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第一节　基因工程赋予生物新的遗传特性
第1课时　基因工程的工具酶和载体及DNA的粗提取和鉴定
[学习目标]　1.概述基因工程的建立过程。2.说明基因工程工具酶和载体的作用。3.尝试DNA的粗提取和鉴定。
一、基因工程的建立过程、基因工程工具酶和载体的作用
1．基因工程是在多个生物学分支学科的基础上发展而来(基因工程的理论基础)
2．对DNA进行剪切、连接和复制是实现重组DNA技术的基础
(1)限制性内切核酸酶(对DNA分子进行剪切)
提醒　细菌等微生物细胞内含有的限制酶能破坏外源DNA，“限制”病毒在细菌内的寄生，限制酶的保护作用是细菌等微生物进化出的一种防御机制。
(2)DNA连接酶(对DNA分子进行连接)
(3)载体(外源DNA片段借助载体可在受体细胞内进行复制)
判断正误
(1)自然界中不同生物共用一套遗传密码(　　)
(2)不同的限制酶有不同的识别序列和切割位点(　　)
(3)不同的限制酶识别的序列均为6个核苷酸对(　　)
(4)DNA连接酶都能连接两个黏性末端和两个平末端(　　)
(5)质粒是双链环状DNA分子，是一种常用载体(　　)
(6)载体能与外源DNA相连并将其送入受体细胞进行扩增(　　)
任务一：基因工程的理论基础
1．为什么不同生物的DNA分子能拼接起来？
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
2．为什么一种生物的基因可以在另一种生物细胞内表达？
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
任务二：限制酶
1．请结合限制酶的作用特点，回答以下问题：
(1)限制酶能切开RNA分子的磷酸二酯键吗？为什么？
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
(2)请结合如图图示，推测限制酶(该限制酶只产生黏性末端)剪切一次后可形成多少个游离的磷酸基团？几个黏性末端？消耗几分子水？
________________________________________________________________________
2．请写出下列限制酶剪切形成的黏性末端，并思考不同限制酶剪切产生的黏性末端是否相同？
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
3．图示黏性末端是由几种限制酶作用产生的？
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
4．推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么？为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA分子？
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
任务三：DNA连接酶
1．请比较DNA连接酶和DNA聚合酶并完成下表。
种类 DNA聚合酶 DNA连接酶
不同点 作用实质 催化 加到已有的脱氧核苷酸片段上，形成磷酸二酯键 催化 之间形成磷酸二酯键
作用结果 催化形成与模板链互补的DNA链，形成新的双链DNA分子 催化具有互补黏性末端或平末端的DNA片段连接起来，形成重组DNA分子
模板
相同点 ①化学本质都是蛋白质； ②都是催化形成磷酸二酯键
2.DNA片段经限制酶处理后产生的相同黏性末端，再经过DNA连接酶处理后，形成的新的序列，能否再被所用的限制酶识别？
(1)若两个相同黏性末端都是由同种限制酶(EcoR Ⅰ)剪切后所得，____(填“能”或“不能”)再被所用的限制酶识别(如图所示)。
(2)若两个相同黏性末端是由不同限制酶剪切所得，一般______(填“能”或“不能”)再被所用的限制酶识别(如图所示)。
任务四：载体需具备的条件
1．载体要与外源DNA片段连接，需要具备什么条件？
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
2．要使携带的外源DNA片段在受体细胞中稳定存在，载体需要具备什么条件？
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
3．我们用肉眼看不到载体是否进入受体细胞，为了便于筛选含重组DNA分子的受体细胞，载体需要具备什么条件？
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
　与DNA相关的几种酶的比较
项目 DNA连接酶 限制酶 DNA聚合酶 解旋酶
作用部位 磷酸二酯键 磷酸二酯键 磷酸二酯键 氢键
作用对象 DNA片段 DNA 单个的脱氧核苷酸 DNA
作用结果 将两个DNA片段连接成完整的DNA分子 切割DNA分子 将单个的脱氧核苷酸连接到DNA单链末端 将双链DNA分子局部解旋为单链
1．限制酶可识别并切割DNA分子上特定的核苷酸序列。如图为四种限制酶BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ以及Bgl Ⅱ的识别序列：
箭头表示每一种限制酶的特定切割部位，其中哪两种限制酶所切割出来的DNA片段末端可以互补结合，其正确的末端互补序列为(　　)
A．BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ，末端互补序列为5′－AATT－3′
B．BamH Ⅰ和Bgl Ⅱ，末端互补序列为5′－GATC－3′
C．BamH Ⅰ和Hind Ⅲ，末端互补序列为5′－GATC－3′
D．EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ，末端互补序列为5′－AATT－3′
2．下列关于基因工程的说法，正确的是(　　)
A．限制酶可以切割DNA和RNA
B．DNA连接酶能将两个碱基通过氢键连接起来
C．载体的作用是将外源基因导入受体细胞，使之稳定存在并表达
D．限制酶断开后的DNA末端均为黏性末端
二、DNA的粗提取和鉴定
1．实验原理
2．方法步骤
判断正误
(1)DNA钠盐溶于酒精，但某些蛋白质不溶于酒精，利用这一原理，可以分离DNA钠盐与蛋白质(　　)
(2)DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同，在2 mol/L的NaCl溶液中溶解度高(　　)
(3)析出的白色絮状物的主要成分是DNA(　　)
任务五：实验原理的分析
1．能否选择哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料？鸡的红细胞呢？为什么？
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
2．实验结果说明絮状物中含有什么？
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
3．鉴定时，为什么要设置只加入二苯胺试剂的试管？
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
4．实验中充分研磨生物材料、倒入冷酒精的目的分别是什么？
________________________________________________________________________
3．如表关于“DNA的粗提取和鉴定”实验的叙述，不正确的是(　　)
选项 试剂 操作 作用
A 研磨液 与生物材料混合 提取溶解DNA
B 2 mol·L－1 NaCl溶液 与提取出的DNA混合 溶解DNA
C 预冷的酒精 加入离心后的上清液中 溶解DNA
D 二苯胺试剂 加入溶解有DNA的NaCl溶液中 鉴定DNA
4.某实验小组进行“DNA的粗提取和鉴定”实验，如图为实验流程。下列相关叙述正确的是(　　)
→→→→→
A．取材时可选用猪血、洋葱、香蕉、菜花等富含DNA的材料进行实验
B．破碎细胞时可以加入洗涤剂，能够瓦解细胞膜，但对DNA没有影响
C．提纯时在滤液中加入2 mol/L的NaCl溶液后会出现白色絮状物(DNA钠盐)
D．DNA鉴定时可通过是否加入二苯胺试剂设置对照实验来观察实验现象
答案精析
一、梳理教材新知
1．基因　新的遗传性状　表达所需要产物　传递和表达　遗传密码的破译
2．(1)细胞　双链DNA　磷酸二酯键　黏性末端　平末端
(2)DNA片段　磷酸二酯键　大肠杆菌　碱基互补　平末端　(3)质粒　复制起点　限制酶　标记基因　环状DNA分子
判断正误
(1)√　(2)√　(3)×　(4)×　(5)√　(6)√
提示　(3)限制酶识别的序列通常是4～8个核苷酸对，以6个核苷酸对最为常见。(4)E.coli DNA连接酶仅能连接黏性末端，T4 DNA连接酶既能连接黏性末端也可以连接平末端。
探究核心知识
任务一
1．(1)DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸。(2)双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构。
2．(1)基因是控制生物性状的独立遗传单位。(2)遗传信息的传递都遵循中心法则。(3)生物界共用一套遗传密码。
任务二
1．(1)限制酶不能切开RNA分子的磷酸二酯键。因为限制酶能够识别双链DNA上特定的一小段核苷酸序列，并催化其中特定的两个核苷酸之间的磷酸二酯键水解，专一对DNA起作用。
(2)形成2个游离的磷酸基团；形成2个黏性末端；消耗2分子水。
2.
不同的限制酶可能会形成相同的黏性末端，例如BamH Ⅰ 和Bgl Ⅱ。
3．是由3种限制酶作用产生的。
4．限制酶是原核生物的一种防御工具，用来剪切侵入细胞的外源DNA，以保证自身安全。含某种限制酶的细菌的DNA分子不具备这种限制酶的识别序列，或者细菌自身的DNA分子经过相应的化学修饰，使限制酶不能将其切开。
任务三
1．单个脱氧核苷酸　两个DNA片段　需要　不需要
2．(1)能　(2)不能
任务四
1．具有一种或多种限制酶的识别序列，供外源DNA片段插入其中。
2．能在受体细胞中自我复制，或整合到受体细胞DNA上，随受体细胞DNA同步复制，这样它携带的外源DNA片段才能在受体细胞中复制，不至于丢失。
3．具有标记基因，以便能够通过表型鉴别含有重组DNA分子的细胞。
落实思维方法
1．B　[限制酶切割出来的DNA片段末端若要互补结合，其黏性末端必须互补，即一种酶切的末端正向序列与另一种酶切的末端反向序列互补。由题图可知，BamHⅠ和BglⅡ酶切割出来的DNA片段末端可以互补结合，其末端互补序列为5′－GATC－3′。综上所述，B符合题意。]
2．C　[一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的位点上切割DNA分子，A错误；DNA连接酶可以将两个DNA片段通过磷酸二酯键连接起来，B错误；限制酶断开后的DNA末端既有黏性末端又有平末端，D错误。]
二、梳理教材新知
1．变性　抑制DNA酶活性　酒精　二苯胺
2．研磨液　尼龙纱布　上清液　加冷酒精　冷酒精　玻璃棒　二苯胺试剂
判断正误
(1)×　(2)√　(3)√
提示　(1)DNA钠盐不溶于酒精而某些蛋白质能溶于酒精。
探究核心知识
1．不能选择哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料。可以选择鸡的红细胞作为实验材料。因为哺乳动物成熟的红细胞没有细胞核，而鸡的红细胞有细胞核。
2．絮状物中含有DNA。
3．作为对照，排除NaCl溶液对实验结果的影响。
4．充分研磨生物材料，使细胞结构破碎，释放出核DNA；冷酒精不仅可以溶解蛋白质，而且能使DNA钠盐形成絮状沉淀物而析出。
落实思维方法
3．C　[DNA钠盐不溶于酒精而某些蛋白质能溶于酒精，利用这一原理可以将蛋白质和DNA进一步分离，C错误。]
4．B　[哺乳动物成熟的红细胞没有细胞核，不能用猪血作DNA提取的实验材料，A错误；提纯时在滤液中加入体积是滤液两倍的冷酒精，静置3～5 min，可见白色絮状物(DNA钠盐)出现，C错误；DNA鉴定时可通过是否加入DNA粗提物来设置实验组和对照组，两组都需加入二苯胺试剂来观察实验现象，D错误。](共72张PPT)
第1课时
基因工程的工具酶和载体及DNA的粗提取和鉴定
第四章 基因工程
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学习目标
1.概述基因工程的建立过程。
2.说明基因工程工具酶和载体的作用。
3.尝试DNA的粗提取和鉴定。
内容索引
一、基因工程的建立过程、基因工程工具酶和载体的作用
二、DNA的粗提取和鉴定
课时对点练
基因工程的建立过程、基因工程工具酶和载体的作用
一
1.基因工程是在多个生物学分支学科的基础上发展而来(基因工程的理论基础)
梳理　教材新知
遗传密码的破译
基因
遗传性状
新的
表达所需要产物
传递和表达
2.对DNA进行剪切、连接和复制是实现重组DNA技术的基础
(1)限制性内切核酸酶(对DNA分子进行剪切)
平末端
细胞
双链DNA
磷酸二酯键
黏性末端
提醒　细菌等微生物细胞内含有的限制酶能破坏外源DNA，“限制”病毒在细菌内的寄生，限制酶的保护作用是细菌等微生物进化出的一种防御机制。
(2)DNA连接酶(对DNA分子进行连接)
平末端
DNA片段
磷酸二酯键
大肠杆菌
碱基互补
(3)载体(外源DNA片段借助载体可在受体细胞内进行复制)
环状DNA分子
质粒
复制起点
限制酶
标记基因
(1)自然界中不同生物共用一套遗传密码(　　)
(2)不同的限制酶有不同的识别序列和切割位点(　　)
(3)不同的限制酶识别的序列均为6个核苷酸对(　　)
√
√
提示　限制酶识别的序列通常是4～8个核苷酸对，以6个核苷酸对最为常见。
×
(4)DNA连接酶都能连接两个黏性末端和两个平末端(　　)
×
提示　E.coli DNA连接酶仅能连接黏性末端，T4 DNA连接酶既能连接黏性末端也可以连接平末端。
(5)质粒是双链环状DNA分子，是一种常用载体(　　)
(6)载体能与外源DNA相连并将其送入受体细胞进行扩增(　　)
√
√
任务一：基因工程的理论基础
1.为什么不同生物的DNA分子能拼接起来？
探究　核心知识
提示　(1)DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸。
(2)双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构。
2.为什么一种生物的基因可以在另一种生物细胞内表达？
提示　(1)基因是控制生物性状的独立遗传单位。
(2)遗传信息的传递都遵循中心法则。
(3)生物界共用一套遗传密码。
任务二：限制酶
1.请结合限制酶的作用特点，回答以下问题：
(1)限制酶能切开RNA分子的磷酸二酯键吗？为什么？
提示　限制酶不能切开RNA分子的磷酸二酯键。因为限制酶能够识别双链DNA上特定的一小段核苷酸序列，并催化其中特定的两个核苷酸之间的磷酸二酯键水解，专一对DNA起作用。
(2)请结合如图图示，推测限制酶(该限制酶只产生黏性末端)剪切一次后可形成多少个游离的磷酸基团？几个黏性末端？消耗几分子水？
提示　形成2个游离的磷酸基团；形成2个黏性末端；消耗2分子水。
2.请写出下列限制酶剪切形成的黏性末端，并思考不同限制酶剪切产生的黏性末端是否相同？
提示　
不同的限制酶可能会形成相同的黏性末端，例如BamHⅠ和BglⅡ。
3.图示黏性末端是由几种限制酶作用产生的？
提示　是由3种限制酶作用产生的。
4.推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么？为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA分子？
提示　限制酶是原核生物的一种防御工具，用来剪切侵入细胞的外源DNA，以保证自身安全。含某种限制酶的细菌的DNA分子不具备这种限制酶的识别序列，或者细菌自身的DNA分子经过相应的化学修饰，使限制酶不能将其切开。
任务三：DNA连接酶
1.请比较DNA连接酶和DNA聚合酶并完成下表。
种类 DNA聚合酶 DNA连接酶
不同点 作用实质 催化 加到已有的脱氧核苷酸片段上，形成磷酸二酯键 催化 之间形成磷酸二酯键
作用结果 催化形成与模板链互补的DNA链，形成新的双链DNA分子 催化具有互补黏性末端或平末端的DNA片段连接起来，形成重组DNA分子
模板 ______ ________
相同点 ①化学本质都是蛋白质； ②都是催化形成磷酸二酯键
单个脱氧核苷酸
两个DNA片段
需要
不需要
2.DNA片段经限制酶处理后产生的相同黏性末端，再经过DNA连接酶处理后，形成的新的序列，能否再被所用的限制酶识别？
(1)若两个相同黏性末端都是由同种限制酶(EcoRⅠ)剪切后所得，___(填“能”或“不能”)再被所用的限制酶识别(如图所示)。
(2)若两个相同黏性末端是由不同限制酶剪切所得，一般 (填“能”或“不能”)再被所用的限制酶识别(如图所示)。
能
不能
任务四：载体需具备的条件
1.载体要与外源DNA片段连接，需要具备什么条件？
提示　具有一种或多种限制酶的识别序列，供外源DNA片段插入其中。
2.要使携带的外源DNA片段在受体细胞中稳定存在，载体需要具备什么条件？
提示　能在受体细胞中自我复制，或整合到受体细胞DNA上，随受体细胞DNA同步复制，这样它携带的外源DNA片段才能在受体细胞中复制，不至于丢失。
3.我们用肉眼看不到载体是否进入受体细胞，为了便于筛选含重组DNA分子的受体细胞，载体需要具备什么条件？
提示　具有标记基因，以便能够通过表型鉴别含有重组DNA分子的细胞。
与DNA相关的几种酶的比较
核心归纳
项目 DNA连接酶 限制酶 DNA聚合酶 解旋酶
作用部位 磷酸二酯键 磷酸二酯键 磷酸二酯键 氢键
作用对象 DNA片段 DNA 单个的脱氧核苷酸 DNA
作用结果 将两个DNA片段连接成完整的DNA分子 切割DNA分子 将单个的脱氧核苷酸连接到DNA单链末端 将双链DNA分子局部解旋为单链
1.限制酶可识别并切割DNA分子上特定的核苷酸序列。如图为四种限制酶BamHⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ以及BglⅡ的识别序列：
箭头表示每一种限制酶的特定切割部位，其中哪两种限制酶所切割出来的DNA片段末端可以互补结合，其正确的末端互补序列为
A.BamHⅠ和EcoRⅠ，末端互补序列为5′－AATT－3′
B.BamHⅠ和BglⅡ，末端互补序列为5′－GATC－3′
C.BamHⅠ和HindⅢ，末端互补序列为5′－GATC－3′
D.EcoRⅠ和HindⅢ，末端互补序列为5′－AATT－3′
√
落实　思维方法
限制酶切割出来的DNA片段末端若要互补结合，其黏性末端必须互补，即一种酶切的末端正向序列与另一种酶切的末端反向序列互补。由题图可知，BamHⅠ
