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热点三 新型基因编辑工具PASTE，实现定点插入超大片段基因
【命题热点】
CRISPR-Cas9基因编辑系统，是由Cas9酶（负责切割DNA双链）和gRNA（负责识别和靶向目标基因组特定位点）组成，gRNA引导Cas9到达基因组的特定位点并指导Cas9切割DNA双链。当Cas9和靶向致病基因的gRNA被递送到细胞中时，会切割致病基因的特定位点，造成DNA双链断裂（DSB），细胞随后启动DNA修复过程，但这种修复过程会出现错误，从而实现对致病基因的敲除。
如果在Cas9切断DNA双链时，同时递送一段DNA模板，细胞在修复过程中就可能将这段DNA模板整合进基因组。但这一过程依赖于DNA双链断裂，这可能会导致有害的染色体缺失、重排、碎裂等等。而且这一过程通常只在分裂细胞中起作用，因为不分裂细胞没有活跃的DNA修复过程。
该研究调的希望能开发出一种新工具，能够在不不引起DNA双链断裂的情况下，去除并替换有缺陷的基因。为了实现这一目标，他们将目光放在了整合酶上，这是一类来自病毒（噬菌体）的酶家族，噬菌体利用整合酶将自己的基因组插入到宿主细菌基因组中。
PASTE——粘贴
在这项研究中，研究团队专注于丝氨酸整合酶，它可以插入大片段DNA序列，最长可达5万个碱基对。这些整合酶的目标是被称为附着位点的特定基因组序列，它起着“着陆垫”的作用。当整合酶在宿主基因组中找到正确的附着位点时，就会与之结合，然后将携带的DNA片段整合进去。然而，将这些整合酶应用于人类基因治疗很有挑战性，因为它们在基因组上的附着位点很特定，很难对整合酶进行重编程以定位到其他位点。
Omar Abudayyeh、Jonathan Gootenberg 团队意识到，CRISPR-Cas9能够靶向特定位点，将其与整合酶结合，有望实现可编程的大片段基因插入。
基于上述想法，研究团队开发了一种名为PASTE（Programmable Addition via Site-specific Targeting Elements）的新工具。该新工具包含Cas9切口酶（只切断DNA一条链，而不造成DNA双链断裂），它在gRNA的引导下切割特定基因组位点，此时Cas9切口酶融合的逆转录酶将整合酶所需的附着位点序列整合进切割位点。通过这种方式，就可以将整合酶所需的附着位点插入基因组中的任何位置，而且这种插入不引起DNA双链断裂，此时，整合酶就可以与附着位点结合，将大片段DNA序列插入。
注：Programmable Addition via Site-specific Targeting Elements（基于位点特异性靶向元件的可编程添加），简称PASTE，PASTE这个词本身有粘贴、插入的意思
Jonathan Gootenberg 表示，这项研究是实现可编程的DNA大片段插入梦想的一大步，通过这一技术可以很容易地根据需要定制附着位点和整合DNA片段。
从上述技术原理来看，PASTE很容易让人想到刘如谦团队开发的先导编辑（Prime Editor），在先导编辑的Cas9切口酶和逆转录酶的基础上融合了丝氨酸整合酶，相当于使用先导编辑先在基因组中插入丝氨酸整合酶的附着位点，然后通过丝氨酸整合酶来插入大片段DNA。
刘如谦团队于2021年12月在 Nature Biotechnology 期刊发表了题为：Programmable deletion, replacement, integration and inversion of large DNA sequences with twin prime editing 的研究论文。
