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第一章 发酵工程
第一节 微生物的培养需要适宜条件
素养目标
根据微生物的代谢类型分析培养基的组成。
科学思维
说出灭菌，消毒和防腐的区别，尝试配制培养基。
科学探究
教学重难点
阐明在发酵工程中灭菌是获得纯净的微生物培养物的前提。
阐明无菌技术是在操作过程中，保持无菌物品与无菌区域不被微生物污染的技术。
课程导入
腐乳是怎样做出来的？古代人们是怎样发现的呢？
微生物
人们对所有形体微小、肉眼不可见的生物的统称。
无细胞结构生物
原核生物
真核生物
病毒：SARS病毒、新冠病毒等RNA病毒；T2噬菌体等DNA病毒。
细菌：蓝细菌、大肠杆菌、乳酸菌等；
放线菌：衣氏放线菌等。
真菌：酵母菌、毛霉等；原生生物：草履虫、变形虫等。
培养基
实验室培养微生物的条件
①要为人们需要的微生物提供合适的营养和环境条件；
②需要除掉与目标微生物具有竞争和寄生关系的异种微生物。
——培养基
——无菌技术
培养基为目标微生物提供适宜的生长环境
概念
人们为满足微生物生长繁殖或积累代谢产物的需要而配制的混合养料。
固体培养基
液体培养基
有无 凝固剂琼脂
培养基为目标微生物提供适宜的生长环境
不同微生物生长所需的培养基成分有差别。
细菌喜荤，霉菌喜素
细菌培养基：含有较高的有机氮，常用蛋白胨和酵母提取物等配制；中性偏碱
霉菌培养基：常用可溶性淀粉加无机物配制，或用添加蔗糖的豆芽汁等配制；中性偏酸
细菌喜碱，霉菌喜酸
培养基为目标微生物提供适宜的生长环境
按化学成分
合成培养基：成分明确；
天然培养基：成分不明确；用于工业生产。
合成培养基：化学成分完全清楚的培养基，一般用于实验室。
天然培养基：成分还不十分清楚或成分不恒定的天然有机物制成的培养基。成本较低，多被用于大规模的生物发酵工业。
培养基为目标微生物提供适宜的生长环境
按功能划分
鉴别培养基：
①加入青霉素的培养基：分离酵母菌、霉菌等真菌
②不加氮源的无氮培养基：分离固氮菌
③不加含碳有机物的无碳培养基：分离自养型微生物
①加入伊红美蓝的培养基：鉴别大肠杆菌
②加入刚果红的培养基：鉴别纤维素分解菌
——将某种类微生物从混杂的微生物群体中分离出来。
选择培养基：
——用于鉴别不同类型的微生物
培养基为目标微生物提供适宜的生长环境
成分
成分 作用 主要来源
碳源 主要作能源物质 无机碳(CO2)
或有机碳(糖类)
氮源 合成蛋白质等有机物 N2,NH3,铵,硝酸盐,
尿素,牛肉膏,蛋白胨
无机盐 调节渗透压等 NaCl,CaCl2等
水 作为溶剂
生长因子 调节促生长 维生素,氨基酸,碱基等
培养基为目标微生物提供适宜的生长环境
类型总结
标准 培养基种类 培养基特点 作用
物理性质 固体培养基 加凝固剂，如琼脂 微生物的分离与鉴定，活菌计数，保藏菌种
半固体培养基 容器放倒不致流出，剧烈震动则破散 观察微生物的运动、分类鉴定
液体培养基 不加凝固剂 常用于工业生产
功能 选择培养基 根据某种微生物的特殊营养要求配置 选择分离
鉴别培养基 加入能与目的菌的代谢产物发生显色反应的指示剂 鉴定
成分来源 天然培养基 含化学成分不明确的天然物质 工业生产
合成培养基 用已知的化学物质配制 分类鉴定
灭菌和无菌操作技术可以排除目标微生物的干扰
芽孢
有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体。芽孢的壁很厚，对干旱、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。芽孢又小又轻，可以随风飘散。当环境适宜的时候，芽孢又可以萌发，形成一个细菌。
条件较温和，能杀死微生物的繁殖体，但不能杀死芽孢等全部微生物。
消毒
说出灭菌，消毒和防腐的区别，尝试配制培养基。
灭菌
灭菌和无菌操作技术可以排除目标微生物的干扰
常用的消毒方法
接种室、接种箱或超净工作台可用紫外线照射30min
100℃煮沸5-6 min