和BglⅡ酶切割出来的DNA片段末端可以互补结合，其末端互补序列为5′－GATC－3′。综上所述，B符合题意。
2.下列关于基因工程的说法，正确的是
A.限制酶可以切割DNA和RNA
B.DNA连接酶能将两个碱基通过氢键连接起来
C.载体的作用是将外源基因导入受体细胞，使之稳定存在并表达
D.限制酶断开后的DNA末端均为黏性末端
√
一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的位点上切割DNA分子，A错误；
DNA连接酶可以将两个DNA片段通过磷酸二酯键连接起来，B错误；
限制酶断开后的DNA末端既有黏性末端又有平末端，D错误。
DNA的粗提取和鉴定
二
1.实验原理
梳理　教材新知
二苯胺
变性
抑制DNA酶活性
酒
精
2.方法步骤
二苯胺试剂
研磨液
尼龙纱布
上
清液
加冷
酒精
冷酒精
璃棒
玻
(1)DNA钠盐溶于酒精，但某些蛋白质不溶于酒精，利用这一原理，可以分离DNA钠盐与蛋白质(　　)
×
提示　DNA钠盐不溶于酒精而某些蛋白质能溶于酒精。
(2)DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同，在2 mol/L的NaCl溶液中溶解度高(　　)
(3)析出的白色絮状物的主要成分是DNA(　　)
√
√
任务五：实验原理的分析
1.能否选择哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料？鸡的红细胞呢？为什么？
探究　核心知识
提示　不能选择哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料。可以选择鸡的红细胞作为实验材料。因为哺乳动物成熟的红细胞没有细胞核，而鸡的红细胞有细胞核。
2.实验结果说明絮状物中含有什么？
提示　絮状物中含有DNA。
3.鉴定时，为什么要设置只加入二苯胺试剂的试管？
提示　作为对照，排除NaCl溶液对实验结果的影响。
4.实验中充分研磨生物材料、倒入冷酒精的目的分别是什么？
提示　充分研磨生物材料，使细胞结构破碎，释放出核DNA；冷酒精不仅可以溶解蛋白质，而且能使DNA钠盐形成絮状沉淀物而析出。
3.如表关于“DNA的粗提取和鉴定”实验的叙述，不正确的是
落实　思维方法
选项 试剂 操作 作用
A 研磨液 与生物材料混合 提取溶解DNA
B 2 mol·L－1 NaCl溶液 与提取出的DNA混合 溶解DNA
C 预冷的酒精 加入离心后的上清液中 溶解DNA
D 二苯胺试剂 加入溶解有DNA的NaCl溶液中 鉴定DNA
√
DNA钠盐不溶于酒精而某些蛋白质能溶于酒精，利用这一原理可以将蛋白质和DNA进一步分离，C错误。
4.某实验小组进行“DNA的粗提取和鉴定”实验，如图为实验流程。下列相关叙述正确的是
A.取材时可选用猪血、洋葱、香蕉、菜花等富含DNA的材料进行实验
B.破碎细胞时可以加入洗涤剂，能够瓦解细胞膜，但对DNA没有影响
C.提纯时在滤液中加入2 mol/L的NaCl溶液后会出现白色絮状物(DNA钠盐)
D.DNA鉴定时可通过是否加入二苯胺试剂设置对照实验来观察实验现象
√
哺乳动物成熟的红细胞没有细胞核，不能用猪血作DNA提取的实验材料，A错误；
提纯时在滤液中加入体积是滤液两倍的冷酒精，静置3～5 min，可见白色絮状物(DNA钠盐)出现，C错误；
DNA鉴定时可通过是否加入DNA粗提物来设置实验组和对照组，两组都需加入二苯胺试剂来观察实验现象，D错误。
网络构建
课时对点练
三
题组一　基因工程的工具酶和载体
1.下列关于限制性内切核酸酶的叙述，错误的是
A.绝大多数的限制性内切核酸酶主要从原核细胞中获取
B.每一种限制性内切核酸酶只能识别特定的核苷酸序列
C.限制性内切核酸酶的作用位点是相邻核苷酸之间的氢键
D.同一种限制性内切核酸酶切割不同的DNA分子可产生能互补配对的黏
性末端
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绝大多数的限制性内切核酸酶主要从细菌等原核细胞中获取，A正确；
限制性内切核酸酶具有特异性，每一种限制性内切核酸酶只能识别特定的核苷酸序列，并在特定的位点将其切割，B正确；
限制性内切核酸酶的作用位点是相邻核苷酸之间的磷酸二酯键，C错误；
不同限制性内切核酸酶切割不同的DNA分子有可能产生相同的黏性末端，同一种限制性内切核酸酶切割不同的DNA分子可产生能互补配对的黏性末端，D正确。
2.(2024·台州高二期中)“基因剪刀”
——限制性内切核酸酶是基因工程中非常重要的一种工具，它所切割的部位是
A.① B.②
C.③ D.④
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限制性内切核酸酶识别双链DNA上特定的一小段核苷酸序列，并催化其中特定的两个核苷酸之间的磷酸二酯键水解，即图中部位②，部位①是磷酸基团和脱氧核糖之间的化学键，部位③是脱氧核糖和碱基之间的化学键，部位④是氢键，B符合题意。
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3.(2024·浙江嘉兴五中高二月考)下列有关酶的叙述，正确的是
A.DNA连接酶以DNA的一条链为模板，将单个脱氧核苷酸连接起来
B.限制性内切核酸酶识别特定的核苷酸序列并在特定位点切割DNA分子
C.DNA聚合酶可将两个DNA分子片段间的缝隙从5′端到3′端连接起来
D.逆转录酶是以RNA为模板指导核糖核苷酸连接合成DNA的酶
√
DNA连接酶连接两个DNA分子片段，A错误；
DNA聚合酶将单个的脱氧核苷酸连接到DNA单链末端，C错误；
逆转录酶是以RNA为模板指导脱氧核苷酸连接合成DNA的酶，D错误。
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4.下列关于基因运输工具——载体，必须具备的条件之一及理由均正确的是
A.能够复制，以便目的基因插入其中
B.具有一种至多种限制酶的识别序列，便于目的基因的表达
C.具有某些标记基因，便于重组DNA的筛选
D.对受体细胞无害，便于重组DNA的筛选
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载体要能够在受体细胞中稳定地保存下来并大量复制，以便提供大量的目的基因，A错误；
载体要具有一种至多种限制酶的识别序列，以便外源基因插入其中，B错误；
携带外源DNA片段的载体进入受体细胞后，能够在受体细胞中进行自我复制，或整合到受体细胞DNA上，随受体细胞DNA进行同步复制，所以载体要对受体细胞无害，以便受体细胞能正常增殖，D错误。
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5.下列关于质粒的叙述，正确的是
A.质粒是细菌细胞核中能自主复制的DNA分子
B.基因工程中被用作载体的质粒都是天然质粒
C.质粒完全水解后最多可产生6种化合物
D.质粒是基因工程中的一种工具酶
√
质粒的化学本质是DNA分子，完全水解后最多可产生6种化合物，即磷酸、脱氧核糖、4种含氮碱基(A、T、C、G)，C正确；
质粒是基因工程的载体，不是工具酶，D错误。
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题组二　DNA的粗提取和鉴定
6.多种实验材料都可以用于DNA的粗提取和鉴定，用香蕉也可以取得较好的实验效果，下列操作正确的是
A.向剪碎的香蕉果肉组织中加入蒸馏水并搅拌，以释放核DNA
B.经研磨过滤后，将研磨液离心5 min，取沉淀物进行下一步操作
C.95%的冷酒精可以溶解某些蛋白质，得到粗提取的DNA
D.将DNA溶于NaCl溶液后，加入现配的二苯胺试剂，混合均匀即可出现
蓝色
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香蕉果肉组织细胞有细胞壁保护，因此加入蒸馏水搅拌不会破坏细胞，不能将核DNA释放出来，A错误；
经研磨过滤后，将研磨液以3 000 r/min的转速离心2 min，取上清液进行下一步操作，B错误；
DNA钠盐不溶于酒精而某些蛋白质能溶于酒精，因此可用95%的冷酒精溶解某些蛋白质、析出DNA钠盐，获得较纯净的DNA，C正确；
在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，D错误。
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7.(2024·金华高二月考)关于“DNA的粗提取和鉴定”实验，下列说法正确的是
A.研磨时倒入的研磨液，是为了破坏细胞壁
B.离心研磨液是为了加速DNA的沉淀
C.过滤时在漏斗中垫上滤纸
D.粗提取DNA过程中，需加入EDTA以抑制DNA酶的活性
√
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研磨液的作用是将细胞破坏，释放出细胞内的DNA，A错误；
离心研磨液是为了加速细胞膜、细胞器、一些较大杂质等的沉淀，B错误；
过滤时在漏斗中垫上尼龙纱布，C错误。
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8.(2023·绍兴高二期末)下列关于“DNA粗提取和鉴定”实验的叙述，正确的是
A.DNA易溶于酒精，不易溶于2 mol/L的NaCl溶液
B.用相同方法从等体积猪血和鸡血中提取的DNA含量相近
C.DNA析出过程需用玻璃棒沿同一个方向轻轻搅动
D.在沸水中，DNA遇双缩脲试剂会出现紫色反应
√
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DNA不溶于酒精，且在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同，在2 mol/L的NaCl溶液中溶解度最高，A错误；
哺乳动物成熟的红细胞没有细胞核，不含众多细胞器，不能用于“DNA的粗提取和鉴定”，故用相同方法从等体积猪血和鸡血中提取的DNA含量不同，B错误；
DNA析出过程中，会出现白色絮状物，用玻璃棒搅动时要沿一个方向轻轻搅拌，防止DNA结构被破坏，C正确；
在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，D错误。
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9.下列关于限制酶与DNA连接酶的说法，正确的是
A.限制酶能对HIV的遗传物质进行切割
B.不同来源的限制酶识别的核苷酸序列一定不同
C.T4 DNA连接酶既能连接平末端也能连接黏性末端
D.DNA连接酶只能连接同种限制酶切割后的黏性末端
√
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限制酶只能对DNA进行切割，HIV的遗传物质是RNA，A错误；
不同来源的限制酶识别的核苷酸序列可能相同，B错误；
不是同种限制酶切割的黏性末端，只要其黏性末端互补，均可用DNA连接酶进行连接，有些DNA连接酶还能连接平末端，D错误。
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10.限制性内切核酸酶可以在特定的位点将DNA分子剪切开。如图为不同种限制酶的识别序列，箭头所指的是酶切位点，下列叙述错误的是
A.能被BamHⅠ识别的序列也一定能被
Sau3AⅠ识别
B.一个DNA分子被EcoRⅠ切成两个片
段时会发生8个氢键的断裂
C.质粒作为基因工程的常用载体，通常会有一种至多种限制性内切核酸
酶的切割位点
D.用BamHⅠ切割的目的基因和用Sau3AⅠ切割的质粒无法连接
√
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能被BamHⅠ识别的序列中包含了
被Sau3AⅠ识别的序列，A正确；
一个DNA分子被EcoRⅠ切成两个
片段时，四个A－T碱基对间的氢
键断裂，每个A－T碱基对有2个氢键，总共会发生8个氢键的断裂，B正确；
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质粒作为基因工程的常用载体，
通常会有多种限制性内切核酸
酶的切割位点，以便目的基因
的插入，C正确；
用BamHⅠ切割的目的基因和用Sau3AⅠ切割的质粒，其黏性末端是相同的，可以连接，D错误。
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11.(2024·金华高二期末)部分限制酶的识别序列及切割位点如表(注：箭头表示切割位点)。下列叙述正确的是
A.表中4种限制酶均是从DNA
两端逐步剪切核苷酸
B.EcoRⅠ酶切后形成的黏性
末端是5′－AATT－3′
C.KpnⅠ与BamHⅠ处理不同
的DNA片段可获得互补的
黏性末端
D.E.coliDNA连接酶可连接AatⅠ酶切后形成的片段
√
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名称 识别序列 及切割位点 名称 识别序列
及切割位点
AatⅠ AGG↓CCT TCC↑GGA EcoRⅠ G↓AATTC
CTTAA↑G
KpnⅠ G↓GTACC CCATG↑G BamHⅠ G↓GATCC
CCTAG↑G
表中4种限制酶均是在DNA特定位置将DNA从内部剪切成片段的，A错误；
根据表中信息可知，EcoRⅠ识别的序列为GAATTC，并在G和A之间切割，因此，酶切后形成的黏性末端是5′－AATT－3′，B正确；
KpnⅠ与BamHⅠ识别的核苷酸序列不同，则形成的黏性末端不同，用这两种酶处理不同的DNA片段获得的黏性末端没有互补关系，C错误；
E.coliDNA连接酶只能连接黏性末端，不能连接平末端，而AatⅠ酶切后形成的是平末端，D错误。
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12.(2024·台州高二联考)已知一双链DNA分子，用限制酶Ⅰ切割得到长度为120 kb( kb：千碱基对)的片段；用限制酶Ⅱ切割得到40 kb和80 kb 2个片段；同时用限制酶Ⅰ和限制酶Ⅱ切割时，得到10 kb、80 kb和30 kb 3个片段。据此分析该双链DNA分子结构及酶切位点情况为
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√
分析DNA长度可知120＝40＋80＝10＋30＋80，即该DNA分子为环状双链DNA，含有1个限制酶Ⅰ的识别位点，切割得到长度为120 kb的片段；含有2个限制酶Ⅱ的识别位点，切割得到40 kb和80 kb 2个片段；同时用限制酶Ⅰ和限制酶Ⅱ切割时，得到10 kb、80 kb和30 kb共3个片段，说明限制酶Ⅰ的识别位点位于限制酶Ⅱ切割后的40 kb片段中，D符合题意。
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13.如表为常用的限制酶及其识别序列和切割位点，据表分析，下列说法正确的是
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注：Y表示C或T，R表示A或G。
限制酶 BamHⅠ EcoRⅠ HindⅡ KpnⅠ Sau3AⅠ SmaⅠ
识别序列和切割位点 G↓GATCC G↓AATTC GTY↓RAC GGTAC↓C ↓GATC CCC↓GGG
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A.一种限制酶只能识别一种脱氧核苷酸序列
B.限制酶的切点一定位于识别序列的内部
C.不同限制酶切割后一定形成不同的黏性末端
D.限制酶切割后不一定形成黏性末端
限制酶 BamHⅠ EcoRⅠ HindⅡ KpnⅠ Sau3AⅠ SmaⅠ
识别序列和切割位点 G↓GATCC G↓AATTC GTY↓RAC GGTAC↓C ↓GATC CCC↓GGG
√
由于Y表示C或T，R表示A或G，说明一种限制性内切核酸酶能识别一种或多种特定的脱氧核苷酸序列，A错误；
限制酶的切割位点不一定在识别序列的内部，如Sau3AⅠ，B错误；
不同限制酶切割后形成的黏性末端不一定相同，如EcoRⅠ、KpnⅠ、SmaⅠ切割后形成的黏性末端各不相同，而BamHⅠ和Sau3AⅠ切割后形成的黏性末端相同，C错误；
限制酶切割后不一定都形成黏性末端，也有平末端，如HindⅡ、SmaⅠ，D正确。
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14.通过重组DNA技术使原有基因得以改造的动物称为转基因动物。运用这一技术可使羊奶中含有人体蛋白质。如图表示这一技术的基本过程。在该工程中所用的基因“分子手术刀”能识别的序列和切点是 ，请回答下列问题：
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(1)从羊染色体中“剪下”羊蛋白质基因的酶是________。人体蛋白质基因“插入”后连接在羊染色体中时需要的酶是____________。
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限制酶
DNA连接酶
(2)请在方框中画出质粒被切割形成黏性末端的过程图。
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答案　如图所示
(3)人体蛋白质基因之所以能“插入”羊的染色体内，是因为___________
____________________________________________________。
(4)1970年，科学家在细菌中发现了第一个限制酶，而在该细菌中没有此限制酶的识别序列，推测该限制酶在细菌细胞中的作用可能是_________
____________________。
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人的遗传物质与羊的遗传物质都为DNA，其物质组成和空间结构相同
切割外源
DNA，起到防御作用
15.某生物兴趣小组开展DNA的粗提取和鉴定的相关探究活动，具体步骤如下：
材料处理：称取新鲜的菜花、辣椒和蒜黄各2份，每份10 g。剪碎后分成两组，一组置于20 ℃、另一组置于－20 ℃条件下保存24 h。
(1)DNA粗提取结果如表。
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注：“＋”越多，表示蓝色越深。
材料保存温度 菜花 辣椒 蒜黄
20 ℃ ＋＋ ＋ ＋＋＋
－20 ℃ ＋＋＋ ＋＋ ＋＋＋＋
(2)该探究性实验课题的名称可能是“探究不同材料和不同___________对DNA提取量的影响”。
(保存)温度
根据表格数据可知，该实验的自变量是温度和不同材料，因此该探究性实验课题的名称可能是“探究不同材料和不同(保存)温度对DNA提取量的影响”。
