宁高考真题)CD163蛋白是PRRSV病毒感染家畜的受体。为实时监控CD163蛋白的表达和转运过程，将红色荧光蛋白RFP基因与CD163基因拼接在一起(如下图)，使其表达成一条多肽。该拼接过程的关键步骤是除去(　　)
CD163基因中编码起始密码子的序列
CD163基因中编码终止密码子的序列
RFP基因中编码起始密码子的序列
RFP基因中编码终止密码子的序列
8.(2023·江苏南通阶段练习)人体内的t－PA蛋白能高效降解由纤维蛋白凝聚而成的血栓，是心梗和脑血栓的急救药，改造后的t－PA蛋白能显著降低出血副作用。下图表示构建含t－PA改良基因重组质粒的过程示意图。下列相关说法错误的是(　　)
构建重组质粒时，选用的限制酶是XmaⅠ和BglⅡ
需要DNA聚合酶将t－PA改良基因与质粒连接
新霉素抗性基因的作用是便于将导入质粒的大肠杆菌筛选出来
在加入新霉素的培养基中选择呈白色的菌落选育工程菌株
【综合提升】
9.大肠杆菌经溶菌酶和阴离子去垢剂(SDS)处理后，拟核DNA就会缠绕在细胞壁碎片上，静置一段时间，质粒分布在上清液中。利用上述原理可初步获得质粒DNA。下列关于质粒的粗提取和鉴定的分析错误的是(　　)
DNA不溶于乙醇，可以用冷乙醇析出上清液中的DNA
DNA能溶于2(mol·L－1)的NaCl溶液，可用二苯胺试剂在沸水加热条件下鉴定DNA
用限制酶Ⅰ和Ⅱ处理提取的产物，电泳出现上图结果，说明未提取到质粒
用琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒，被染色的质粒可通过紫外灯照射以看到结果
10.(多选)如图为某基因结构示意图及该基因上几种限制酶的酶切位点，下列相关叙述错误的是(　　)
图中所示基因可能来自真核生物，也可能来自原核生物
PCR技术扩增该基因时，形成磷酸二酯键所需要的能量可由dNTP提供
利用PCR技术扩增该基因时，可根据Ⅰ、Ⅲ区域的DNA序列设计引物
用该基因作为目的基因和质粒构建重组质粒时，只能用SmaⅠ切割
11.(多选)(2023·江苏苏州期中)人呼吸道合胞病毒(HRSV)是一种单链－RNA病毒，下图是构建人呼吸道合胞病毒基因组载体的示意图，下表是相关限制酶的识别序列及切割位点，下列叙述正确的有(　　)
限制酶 BclⅠ EcoRⅠ XbaⅠ BamHⅠ Sau3AⅠ
识别序列和切割位点 T↓GATCA G↓AATTC T↓CTAGA G↓GATCC ↓GATC
HRSV入侵细胞后在DNA聚合酶催化下合成＋RNA
过程②需要逆转录酶和Taq酶的参与
过程③需要用XbaⅠ和BclⅠ酶切割质粒A
过程④将质粒B导入大肠杆菌，有利于质粒B准确复制、稳定保存
12.(17分)(2024·江苏扬州阶段练习)β葡萄糖苷酶(BglB)是工业生产中降解纤维素的关键酶，研究人员利用基因工程技术，将编码BglB的基因转移到了大肠杆菌的细胞中并使之表达。下图1～3分别表示BglⅡ、BamHⅠ两种限制酶的识别序列和酶切位点，及其在质粒和含凝乳酶基因的外源DNA片段上的切割位点。其中，质粒含有leu2基因可用于合成亮氨酸，目的基因含有卡那霉素抗性基因KanR。bp为碱基对。回答下列问题：
(1)(5分)在基因工程中，质粒和目的基因构建重组质粒时必需的工具酶有________________________________。
(2)(5分)BglⅡ酶切后的质粒与BamHⅠ酶切后的目的基因能够连接的原因是______________________________________________________________________