刘如谦团队开发了升级版的先导编辑（Prime Editor），将其命名为——双先导编辑（Twin Prime Editing，TwinPE）。TwinPE同样不会导致DNA双链断裂，通过一个先导编辑蛋白（prime editor protein）和两个向导RNA（pegRNA），可实现对人类基因组的可编程的大片段DNA的删除、替换、整合和倒位。
实现大片段DNA的定点插入
在这项研究中，研究团队使用PASTE技术将DNA片段插入了包括肝细胞、T细胞和淋巴母细胞等人类细胞中，研究团队测试了13个不同的DNA片段，其中包括一些具有治疗意义的基因，能够将它们插入到基因组中的9个不同位点。
在人类细胞中，PASTE将DNA片段成功插入基因组的效率在5%-60%之间，而且很少在插入位点引入不需要的Indel（插入或缺失突变）。Omar Abudayyeh 表示，很少看到Indel，是因为PASTE没有造成DNA双链断裂，因此不必担心染色体重排或染色体缺失等潜在副作用。
研究团队还在“人源化”的小鼠模型中进行了测试，他们发现，PASTE能够在这些小鼠肝脏中插入基因。这些小鼠的肝脏由大约70%的人类肝细胞组成，而PASTE成功地将新基因整合到2.5%的这些细胞中。
在这项研究中，研究团队最长插入了36000个碱基对的DNA序列，但他们表示还可以更长。人类基因的碱基对从几百个到200多万个不等，但在治疗中只需要使用其中编码蛋白质的序列，也就是外显子序列即可，这大大减少了所需插入的DNA片段的大小。
2022年10月，弧光研究所（Arc Institute）的 Patrick Hsu 团队在 Nature Biotechnology 期刊发表了题为：Systematic discovery of recombinases for efficient integration of large DNA sequences into the human genome 的研究论文。该研究开发了一种算法识别了数千种丝氨酸整合酶及其DNA附着位点，将已知丝氨酸整合酶的多样性扩大了100倍。这些整合酶可以将超过7kb的大型DNA片段精准、高效地插入人类基因组。
大量识别新的丝氨酸整合酶及其附着位点是利用整合酶进行大片段DNA插入的一种思路，但是绝大部分的丝氨酸整合酶对人类细胞而言是有毒的，这就导致了发现的大部分新的丝氨酸整合酶是不可用的。因此，人为向基因组导入附着位点的方式，能够几乎在基因组的任何位置利用丝氨酸整合酶插入大片段DNA。
这种新工具有望用于治疗由大量突变的缺陷基因引起的疾病，例如囊性纤维化。论文共同通讯作者 Omar Abudayyeh 表示，这项研究是朝着基因治疗最初应该做的方向努力，也就是替换基因，而不仅仅是修正单个突变。
据悉，Omar Abudayyeh、Jonathan Gootenberg 于2021年创立了一家名为 Tome Biosciences 的生物技术公司。研究团队正在进一步探索使用PASTE技术来替换有缺陷的囊性纤维化基因的可行性，此外，该技术可以用于治疗许多由基因突变引起的疾病，例如血友病、G6PD缺乏症、亨廷顿舞蹈症等等。
对于大片段DNA的插入或替换而言，CRSIPR-Cas9可能并不是很好的工具，自然界中大量的可移动遗传元件，能够从中不断发现有趣、有用的新工具，是未来值得探索的方向。
总的来说，这些研究实现了在分裂和非分裂细胞中的高效、定点的大片段DNA插入，大大扩展了基因编辑的范围，为复杂基因缺陷疾病的治疗提供了新的工具，同时也为CAR-T等细胞疗法提供了新的工具。
【热点练习】
1.研究发现，鱼体内用于去除RNA甲基化修饰的m6A去甲基化酶FTO，可擦除NOD基因的mRNA甲基化修饰，避免mRNA被YTHDF2蛋白质识别并降解，从而提高鱼类的抗病能力。下列叙述正确的是( )
A.mRNA的甲基化修饰不会改变其碱基序列和相应的表型
B.提高NOD基因的mRNA甲基化水平会抑制NOD基因的表达
C.饲喂适量的FTO蛋白抑制剂有助于提高鱼类的抗病能力