62-65℃下煮30 min或80-90℃处理30s-1min
用75%酒精、新洁尔灭等进行皮肤消毒；氯气消毒水源等
煮沸消毒
巴氏消毒
化学药剂消毒
紫外线消毒
灭菌和无菌操作技术可以排除目标微生物的干扰
常见的灭菌方法
定义：利用沸水、流通蒸汽或高压蒸汽进行灭菌。高压蒸汽灭菌效果最好，100 kPa、121℃下维持15-20 min，常用于培养基、无菌水等的灭菌。
原理：高温蒸汽破坏蛋白质、核酸等结构使其变性
优点：操作简便，效果可靠，可以杀灭所有的生物，包括最耐热的某些微生物的休眠体。基本保持培养基的营养成分不被破坏。
对象：培养基等
湿热灭菌
灭菌和无菌操作技术可以排除目标微生物的干扰
定义：160-170℃下加热2-3h。常用于玻璃器皿和金属器具。
原理：使微生物细胞膜破坏、蛋白质变性和原生质干燥等
对象：耐高温，需保持干燥的物品，适用于
玻璃器皿 (如试管、培养皿、吸管、注射器)
金属器具 (如针头、 镊子、剪刀等)的灭菌
干热灭菌
常见的灭菌方法
灭菌和无菌操作技术可以排除目标微生物的干扰
常用于接种环、接种针、试管口等的灭菌。
原理：使微生物燃烧
对象：接种工具如接种环、接种针，以及接种过程中的试管口或瓶口等易被污染部位。
灼烧灭菌
常见的灭菌方法
灭菌和无菌操作技术可以排除目标微生物的干扰
涂布器
接种环
灭菌和无菌操作技术可以排除目标微生物的干扰
消毒和灭菌总结
类型 适用范围 操作方法
消 毒
灭 菌
较为温和理化方法，杀死部分微生物（不包括芽孢、孢子）
强烈的理化方法，杀死所有微生物（包括芽孢、孢子）
煮沸消毒法
日常生活
100 ℃煮沸5～6 min
巴氏消毒法
不耐高温的液体
62～65 ℃煮30 min或80-90 ℃煮30s-1 min
化学药剂
生物活体、水源等
擦拭等,如用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源
紫外线
紫外线照射30 min
灼烧灭菌
接种的金属工具、接种时用的试管口或瓶口等
直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧
干热灭菌
耐高温、需要保持干燥的物品，如玻璃器皿和金属用具等
物品放入干热灭菌箱,160～170 ℃加热2～3h
湿热灭菌
培养基、培养皿等,生产和实验室常用
高压蒸汽灭菌锅内,100 kPa,温度121 ℃,15～30 min
接种室、接种箱，超净工作台
灭菌和无菌操作技术可以排除目标微生物的干扰
配制可用于培养酵母菌的马铃薯蔗糖培养基
目的要求:配制液体培养基和固体培养基。
材料用具:马铃薯、蔗糖、琼脂、天平、试管、烧杯、三角瓶、培养皿、封口膜(或纱布)、牛皮纸或报纸、橡皮筋、小刀、高压灭菌锅、玻璃漏斗、移液器等。
马铃薯蔗糖培养基配方
去皮马铃薯丝 20g
蔗糖 2g
琼脂 1.5-2g
将上述物质溶解后，用蒸馏水定容至100mL
灭菌和无菌操作技术可以排除目标微生物的干扰
配制可用于培养酵母菌的马铃薯蔗糖培养基
方法步骤
计算：根据配方计算出所需的马铃薯、蔗糖和琼脂的用量
配制20%马铃薯浸汁：去皮→称重→切块→加水→煮沸→过滤加入蔗糖→定容
制备斜面、固体、液体培养基：
液体培养基：将马铃薯浸汁分装→灭菌
斜面培养基：在马铃薯浸汁中加入琼脂→加热溶化→分装到试管→灭菌后摆成斜面
固体培养基：将剩余的培养基分装到三角瓶中，封口→灭菌→倒平板（平板培养基）
灭菌和无菌操作技术可以排除目标微生物的干扰
配制可用于培养酵母菌的马铃薯蔗糖培养基
注意事项
制作斜面培养基和固体培养基时要注意控制好温度，防止培养基提前凝固。
斜面培养基试管中的液体量约为试管长度1/4(5-8mL)
培养基需要经高压蒸汽灭菌(1kg/cm2、121℃下灭菌20min)
棉塞的长度要保证既能塞住瓶口，在瓶口外又要留有一定的长度，方便接种时用无名指、小拇指取下来；粗细也要适当，以不易脱落为度。
制作棉塞应该使用普通棉花，不能使用医用的脱脂棉，防止脱脂棉吸水后引起污染.