材料保存温度 菜花 辣椒 蒜黄
20 ℃ ＋＋ ＋ ＋＋＋
－20 ℃ ＋＋＋ ＋＋ ＋＋＋＋
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(3)DNA的鉴定可用________试剂在__________条件下进行。
二苯胺
95 ℃水浴
鉴定DNA时可用二苯胺试剂，在95 ℃水浴条件下，DNA遇二苯胺试剂会被染成蓝色。
材料保存温度 菜花 辣椒 蒜黄
20 ℃ ＋＋ ＋ ＋＋＋
－20 ℃ ＋＋＋ ＋＋ ＋＋＋＋
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(4)根据实验结果分析：
①结论1：与20 ℃相比，相同实验材料在－20 ℃条件下保存，DNA的提取量更____(填“多”或“少”)。
结论2：等质量的不同实验材料，在相同的保存温度下，从______中提取的DNA量最多。
多
蒜黄
材料保存温度 菜花 辣椒 蒜黄
20 ℃ ＋＋ ＋ ＋＋＋
－20 ℃ ＋＋＋ ＋＋ ＋＋＋＋
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结论1：与20 ℃相比，相同实验材料在－20 ℃条件下保存，与二苯胺试剂进行95 ℃水浴加热后蓝色更深，说明DNA的提取量更多。结论2：等质量的不同实验材料，在相同的保存温度下，蒜黄与二苯胺试剂进行95 ℃水浴加热后蓝色最深，说明从蒜黄中提取的DNA量最多。
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②针对结论1，请提出合理的解释：低温抑制了______________的活性，DNA降解速度减慢。
(核酸水解)酶
出现结论1的原因是低温抑制了(核酸水解)酶的活性，DNA降解速度减慢。
材料保存温度 菜花 辣椒 蒜黄
20 ℃ ＋＋ ＋ ＋＋＋
－20 ℃ ＋＋＋ ＋＋ ＋＋＋＋第2课时　获取目的基因、PCR扩增DNA片段及凝胶电泳鉴定
[学习目标]　1.阐明PCR的原理、反应所需的条件和反应的过程。2.尝试PCR扩增DNA片段及凝胶电泳鉴定。
一、真核、原核基因的结构及获取目的基因
1．真核细胞与原核细胞基因的结构
提醒　真核细胞中外显子和内含子均会被转录成RNA。在mRNA成熟的过程中，内含子对应部位会被切除。
2．获取目的基因的方法
提醒　(1)同一生物的基因组文库中所含的基因往往是相同的；(2)不同组织细胞的cDNA文库是不同的；(3)同一组织细胞在不同的发育阶段，cDNA文库也会有差异。
3.PCR技术
判断正误
(1)真核细胞基因外显子会被转录成RNA，而内含子不能被转录(　　)
(2)利用成熟的mRNA逆转录合成的cDNA片段，不含有启动子、终止子等调控序列(　　)
(3)PCR过程模板DNA双链在解旋酶催化下解旋(　　)
(4)PCR扩增DNA片段的起点和终点由2个引物决定(　　)
任务一：cDNA文库的特点
1．cDNA文库中的基因是否含有启动子、终止子和内含子等序列，为什么？
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
2．不同组织细胞和同一组织细胞在不同的发育阶段，cDNA文库是否会有差异？为什么？
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
任务二：PCR技术的原理和过程
分析PCR过程示意图，思考回答下列问题：
(1)PCR技术中DNA双链解旋的原理与体内DNA复制相同吗？若不同，请说明区别。
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
(2)与体内DNA复制相比，PCR技术所用的Taq DNA聚合酶有什么特点？
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
(3)PCR扩增的DNA片段大小由什么决定？
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
(4)在第几轮循环产物中开始出现目标DNA片段(两条核苷酸链等长的DNA分子)
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
(5)利用PCR扩增1个DNA片段，经过n次循环后，反应体系中共有多少个DNA片段，其中目标DNA片段(两条核苷酸链等长的DNA分子)有多少个，共消耗引物多少个？
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
1．比较启动子和起始密码子、终止子和终止密码子
项目 位置 功能
启动子 基因的非编码区，在基因的“上游” RNA聚合酶结合的位点，控制转录的开始
起始密码子 位于mRNA上的开始位置 翻译的开始，肽链延伸的第一个氨基酸的位点
终止子 基因的非编码区，在基因末端 控制转录结束
终止密码子 位于mRNA的末端 翻译的结束，肽链延伸的终止
2.原核细胞基因与真核细胞基因的比较
3．cDNA文库和基因组文库的主要区别
文库类型 cDNA文库 基因组文库
文库大小 小 大
基因中启动子和终止子 无 有
基因中内含子 无 有
基因多少 某种生物的部分基因 某种生物的全部基因
4. PCR技术与细胞内DNA复制的比较
1．(2024·台州高二联考)如图为人胰岛素基因结构模式图，下列叙述正确的是(　　)
A．启动子是RNA聚合酶结合的位点
B．cDNA文库和基因组文库的基因中均含有内含子
C．人胰岛α细胞的cDNA文库中可找到该基因
D．细胞内DNA复制时，只对编码区进行复制
2．PCR引物的3′端为结合模板DNA的关键碱基，5′端无严格限制，可用于添加限制酶切点等序列。下列叙述正确的是(　　)
A．该图表示PCR循环中的变性环节
B．PCR第四次循环要消耗8对引物
C．TaqDNA聚合酶催化相邻的两个游离dNTP之间形成磷酸二酯键
D．用图中引物扩增两个循环后即可获得两端添加限制酶切点的脱氧核苷酸链等长的产物
二、活动：PCR扩增DNA片段及凝胶电泳鉴定
1．实验原理
2．方法步骤
(1)PCR扩增
(2)琼脂糖凝胶电泳
提醒　(1)为避免外源DNA等因素干扰，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压蒸汽灭菌。(2)在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，微量移液器上的枪头都必须更换。
判断正误
(1)PCR使用的微量离心管使用前必须进行灭菌处理(　　)
(2)微量移液器的枪头，吸取一种试剂后，可以重复使用(　　)
(3)不同的DNA Marker所含DNA片段长度相同但含量不同(　　)
任务三：实验结果的分析
1．在电泳过程中，分子移动的方向是由什么决定的？
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2．DNA分子的迁移速率与哪些因素有关？
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3．判断是否成功扩增出DNA片段的依据是什么？
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
4．如果扩增条带不止一条，可能的原因有哪些？
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5．PCR扩增DNA片段及凝胶电泳鉴定实验活动的对照组应该如何设计？
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
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1．PCR的阳性对照和阴性对照
(1)阳性对照：即Marker，推测PCR产物长度，判断PCR产物是否是目的片段。
(2)阴性对照：PCR的空白管，除了不加模板外，其成分与其他管一样，证明没有其他模板污染。
2．PCR扩增结果的分析
(1)如果扩增不成功，可能的原因：漏加了PCR的某种反应成分；各反应成分的用量不当；PCR程序设置不当等。
(2)如果扩增结果不止一条条带，可能的原因：模板被污染；引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易聚合形成二聚体；退火温度过低；Taq DNA聚合酶的质量不好等。
3．(2024·嘉兴高二期末)聚合酶链式反应(PCR)是一种体外扩增DNA片段的技术。某DNA片段的PCR反应程序如图所示。
下列叙述正确的是(　　)
A．预变性可促进模板DNA边解旋边复制
B．退火是让解旋状态模板DNA恢复双螺旋
C．延伸结束后，新片段中的引物将被切除
D．终延伸可使目的基因的扩增更加充分
4．下列有关电泳的叙述，不正确的是(　　)
A．电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程
B．待测样品中各种分子的形状、大小及带电性质的差异等会影响其在电泳中的迁移速度
C．进行电泳时，带电粒子会向着与其所带电荷相同的电极移动
D．常用的电泳方法是琼脂糖凝胶电泳
答案精析
一、梳理教材新知
1．RNA聚合酶　转录　转录　不连续的　内含子　连续的
2．特定顺序　目的基因　序列较短　DNA片段　逆转录酶　DNA聚合酶
3.脱氧核苷三磷酸　耐高温的TaqDNA聚合酶　人工合成　单链DNA　变性　氢键　退火　各自互补的DNA单链　延伸　两条DNA单链　4种dNTP　耐高温的TaqDNA聚合酶　2个引物　电泳
判断正误
(1)×　(2)√　(3)×　(4)√
提示　(1)真核细胞基因外显子和内含子均会被转录成RNA。在mRNA成熟的过程中，内含子对应部位会被切除。(3)PCR过程模板DNA双链在高温下(90 ℃～95 ℃)氢键断裂，解旋成2条DNA单链。
探究核心知识
任务一
1．不含有启动子、终止子和内含子等序列。因为cDNA是由成熟的mRNA逆转录合成的，其中不含有基因的调控序列启动子和终止子，也不含有内含子。
2．cDNA文库有差异；因为基因的选择性表达，不同组织细胞内转录的mRNA不同，则由mRNA逆转录形成的cDNA也不同；同一组织细胞在不同的发育阶段转录的mRNA不同，所以cDNA文库也有差异。
任务二
(1)不相同；PCR技术中利用高温使DNA双链氢键断裂，解旋成2条DNA单链，而体内DNA复制利用解旋酶使DNA双链解旋。
(2)有耐高温的特点。
(3)PCR扩增的DNA片段大小由2个引物决定。
(4)在第3轮循环产物中开始出现目标DNA片段。
(5)n次循环后，反应体系中共有2n个DNA片段；目标DNA片段有2n－2n个；共消耗引物2n＋1－2个。
落实思维方法
1．A　[启动子位于基因的非编码区，是RNA聚合酶结合的位点，控制转录的开始，A正确；内含子和外显子均会被转录成RNA，再经过切去内含子对应部位、连接外显子对应部位等RNA加工过程，形成成熟的mRNA，而cDNA文库是以成熟的mRNA为模板逆转录合成的，故不含内含子，B错误；只有人胰岛β细胞合成胰岛素，胰岛素基因的cDNA只能在由胰岛β细胞建立的cDNA文库中找到，C错误；细胞内DNA复制时，DNA分子中所有序列均被复制，即不管是编码区还是非编码区均被复制，D错误。]
2．B　[图中引物与模板链碱基互补配对，表示PCR循环中的退火环节，A错误；PCR三次循环共消耗23－1＝7(对)引物，PCR四次循环共消耗24－1＝15(对)引物，第四次循环要消耗8对引物，B正确；Taq DNA聚合酶将核苷酸不断地连接到两个引物的3′端，C错误；通过绘图可推知，第三轮循环产物中开始出现含限制酶切点的脱氧核苷酸链等长的DNA片段，D错误。]
二、梳理教材新知
1．变性　退火　延伸　琼脂糖凝胶电泳　亚甲基蓝　75%酒精　蒸馏水
2．(1)微量移液器　微量离心管　PCR仪　(2)胶盒　加样孔　亚甲基蓝　蓝色　Marker
判断正误
(1)√　(2)×　(3)×
提示　(2)微量移液器的枪头，吸取一种试剂后，必须更换，不能重复使用。(3)不同的DNA Marker所含DNA片段长度和含量是不同的。
探究核心知识
1．由分子所带电荷决定。在电场的作用下，带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动。
2．与DNA分子的大小、形状、所带电荷等因素有关。
3．观察蓝色条带的数目和位置，通过和Marker对比来判断扩增的结果。
4．模板被污染、引物设计不合理、退火温度过低、Taq DNA聚合酶质量不好等。
5．除了不加酵母细胞悬液外，其成分和其他微量离心管一样。
落实思维方法
3．D　[预变性的目的是破坏DNA中可能存在的较难破坏的复杂二级结构，使DNA充分变性，A错误；退火是让2个引物分别与各自互补的DNA单链结合，B错误；延伸结束后，新片段中引物不会被切除，C错误；终延伸过程是为了让引物完全延伸并让单链产物完全复性形成双链结构，可使目的基因的扩增更加充分，D正确。]
4．C　[进行电泳时，带电粒子会向着与其所带电荷相反的电极移动，C错误。](共77张PPT)
第2课时
获取目的基因、PCR扩增DNA片段及凝胶电泳鉴定
第四章 基因工程
<<<
学习目标
1.阐明PCR的原理、反应所需的条件和反应的过程。
2.尝试PCR扩增DNA片段及凝胶电泳鉴定。
内容索引
一、真核、原核基因的结构及获取目的基因
二、活动：PCR扩增DNA片段及凝胶电泳鉴定
课时对点练
真核、原核基因的结构及获取目的基因
一
1.真核细胞与原核细胞基因的结构
梳理　教材新知
连续的
RNA聚合
酶
转录
转录
不连续
的
内含子
提醒　真核细胞中外显子和内含子均会被转录成RNA。在mRNA成熟的过程中，内含子对应部位会被切除。
2.获取目的基因的方法
特定顺序
目的基因
序列较短
DNA片段
DNA聚合酶
逆转录酶
提醒　(1)同一生物的基因组文库中所含的基因往往是相同的；(2)不同组织细胞的cDNA文库是不同的；(3)同一组织细胞在不同的发育阶段，cDNA文库也会有差异。
3.PCR技术
脱氧核苷三磷酸
耐高温的Taq DNA聚合酶
人工合成
单链DNA
变性
氢键
退火
各自互补
的DNA单链
延伸
两条DNA单链
4种dNTP
耐高温的
Taq DNA聚合酶
电泳
2个引物
(1)真核细胞基因外显子会被转录成RNA，而内含子不能被转录
(　　)
提示　真核细胞基因外显子和内含子均会被转录成RNA。在mRNA成熟的过程中，内含子对应部位会被切除。
×
(2)利用成熟的mRNA逆转录合成的cDNA片段，不含有启动子、终止子等调控序列(　　)
√
(3)PCR过程模板DNA双链在解旋酶催化下解旋(　　)
×
提示　PCR过程模板DNA双链在高温下(90 ℃～95 ℃)氢键断裂，解旋成2条DNA单链。
(4)PCR扩增DNA片段的起点和终点由2个引物决定(　　)
√
任务一：cDNA文库的特点
1.cDNA文库中的基因是否含有启动子、终止子和内含子等序列，为什么？
探究　核心知识
提示　不含有启动子、终止子和内含子等序列。因为cDNA是由成熟的mRNA逆转录合成的，其中不含有基因的调控序列启动子和终止子，也不含有内含子。
2.不同组织细胞和同一组织细胞在不同的发育阶段，cDNA文库是否会有差异？为什么？
提示　cDNA文库有差异；因为基因的选择性表达，不同组织细胞内转录的mRNA不同，则由mRNA逆转录形成的cDNA也不同；同一组织细胞在不同的发育阶段转录的mRNA不同，所以cDNA文库也有差异。
任务二：PCR技术的原理和过程
分析PCR过程示意图，思考回答下列问题：
(1)PCR技术中DNA双链解旋的原理与体内DNA复制相同吗？若不同，请说明区别。
提示　不相同；PCR技术中利用高温使DNA双链氢键断裂，解旋成2条DNA单链，而体内DNA复制利用解旋酶使DNA双链解旋。
(2)与体内DNA复制相比，PCR技术所用的Taq DNA聚合酶有什么特点？
提示　有耐高温的特点。
提示　在第3轮循环产物中开始出现目标DNA片段。
(3)PCR扩增的DNA片段大小由什么决定？
提示　PCR扩增的DNA片段大小由2个引物决定。
(4)在第几轮循环产物中开始出现目标DNA片段(两条核苷酸链等长的DNA分子)
(5)利用PCR扩增1个DNA片段，经过n次循环后，反应体系中共有多少个DNA片段，其中目标DNA片段(两条核苷酸链等长的DNA分子)有多少个，共消耗引物多少个？
提示　n次循环后，反应体系中共有2n个DNA片段；目标DNA片段有2n－2n个；共消耗引物2n＋1－2个。
1.比较启动子和起始密码子、终止子和终止密码子
核心归纳
项目 位置 功能
启动子 基因的非编码区，在基因的“上游” RNA聚合酶结合的位点，控制转录的开始
起始密码子 位于mRNA上的开始位置 翻译的开始，肽链延伸的第一个氨基酸的位点
终止子 基因的非编码区，在基因末端 控制转录结束
终止密码子 位于mRNA的末端 翻译的结束，肽链延伸的终止
2.原核细胞基因与真核细胞基因的比较
核心归纳
3.cDNA文库和基因组文库的主要区别
核心归纳
文库类型 cDNA文库 基因组文库
文库大小 小 大
基因中启动子和终止子 无 有
基因中内含子 无 有
基因多少 某种生物的部分基因 某种生物的全部基因
4. PCR技术与细胞内DNA复制的比较
核心归纳
1.(2024·台州高二联考)如图为人胰岛素基因结构模式图，下列叙述正确的是
落实　思维方法
A.启动子是RNA聚合酶结合的位点
B.cDNA文库和基因组文库的基因中均含有内含子
C.人胰岛α细胞的cDNA文库中可找到该基因
D.细胞内DNA复制时，只对编码区进行复制
√
启动子位于基因的非编码
区，是RNA聚合酶结合的
位点，控制转录的开始，
A正确；
内含子和外显子均会被转录成RNA，再经过切去内含子对应部位、连接外显子对应部位等RNA加工过程，形成成熟的mRNA，而cDNA文库是以成熟的mRNA为模板逆转录合成的，故不含内含子，B错误；
只有人胰岛β细胞合成胰岛
素，胰岛素基因的cDNA
只能在由胰岛β细胞建立的
cDNA文库中找到，C错误；
细胞内DNA复制时，DNA分子中所有序列均被复制，即不管是编码区还是非编码区均被复制，D错误。
2.PCR引物的3′端为结合模板DNA的关键碱基，5′端无严格限制，可用于添加限制酶切点等序列。下列叙述正确的是
A.该图表示PCR循环中的变性环节
B.PCR第四次循环要消耗8对引物
C.TaqDNA聚合酶催化相邻的两个游离dNTP之间形成磷酸二酯键
D.用图中引物扩增两个循环后即可获得两端添加限制酶切点的脱氧核苷
酸链等长的产物
√
图中引物与模板链碱基互补配对，
表示PCR循环中的退火环节，A
错误；
PCR三次循环共消耗23－1＝7(对)引物，PCR四次循环共消耗24－1＝15(对)引物，第四次循环要消耗8对引物，B正确；
Taq DNA聚合酶将核苷酸不断地连接到两个引物的3′端，C错误；
通过绘图可推知，第三轮循环产物中开始出现含限制酶切点的脱氧核苷酸链等长的DNA片段，D错误。
活动：PCR扩增DNA片段及凝胶电泳鉴定
二
1.实验原理