D.甲基化会使RNA聚合酶结合起始密码子的过程受到干扰
2.β地中海贫血（简称“β地贫”）是一种由于基因突变导致的血红蛋白合成障碍引起的遗传病。血红蛋白由2条α肽链和2条β或γ肽链组成，α肽链基因（用A表示）位于16号染色体，β和γ肽链基因（分别用B、D表示）均位于11号染色体。正常人出生后D基因停止表达而B基因开始表达，DNA甲基转移酶（DNMT）在此过程中发挥关键作用（如图1）。β地贫患者甲的症状明显比其他患者轻，研究人员对此开展研究，结果如图2。下列叙述错误的是( )
A.A和B基因的遗传遵循自由组合定律
B.正常人D基因关闭表达的原因可能是DNMT催化D基因的启动子甲基化
C.甲的症状较轻可能是D基因发生了去甲基化导致γ肽链表达量增高所致
D.可利用基因组编辑技术转入DNMT基因或增强DNMT的活性来治疗β地贫
3.近年诞生的具有划时代意义的CRISPR/Cas9基因编辑技术可简单、准确地进行基因定点编辑。其原理是由一条单链向导RNA引导核酸内切酶Cas9到一个特定的基因位点进行切割。通过设计向导RNA中20个碱基的识别序列，可人为选择DNA上的目标位点进行切割(见图)。下列相关叙述错误的是( )
A. Cas9蛋白由相应基因指导在核糖体中合成
B. 向导RNA中的双链区遵循碱基配对原则
C. 向导RNA可在逆转录酶催化下合成
D. 若α链剪切点附近序列为…TCCACAATC…，则相应的识别序列为…UCCACAAUC…
4.我国科学家利用基因编辑技术，从杂交稻春优84中同时敲除PAIRI、REC8、OSDI和MTL四个内源基因，获得了可以发生无融合生殖的水稻材料，无融合生殖是不通过受精作用而产生种子的生殖方式，这意味着水稻杂交种未来或可留种。PAIRI基因被破坏，同源染色体不能进行配对；REC8基因被破坏，姐妹染色体提前分离；OSDI基因被破坏，细胞不能进行第二次分裂；MTL基因被破坏，雄配子中的染色体消失。下列分析错误的是( )
A.基因突变具有低频性，诱导PAIRI、REC8和OSDI基因同时突变的难度较大
B.同时破坏PAIRI、REC8和OSDI基因，得到的配子染色体数目与亲本体细胞染色体数目不同
C.PAIRI基因的产物在减数分裂Ⅰ前期发挥作用
D.若某二倍体水稻植株仅发生MTL基因突变，该植株自交，则其子代高度不育
5.转录后调控包括前体RNA的加工、RNA编辑等。前体RNA的加工是指对DNA的转录产物，即核内不均一RNA(hnRNA)，进行加帽、剪接等操作，使之变成成熟的信使RNA(mRNA)的过程；RNA编辑能够对mRNA的编码序列进行改动，使得同一个基因可以编码出含有不同氨基酸序列的蛋白质。下列说法错误的是( )
A.hnRNA以DNA的一条链为模板转录而来
B.RNA编辑后基因的遗传信息发生改变
C.只有剪切掉hnRNA的非编码序列才能形成成熟的mRNA
D.RNA编辑使遗传信息在RNA水平发生改变
6.CRISPER/Cas9基因编辑技术是由一条单链向导RNA引导核酸内切酶Cas9到一个特定的基因位点进行准确切割的技术，CRISPR off是一种可编程的表观遗传“记忆书写器”，它由切割活性丧失的Cas9蛋白和DNA甲基转移酶融合而成。为研究CRISPR off系统是否适用于治疗重大疾病，研究人员决定在神经元上进行测试——通过CRISPR off实现神经元中Tau蛋白表达的降低(Tau蛋白会在大脑中形成“缠结”，进而导致记忆丧失和阿尔茨海默症的其他症状)。下列相关叙述错误的是( )
A.表观遗传是不依赖于DNA序列变化的遗传现象
B.表观遗传现象比较常见，普遍存在于生物体的生长、发育和衰老的整个生命过程中
C.DNA甲基转移酶对Tau蛋白基因的作用是抑制该基因表达
D.CRISPR off系统对基因进行甲基化后的性状改变，一定能遗传给后代
7.基因编辑技术是当前生命科学和生物医学等领域研究的热点，它通过修饰基因而改变基因的表达。如图表示细胞内基因表达过程，其中过程M称为( )