______________________________________________________________________。
(3)(2分)将连接后的产物转入某种大肠杆菌，该细菌对卡那霉素敏感，且不能在缺乏亮氨酸的培养基中培养。若使用BglⅡ处理重组质粒(目的基因和质粒连接后形成的)，可以得到长度为________的________(填“线性”或“环状”)的DNA。
(4)(5分)大肠杆菌不能降解纤维素，但转入上述建构好的表达载体后则获得了降解纤维素的能力，这是因为______________________________________________
_____________________________________________________________________。
课时精练15　基因工程的基本操作程序之目的基因的获取、基因表达载体的构建
1.B　[胰岛素基因只在胰岛B细胞中表达，因此用于逆转录的mRNA只能从胰岛B细胞中获取，A正确；逆转录过程是以RNA为模板合成DNA的过程，以四种游离的脱氧核糖核苷酸为原料，B错误；真核细胞的mRNA转录后通过加工剪切了内含子和启动子，因此逆转录得到的目的基因不含启动子和内含子，C正确；逆转录获取目的基因是利用碱基互补配对原则获得DNA链，D正确。]
2.A　[由图可知，该过程利用的是某种生物的基因组DNA，用限制酶切割后，与载体连接注入受体菌中，该过程是构建基因组文库。]
3.D　[过程①表示以RNA为模板合成DNA，表示逆转录过程，属于中心法则的内容，A错误；过程②表示利用PCR扩增DNA片段，需要用到的酶是Taq酶，B错误；探究DNA的复制方式采用同位素标记法，不是荧光标记法，C错误；逆转录是以RNA为模板合成DNA的过程，PCR是体外模拟DNA复制的技术，所以应加入的原料是4种脱氧核苷三磷酸，D正确。]
4.A　[哺乳动物(如兔)成熟的红细胞无细胞核和众多细胞器，不能提取到DNA，故兔血不宜作为该实验的实验材料，A错误；为防止DNA断裂，在DNA析出过程中搅拌操作要轻柔且沿着一个方向，B正确；DNA不溶于乙醇溶液，但是细胞中的某些蛋白质溶于乙醇溶液，预冷的、体积分数为95%的乙醇溶液可用来进一步纯化粗提的DNA，C正确；在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺呈现蓝色，因此，用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行水浴加热，D正确。]
5.B　[研磨液具有破坏细胞膜、使DNA与蛋白质分离的作用，DNA与蛋白质分离时，主要是SDS使蛋白质变性，便于分离，A正确；不能用滤纸过滤，滤纸会吸附DNA，造成DNA损失，应该用纱布过滤，B错误；DNA不溶于乙醇溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于乙醇，故过程③依据的原理是蛋白质等杂质能溶于乙醇，而DNA不溶，C正确；在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，试管a中无DNA，试管b中含有DNA，过程④沸水浴后，试管a、b中溶液颜色分别为无色、蓝色，D正确。]
6.A　[构建重组质粒时，首先要用②限制性内切核酸酶切割含有目的基因的DNA片段和质粒，其次需要用①DNA连接酶将目的基因与质粒连接；③RNA聚合酶催化转录过程，获得重组质粒时不需要RNA聚合酶；获得重组质粒时，需要④具有标记基因的质粒作为载体；重组质粒是由⑤目的基因与质粒形成的；⑥四种脱氧核苷酸是合成DNA的原料，获得重组质粒不需要四种脱氧核苷酸。]