灭菌和无菌操作技术可以排除目标微生物的干扰
配置20％马铃薯浸汁液
灭菌和无菌操作技术可以排除目标微生物的干扰
固体培养基（平板）
加入琼脂，加热融化
高压蒸汽灭菌
灭菌和无菌操作技术可以排除目标微生物的干扰
（三）斜面
摆斜面
加入琼脂，加热融化
分装
高压蒸汽灭菌
课堂练习
1.下列有关培养基配制的描述，正确的是（ ）
A.营养物质含量越多，微生物的生长繁殖越快
B.任何培养基都必须含有碳源、氮源、水、无机盐等成分
C.培养基是依据人们的需求，配制出的供微生物生长繁殖的营养基质
D.微生物的生长除受营养因素影响外，还受到pH、渗透压等影响
D
解析：培养基中的营养物质需要控制一定的含量和比例，营养物质含量太多会导致培养基渗透压过高，从而抑制微生物的生长，A错误；培养基不一定含有碳源、氨源，如培养自养型微生物的培养基不需加碳源，分离自生固氮菌的培养基不需加氮源，B错误；培养基是人们为满足微生物生长繁殖或积累代谢产物的需求而配制的混合养料，C错误；微生物的生长除受营养因素影响外，还受到pH、氧气、渗透压等的影响，D正确。
课堂练习
2.无菌技术是微生物培养中的关键技术之一，内容主要包括消毒和灭菌。下列关于无菌技术的叙述，错误的是（ ）
A.生物消毒法可以杀死物体内部包括芽孢和孢子在内的所有微生物
B.常用的消毒方法主要包括煮沸消毒、化学药物消毒、紫外线消毒等
C.常用的灭菌方法主要包括干热灭菌、湿热灭菌、灼烧灭菌等
D.为避免周围环境中微生物的污染，消毒灭菌后的操作应在超净工作台进行
A
解析：生物消毒法比较温和，只能除去部分微生物，A错误。
课堂练习
3.下列有关微生物培养基种类及配制原则的表述，正确的是（ ）
A.任何培养基都必须含有碳源、氮源、水、无机盐及琼脂
B.液体培养基可用于观察菌落，固体培养基可用于工业生产
C.微生物的生长除受营养因素影响外，还受到pH、O2、渗透压等的影响
D.培养霉菌时一般需将培养基的pH调节到中性或微碱性
A
解析：培养基一般都含有碳源、氮源、水和无机盐，固体、半固体培养基含有琼脂，而液体培养基不含琼脂， A错误；一般固体培养基可用于观察菌落，液体培养基可用于工业生产，B错误；微生物的生长除受营养因素影响外，还受到pH、O2、渗透压等的影响，C正确；培养霉菌时一般需将培养基的pH调至酸性，D错误。
课堂练习
3.在生产生活和科研中，经常通过无菌技术避免杂菌的污染。下列叙述正确的是（ ）
A.通过消毒或灭菌，可杀死所有的微生物，包括孢子和芽孢
B.接种环、涂布器等接种用具的灭菌方式只有灼烧灭菌
C.为避免污染，接种等操作尽量在超净工作台上并在酒精灯火焰附近进行
D.对于牛奶等不耐高温的液体，一般采用紫外线照射法进行消毒
C
解析：只有通过灭菌，才可以将所有的微生物，包括孢子和芽孢都杀死，A错误；接种环、涂布器等接种用具除了灼烧灭菌外，也可用高压蒸汽灭菌，B错误；为避免环境污染，接种等操作尽量在超净工作台上并在酒精灯火焰附近进行，超净工作台台面每次实验前要用75%酒精擦拭，然后紫外线消毒30min,C正确；对于一些不耐高温的液体，如牛奶，一般采用巴氏消毒法，D错误。
总结归纳
培养基的类型
培养基的营养物质
常用的消毒方法
常用的灭菌方法
微生物的培养需要适宜条件
培养基
无菌技术
煮沸消毒
巴氏消毒
化学药剂消毒
紫外线消毒
湿热灭菌
干热灭菌
灼烧灭菌
基本成分：碳源、氮源、水、无机盐
特殊需求：维生素（如乳酸杆菌）、碱基等
按物理性质划分
按组成成分划分
按功能划分

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