梳理　教材新知
蒸馏水
变性
退火
延伸
琼脂糖凝
胶电泳
亚甲基蓝
75%酒精
2.方法步骤
(1)PCR扩增
PCR仪
微量移液器
微量离心管
(2)琼脂糖凝胶电泳
胶盒
加样孔
Marker
亚甲基蓝
蓝色
提醒　(1)为避免外源DNA等因素干扰，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压蒸汽灭菌。(2)在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，微量移液器上的枪头都必须更换。
(1)PCR使用的微量离心管使用前必须进行灭菌处理(　　)
(2)微量移液器的枪头，吸取一种试剂后，可以重复使用(　　)
×
提示　微量移液器的枪头，吸取一种试剂后，必须更换，不能重复使用。
(3)不同的DNA Marker所含DNA片段长度相同但含量不同(　　)
√
提示　不同的DNA Marker所含DNA片段长度和含量是不同的。
×
任务三：实验结果的分析
1.在电泳过程中，分子移动的方向是由什么决定的？
探究　核心知识
提示　由分子所带电荷决定。在电场的作用下，带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动。
2.DNA分子的迁移速率与哪些因素有关？
提示　与DNA分子的大小、形状、所带电荷等因素有关。
3.判断是否成功扩增出DNA片段的依据是什么？
提示　观察蓝色条带的数目和位置，通过和Marker对比来判断扩增的
结果。
4.如果扩增条带不止一条，可能的原因有哪些？
提示　模板被污染、引物设计不合理、退火温度过低、Taq DNA聚合酶质量不好等。
5.PCR扩增DNA片段及凝胶电泳鉴定实验活动的对照组应该如何设计？
提示　除了不加酵母细胞悬液外，其成分和其他微量离心管一样。
1.PCR的阳性对照和阴性对照
(1)阳性对照：即Marker，推测PCR产物长度，判断PCR产物是否是目的片段。
(2)阴性对照：PCR的空白管，除了不加模板外，其成分与其他管一样，证明没有其他模板污染。
核心归纳
2.PCR扩增结果的分析
(1)如果扩增不成功，可能的原因：漏加了PCR的某种反应成分；各反应成分的用量不当；PCR程序设置不当等。
(2)如果扩增结果不止一条条带，可能的原因：模板被污染；引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易聚合形成二聚体；退火温度过低；Taq DNA聚合酶的质量不好等。
核心归纳
3.(2024·嘉兴高二期末)聚合酶链式反应(PCR)是一种体外扩增DNA片段的技术。某DNA片段的PCR反应程序如图所示。
下列叙述正确的是
A.预变性可促进模板DNA边解
旋边复制
B.退火是让解旋状态模板DNA
恢复双螺旋
C.延伸结束后，新片段中的引物将被切除
D.终延伸可使目的基因的扩增更加充分
落实　思维方法
√
预变性的目的是破坏DNA中
可能存在的较难破坏的复杂
二级结构，使DNA充分变性，
A错误；
退火是让2个引物分别与各自互补的DNA单链结合，B错误；
延伸结束后，新片段中引物不会被切除，C错误；
终延伸过程是为了让引物完全延伸并让单链产物完全复性形成双链结构，可使目的基因的扩增更加充分，D正确。
4.下列有关电泳的叙述，不正确的是
A.电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程
B.待测样品中各种分子的形状、大小及带电性质的差异等会影响其在电
泳中的迁移速度
C.进行电泳时，带电粒子会向着与其所带电荷相同的电极移动
D.常用的电泳方法是琼脂糖凝胶电泳
√
进行电泳时，带电粒子会向着与其所带电荷相反的电极移动，C错误。
网络构建
课时对点练
三
题组一　基因的结构
1.如图为一个真核基因的结构示意图，下列对基因特点的叙述，正确的是
A.非编码区是外显子，编码区是内含子
B.非编码区中含有翻译过程中的起始密码子和终止密码子的对应碱基序列
C.不管是原核基因还是真核基因，能编码蛋白质的序列都位于编码区
D.非编码区对该基因转录不发挥作用
√
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外显子和内含子都位于编码区，A错误；
密码子对应的碱基序列位于编码区，B错误；
非编码区含有启动子、终止子等结构，对转录有调控作用，D错误。
2.(2023·丽水高二期末)基因表达过程中外显子和内含子都能发生转录，模板链转录形成一条前体mRNA链，前体mRNA链中由内含子转录的片段被剪切后，再重新将其余片段拼接起来成为成熟的mRNA。下列叙述正确的是
A.mRNA可与多个核糖体结合同时合成多条肽链
B.原核生物基因编码区转录不需RNA聚合酶催化
C.前体mRNA链经蛋白酶剪切后成为成熟的mRNA
D.外显子中发生碱基对替换必然会导致性状的改变
√
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mRNA可与多个核糖体结合同时合成多条相同的肽链，提高了翻译的效率，A正确；
RNA聚合酶的作用是催化DNA转录形成RNA，原核生物基因编码区的转录需要RNA聚合酶催化，B错误；
蛋白酶的作用是催化蛋白质水解，mRNA为核酸，不能被蛋白酶剪切，C错误；
遗传密码具有简并性，外显子中发生碱基对替换不一定会导致性状的改变，D错误。
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题组二　获取目的基因的方法
3.在基因比较小，核苷酸序列又已知的情况下，获得该基因的最佳方法是
A.以4种脱氧核苷酸为原料人工合成
B.用mRNA为模板逆转录合成DNA
C.从基因组文库中筛选
D.从生物材料中直接分离
√
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在目的基因比较小，核苷酸序列已知的情况下常采用化学合成法，A符合题意。
4.建立基因文库是获取目的基因的方法之一，下列关于基因文库的说法，正确的是
A.构建基因文库需要将基因导入微生物细胞，形成克隆
B.基因文库的构建不需要限制酶和DNA连接酶
C.基因组文库含有该生物的大部分基因
D.部分基因文库就是cDNA文库
√
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构建基因文库需要限制酶和DNA连接酶，B错误；
基因组文库含有该生物的全部基因，C错误；
cDNA文库是部分基因文库中的一种，D错误。
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题组三　PCR技术
5.PCR实验的特异性主要取决于
A.DNA聚合酶的种类 B.反应体系中模板DNA的量
C.引物的碱基序列特异性 D.dNTP的浓度
√
引物决定了PCR过程中复制的特定DNA序列区间，即引物的碱基序列特异性决定了PCR过程的特异性。
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6.(2023·绍兴高二期中)利用PCR技术将某DNA分子扩增n代的过程中，下列叙述错误的是
A.引物越短，PCR扩增的非目标DNA就越多
B.共有(2n－1)对引物参与子代DNA分子的合成
C.引物中G/C含量越高，退火温度越高
D.适温延伸过程中，需要提供ATP
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√
引物越短，其特异性越低，引物与非目标DNA结合的可能性越大，因此PCR扩增的非目标DNA就越多，A正确；
PCR技术的原理是DNA复制，根据DNA分子半保留复制的特点可知，共有(2n－1)对引物参与子代DNA分子的合成，B正确；
适温延伸过程中，由dNTP水解磷酸提供能量，不需要提供ATP，D错误。
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题组四　PCR扩增DNA片段及凝胶电泳鉴定
7.(2024·宁波高二期中)如图为利用逆转录方法和PCR技术扩增目的基因片段的过程示意图。据图分析，下列说法错误的是
A.在第3轮PCR结束后，两条链等长的DNA
占1/4
B.⑤过程使用70～75 ℃的温度处理既可以
防止DNA变性，也可以促进子链的延伸
C.④过程两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合
D.第4轮④过程中消耗15对引物
√
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在第3轮PCR结束后，两条链等长的
DNA的数量有23－2×3＝2(个)，经
过3次复制后产生的DNA分子数目为
23＝8(个)，可见，两条链等长的DNA片段占1/4，A正确；
⑤过程为延伸，延伸过程使用70～75 ℃的温度处理既可以防止DNA变性，还能促进子链的延伸，B正确；
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④过程为退火，退火过程中两种引
物通过碱基互补配对与两条单链
DNA结合，C正确；
第4轮中产生的DNA分子数目为24＝16(个)，该过程需要新合成16条子链，因而需要16个引物，即④过程中消耗8对引物，D错误。
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8.(2024·杭州高二期中)带电粒子在电场作用下，向着与其电性相反的电极移动，称为电泳。下列关于电泳的叙述，正确的是
A.电泳中带电粒子迁移速率只与所带电荷有关
B.电泳的过程要在一定的pH下进行，所以要使用缓冲液
C.DNA片段根据长度大小在凝胶上分开，形成连续的条带
D.切断电源后即可用肉眼观察到DNA条带在凝胶上的位置
√
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电泳利用了待分离样品中各种粒子带电性质的差异及分子本身大小、形状的不同，使带电粒子产生不同的迁移速率，从而实现样品中各种粒子的分离，A错误；
电泳过程中维持合适的pH，并使溶液具有一定的导电性，利于核酸迁移，B正确；
DNA片段根据长度大小在凝胶上分开，形成不连续的条带，每个条带包含的DNA片段长度是相同的，C错误；
DNA本身是无色的，可以用荧光或放射性染料对DNA进行标记，或使用亚甲基蓝将DNA染成蓝色，再进行观察，肉眼无法直接观察，D错误。
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9.如果要用PCR扩增以下DNA模板中的基因1，需要的一对引物序列是
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A.引物Ⅰ是5′－CTTCGAAATTC－3′，引物Ⅱ是5′－TCTCCCGATCGG－3′
B.引物Ⅰ是5′－CTTCGAAATTC－3′，引物Ⅱ是5′－CCGATCGGGAGA－3′
C.引物Ⅰ是5′－GAAGCTTTAAG－3′，引物Ⅱ是5′－AGAGCAAAGGAT－3′
D.引物Ⅰ是5′－GAAGCTTTAAG－3′，引物Ⅱ是5′－CCGATCGGGAGA－3′
√
设计正向引物时，该引物序列应该为待扩增DNA序列接近5′端处的序列；设计反向引物时，该引物序列应该是待扩增DNA序列接近3′端处的序列的反向互补序列。因此，要用PCR扩增上述DNA模板中的基因1(5′CTTCGAAATTC－基因1－TCTCCCGATCGG3′)，需要的一对引物序列是5′－CTTCGAAATTC－3′和5′－CCGATCGGGAGA－3′，B符合题意。
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10.为优化目的基因(700 bp)的PCR条件，研究者设计不同的退火温度进行实验，产物的琼脂糖凝胶电泳结果如图。据图分析，下列叙述错误的是
A.对照组可用无菌蒸馏水代替模板，其他
成分相同
B.电泳条带的宽度、亮度与扩增产物大小
呈正相关
C.退火温度的高低会影响PCR扩增产物的
纯度
D.58 ℃是本实验中扩增该基因的最佳退火温度
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实验设计应遵循对照原则与单一变
量原则，故对照组可用无菌蒸馏水
代替模板，其他成分相同，A正确；
PCR技术中，反应最终的电泳条带
的宽度、亮度与PCR扩增产物的含
量呈正相关，B错误；
退火温度会影响引物与模板链的结合，进而影响PCR扩增产物的纯度，C正确；
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据题图可知，58 ℃条件下条带宽度最大，故该温度是本实验中扩增该基因的最佳退火温度，D正确。
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11.(2024·嘉兴高二期中)下列关于PCR技术的叙述，正确的是
A.PCR技术所用TaqDNA聚合酶能耐高温，其最适温度是95 ℃
B.一个DNA片段经PCR扩增n次后需2n个引物
C.在第2轮循环产物中开始出现目标DNA片段
D.一个DNA片段经PCR扩增n次后含目标DNA片段的数目为2n－2n
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PCR技术所用Taq DNA聚合酶能耐高温，其适宜温度约为72 ℃，A错误；
每合成一条子链需要一个引物，PCR扩增n次后有2n＋1条DNA单链，其中有两条是母链，所以经PCR扩增n次后需2n＋1－2个引物，B错误；
第1次扩增的产物DNA为长－中链，第2次扩增出现中－短链，在第3轮循环产物中开始出现目标DNA片段(短－短链)，C错误；
一个DNA片段扩增n次后有2个长－中链和2n－2个中－短链，则含目标DNA片段的数目为2n－2－(2n－2)＝2n－2n，D正确。
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12.荧光定量PCR技术可定量检测病毒核酸样本中DNA含量，其原理是：在PCR反应体系中加入引物的同时，加入与某条模板链互补的荧光探针，当耐高温的Taq DNA聚合酶催化子链延伸至探针处会水解探针，使荧光监
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测系统接收到荧光信号，即每扩增一次，就有一个荧光分子生成(如图所示)。下列说法正确的是
A.该技术的原理是DNA的体外复制，需要用
到解旋酶和Taq DNA聚合酶
B.该技术需要用到一对引物，且引物之间的
碱基序列不能互补
C.该技术中Taq DNA聚合酶只能从引物的5′
端开始延伸DNA链
D.若循环次数相同，荧光值越低，证明病毒感染程度越高
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PCR技术的原理是DNA的体外复制，其中模
板DNA双链在高温下氢键断裂，不需要解旋
酶，A错误；
PCR技术用到的引物之间的碱基序列不能互
补，以免影响引物与模板链的结合，B正确；
Taq DNA聚合酶只能从引物的3′端开始延伸DNA链，C错误；
循环次数相同时，荧光值越高，证明感染的病毒越多，感染程度越高，D错误。
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13.一种单链RNA病毒的核酸检测采用“实时荧光定量RT—PCR”技术，通常在1～2 h内即可得到检测结果。此方法是PCR技术和荧光检测技术的结合，利用荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR产物进行检测分析。步骤如图，回答下列问题：
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(1)利用样本中提取的RNA获得cDNA，过程①使用________酶。需要将样本中的RNA经过过程①形成cDNA后再进行PCR扩增的原因是__________
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逆转录
PCR扩增
必须以DNA为模板，RNA不能作为PCR扩增的模板
(2)PCR技术的原理是_______________________，一般要经历三十多次循环，每次循环可以分为变性、退火和延伸三步，每一个步骤都要控制好相应的温度，延伸的温度______(填“高于”“低于”或“等于”，下同)退火的温度，而______变性的温度。在循环之前，常要进行一次_______，以便增加大分子模板DNA彻底变性的概率。
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DNA双链的半保留复制
高于
低于
预变性
(3)过程②中对cDNA序列进行扩增，需设计两种引物。如图为cDNA的部分序列，请问两种引物的结合位置是_________(填编号)。
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Ⅱ和Ⅲ
(4)在检测过程中，随着PCR的进行，反应产物不断累积，“杂交双链”荧光信号的强度也等比例增加，为了保证检测结果的准确性，一般要达到或超过阈值时才能判定为阳性，最终确诊。虽然RT—PCR技术是当前被广泛认可的检测手段之一，但仍然存在“假阴性”现象，结合上述内容，分析可能产生“假阴性”的因素有________(填字母)。
A.取样不规范导致所获样本量不足
B.样本运输中出现了损坏
C.检测样本被污染
D.病毒相应关键序列发生了改变
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8
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14
ABCD
14.1985年，穆利斯等人发明了PCR技术。请回答下列有关问题：
(1)若要使用PCR扩增目的基因，则需要在反应体系中添加的物质有4种脱氧核苷三磷酸、引物、模板和__________________，其中引物的作用是______________________。
(2)PCR中每次循环的步骤依次是__________________。PCR的产物常用琼脂糖凝胶电泳来鉴定，在凝胶中DNA分子的迁移速率与_____________
___________________等因素有关。
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Taq DNA聚合酶
定位DNA合成的起始点
变性、退火和延伸
小、形状、所带电荷
DNA分子的大
(3)利用PCR技术可以从苏云金芽孢杆菌DNA分子中扩增出Bt毒蛋白基因，原因是_________________________________________________________