7.B　[为实时监控CD163蛋白的表达和转运过程，则拼接在一起的红色荧光蛋白RFP基因与CD163基因都得转录和翻译，使其表达成一条多肽，因此拼接在一起的CD163基因转录形成的mRNA中不能出现终止密码子，否则红色荧光蛋白RFP基因转录形成的mRNA不能进行翻译，无法合成红色荧光蛋白，因此该拼接过程的关键步骤是除去CD163基因中编码终止密码子的序列，B符合题意，A、C、D不符合题意。]
8.B　[根据图中目的基因两端的黏性末端以及各种限制酶的的切割位点可知，在构建重组质粒时，选用限制酶XmaⅠ和BglⅡ切割质粒，才能与目的基因t－PA改良基因高效连接，A正确；将t－PA改良基因与质粒连接的酶是DNA连接酶，不是DNA聚合酶，B错误；在构建重组质粒时，其中的新霉素抗性基因没有被破坏，因此可以根据对新霉素的抗性将成功导入质粒的大肠杆菌筛选出来，即该基因的作用是便于将成功导入质粒的大肠杆菌筛选出来，C正确；重组质粒已经破坏了mlacZ基因，其不会表达产物，即细胞呈白色，所以，在加入新霉素的培养基中选择呈白色的菌落选育工程菌株，D正确。]
9.C　[DNA不溶于乙醇，可以用冷却的、体积分数为95%的乙醇析出上清液中的DNA，A正确；DNA能溶于2(mol·L－1)的NaCl溶液，这样可以去除DNA中的某些杂质，提取的DNA可用二苯胺试剂鉴定，在沸水加热条件下出现蓝色，B正确；限制酶Ⅰ和限制酶Ⅱ处理提取的产物，只得到一条带，说明提取物是环状DNA，即提取物为质粒，C错误。]
10.AD　[图中基因的编码区存在外显子和内含子，因此该目的基因来源于真核生物，A错误；Ⅰ、Ⅲ区域位于编码区上、下游，可根据这两区域的DNA序列设计引物，C正确；SmaⅠ的酶切位点在编码区，会破坏目的基因，所以不能用SmaⅠ切割目的基因，D错误。]
11.BCD　[HRSV是一种单链－RNA病毒，侵染人体后，以该链为模板合成＋RNA，而DNA聚合酶作用的结果是以DNA为模板合成DNA，A错误；过程②以单链RNA为模板合成DNA，是逆转录过程，同时利用RT－PCR进行扩增，所以需要逆转录酶和Taq酶，B正确；BamHⅠ和Sau3AⅠ会切割复制原点，EcoRⅠ会切割标记基因，同种限制酶切割质粒和目的基因形成的黏性末端相同，为防止酶切后质粒自身环化，通常使用两种限制酶切割质粒，故应该选择XbaⅠ和BclⅠ酶切割质粒A，C正确；过程④是将重组质粒导入大肠杆菌，目的是扩增重组DNA分子，有利于质粒B准确复制、稳定保存，D正确。]
12.(1)限制性内切核酸酶(限制酶)和DNA连接酶　(2)酶切后产生相同的黏性末端(并遵循碱基互补配对原则)　(3)3 300 bp　环状　(4)转基因的大肠杆菌能分泌出有活性的BglB(β－葡萄糖苷酶)
解析　(1)在基因工程中，质粒和目的基因构建重组质粒时必需先用限制性内切核酸酶(限制酶)切割，将切割后的质粒和目的基因连接起来需要DNA连接酶。(2)由于BglⅡ酶切后的质粒与BamHⅠ酶切后产生相同的黏性末端并遵循碱基互补配对原则，因此BglⅡ酶切后的质粒与BamHⅠ酶切后的目的基因能够连接。(3)将连接后的产物转入某种大肠杆菌，该细菌对卡那霉素敏感，且不能在缺乏亮氨酸的培养基中培养。质粒长度为2 800 bp，目的基因长度为500 bp，重组后重组质粒上只有一个BglⅡ的酶切位点，故使用BglⅡ处理重组质粒，可以得到长度为2 800＋500＝3 300(bp)的环状DNA；将连接后的产物转入某种大肠杆菌，根据该细菌对卡那霉素敏感，且不能在缺乏亮氨酸的培养基中培养。(4)大肠杆菌不能降解纤维素，但由于转基因的大肠杆菌能分泌出有活性的BglB，故转入上述建构好的表达载体后则获得了降解纤维素的能力。课时精练16　基因工程的基本操作程序之将目的目的基因及其表达产物的检测鉴定
(时间：30分钟　分值：50分)
选择题：第1～10题，每小题3.5分，共35分。