A.复制 B.转录 C.翻译 D.逆转录
8.RNA编辑是指在mRNA水平上改变遗传信息的过程。RNA编辑常见于mRNA在编码区发生碱基的替换，或增减一定数目的核苷酸。下列相关叙述正确的是( )
A.RNA编辑发生时，mRNA可能会出现碱基由胸腺嘧啶替换为腺嘌呤的情况
B.mRNA的编码区内增减一定数目的核苷酸会改变一个密码子的碱基数量
C.若碱基发生替换，则翻译时多肽链的氨基酸数目不会发生改变
D.RNA编辑可以在不改变基因组的前提下，增加细胞内蛋白质的多样性
9.无融合生殖是不通过受精作用而产生种子的生殖方式。研究表明，参与水稻减数分裂的PAIR1、REC8和OSD1三个基因同时突变后，植株的减数分裂将转变成类似有丝分裂的过程。我国科学家利用基因编辑技术，从杂交稻春优84中同时敲除PAIR1、REC8、OSD1和MTL四个基因，获得了可以发生无融合生殖的水稻材料，这意味着水稻杂交种未来或可留种。下列分析错误的是( )
A.无融合生殖属于无性繁殖方式，可以将水稻的杂种优势保留下来
B.基因突变具有低频性，诱导PAIR1、REC8和OSD1基因同时突变的难度较大
C.水稻细胞中，MTL基因可能与减数分裂的正常进行有关
D.从杂交稻春优84中敲除基因需要用到限制酶和DNA聚合酶
10.2020年诺贝尔化学奖颁给了两位在基因编辑技术方面做出贡献的女科学家，表彰她们开发了基因技术中最锐利的工具之一（CRISPR/Cas9“基因剪刀”）。CRISPR/Cas9系统主要包含向导RNA和Cas9蛋白两个部分，向导RNA能识别并结合特定的DNA序列，从而引导Cas9蛋白结合到相应位置并剪切DNA，最终实现对靶基因序列的编辑，其工作原理如图所示。下列说法错误的是( )
A.CRISPR/Cas9系统可应用于对人类遗传病的治疗
B.Cas9蛋白的功能类似于基因工程中DNA连接酶的作用
C.向导RNA识别序列发生错配可能会导致基因被错误剪辑
D.向导RNA能通过碱基互补配对形成DNA-RNA杂合双链
答案以及解析
1.答案：B
解析：A、mRNA的甲基化不会改变自身碱基序列，但可能会影响翻译过程，从而改变生物的表型，A错误；
B、提高NOD基因mRNA的甲基化水平升高会抑制NOD基因的翻译，B正确；
C、给鱼类饲喂适量的FTO蛋白抑制剂，则FTO蛋白不能发挥作用，即FTO蛋白不能擦除N基因mRNA的甲基化修饰，导致被Y蛋白识别并降解的mRNA量增加，从而降低了鱼类的抗病能力，C错误；
D、起始密码子存在于mRNA上，RNA聚合酶结合的是DNA上的启动部位，D错误。
故选B。
2.答案：D
解析：由题干信息可知，A和B基因位于非同源染色体上，遵循自由组合定律，A叙述正确。由题图1可推知，正常人D基因关闭表达的原因可能是DNMT催化D基因的启动子甲基化，B叙述正确。由题图2可知，甲的γ肽链表达量增高，可能是D基因发生了去甲基化，从而使得其症状较轻，C叙述正确。综合题图1、2信息可推知，可利用基因组编辑技术去除DNMT基因或降低DNMT的活性来治疗β地贫，D叙述错误。
3.答案：C
解析：本题考查DNA与RNA的分子结构以及碱基互补配对原则,意在考查考生的理解能力和分析推理能力。Cas9蛋白的合成场所是核糖体,A项正确;在向导RNA中的双链区存在碱基互补配对,遵循碱基互补配对原则,B项正确;RNA不是在逆转录酶催化下合成的,而是经转录产生的,C项错误;依据减基互补配对原则,若α链剪切位点附近序列为……TCCAGAATC……,则与向导RNA中的识别序列配对的另一条链的碱基序列是……AGGTCTTAG……,故向导RNA中的识别序列是……UCCAGAAUC……,D项正确。
4.答案：B