_________________________________，至少需要____轮循环才能得到只含有Bt毒蛋白基因的片段，经过5轮复制，需要引物_____个，其中只含有Bt毒蛋白基因的片段占总DNA片段的比例为_______。
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引物是根据Bt毒蛋白基因的一段已知序列设计合成的(或引物能与Bt毒蛋白基因的DNA特异性结合)
3
62
11/16
根据Bt毒蛋白基因的一段已知序列设计合成的引物(或引物能与Bt毒蛋白基因的DNA特异性结合)，可利用PCR技术从苏云金芽孢杆菌DNA分子中扩增出Bt毒蛋白基因。至少需要3轮循环才能得到只含有Bt毒蛋白基因的片段，复制次数和目的基因个数的关系式是：目的基因的个数为2n－2n，经过5轮复制，由于两条模板链不需要引物，所以需要引物的个数为(2×25－2)＝62(个)。经过5轮复制后，目的基因的个数是(25－2×5)＝22(个)，DNA分子的总数是25＝32(个)，所以其中只含有Bt毒蛋白基因的片段占总DNA片段的比例为11/16。
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14第3课时　表达载体的构建和目的基因的导入和检测
[学习目标]　1.说出表达载体的组成和利用表达载体构建重组DNA分子的过程。2.列举将目的基因导入细菌、动物细胞和植物细胞的方法。3.列举检测目的基因及其表达产物的方法。4.概括基因工程的基本操作程序。5.针对人类生产或生活的需要，能运用基因工程技术尝试设计获得某一转基因产品的方案。
一、利用表达载体构建重组DNA分子、将目的基因导入受体细胞
1．利用表达载体构建重组DNA分子——基因工程的核心
(1)相关概念与组成
(2)构建重组DNA分子
2．将目的基因导入受体细胞
判断正误
(1)构建重组DNA分子时，必须用同种限制酶剪切含目的基因的DNA片段及表达载体(　　)
(2)Ca2＋能促进细菌摄取外源DNA，成为感受态细胞(　　)
(3)Ti质粒上的T－DNA片段能整合到植物染色体DNA中(　　)
任务一：限制酶的选择原则
如表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中箭头表示相关限制酶的酶切位点。请据图回答下列问题：
限制酶 BamH Ⅰ Hind Ⅲ EcoR Ⅰ Sma Ⅰ
识别序 列及切 割位点
(1)构建重组DNA分子，能否用限制酶SmaⅠ切割质粒？为什么？
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
(2)与只使用限制酶EcoRⅠ(又称单酶切法)相比较，使用BamHⅠ和Hind Ⅲ两种限制酶同时处理(又称双酶切法)质粒、外源DNA的优点是什么？
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
任务二：农杆菌转化法的原理
如图为利用农杆菌转化法制备转基因植物的过程图，据图回答下列问题：
(1)重组Ti质粒的构建需要哪些酶的作用？
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
(2)在用农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞的过程中，一定要将目的基因插入Ti质粒的T－DNA上的原因是什么？
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
(3)将重组质粒导入农杆菌细胞时，应怎样处理农杆菌细胞？
________________________________________________________________________
1．限制酶的选择原则
(1)根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类
①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，以便将目的基因“切出”，如图甲可选择PstⅠ。
②不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，以防破坏目的基因，如图甲不能选择SmaⅠ。
③为避免目的基因和质粒的自身环化和反向连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲和图乙也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(双酶切法)，而且这种双酶切法不会破坏目的基因、标记基因、启动子和终止子。
(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类
①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶一致，以确保具有相同的黏性末端。
②质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，应至少含有一个完好的标记基因，如图中限制酶PstⅠ因其会破坏标记基因而不宜选择。
③所选限制酶切点不应位于复制起点处，会破坏复制起点，如果所选限制酶的切点不止一个，则切割重组后可能会丢失某些片段，若丢失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。
④所选限制酶切点应位于启动子与终止子之间，如图中HindⅢ会破坏启动子，EcoRⅠ会破坏终止子，而NdeⅠ和BamHⅠ切出的切口可让目的基因嵌入启动子与终止子之间。
(3)参考Ti质粒的T－DNA片段选择限制酶
若质粒上标出T－DNA片段，则所选限制酶切点应位于T－DNA片段中，从而有利于将目的基因嵌入T－DNA片段上——因为Ti质粒的T－DNA片段最易转移至受体细胞并且整合到受体细胞染色体DNA中。
2．农杆菌转化法中的两次拼接、两次导入
(1)两次拼接：第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T－DNA上，第二次拼接(非人工操作)是指携带目的基因的T－DNA整合到受体细胞染色体的DNA上。
(2)两次导入：第一次导入是将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌，第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T－DNA导入受体细胞。
1．如图是利用基因工程技术构建重组表达载体的过程示意图，其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ为四种限制酶。下列相关叙述错误的是(　　)
A．需要用限制酶PstⅠ和EcoRⅠ来切割质粒
B．表达载体中的抗青霉素基因在受体细胞中能复制
C．表达载体中抗原基因的终止子位于抗青霉素基因的下游
D．表达载体中目的基因的上游有启动子
2．农杆菌能感染双子叶植物而通常不感染单子叶植物，是因为受伤的双子叶植物能分泌某些酚类物质诱导Ti质粒中的Vir基因区段表达，该表达产物能诱导Ti质粒产生一条新的T－DNA单链分子。此单链分子可进入植物细胞并整合到染色体中。下列相关叙述错误的是(　　)
A．可以通过在伤口施加相关酚类物质而使单子叶植物也成为农杆菌易感植物
B．农杆菌感染宿主细胞的原理与肺炎链球菌转化实验的原理类似
C．使用农杆菌转化法时，目的基因应插入Ti质粒的T－DNA中
D．合成新的T－DNA单链需要的DNA连接酶与限制酶，均在宿主细胞内合成
二、检测目的基因及其表达产物
四个方面进行检测和鉴定：________、RNA、蛋白质和____________。
提醒　(1)通过检测DNA可确定目的基因在受体细胞中是否稳定存在。(2)进行转录和翻译水平检测的原因是插入的目的基因不一定会表达。(3)进行个体性状检测的原因是基因表达产物不一定具有活性，个体表现出目的基因控制的特定性状并稳定遗传是判断转基因成功的直接证据。
判断正误
(1)PCR技术可更加精准地鉴定受体细胞是否转入目的基因(　　)
(2)核酸分子杂交只能检测DNA，不能检测RNA(　　)
(3)核酸探针是带有放射性或荧光标记的单链DNA(　　)
(4)能探测到目的蛋白，说明目的基因在受体细胞内成功表达(　　)
(5)个体水平是否出现相应性状是判断转基因成功的直接证据(　　)
任务三：借助标记基因检测受体细胞是否含有目的基因的原理
某一质粒载体如图所示，外源DNA插入ampr或tetr中会导致相应的基因失活(ampr表示氨苄青霉素抗性基因，tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamHⅠ酶切后，与用BamHⅠ酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌，结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。计划用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，回答下列问题：
(1)未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是什么？
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
(2)含有质粒载体和含有插入了目的基因的重组质粒的细胞也是不能区分的，其原因是什么？
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
(3)若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌的单菌落，还需使用含有什么物质的固体培养基？原因是什么？
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
任务四：目的基因及其表达产物的检测和鉴定方法
1．用什么方法可以更加精准地鉴定受体细胞中是否转入了目的基因？
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
2．用什么方法检测目的基因是否转录和翻译？
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
3．如果目的基因是抗虫基因，在个体水平上怎么检测？如果目的基因是耐盐基因呢？
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
　检测目的基因及其表达产物
(1)界定“标记基因”与“PCR技术”或“核酸分子杂交技术”在目的基因检测中的作用。
①载体上标记基因的标记原理
载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养基中加入该种抗生素就可能只保留转入载体并已表达的受体细胞，倘若在选择培养基中不能存活，则表明无载体转入，当然不会有“目的基因”转入，能存活时必含该载体。
②“标记基因”筛选后还需应用“PCR技术”或“核酸分子杂交技术”确认目的基因是否转入的原因：经上述步骤筛选得到的受体细胞，只是含特定的标记基因的质粒，然而，该质粒上是否成功嵌入了目的基因还不确定，故仍需利用“PCR技术”或“核酸分子杂交技术”检测受体细胞的质粒上是否含有目的基因。
(2)使用“PCR技术”或“目的基因”作探针，运用“核酸分子杂交技术”检测目的基因是否转录出特定的mRNA。
(3)采用“抗原—抗体杂交技术”，从转基因生物中提取蛋白质(作抗原)与相应抗体杂交，依据是否出现杂交带确认目的基因是否“指导”特定蛋白质的合成。
(4)采用抗虫、抗病毒等“接种实验”进行目的基因成功表达的“个体生物学”水平的检测。
3．图1表示某重组质粒的构建过程，质粒P0具有四环素抗性基因(tetr)和氨苄青霉素抗性基因(ampr)，并且含有限制性内切核酸酶EcoRⅤ的酶切位点。为筛选出含有重组质粒P1的菌落，采用含有不同抗生素的平板进行筛选，得到甲、乙、丙三类菌落，三类菌落形态相同，其生长情况如图2。下列叙述正确的是(　　)
A．甲类菌落可能同时导入了P0和P1质粒
B．乙类菌落扩大培养后可用于生产
C．丙类菌落可能导入了含反向连接目的基因的质粒
D．用玻璃刮刀将无抗生素平板上的菌落按位置接种到其他三个平板上
4．为了对重金属污染的土壤进行生物修复，研究者将从杨树中克隆的重金属转运蛋白(HMA3)基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中(如图)。为检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因，同时避免内源HMA3基因的干扰，在进行PCR扩增时，应选择的引物组合是(　　)
A．①＋③ B．①＋②
C．③＋② D．③＋④
答案精析
一、梳理教材新知
1．(1)扩增　蛋白质　复制起点　启动子　终止子　(2)相同限制酶　连接酶　重组质粒
2．感受态细胞　显微注射　受精卵　农杆菌转化
T－DNA　转化　植物染色体DNA　植物组织培养　基因枪　花粉管通道
判断正误
(1)×　(2)√　(3)√
提示　(1)在构建重组DNA分子时，为形成相同的黏性末端，常用同种限制酶剪切含目的基因的DNA片段及表达载体，但也可用同尾酶(切割不同的DNA片段但产生相同黏性末端的一类限制酶)进行切割。
探究核心知识
(1)不能用限制酶SamⅠ切割质粒。因为限制酶SmaⅠ会破坏质粒上的抗生素抗性基因，质粒上的抗生素抗性基因是标记基因，便于重组DNA分子的筛选，若被破坏，则无法进一步筛选。
(2)双酶切法可以防止质粒和目的基因的自身环化以及目的基因与质粒的反向连接。
任务二
(1)需要限制酶、DNA连接酶的作用。
(2)原因是农杆菌中的Ti质粒上的T－DNA片段能整合到植物染色体DNA中，将目的基因插入质粒的T－DNA中，目的基因就会随T－DNA整合到植物染色体DNA中。
(3)将重组质粒导入农杆菌细胞时，要用CaCl2溶液处理农杆菌细胞，使其成为感受态细胞，有利于重组质粒的导入。
落实思维方法
1．C　[限制酶SmaⅠ的识别序列位于目的基因中，因此利用表达载体构建重组DNA分子时不能用限制酶SmaⅠ，应用限制酶PstⅠ、EcoRⅠ，A正确；表达载体中的抗青霉素基因在受体细胞中能稳定存在且遗传给下一代，B正确；表达载体中抗原基因的终止子位于抗青霉素基因的上游，C错误；表达载体中目的基因的上游有启动子，是RNA聚合酶识别和结合的位点，D正确。]
2．D　[由题干信息可知，农杆菌能感染双子叶植物是因为受伤的双子叶植物能分泌某些酚类物质诱导Ti质粒中的Vir基因区段表达，因此可以通过在伤口施加相关酚类物质而使单子叶植物也成为农杆菌易感植物，A正确；农杆菌感染宿主细胞是把Ti质粒上的T－DNA片段整合到植物细胞染色体DNA中，其原理与肺炎链球菌转化实验的原理类似，都是基因重组，B正确。]
二、梳理教材新知
DNA　个体性状　标记基因　PCR引物　待检DNA　电泳　DNA测序技术　放射性　DNA或RNA　单链　mRNA　抗原－抗体　特定性状
判断正误
(1)√　(2)×　(3)×　(4)√　(5)√
提示　(2)核酸分子杂交能检测DNA，也能检测目的基因是否转录出RNA。(3)核酸探针是带有放射性或荧光标记的具有特定核苷酸序列的DNA或RNA。
探究核心知识
任务三
(1)二者均不含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不能生长。
(2)二者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长。
(3)还需要含有四环素的固体培养基。因为目的基因的插入破坏了质粒载体的tetr(四环素抗性基因)，故含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌不能在含有四环素的培养基上生长，从而与仅含有质粒载体的大肠杆菌区分开。
任务四
1．PCR技术和核酸分子杂交技术。
2．用核酸分子杂交技术检测目的基因是否转录出mRNA；用抗原—抗体杂交技术检测目的基因是否翻译出相应蛋白质。
3．如果目的基因是抗虫基因，则要进行抗虫接种实验。如果目的基因是耐盐基因，则要用一定浓度的盐水浇灌。
落实思维方法
3．A　[由题图可知，甲类菌落既抗氨苄青霉素，又抗四环素，其可能同时导入了P0和P1质粒，也可能只导入了P0质粒，A正确；乙类菌落不抗四环素，但抗氨苄青霉素，其可能导入了P1质粒，但还需要进一步的鉴定，例如进行抗原—抗体杂交后，才能扩大培养进行生产，B错误；丙类菌落既不抗四环素，也不抗氨苄青霉素，说明其没有导入质粒，C错误；应该用接种环将菌落接种到其他平板上，D错误。]
4．B　[根据图示中引物的位置可知，若要检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因，同时避免内源HMA3基因的干扰，需要检测是否含有高效启动子序列和HMA3基因序列，应选择的引物组合为①＋②，B符合题意。](共82张PPT)
第3课时
表达载体的构建和目的基因的导入和检测
第四章 基因工程
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学习目标
1.说出表达载体的组成和利用表达载体构建重组DNA分子的过程。
2.列举将目的基因导入细菌、动物细胞和植物细胞的方法。
3.列举检测目的基因及其表达产物的方法。
4.概括基因工程的基本操作程序。
5.针对人类生产或生活的需要，能运用基因工程技术尝试设计获得某一转基因产品的方案。
内容索引
一、利用表达载体构建重组DNA分子、将目的基因导入受体细胞
二、检测目的基因及其表达产物
课时对点练
利用表达载体构建重组DNA分子、将目的基因导入受体细胞
一
1.利用表达载体构建重组DNA分子——基因工程的核心
(1)相关概念与组成
梳理　教材新知
终止子
扩增
蛋白质
复制起点
启动子
(2)构建重组DNA分子
重组质粒
相同
限制酶
连接酶
2.将目的基因导入受体细胞
感受态细胞
显微
注射
受精卵
农杆菌
转化
T-DNA
转化
植物染色体DNA
植物组织培养
基因
枪
花粉管
通道
(1)构建重组DNA分子时，必须用同种限制酶剪切含目的基因的DNA片段及表达载体(　　)
提示　在构建重组DNA分子时，为形成相同的黏性末端，常用同种限制酶剪切含目的基因的DNA片段及表达载体，但也可用同尾酶(切割不同的DNA片段但产生相同黏性末端的一类限制酶)进行切割。
×
(2)Ca2＋能促进细菌摄取外源DNA，成为感受态细胞(　　)
(3)Ti质粒上的T－DNA片段能整合到植物染色体DNA中(　　)
√
√
任务一：限制酶的选择原则
如表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中箭头表示相关限制酶的酶切位点。请据图回答下列问题：