【基础对点】
知识点1　将目的基因导入受体细胞
1.构建好的基因表达载体需要通过一定的方式才能进入受体细胞。下列受体细胞与常用导入方法对应错误的是(　　)
选项 受体细胞 常用的导入方法
A 大肠杆菌细胞 Ca＋处理法
B 小鼠细胞 显微注射法
C 南瓜细胞 农杆菌转化法
D 枯草芽孢杆菌 显微注射法
A B
C D
2.下列关于目的基因导入受体细胞的描述，正确的是(　　)
可以通过显微注射法直接将目的基因导入哺乳动物的受精卵中
通过基因工程大量获得胰岛素时，受体细胞选择大肠杆菌比酵母菌更有优势
可以用PEG处理大肠杆菌将目的基因导入其细胞内
可以使用病毒将目的基因导入受体细胞
3.下图表示应用基因工程技术生产干扰素的三条途径，下列相关叙述错误的是(　　)
途径甲中，过程Ⅰ应将干扰素基因和乳腺中特异表达的基因的启动子重组
途径乙中，过程Ⅱ一般所采用的方法是农杆菌转化法
途径丙中，过程Ⅱ可用Ca2＋处理大肠杆菌，以制备感受态细胞
三条途径中，由于使用的目的基因相同，表达出的干扰素结构也完全相同
知识点2　目的基因及其表达产物的检测鉴定
4.要检测受体DNA中是否成功插入了目的基因，需要用基因探针，这里的基因探针是指(　　)
用于检测疾病的医疗器械
带标记的与目的基因互补的核酸序列
带标记的蛋白质分子
人工合成的免疫球蛋白
5.斑点印迹杂交是一种简单的DNA分子杂交技术，其技术流程如图。据此分析，下列说法正确的是(　　)
p和q片段的杂交双链区域形成过程中有氢键和磷酸二酯键生成
p和q片段能够杂交的主要原因是两单链的碱基排列顺序相同
放射性自显影技术可显示原培养皿中含目的基因的菌落位置
斑点印迹杂交技术可用于检测目的基因是否在受体细胞中成功表达
6.棉花是我国重要的经济作物，黄萎病是棉花的最主要病害之一，有棉花的“癌症”之称。我国科学家在世界上首次获得转基因抗黄萎病棉花新株系。这将使棉花“癌症”有望得到根治。科学家将从海岛棉中分离出来的抗黄萎病基因At7导入陆地棉中，使陆地棉获得抗病性状。下列对转基因棉的检测与鉴定的叙述，错误的是(　　)
检测转基因棉是否导入基因At7，需要一段能与基因At7互补的短单链核酸引物
检测转基因棉中的基因At7是否转录出mRNA，其原理是抗原与抗体的特异性结合
检测到转基因棉表达出At7蛋白，说明转基因棉中成功导入了基因At7并能表达
检测转基因棉是否抗黄萎病，可接种黄萎病的病原体到转基因棉植株上
【综合提升】
7.下图是利用基因工程培育抗虫植物的示意图。下列相关叙述正确的是(　　)
②的构建需要限制性内切核酸酶和DNA聚合酶参与
③侵染植物细胞后，重组Ti质粒整合到④的染色体上
④的染色体上若含抗虫基因，则⑤就表现出抗虫性状
⑤只要表现出抗虫性状就表明植株发生了可遗传变异
8.(2023·江苏淮安高二质检)α1抗胰蛋白酶缺乏症是北美常见的一种单基因遗传病，患者成年后会出现肺气肿及其他疾病，严重者甚至死亡。利用基因工程技术将控制该酶合成的基因导入羊的受精卵，最终培育出能在乳腺细胞表达人α1抗胰蛋白酶的转基因羊，从而更容易获得这种酶。下列关于该过程的叙述中，错误的是(　　)
载体上绿色荧光蛋白基因(GFP基因)的作用是便于筛选含有目的基因的受体细胞
将目的基因导入羊受精卵中，可以使用显微注射法
培养出的转基因羊的所有细胞中都含有该目的基因，故该羊有性生殖产生的后代也都能产生α1抗胰蛋白酶
转基因母羊乳腺细胞中α1抗胰蛋白酶基因才会得以表达，因此可以从乳汁中提取α1抗胰蛋白酶
9.(多选)(2023·江苏徐州期中)科学家通过改变一种名为NR2B的基因研制出了转基因超级小鼠Hobbie－J，Hobbie－J比普通老鼠更加聪明，大脑运转更加迅速，它能够轻松完成迷宫任务。下列关于Hobbie－J产生过程的描述，错误的是(　　)