解析：基因突变具有低频性，诱导PAIRI、REC8和OSDI基因同时突变的难度较大，A正确；同时破坏水稻细胞中的PAIRI、REC8和OSDI基因，产生配子的过程相当于进行了一次有丝分裂，得到的配子染色体数目与亲本体细胞染色体数目相同，B错误；PAIRI基因被破坏后，不能进行联会，故可推测该基因的产物在减数分裂Ⅰ前期发挥作用，C正确；若某二倍体水稻植株仅发生MTL基因突变，则产生的雌配子中只有1个染色体组且雄配子中染色体消失，故该植株自交，其子代为单倍体，高度不育，D正确。
5.答案：B
解析：由题意可知，hnRNA是DNA的转录产物，故hnRNA是以DNA的一条链为模板转录而来的，A说法正确；遗传信息蕴藏在DNA的4种碱基排列顺序中，基因是具有遗传效应的DNA片段，RNA编辑只是对mRNA的编码序列进行改动，基因的遗传信息并没有发生改变，B说法错误；由题意可知，hnRNA需要经过加帽、剪接等操作才能变成成熟的mRNA，C说法正确；根据中心法则可知，转录使遗传信息从DNA流向RNA，RNA编辑能够对mRNA的编码序列进行改动，使遗传信息在RNA水平上发生改变，D说法正确。
6.答案：D
解析：生物体中基因的碱基序列保持不变，但基因表达和表型发生可遗传变化的现象，叫作表观遗传，故表观遗传不依赖于DNA序列变化，A正确；表观遗传现象比较常见，普遍存在于生物体的生长、发育和衰老的整个生命过程中，B正确；由题干可知，DNA甲基转移酶对Tau蛋白基因的影响是降低了Tau蛋白表达，因此该酶抑制了Tau蛋白基因的表达，C正确；CRISPRoff系统对基因进行甲基化后的性状改变，若发生在体细胞内是不能遗传给后代的，D错误。
7.答案：B
解析：细胞内基因表达过程包括转录和翻译，由题图分析可知，M过程是以DNA为模板合成RNA的过程，因此M是转录过程，N是翻译过程，B正确。
8.答案：D
解析：本题主要考查基因的表达，考查学生的理解能力和获取信息的能力。mRNA中没有胸腺嘧啶，不会出现胸腺嘧啶替换为腺嘌呤的情况，A错误。mRNA的编码区内增减一定数目的核苷酸不会改变一个密码子的碱基数量，B错误。若碱基发生替换，则翻译时多肽链的氨基酸数目有可能会发生改变，例如，若碱基发生替换后，将原来编码某氨基酸的密码子转变为终止密码子，则翻译就会提前结束，多肽链的氨基酸数目会减少，C错误。RNA编辑可以在不改变基因组的前提下，改变mRNA的碱基序列，不同碱基序列编码不同的氨基酸，从而增加细胞内蛋白质的多样性，D正确。
9.答案：D
解析：无融合生殖不通过受精作用繁殖后代，属于无性繁殖，后代不会发生性状分离，可以将水稻的杂种优势保留下来；基因突变具有低频性，诱导PAIR1、REC8和OSD1基因同时突变的难度较大，因此科学家另辟蹊径，采用基因编辑技术敲除相关基因获得可发生无融合生殖的水稻材料用于后续研究；敲除PAIR1、REC8、OSD1和MTL四个基因，获得了可以发生无融合生殖的水稻，即水稻的减数分裂转变成类似有丝分裂的过程，由此推测MTL基因可能与减数分裂的正常进行有关；利用基因编辑技术敲除基因需要用到限制酶，恢复敲除基因后的DNA片段需要用DNA连接酶。
10.答案：B
解析：本题考查基因工程的工具及应用。根据题意分析可知， CRISPR/Cas9系统最终能实现对靶基因序列的编辑，故可利用该技术对因基因序列出错而导致的遗传病进行修正治疗，A正确；由题干信息“向导RNA能识别并结合特定的DNA序列，从而引导Cas9蛋白结合到相应位置并剪切DNA”，说明Cas9蛋白的功能类似于基因工程中限制酶的作用，B错误；CRISPR/Cas9基因编辑技术有时存在编辑对象出错而造成错误剪辑的情况，其原因是其他DNA序列也含有与向导RNA互补的序列，可能造成向导RNA发生错配而出现错误剪辑，C正确；向导RNA能识别并结合特定的DNA序列，该序列通过碱基互补配对形成DNA-RNA杂合双链，D正确

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