探究　核心知识
限制酶 BamHⅠ HindⅢ EcoRⅠ SmaⅠ
识别序 列及切 割位点
(1)构建重组DNA分子，能否用限制酶SmaⅠ切割质粒？为什么？
限制酶 BamHⅠ HindⅢ EcoRⅠ SmaⅠ
识别序 列及切 割位点
提示　不能用限制酶SamⅠ切割质粒。因为限制酶SmaⅠ会破坏质粒上的抗生素抗性基因，质粒上的抗生素抗性基因是标记基因，便于重组DNA分子的筛选，若被破坏，则无法进一步筛选。
(2)与只使用限制酶EcoRⅠ(又称单酶切法)相比较，使用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶同时处理(又称双酶切法)质粒、外源DNA的优点是什么？
限制酶 BamHⅠ HindⅢ EcoRⅠ SmaⅠ
识别序 列及切 割位点
提示　双酶切法可以防止质粒和目的基因的自身环化以及目的基因与质粒的反向连接。
任务二：农杆菌转化法的原理
如图为利用农杆菌转化法制备转基因植物的过程图，据图回答下列问题：
(1)重组Ti质粒的构建需要哪些酶的作用？
提示　需要限制酶、DNA连接酶的作用。
(2)在用农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞的过程中，一定要将目的基因插入Ti质粒的T－DNA上的原因是什么？
提示　原因是农杆菌中的Ti质粒上的T－DNA片段能整合到植物染色体DNA中，将目的基因插入质粒的T－DNA中，目的基因就会随T－DNA整合到植物染色体DNA中。
(3)将重组质粒导入农杆菌细胞时，应怎样处理农杆菌细胞？
提示　将重组质粒导入农杆菌细胞时，要用CaCl2溶液处理农杆菌细胞，使其成为感受态细胞，有利于重组质粒的导入。
1.限制酶的选择原则
核心归纳
(1)根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类
①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，以便将目的基因“切出”，如图甲可选择PstⅠ。
②不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，以防破坏目的基因，如图甲不能选择SmaⅠ。
核心归纳
③为避免目的基因和质粒的自身环化和反向连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲和图乙也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(双酶切法)，而且这种双酶切法不会破坏目的基因、标记基因、启动子和终止子。
核心归纳
(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类
①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶一致，以确保具有相同的黏性末端。
②质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，应至少含有一个完好的标记基因，如图中限制酶PstⅠ因其会破坏标记基因而不宜选择。
核心归纳
③所选限制酶切点不应位于复制起点处，会破坏复制起点，如果所选限制酶的切点不止一个，则切割重组后可能会丢失某些片段，若丢失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。
核心归纳
④所选限制酶切点应位于启动子与终止子之间，如图中HindⅢ会破坏启动子，EcoRⅠ会破坏终止子，而NdeⅠ和BamHⅠ切出的切口可让目的基因嵌入启动子与终止子之间。
核心归纳
(3)参考Ti质粒的T－DNA片段选择限制酶
若质粒上标出T－DNA片段，则所选限制酶切点应位于T－DNA片段中，从而有利于将目的基因嵌入T－DNA片段上——因为Ti质粒的T－DNA片段最易转移至受体细胞并且整合到受体细胞染色体DNA中。
2.农杆菌转化法中的两次拼接、两次导入
核心归纳
(1)两次拼接：第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T－DNA上，第二次拼接(非人工操作)是指携带目的基因的T－DNA整合到受体细胞染色体的DNA上。
核心归纳
(2)两次导入：第一次导入是将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌，第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T－DNA导入受体细胞。
1.如图是利用基因工程技术构建重组表达载体的过程示意图，其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ为四种限制酶。下列相关叙述错误的是
A.需要用限制酶PstⅠ和EcoRⅠ来切割质粒
B.表达载体中的抗青霉素基因在受体细胞
中能复制
C.表达载体中抗原基因的终止子位于抗青
霉素基因的下游
D.表达载体中目的基因的上游有启动子
落实　思维方法
√
限制酶SmaⅠ的识别序列位于目的基因
中，因此利用表达载体构建重组DNA
分子时不能用限制酶SmaⅠ，应用限制
酶PstⅠ、EcoRⅠ，A正确；
表达载体中的抗青霉素基因在受体细胞中能稳定存在且遗传给下一代，B正确；
表达载体中抗原基因的终止子位于抗青霉素基因的上游，C错误；
表达载体中目的基因的上游有启动子，是RNA聚合酶识别和结合的位点，D正确。
2.农杆菌能感染双子叶植物而通常不感染单子叶植物，是因为受伤的双子叶植物能分泌某些酚类物质诱导Ti质粒中的Vir基因区段表达，该表达产物能诱导Ti质粒产生一条新的T－DNA单链分子。此单链分子可进入植物细胞并整合到染色体中。下列相关叙述错误的是
A.可以通过在伤口施加相关酚类物质而使单子叶植物也成为农杆菌易感
植物
B.农杆菌感染宿主细胞的原理与肺炎链球菌转化实验的原理类似
C.使用农杆菌转化法时，目的基因应插入Ti质粒的T－DNA中
D.合成新的T－DNA单链需要的DNA连接酶与限制酶，均在宿主细胞内
合成
√
由题干信息可知，农杆菌能感染双子叶植物是因为受伤的双子叶植物能分泌某些酚类物质诱导Ti质粒中的Vir基因区段表达，因此可以通过在伤口施加相关酚类物质而使单子叶植物也成为农杆菌易感植物，A正确；
农杆菌感染宿主细胞是把Ti质粒上的T－DNA片段整合到植物细胞染色体DNA中，其原理与肺炎链球菌转化实验的原理类似，都是基因重组，B正确。
检测目的基因及其表达产物
二
四个方面进行检测和鉴定： 、RNA、蛋白质和 。
梳理　教材新知
DNA
个体性状
标记基因
PCR引物
待检DNA
电泳
DNA测序技术
放射性
DNA或RNA
单链
特定性状
mRNA
抗原-
抗体
提醒　(1)通过检测DNA可确定目的基因在受体细胞中是否稳定存在。
(2)进行转录和翻译水平检测的原因是插入的目的基因不一定会表达。
(3)进行个体性状检测的原因是基因表达产物不一定具有活性，个体表现出目的基因控制的特定性状并稳定遗传是判断转基因成功的直接证据。
(1)PCR技术可更加精准地鉴定受体细胞是否转入目的基因(　　)
(2)核酸分子杂交只能检测DNA，不能检测RNA(　　)
×
提示　核酸分子杂交能检测DNA，也能检测目的基因是否转录出RNA。
(3)核酸探针是带有放射性或荧光标记的单链DNA(　　)
√
提示　核酸探针是带有放射性或荧光标记的具有特定核苷酸序列的DNA或RNA。
×
(4)能探测到目的蛋白，说明目的基因在受体细胞内成功表达(　　)
(5)个体水平是否出现相应性状是判断转基因成功的直接证据(　　)
√
√
任务三：借助标记基因检测受体细胞是否含有目的基因的原理
某一质粒载体如图所示，外源DNA插入ampr或tetr中
会导致相应的基因失活(ampr表示氨苄青霉素抗性基
因，tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用
BamHⅠ酶切后，与用BamHⅠ酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌，结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。计划用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，回答下列问题：
探究　核心知识
(1)未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是什么？
提示　二者均不含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不能生长。
(2)含有质粒载体和含有插入了目的基因的重组质粒的细胞也是不能区分的，其原因是什么？
提示　二者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长。
(3)若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌的单菌落，还需使用含有什么物质的固体培养基？原因是什么？
提示　还需要含有四环素的固体培养基。因为目的基因的插入破坏了质粒载体的tetr(四环素抗性基因)，故含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌不能在含有四环素的培养基上生长，从而与仅含有质粒载体的大肠杆菌区分开。
任务四：目的基因及其表达产物的检测和鉴定方法
1.用什么方法可以更加精准地鉴定受体细胞中是否转入了目的基因？
提示　PCR技术和核酸分子杂交技术。
2.用什么方法检测目的基因是否转录和翻译？
提示　用核酸分子杂交技术检测目的基因是否转录出mRNA；用抗原—抗体杂交技术检测目的基因是否翻译出相应蛋白质。
3.如果目的基因是抗虫基因，在个体水平上怎么检测？如果目的基因是耐盐基因呢？
提示　如果目的基因是抗虫基因，则要进行抗虫接种实验。如果目的基因是耐盐基因，则要用一定浓度的盐水浇灌。
(1)界定“标记基因”与“PCR技术”或“核酸分子杂交技术”在目的基因检测中的作用。
①载体上标记基因的标记原理
载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养基中加入该种抗生素就可能只保留转入载体并已表达的受体细胞，倘若在选择培养基中不能存活，则表明无载体转入，当然不会有“目的基因”转入，能存活时必含该载体。
核心归纳
检测目的基因及其表达产物
②“标记基因”筛选后还需应用“PCR技术”或“核酸分子杂交技术”确认目的基因是否转入的原因：经上述步骤筛选得到的受体细胞，只是含特定的标记基因的质粒，然而，该质粒上是否成功嵌入了目的基因还不确定，故仍需利用“PCR技术”或“核酸分子杂交技术”检测受体细胞的质粒上是否含有目的基因。
(2)使用“PCR技术”或“目的基因”作探针，运用“核酸分子杂交技术”检测目的基因是否转录出特定的mRNA。
核心归纳
(3)采用“抗原—抗体杂交技术”，从转基因生物中提取蛋白质(作抗原)与相应抗体杂交，依据是否出现杂交带确认目的基因是否“指导”特定蛋白质的合成。
(4)采用抗虫、抗病毒等“接种实验”进行目的基因成功表达的“个体生物学”水平的检测。
核心归纳
3.图1表示某重组质粒的构建过程，质粒P0具有四环素抗性基因(tetr)和氨苄青霉素抗性基因(ampr)，并且含有限制性内切核酸酶EcoRⅤ的酶切位点。为筛选出含有重组质粒P1的菌落，采用含有不同抗生素的平板进行筛选，得到甲、乙、丙三类菌落，三类菌落形态相同，其生长情况如图2。下列叙述正确的是
A.甲类菌落可能同时导入了P0和P1质粒
B.乙类菌落扩大培养后可用于生产
C.丙类菌落可能导入了含反向连接目的
基因的质粒
D.用玻璃刮刀将无抗生素平板上的菌落
按位置接种到其他三个平板上
落实　思维方法
√
由题图可知，甲类菌落既抗氨苄青霉素，又抗四环素，其可能同时导入了P0和P1质粒，也可能只导入了P0质粒，A正确；
乙类菌落不抗四环素，但抗氨苄青霉素，其可能导入了P1质粒，但还需要进一步的鉴定，例如进行抗原—抗体杂交后，才能扩大培养进行生产，B错误；
丙类菌落既不抗四环素，也不抗氨苄青霉素，说明其没有导入质粒，C错误；
应该用接种环将菌落接种到其他平板上，D错误。
4.为了对重金属污染的土壤进行生物修复，研究者将从杨树中克隆的重金属转运蛋白(HMA3)基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中(如图)。为检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因，同时避免内源HMA3基因的干扰，在进行PCR扩增时，应选择的引物组合是
A.①＋③
B.①＋②
C.③＋②
D.③＋④
√
根据图示中引物的位置可知，若要检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因，同时避免内源HMA3基因的干扰，需要检测是否含有高效启动子序列和HMA3基因序列，应选择的引物组合为①＋②，B符合题意。
网络构建
课时对点练
三
题组一　利用表达载体构建重组DNA分子
1.(2024·台州高二期中)基因工程的核心步骤是
A.获取目的基因
B.构建重组DNA分子
C.将重组DNA分子导入受体细胞
D.检测目的基因及其表达产物
√
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2.质粒的示意图如图，其中ori为复制必需的序列，ampr为氨苄青霉素抗性基因，tetr为四环素抗性基因，箭头表示限制性内切核酸酶的酶切位点。若要得到一个能在氨苄青霉素培养基上生长而不能在四环素培养基上生长的含重组质粒的细胞，应选择的合适的酶切位点是
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图A中酶切位点在ori序列上，该序列被破坏，重组质粒将无法进行复制，因此含重组质粒的细胞既不能在四环素培养基上生长，也不能在氨苄青霉素培养基上生长，A不符合题意；
图B中酶切位点没有破坏三个基因，因此含重组质粒的细胞既能在四环素培养基上生长，也能在氨苄青霉素培养基上生长，B不符合题意；
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图C中酶切位点在氨苄青霉素抗性基因上，氨苄青霉素抗性基因被破坏，则含重组质粒的细胞能在四环素培养基上生长而不能在氨苄青霉素培养基上生长，C不符合题意；
图D中酶切位点在四环素抗性基因上，四环素抗性基因被破坏，则含重组质粒的细胞能在氨苄青霉素培养基上生长而不能在四环素培养基上生长，D符合题意。
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3.下列关于重组DNA分子的说法，不正确的是
A.真核基因要在细菌中持续高水平地表达，质粒上需要加入细菌的启动
子、终止子
B.重组DNA分子包含启动子、目的基因、终止子、标记基因等
C.启动子位于目的基因的“上游”，能够启动翻译
D.不同的目的基因所需的启动子不一定相同
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重组DNA分子包括启动子、终止子、目的基因、标记基因，其中启动子位于目的基因的“上游”，是启动转录的一段DNA，终止子位于目的基因末端，B正确，C错误；
不同的目的基因具有不同的核苷酸序列，其启动子也不一定相同，D正确。
4.(2024·宁波高二期中)图1、图2中箭头表示相关限制酶的酶切位点。下列说法正确的是
A.重组DNA技术所用的工具酶是限制酶、DNA连
接酶和载体
B.不同种限制酶切割DNA产生的黏性末端一定不
能互补
C.用图中质粒和外源DNA构建重组质粒，可使用
SmaⅠ切割
D.使用EcoRⅠ同时处理质粒和外源DNA，可能会发生质粒或目的基因的自身
环化
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载体不是工具酶，A错误；
某些不同的限制酶切割DNA也可能产生相同的黏性末端，这些黏性末端可以互补，B错误；
由于目的基因内部和抗生素抗性基因内部都含有SmaⅠ的酶切位点，故不能使用SmaⅠ切割目的基因和外源DNA，C错误；
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使用EcoRⅠ同时处理质粒和外源DNA，可能会发生质粒或目的基因的自身环化，一般用两种限制酶切割质粒和外源DNA，防止自身环化，D正确。
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题组二　将目的基因导入受体细胞
5.基因工程受体细胞可以是细菌、动物或者植物细胞，因此将目的基因导入受体细胞的方法也有所差异。下列叙述错误的是
A.导入植物细胞常采用农杆菌转化法
B.基因枪法可将目的基因导入植物叶绿体等细胞器中
C.大肠杆菌作为受体细胞时，通常需要使用CaCl2溶液处理
D.显微注射可以将目的基因直接注射给植物体受精卵细胞
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将目的基因导入植物细胞采用最多的方法是农杆菌转化法，此外还有基因枪法和花粉管通道法等，A正确；
基因枪法可将目的基因导入叶绿体等细胞器中，这样可以避免目的基因随着花粉进行传播，B正确；
将目的基因导入微生物细胞，如大肠杆菌时，常用CaCl2溶液处理法，即需要使用CaCl2溶液处理大肠杆菌细胞，使之成为感受态细胞，C正确；
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显微注射可以将目的基因的重组DNA片段通过显微操作仪注射到动物受精卵内还未融合的雄性细胞核中，体外培养一段时间后再将胚胎移植到雌性动物子宫内，从而可获得转基因动物，D错误。
6.(2024·浙大附中高二期中)研究人员利用农杆菌将外源基因A导入水稻细胞中，然后通过植物组织培养技术获得了含有外源基因A的第一代水稻植株。如图为重组Ti质粒示意图。下列叙述错误的是
A.外源基因A必须整合在T－DNA片段内
B.第一代水稻植株中所有细胞都存在外源基因A
C.水稻的组织培养过程中需调整植物激素的比例
D.培养含有外源基因A的水稻细胞不需要添加潮霉素
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Ti质粒的T－DNA片段可以整合到受体细胞的染色体DNA中，故外源基因A必须整合在T－DNA片段内，A正确；
第一代水稻植株进行减数分裂时，同源染色体分离，产生的配子细胞可能不含有外源基因A，B错误；
水稻组织培养过程中需调节植物激素的种类和比例，以保证愈伤组织再分化并得到完整的植株，C正确。
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题组三　检测目的基因及其表达产物
7.检测目的基因是否在转基因生物体内表达成功的常用方法是