通过PCR技术扩增NR2B基因的前提是已知该基因全部的核苷酸序列
改变后的NR2B基因作为目的基因，可直接注入小鼠受精卵内
启动子和终止密码子均在NR2B基因转录时发挥作用
可采用PCR等技术检测改变后的NR2B基因是否导入小鼠体内
10.(多选)(2023·江苏南通阶段练习)B基因存在于水稻基因组中，且仅在体细胞(2n)和精子(n)中正常表达，卵细胞中不表达。为研究B基因表达对卵细胞的影响，设计了如下实验(Luc基因表达的荧光素酶能催化荧光素产生荧光，融合基因表达的蛋白质保留两种蛋白质各自功能)。下列相关叙述正确的有(　　)
可能由于DNA聚合酶不能合成导致B基因在水稻卵细胞中不能转录
过程①中TDNA以单链形式随机整合到受体细胞的染色体DNA上
过程②转化筛选水稻愈伤组织时，需在培养基中加入潮霉素
可通过检测加入荧光素的卵细胞中是否发出荧光鉴定B基因是否表达
11.(15分)科学家通过基因工程，将苏云金芽孢杆菌的Bt毒蛋白基因转入到普通棉株细胞内，并成功实现了表达，从而培育出了能抗棉铃虫的棉花植株——抗虫棉。其过程大致如图所示：
(1)(2分)基因表达载体的组成有Bt毒蛋白基因、启动子、终止子以及 ________ 等，启动子是 ________ 识别和结合的部位。
(2)(4分)用Ti质粒作为载体，是因为Ti质粒上有________ ，它能将Bt毒蛋白基因整合到棉花细胞的 ____________ 上。
(3)(4分)将Bt毒蛋白基因导入棉花细胞内采用的方法是 ____________ 。将基因表达载体转入农杆菌，首先必须用 ________ 处理农杆菌。
(4)(5分)检测Bt毒蛋白基因在抗虫棉中是否成功表达，在分子水平上的检测方法是____________；要确定抗虫棉是否具有抗虫特性，还需要进行 ____________ 水平的鉴定。
课时精练16　基因工程的基本操作程序之将目的基因导入受体细胞、目的基因及其表达产物的检测鉴定
1.D　[用一定浓度的CaCl2溶液处理，便能成为感受态的细胞，然后再将这些感受态的细胞和重组的表达载体混合于缓冲液中，完成转化过程，A正确；将目的基因导入哺乳动物细胞的方法是显微注射法，且通常选择小鼠的受精卵细胞，B正确；将目的基因导入南瓜细胞(植物细胞)的方法是农杆菌转化法，这是导入植物细胞最常用的方法，C正确；枯草芽孢杆菌属于微生物细胞，将目的基因导入微生物细胞的方法是Ca2＋处理法(感受态细胞法)，D错误。]
2.D　[目的基因导入受体细胞前必须进行基因表达载体的构建，不能直接将目的基因导入，A错误；酵母菌细胞中有多种细胞器，作为受体细胞生产胰岛素(分泌蛋白)比大肠杆菌更有优势，B错误；大肠杆菌作为受体细胞时应使用Ca2＋进行处理，C错误；可以利用部分病毒将自身DNA整合到宿主细胞染色体上的特点，通过病毒的感染将目的基因导入相关受体细胞，D正确。]
3.D　[途径甲中，要想使目的基因在乳腺中表达，过程Ⅰ应将干扰素基因和乳腺蛋白基因的启动子重组，A正确；途径乙中，过程Ⅱ将目的基因导入植物细胞时，一般所采用的方法是农杆菌转化法，B正确；途径丙中，过程Ⅱ将目的基因导入大肠杆菌时，常用Ca2＋处理大肠杆菌，使其成为感受态细胞，C正确；干扰素是一种分泌蛋白，干扰素基因表达后需要在真核细胞的内质网和高尔基体进行加工才能形成具有特定结构的蛋白质，大肠杆菌没有内质网和高尔基体，表达出的干扰素结构与甲、乙两条途径表达出的干扰素结构不同，D错误。]
4.B　[本题中基因探针是指用放射性同位素或荧光分子标记的与目的基因互补的核酸序列，利用碱基互补配对原则，检测目的基因是否导入受体细胞的DNA中。]