A.核酸分子杂交技术
B.荧光分子标记技术
C.放射性同位素标记技术
D.抗原—抗体杂交技术
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8.目的基因导入受体细胞后，需要检测目的基因是否可以维持稳定和表达其遗传特性。下列关于目的基因的检测和鉴定的叙述，正确的是
A.目的基因能否在受体细胞中稳定遗传的关键是能否转录出mRNA
B.可采用PCR检测目的基因是否转录和翻译
C.可从转基因生物中提取蛋白质来检测目的基因是否翻译成相应蛋白质
D.抗虫、抗病检验用于确定转基因生物是否具备相关性状属于分子水平
的检测
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目的基因导入受体细胞后，首先要检测转基因生物(染色体)DNA上是否插入了目的基因，这是目的基因能否在受体细胞中稳定遗传的关键，A错误；
PCR可用于检测目的基因是否转录，检测目的基因是否翻译用抗原—抗体杂交技术，B错误；
抗虫、抗病检验用于确定转基因生物是否具备相关性状，属于个体生物学水平的鉴定，D错误。
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9.(2024·杭州学军中学高二月考)科研人员利用农杆菌转化法将抗病毒蛋白基因C导入番木瓜，培育出转基因抗病毒番木瓜，所用的Ti质粒如图所示。下列叙述正确的是
A.该技术的原理是农杆菌的拟核DNA与番木瓜基因
发生重组
B.构建表达载体需要限制酶和耐高温的Taq DNA聚
合酶
C.可利用PCR技术筛选出含有抗病毒蛋白基因C的受体细胞
D.可利用卡那霉素抗性基因检测是否成功构建抗病毒番木瓜
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和番木瓜基因发生重组的是农杆菌Ti质粒上的基
因，A错误；
构建表达载体需要限制酶和DNA连接酶，B错误；
可利用 PCR 技术扩增目的基因，进而筛选出含
有抗病毒蛋白基因C的受体细胞，C正确；
因为转入番木瓜的是重组Ti质粒的T－DNA，其中不含卡那霉素抗性基因，因此转基因抗病毒番木瓜中不含有卡那霉素抗性基因，D错误。
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阅读下列材料，完成第10、11小题。
研究发现，利用抗体抑制肿瘤细胞表面的CD47蛋白的活性，可促进巨噬细胞吞噬肿瘤细胞。为制备抗CD47抗体，研究人员先利用基因工程制备CD47蛋白，如图为含CD47基因的外源DNA、质粒DNA的有关信息，EcoRⅠ、BamHⅠ、SalⅠ、XhoⅠ均为限制酶，Kanr、tetr分别为卡那霉素抗性基因、四环素抗性基因。
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10.为了形成合适的重组质粒，切割外源DNA和质粒DNA时应该选用的限制酶是
A.EcoRⅠ和XhoⅠ B.BamHⅠ和XhoⅠ
C.EcoRⅠ和SalⅠ D.BamHⅠ和SalⅠ
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由题图可知，当用EcoRⅠ和XhoⅠ切割质粒时，质粒上的两个标记基因均被破坏，故构建重组质粒不能选用EcoRⅠ和XhoⅠ，A不符合题意；
用BamHⅠ和XhoⅠ构建重组质粒时，既可以获得完整的目的基因，又可以获得含有卡那霉素抗性基因的重组质粒，B符合题意；
由于目的基因内含有SalⅠ的酶切位点，所以不能用SalⅠ切割目的基因，C、D不符合题意。
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11.重组质粒导入大肠杆菌的成功率很低，需经筛选才能获得导入成功的大肠杆菌，以下菌种为所需菌种的是
A.能在含卡那霉素的培养基上生长的菌种
B.能在含四环素的培养基上生长的菌种
C.能在含卡那霉素的培养基上生长、而不能在含四环素的培养基上生长
的菌种
D.能在含四环素的培养基上生长、而不能在含卡那霉素的培养基上生长
的菌种
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根据分析可知，用BamHⅠ和XhoⅠ构建重组质粒时，重组质粒中的四环素抗性基因被破坏，而卡那霉素抗性基因未被破坏，所以重组质粒导入成功的大肠杆菌中含有卡那霉素抗性基因，而不含四环素抗性基因，故所需菌种能在含卡那霉素的培养基上生长、而不能在含四环素的培养基上生长，C符合题意。
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12.某课题组为得到青蒿素高产品系，将青蒿素合成过程中的某一关键酶基因(fps)通过图示方法，使该基因在细胞内的表达增加，以实现转基因青蒿中青蒿素含量的显著提高。下列叙述正确的是
A.可用PCR技术直接扩增青蒿总RNA来获取目的基因
B.通过PCR技术可检测fps基因是否表达出蛋白质
C.酶1、酶2和酶3作用的部位都是磷酸二酯键
D.含有fps基因的青蒿植株即为所需新品系
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提取青蒿总RNA后需要逆转录形成cDNA才能利用PCR技术扩增得到目的基因，PCR不能直接扩增RNA，A错误；
是否表达出蛋白质需要用抗原－抗体杂交技术检测，B错误；
据题图可知，酶1是逆转录酶，酶2是限制酶，酶3是DNA连接酶，它们的作用部位都是磷酸二酯键，C正确；
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含有fps基因的青蒿植株表示成功导入目的基因，但还需要最终检测出转基因青蒿中青蒿素含量的显著提高才表示得到了所需新品系，D错误。
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13.抗虫棉可有效减少棉铃虫对幼铃的危害，而使棉花生殖生长相对增强。转基因单价抗虫棉是将苏云金芽孢杆菌中专门破坏棉铃虫消化道的Bt毒蛋白基因经过改造后利用农杆菌转入棉花细胞中研制而成的。请回答下列有关问题：
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(1)获取Bt毒蛋白基因的方法有很多，例如：根据Bt毒蛋白的________序列，推导出其基因序列，再利用化学方法合成目的基因；用已获得的纯度高的Bt毒蛋白作为抗原，通过________________技术获得特异性探针，并将苏云金芽孢杆菌____________中所有基因进行表达，然后利用该探针，找出与之对应的目的基因。用PCR扩增目的基因时，为了能与酶切后的质粒进行连接，需要在扩增前设计的引物上添加___________________
__________，然后利用工具酶可获取重组质粒(表达载体)。
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氨基酸
单克隆抗体制备
基因组文库
限制(性内切核酸)酶
识别序列
(2)培育该转基因抗虫棉的核心环节是__________________，重组质粒进入受体细胞与质粒上的__________基因有关。
(3)转入Bt毒蛋白基因的棉花的愈伤组织细胞，主要有两条再生植株的途径：一是由愈伤组织先分化产生芽和根后再形成一个完整植株的_______
____途径；二是由愈伤组织产生_________后再萌发形成完整植株的发生途径。
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构建重组DNA分子
T－DNA
器官发
生
胚状体
14.(2024·台州高二期中)B基因存在于水稻基因组中，仅在体细胞(2n)和精子中正常表达，在卵细胞中不转录。为研究B基因表达对卵细胞的影响，设计了如图所示的实验来获取能
够在卵细胞中表达B基因的转基
因植株。Luc基因是荧光素酶基
因，能催化荧光素产生荧光。
请据图回答下列问题：
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(1)从水稻体细胞中提取总RNA，在________酶的催化下构建________文库，进而获得B基因编码蛋白的序列。要想快速、大量获得该B－Luc融合基因可以采用PCR技术，该技术的
原理是___________________，该
过程中需加入模板、引物、dNTP
和酶等，其中，被不断消耗的物
质有________________________，
dNTP的作用是________________。
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逆转录
cDNA
DNA的半保留复制
引物和dNTP(缺一不可)
提供原料和能量
(2)融合基因必须插入Ti质粒的__________中，并连接到启动子和终止子之间，其中启动子是____________的结合位点。图中卡那霉素抗性基因作为标记基因，用于检测______________________________________。
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T－DNA
RNA聚合酶
B－Luc融合基因是否成功导入农杆菌细胞
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融合基因必须插入Ti质粒的T－DNA中，并连接到启动子和终止子之间；启动子是RNA聚合酶的结合位点。图中卡那霉素抗性基因作为标记基因，用于检测B－Luc融合基因是否成功导入农杆菌细胞。
(3)过程①常对农杆菌进行________处理。若借助Luc基因的表达产物来完成图中第二次鉴定筛选，则具体方法是_____________________________
________。
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CaCl2
检测加入荧光素的细胞中是否发
出荧光
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过程①常对农杆菌用CaCl2进行处理，使其成为感受态细胞，便于转化。因为Luc基因能催化荧光素产生荧光，若借助Luc基因的表达产物来完成图中第二次鉴定筛选，则具体方法是检测加入荧光素的细胞中是否发出荧光。
(4)从转基因水稻植株未成熟种子中分离出胚，观察到细胞内仅含一个染色体组，判定该胚是由未受精的卵细胞发育形成的，而一般情况下水稻卵细胞在未受精时不进行发育，由此表明B基因的表达能使卵细胞______
_________________，该转基因水稻产生的所有卵细胞中不一定都含有
B－Luc融合基因的原因有_________________________________________
_________________________________________________________________________________________________________________(合理即可)。
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受精直接发育成胚
不经
若B－Luc融合基因只整合到水稻的一条染色体上，减数分裂后只有部分卵细胞含有B－Luc融合基因[或转基因水稻形成卵细胞的过程中B－Luc融合基因发生了突变(丢失)]
由题意可知，B基因的表达能使卵细胞不经受精直接发育成胚；该转基因水稻产生的所有卵细胞中不一定都含有B－Luc融合基因的原因：若B－Luc融合基因只整合到水稻的一条染色体上，减数分裂后只有部分卵细胞含有B－Luc融合基因；转基因水稻形成卵细胞的过程中B－Luc融合基因发生了突变(丢失)。
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14作业16　基因工程的工具酶和载体及DNA的粗提取和鉴定
(分值：100分)
第1～4题，每题5分；第5～13题，每题6分，共74分。
题组一　基因工程的工具酶和载体
1．下列关于限制性内切核酸酶的叙述，错误的是(　　 )
A．绝大多数的限制性内切核酸酶主要从原核细胞中获取
B．每一种限制性内切核酸酶只能识别特定的核苷酸序列
C．限制性内切核酸酶的作用位点是相邻核苷酸之间的氢键
D．同一种限制性内切核酸酶切割不同的DNA分子可产生能互补配对的黏性末端
2．(2024·台州高二期中)“基因剪刀”——限制性内切核酸酶是基因工程中非常重要的一种工具，它所切割的部位是(　　)
A．① B．② C．③ D．④
3．(2024·浙江嘉兴五中高二月考)下列有关酶的叙述，正确的是(　　)
A．DNA 连接酶以 DNA 的一条链为模板，将单个脱氧核苷酸连接起来
B．限制性内切核酸酶识别特定的核苷酸序列并在特定位点切割 DNA 分子
C．DNA 聚合酶可将两个 DNA 分子片段间的缝隙从5′端到3′端连接起来
D．逆转录酶是以 RNA 为模板指导核糖核苷酸连接合成 DNA 的酶
4．下列关于基因运输工具——载体，必须具备的条件之一及理由均正确的是(　　)
A．能够复制，以便目的基因插入其中
B．具有一种至多种限制酶的识别序列，便于目的基因的表达
C．具有某些标记基因，便于重组DNA的筛选
D．对受体细胞无害，便于重组DNA的筛选
5．下列关于质粒的叙述，正确的是(　　)
A．质粒是细菌细胞核中能自主复制的DNA分子
B．基因工程中被用作载体的质粒都是天然质粒
C．质粒完全水解后最多可产生6种化合物
D．质粒是基因工程中的一种工具酶
题组二　DNA的粗提取和鉴定
6．多种实验材料都可以用于DNA的粗提取和鉴定，用香蕉也可以取得较好的实验效果，下列操作正确的是(　　)
A．向剪碎的香蕉果肉组织中加入蒸馏水并搅拌，以释放核DNA
B．经研磨过滤后，将研磨液离心5 min，取沉淀物进行下一步操作
C．95%的冷酒精可以溶解某些蛋白质，得到粗提取的DNA
D．将DNA溶于NaCl溶液后，加入现配的二苯胺试剂，混合均匀即可出现蓝色
7．(2024·金华高二月考)关于“DNA的粗提取和鉴定”实验，下列说法正确的是(　　)
A．研磨时倒入的研磨液，是为了破坏细胞壁
B．离心研磨液是为了加速DNA的沉淀
C．过滤时在漏斗中垫上滤纸
D．粗提取DNA过程中，需加入EDTA以抑制DNA酶的活性
8．(2023·绍兴高二期末)下列关于“DNA粗提取和鉴定”实验的叙述，正确的是(　　)
A．DNA易溶于酒精，不易溶于2 mol/L的NaCl溶液
B．用相同方法从等体积猪血和鸡血中提取的DNA含量相近
C．DNA析出过程需用玻璃棒沿同一个方向轻轻搅动
D．在沸水中，DNA遇双缩脲试剂会出现紫色反应
9．下列关于限制酶与DNA连接酶的说法，正确的是(　　)
A．限制酶能对HIV的遗传物质进行切割
B．不同来源的限制酶识别的核苷酸序列一定不同
C．T4 DNA连接酶既能连接平末端也能连接黏性末端
D．DNA连接酶只能连接同种限制酶切割后的黏性末端
10．限制性内切核酸酶可以在特定的位点将DNA分子剪切开。如图为不同种限制酶的识别序列，箭头所指的是酶切位点，下列叙述错误的是(　　)
A．能被BamHⅠ识别的序列也一定能被Sau3AⅠ识别
B．一个DNA分子被EcoRⅠ切成两个片段时会发生8个氢键的断裂
C．质粒作为基因工程的常用载体，通常会有一种至多种限制性内切核酸酶的切割位点
D．用BamHⅠ切割的目的基因和用Sau3AⅠ切割的质粒无法连接
11．(2024·金华高二期末)部分限制酶的识别序列及切割位点如表(注：箭头表示切割位点)。下列叙述正确的是(　　)
名称 识别序列及切割位点 名称 识别序列及切割位点
AatⅠ AGG↓CCT TCC↑GGA EcoRⅠ G↓AATTC CTTAA↑G
KpnⅠ G↓GTACC CCATG↑G BamHⅠ G↓GATCC CCTAG↑G
A.表中4种限制酶均是从DNA两端逐步剪切核苷酸
B．EcoRⅠ酶切后形成的黏性末端是5′－AATT－3′
C．KpnⅠ与BamHⅠ处理不同的DNA片段可获得互补的黏性末端
D．E.coliDNA连接酶可连接AatⅠ酶切后形成的片段
12．(2024·台州高二联考)已知一双链DNA分子，用限制酶Ⅰ切割得到长度为120 kb( kb：千碱基对)的片段；用限制酶Ⅱ切割得到40 kb和80 kb 2个片段；同时用限制酶Ⅰ和限制酶Ⅱ切割时，得到10 kb、80 kb和30 kb 3个片段。据此分析该双链DNA分子结构及酶切位点情况为(　　)
A　　　　　　　　　　B
C　　　　　　　　　　D
13．如表为常用的限制酶及其识别序列和切割位点，据表分析，下列说法正确的是(　　)
限制酶 BamHⅠ EcoRⅠ HindⅡ KpnⅠ Sau3AⅠ SmaⅠ
识别序列和切割位点 G↓GATCC G↓AATTC GTY↓RAC GGTAC↓C ↓GATC CCC↓GGG
注：Y表示C或T，R表示A或G。
A．一种限制酶只能识别一种脱氧核苷酸序列
B．限制酶的切点一定位于识别序列的内部
C．不同限制酶切割后一定形成不同的黏性末端
D．限制酶切割后不一定形成黏性末端
14．(14分)通过重组DNA技术使原有基因得以改造的动物称为转基因动物。运用这一技术可使羊奶中含有人体蛋白质。如图表示这一技术的基本过程。在该工程中所用的基因“分子手术刀”能识别的序列和切点是，请回答下列问题：
(1)从羊染色体中“剪下”羊蛋白质基因的酶是____________。人体蛋白质基因“插入”后连接在羊染色体中时需要的酶是____________________。
(2)(4分)请在方框中画出质粒被切割形成黏性末端的过程图。
(3)(4分)人体蛋白质基因之所以能“插入”羊的染色体内，是因为____________________。
(4)1970年，科学家在细菌中发现了第一个限制酶，而在该细菌中没有此限制酶的识别序列，推测该限制酶在细菌细胞中的作用可能是_________________________________________。
15．(12分)某生物兴趣小组开展DNA的粗提取和鉴定的相关探究活动，具体步骤如下：
材料处理：称取新鲜的菜花、辣椒和蒜黄各2份，每份10 g。剪碎后分成两组，一组置于20 ℃、另一组置于－20 ℃条件下保存24 h。
(1)DNA粗提取结果如表。
材料保存温度 菜花 辣椒 蒜黄
20 ℃ ＋＋ ＋ ＋＋＋
－20 ℃ ＋＋＋ ＋＋ ＋＋＋＋
注：“＋”越多，表示蓝色越深。
(2)该探究性实验课题的名称可能是“探究不同材料和不同________对DNA提取量的影响”。
(3)DNA的鉴定可用__________试剂在__________条件下进行。
(4)根据实验结果分析：
①结论1：与20 ℃相比，相同实验材料在－20 ℃条件下保存，DNA的提取量更____(填“多”或“少”)。
结论2：等质量的不同实验材料，在相同的保存温度下，从________中提取的DNA量最多。
②针对结论1，请提出合理的解释：低温抑制了________的活性，DNA降解速度减慢。