5.C　[p和q杂交过程中，双链区域会有氢键形成，但不会形成磷酸二酯键，A错误；p和q片段能够杂交是因为两单链的碱基可以互补配对，B错误；斑点印迹杂交技术是将目的基因片段用放射性同位素或荧光进行标记，与受体细胞的基因组DNA进行杂交，如果目的基因整合到受体细胞上，那么标记的目的基因片段就会与其结合，通过放射性自显影技术就可以检测出整合有目的基因的受体细胞，所以该技术可以显示原培养基中含目的基因的菌落位置，C正确；斑点印迹杂交是一种简单的DNA分子杂交技术，该技术可以检测目的基因的导入和转录，但无法用于检测目的基因是否在受体细胞中成功表达，检测目的基因是否在受体细胞中表达常用抗原－抗体杂交法，D错误。]
6.B　[检测转基因棉是否导入基因At7，可采用DNA分子杂交法，需要一段能与基因At7互补的短单链核酸引物，A正确；检测转基因棉中的基因At7是否转录出mRNA，可采用分子杂交技术，其原理是DNA半保留方式复制，B错误；基因表达包括转录和翻译，检测到转基因棉表达出At7蛋白，说明转基因棉中成功导入了基因At7并能表达，C正确；个体水平检测转基因棉是否抗黄萎病，可接种黄萎病的病原体到转基因棉植株上，D正确。]
7.D　[重组质粒的构建需要限制性内切核酸酶和DNA连接酶参与，DNA聚合酶一般用于DNA复制过程，A错误；③侵染植物细胞后，重组Ti质粒上的T－DNA整合到植物细胞的染色体上，B错误；如果受体细胞的染色体上含抗虫基因，只能说明抗虫基因成功整合到受体细胞的染色体上，不代表该基因就一定能成功表达，因此不能确定⑤是否表现出抗虫性状，C错误。]
8.C　[培养出的转基因羊的所有细胞中都含有该目的基因，但目的基因在受体细胞中不是成对的，只有一个，转基因羊有性生殖产生的后代发生性状分离，产生的后代可能没有目的基因，也就不能产生α1－抗胰蛋白酶，C错误。]
9.ABC　[通过PCR技术扩增NR2B基因的前提是掌握NR2B基因的两端的部分核苷酸序列，以便合成引物，A错误；改变后的NR2B基因作为目的基因，需要与载体结合后才可注入小鼠受精卵内，B错误；启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，可用于驱动基因的转录，而终止密码子位于mRNA上，与基因的翻译过程有关，C错误；可采用DNA分子杂交法检测改变后的NR2B基因是否导入小鼠体内：若出现杂交带，则可证明导入成功，D正确。]
10.CD　[转录需要RNA聚合酶，DNA聚合酶与DNA复制有关，A错误；过程①中T－DNA以双链形式整合到受体细胞的染色体DNA上，B错误；重组质粒上含有潮霉素抗性基因，可以在培养基中加入潮霉素，筛选含有重组质粒的水稻愈伤组织细胞，C正确；Luc基因表达的荧光素酶能催化荧光素产生荧光，融合基因表达的蛋白质能保留两种蛋白质各自功能，B－Luc融合基因表达，会使加入荧光素的卵细胞发出荧光，D正确。]
11.(1)标记基因　RNA聚合酶　(2)T－DNA　染色体DNA
(3)农杆菌转化法　Ca2＋　(4)抗原－抗体杂交法　个体
解析　(1)基因表达载体的构建是基因工程中的核心步骤，其组成包括：目的基因、启动子、终止子、标记基因等，启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位。(2)Ti质粒上有T－ DNA，可用Ti质粒作为载体，它能将Bt毒蛋白基因整合到棉花细胞的染色体DNA上。(3)将Bt毒蛋白基因导入棉花细胞内常采用农杆菌转化法。将基因表达载体转入农杆菌，首先必须用Ca2＋处理农杆菌，使农杆菌成为感受态细胞。(4)检测Bt毒蛋白基因在抗虫棉中是否成功表达，在分子水平上的检测方法是抗原－抗体杂交法；要确定抗虫棉是否具有抗虫特性，还需要进行个体水平的鉴定。

展开更多......

收起↑