答案精析
1．C　[绝大多数的限制性内切核酸酶主要从细菌等原核细胞中获取，A正确；限制性内切核酸酶具有特异性，每一种限制性内切核酸酶只能识别特定的核苷酸序列，并在特定的位点将其切割，B正确；限制性内切核酸酶的作用位点是相邻核苷酸之间的磷酸二酯键，C错误；不同限制性内切核酸酶切割不同的DNA分子有可能产生相同的黏性末端，同一种限制性内切核酸酶切割不同的DNA分子可产生能互补配对的黏性末端，D正确。]
2．B　[限制性内切核酸酶识别双链DNA上特定的一小段核苷酸序列，并催化其中特定的两个核苷酸之间的磷酸二酯键水解，即图中部位②，部位①是磷酸基团和脱氧核糖之间的化学键，部位③是脱氧核糖和碱基之间的化学键，部位④是氢键，B符合题意。]
3．B　[DNA连接酶连接两个DNA分子片段，A错误；DNA聚合酶将单个的脱氧核苷酸连接到DNA单链末端，C错误；逆转录酶是以RNA为模板指导脱氧核苷酸连接合成DNA的酶，D错误。]
4．C　[载体要能够在受体细胞中稳定地保存下来并大量复制，以便提供大量的目的基因，A错误；载体要具有一种至多种限制酶的识别序列，以便外源基因插入其中，B错误；携带外源DNA片段的载体进入受体细胞后，能够在受体细胞中进行自我复制，或整合到受体细胞DNA上，随受体细胞DNA进行同步复制，所以载体要对受体细胞无害，以便受体细胞能正常增殖，D错误。]
5．C　[质粒的化学本质是DNA分子，完全水解后最多可产生6种化合物，即磷酸、脱氧核糖、4种含氮碱基(A、T、C、G)，C正确；质粒是基因工程的载体，不是工具酶，D错误。]
6．C　[香蕉果肉组织细胞有细胞壁保护，因此加入蒸馏水搅拌不会破坏细胞，不能将核DNA释放出来，A错误；经研磨过滤后，将研磨液以3 000 r/min的转速离心2 min，取上清液进行下一步操作，B错误；DNA钠盐不溶于酒精而某些蛋白质能溶于酒精，因此可用95%的冷酒精溶解某些蛋白质、析出DNA钠盐，获得较纯净的DNA，C正确；在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，D错误。]
7．D　[研磨液的作用是将细胞破坏，释放出细胞内的DNA，A错误；离心研磨液是为了加速细胞膜、细胞器、一些较大杂质等的沉淀，B错误；过滤时在漏斗中垫上尼龙纱布，C错误。]
8．C　[ DNA不溶于酒精，且在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同，在2 mol/L的NaCl溶液中溶解度最高，A错误；哺乳动物成熟的红细胞没有细胞核，不含众多细胞器，不能用于“DNA的粗提取和鉴定”，故用相同方法从等体积猪血和鸡血中提取的DNA含量不同，B错误；DNA析出过程中，会出现白色絮状物，用玻璃棒搅动时要沿一个方向轻轻搅拌，防止DNA结构被破坏，C正确；在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，D错误。]
9．C　[限制酶只能对DNA进行切割，HIV的遗传物质是RNA，A错误；不同来源的限制酶识别的核苷酸序列可能相同，B错误；不是同种限制酶切割的黏性末端，只要其黏性末端互补，均可用DNA连接酶进行连接，有些DNA连接酶还能连接平末端，D错误。]
10．D　[能被BamHⅠ识别的序列中包含了被Sau3AⅠ识别的序列，A正确；一个DNA分子被EcoRⅠ切成两个片段时，四个A－T碱基对间的氢键断裂，每个A－T碱基对有2个氢键，总共会发生8个氢键的断裂，B正确；质粒作为基因工程的常用载体，通常会有多种限制性内切核酸酶的切割位点，以便目的基因的插入，C正确；用BamHⅠ切割的目的基因和用Sau3AⅠ切割的质粒，其黏性末端是相同的，可以连接，D错误。]
11．B　[表中4种限制酶均是在DNA特定位置将DNA从内部剪切成片段的，A错误；根据表中信息可知，EcoRⅠ识别的序列为GAATTC，并在G和A之间切割，因此，酶切后形成的黏性末端是5′－AATT－3′，B正确；KpnⅠ与BamHⅠ识别的核苷酸序列不同，则形成的黏性末端不同，用这两种酶处理不同的DNA片段获得的黏性末端没有互补关系，C错误；E.coliDNA连接酶只能连接黏性末端，不能连接平末端，而AatⅠ酶切后形成的是平末端，D错误。]
12．D　[分析DNA长度可知120＝40＋80＝10＋30＋80，即该DNA分子为环状双链DNA，含有1个限制酶Ⅰ的识别位点，切割得到长度为120 kb的片段；含有2个限制酶Ⅱ的识别位点，切割得到40 kb和80 kb 2个片段；同时用限制酶Ⅰ和限制酶Ⅱ切割时，得到10 kb、80 kb和30 kb共3个片段，说明限制酶Ⅰ的识别位点位于限制酶Ⅱ切割后的40 kb片段中，D符合题意。]
13．D　[由于Y表示C或T，R表示A或G，说明一种限制性内切核酸酶能识别一种或多种特定的脱氧核苷酸序列，A错误；限制酶的切割位点不一定在识别序列的内部，如Sau3A Ⅰ，B错误；不同限制酶切割后形成的黏性末端不一定相同，如EcoR Ⅰ、Kpn Ⅰ、Sma Ⅰ 切割后形成的黏性末端各不相同，而BamH Ⅰ和Sau3A Ⅰ切割后形成的黏性末端相同，C错误；限制酶切割后不一定都形成黏性末端，也有平末端，如Hind Ⅱ、Sma Ⅰ，D正确。]
14．(1)限制酶　DNA连接酶　(2)如图所示
(3)人的遗传物质与羊的遗传物质都为DNA，其物质组成和空间结构相同　(4)切割外源DNA，起到防御作用
15．(2)(保存)温度　(3)二苯胺　95 ℃水浴　(4)①多　蒜黄　②(核酸水解)酶
解析　(2)根据表格数据可知，该实验的自变量是温度和不同材料，因此该探究性实验课题的名称可能是“探究不同材料和不同(保存)温度对DNA提取量的影响”。(3)鉴定DNA时可用二苯胺试剂，在95 ℃水浴条件下，DNA遇二苯胺试剂会被染成蓝色。(4)①结论1：与20 ℃相比，相同实验材料在－20 ℃条件下保存，与二苯胺试剂进行95 ℃水浴加热后蓝色更深，说明DNA的提取量更多。结论2：等质量的不同实验材料，在相同的保存温度下，蒜黄与二苯胺试剂进行95 ℃水浴加热后蓝色最深，说明从蒜黄中提取的DNA量最多。②出现结论1的原因是低温抑制了(核酸水解)酶的活性，DNA降解速度减慢。作业17　获取目的基因、PCR扩增DNA片段及凝胶电泳鉴定
(分值：100分)
第1～4题，每题5分；第5～12题，每题6分，共68分。
题组一　基因的结构
1．如图为一个真核基因的结构示意图，下列对基因特点的叙述，正确的是(　　)
A．非编码区是外显子，编码区是内含子
B．非编码区中含有翻译过程中的起始密码子和终止密码子的对应碱基序列
C．不管是原核基因还是真核基因，能编码蛋白质的序列都位于编码区
D．非编码区对该基因转录不发挥作用
2．(2023·丽水高二期末)基因表达过程中外显子和内含子都能发生转录，模板链转录形成一条前体mRNA链，前体mRNA链中由内含子转录的片段被剪切后，再重新将其余片段拼接起来成为成熟的mRNA。下列叙述正确的是(　　)
A．mRNA可与多个核糖体结合同时合成多条肽链
B．原核生物基因编码区转录不需RNA聚合酶催化
C．前体mRNA链经蛋白酶剪切后成为成熟的mRNA
D．外显子中发生碱基对替换必然会导致性状的改变
题组二　获取目的基因的方法
3．在基因比较小，核苷酸序列又已知的情况下，获得该基因的最佳方法是(　　)
A．以4种脱氧核苷酸为原料人工合成
B．用mRNA为模板逆转录合成DNA
C．从基因组文库中筛选
D．从生物材料中直接分离
4．建立基因文库是获取目的基因的方法之一，下列关于基因文库的说法，正确的是(　　 )
A．构建基因文库需要将基因导入微生物细胞，形成克隆
B．基因文库的构建不需要限制酶和DNA连接酶
C．基因组文库含有该生物的大部分基因
D．部分基因文库就是cDNA文库
题组三　PCR技术
5．PCR实验的特异性主要取决于(　　)
A．DNA聚合酶的种类
B．反应体系中模板DNA的量
C．引物的碱基序列特异性
D．dNTP的浓度
6．(2023·绍兴高二期中)利用PCR技术将某DNA分子扩增n代的过程中，下列叙述错误的是(　　)
A．引物越短，PCR扩增的非目标DNA就越多
B．共有(2n－1)对引物参与子代DNA分子的合成
C．引物中G/C含量越高，退火温度越高
D．适温延伸过程中，需要提供ATP
题组四　PCR扩增DNA片段及凝胶电泳鉴定
7．(2024·宁波高二期中)如图为利用逆转录方法和PCR技术扩增目的基因片段的过程示意图。据图分析，下列说法错误的是(　　)
A．在第3轮PCR结束后，两条链等长的DNA占1/4
B．⑤过程使用70～75 ℃的温度处理既可以防止DNA变性，也可以促进子链的延伸
C．④过程两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合
D．第4轮④过程中消耗15对引物
8．(2024·杭州高二期中)带电粒子在电场作用下，向着与其电性相反的电极移动，称为电泳。下列关于电泳的叙述，正确的是(　　)
A．电泳中带电粒子迁移速率只与所带电荷有关
B．电泳的过程要在一定的pH下进行，所以要使用缓冲液
C．DNA片段根据长度大小在凝胶上分开，形成连续的条带
D．切断电源后即可用肉眼观察到DNA条带在凝胶上的位置
9．如果要用PCR扩增以下DNA模板中的基因1，需要的一对引物序列是(　　)
A．引物Ⅰ是5′－CTTCGAAATTC－3′，引物Ⅱ是5′－TCTCCCGATCGG－3′
B．引物Ⅰ是5′－CTTCGAAATTC－3′，引物Ⅱ是5′－CCGATCGGGAGA－3′
C．引物Ⅰ是5′－GAAGCTTTAAG－3′，引物Ⅱ是5′－AGAGCAAAGGAT－3′
D．引物Ⅰ是5′－GAAGCTTTAAG－3′，引物Ⅱ是5′－CCGATCGGGAGA－3′
10．为优化目的基因(700 bp)的PCR条件，研究者设计不同的退火温度进行实验，产物的琼脂糖凝胶电泳结果如图。据图分析，下列叙述错误的是(　　)
A．对照组可用无菌蒸馏水代替模板，其他成分相同
B．电泳条带的宽度、亮度与扩增产物大小呈正相关
C．退火温度的高低会影响PCR扩增产物的纯度
D．58 ℃是本实验中扩增该基因的最佳退火温度
11．(2024·嘉兴高二期中)下列关于PCR技术的叙述，正确的是(　　)
A．PCR技术所用TaqDNA聚合酶能耐高温，其最适温度是95 ℃
B．一个DNA片段经PCR扩增n次后需2n个引物
C．在第2轮循环产物中开始出现目标DNA片段
D．一个DNA片段经PCR扩增n次后含目标DNA片段的数目为2n－2n
12．荧光定量PCR技术可定量检测病毒核酸样本中DNA含量，其原理是：在PCR反应体系中加入引物的同时，加入与某条模板链互补的荧光探针，当耐高温的Taq DNA聚合酶催化子链延伸至探针处会水解探针，使荧光监测系统接收到荧光信号，即每扩增一次，就有一个荧光分子生成(如图所示)。下列说法正确的是(　　)
A．该技术的原理是DNA的体外复制，需要用到解旋酶和Taq DNA聚合酶
B．该技术需要用到一对引物，且引物之间的碱基序列不能互补
C．该技术中Taq DNA聚合酶只能从引物的5′端开始延伸DNA链
D．若循环次数相同，荧光值越低，证明病毒感染程度越高
13．(16分)一种单链RNA病毒的核酸检测采用“实时荧光定量RT—PCR”技术，通常在1～2 h内即可得到检测结果。此方法是PCR技术和荧光检测技术的结合，利用荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR产物进行检测分析。步骤如图，回答下列问题：
(1)利用样本中提取的RNA获得cDNA，过程①使用________酶。需要将样本中的RNA经过过程①形成cDNA后再进行PCR扩增的原因是_____________________________________。
(2)PCR技术的原理是__________________________________________________________，
一般要经历三十多次循环，每次循环可以分为变性、退火和延伸三步，每一个步骤都要控制好相应的温度，延伸的温度________(填“高于”“低于”或“等于”，下同)退火的温度，而________变性的温度。在循环之前，常要进行一次________，以便增加大分子模板DNA彻底变性的概率。
(3)过程②中对cDNA序列进行扩增，需设计两种引物。如图为cDNA的部分序列，请问两种引物的结合位置是____________(填编号)。
(4)在检测过程中，随着PCR的进行，反应产物不断累积，“杂交双链”荧光信号的强度也等比例增加，为了保证检测结果的准确性，一般要达到或超过阈值时才能判定为阳性，最终确诊。虽然RT—PCR技术是当前被广泛认可的检测手段之一，但仍然存在“假阴性”现象，结合上述内容，分析可能产生“假阴性”的因素有________(填字母)。
A．取样不规范导致所获样本量不足
B．样本运输中出现了损坏
C．检测样本被污染
D．病毒相应关键序列发生了改变
14．(16分)1985年，穆利斯等人发明了PCR技术。请回答下列有关问题：
(1)若要使用PCR扩增目的基因，则需要在反应体系中添加的物质有4种脱氧核苷三磷酸、引物、模板和__________________，其中引物的作用是__________________________。
(2)PCR中每次循环的步骤依次是________________________。PCR的产物常用琼脂糖凝胶电泳来鉴定，在凝胶中DNA分子的迁移速率与________________________________等因素有关。
(3)利用PCR技术可以从苏云金芽孢杆菌DNA分子中扩增出Bt毒蛋白基因，原因是______
____________________________________________________________________________，
至少需要______轮循环才能得到只含有Bt毒蛋白基因的片段，经过5轮复制，需要引物______个，其中只含有Bt毒蛋白基因的片段占总DNA片段的比例为________。
答案精析
1．C　[外显子和内含子都位于编码区，A错误；密码子对应的碱基序列位于编码区，B错误；非编码区含有启动子、终止子等结构，对转录有调控作用，D错误。]
2．A　[mRNA可与多个核糖体结合同时合成多条相同的肽链，提高了翻译的效率，A正确；RNA聚合酶的作用是催化DNA转录形成RNA，原核生物基因编码区的转录需要RNA聚合酶催化，B错误；蛋白酶的作用是催化蛋白质水解，mRNA为核酸，不能被蛋白酶剪切，C错误；遗传密码具有简并性，外显子中发生碱基对替换不一定会导致性状的改变，D错误。]
3．A　[在目的基因比较小，核苷酸序列已知的情况下常采用化学合成法，A符合题意。]
4．A　[构建基因文库需要限制酶和DNA连接酶，B错误；基因组文库含有该生物的全部基因，C错误；cDNA文库是部分基因文库中的一种，D错误。]
5．C　[引物决定了PCR过程中复制的特定DNA序列区间，即引物的碱基序列特异性决定了PCR过程的特异性。]
6．D　[引物越短，其特异性越低，引物与非目标DNA结合的可能性越大，因此PCR扩增的非目标DNA就越多，A正确；PCR技术的原理是DNA复制，根据DNA分子半保留复制的特点可知，共有(2n－1)对引物参与子代DNA分子的合成，B正确；适温延伸过程中，由dNTP水解磷酸提供能量，不需要提供ATP，D错误。]
7．D　[在第3轮PCR结束后，两条链等长的DNA的数量有23－2×3＝2(个)，经过3次复制后产生的DNA分子数目为23＝8(个)，可见，两条链等长的DNA片段占1/4，A正确；⑤过程为延伸，延伸过程使用70～75 ℃的温度处理既可以防止DNA变性，还能促进子链的延伸，B正确；④过程为退火，退火过程中两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，C正确；第4轮中产生的DNA分子数目为24＝16(个)，该过程需要新合成16条子链，因而需要16个引物，即④过程中消耗8对引物，D错误。]
8．B　[电泳利用了待分离样品中各种粒子带电性质的差异及分子本身大小、形状的不同，使带电粒子产生不同的迁移速率，从而实现样品中各种粒子的分离，A错误；电泳过程中维持合适的pH，并使溶液具有一定的导电性，利于核酸迁移，B正确；DNA片段根据长度大小在凝胶上分开，形成不连续的条带，每个条带包含的DNA片段长度是相同的，C错误；DNA本身是无色的，可以用荧光或放射性染料对DNA进行标记，或使用亚甲基蓝将DNA染成蓝色，再进行观察，肉眼无法直接观察，D错误。]
9．B　[设计正向引物时，该引物序列应该为待扩增DNA序列接近5′端处的序列；设计反向引物时，该引物序列应该是待扩增DNA序列接近3′端处的序列的反向互补序列。因此，要用PCR扩增上述DNA模板中的基因1(5′CTTCGAAATTC－基因1－TCTCCCGATCGG3′)，需要的一对引物序列是5′－CTTCGAAATTC－3′和5′－CCGATCGGGAGA－3′，B符合题意。]
10．B　[实验设计应遵循对照原则与单一变量原则，故对照组可用无菌蒸馏水代替模板，其他成分相同，A正确；PCR技术中，反应最终的电泳条带的宽度、亮度与PCR扩增产物的含量呈正相关，B错误；退火温度会影响引物与模板链的结合，进而影响PCR扩增产物的纯度，C正确；据题图可知，58 ℃条件下条带宽度最大，故该温度是本实验中扩增该基因的最佳退火温度，D正确。]
11．D　[PCR技术所用Taq DNA聚合酶能耐高温，其适宜温度约为72 ℃，A错误；每合成一条子链需要一个引物，PCR扩增n次后有2n＋1条DNA单链，其中有两条是母链，所以经PCR扩增n次后需2n＋1－2个引物，B错误；第1次扩增的产物DNA为长－中链，第2次扩增出现中－短链，在第3轮循环产物中开始出现目标DNA片段(短－短链)，C错误；一个DNA片段扩增n次后有2个长－中链和2n－2个中－短链，则含目标DNA片段的数目为2n－2－(2n－2)＝2n－2n，D正确。]
12．B　[PCR技术的原理是DNA的体外复制，其中模板DNA双链在高温下氢键断裂，不需要解旋酶，A错误；PCR技术用到的引物之间的碱基序列不能互补，以免影响引物与模板链的结合， B正确；Taq DNA聚合酶只能从引物的3′端开始延伸DNA链，C错误；循环次数相同时，荧光值越高，证明感染的病毒越多，感染程度越高，D错误。]
13．(1)逆转录　PCR扩增必须以DNA为模板，RNA不能作为PCR扩增的模板　(2)DNA双链的半保留复制　高于　低于　预变性　(3)Ⅱ和Ⅲ　(4)ABCD
14．(1)Taq DNA聚合酶　定位DNA合成的起始点
(2)变性、退火和延伸　DNA分子的大小、形状、所带电荷
(3)引物是根据Bt毒蛋白基因的一段已知序列设计合成的(或引物能与Bt毒蛋白基因的DNA特异性结合)
3　62　11/16
解析　(3)根据Bt毒蛋白基因的一段已知序列设计合成的引物(或引物能与Bt毒蛋白基因的DNA特异性结合)，可利用PCR技术从苏云金芽孢杆菌DNA分子中扩增出Bt毒蛋白基因。至少需要3轮循环才能得到只含有Bt毒蛋白基因的片段，复制次数和目的基因个数的关系式是：目的基因的个数为2n－2n，经过5轮复制，由于两条模板链不需要引物，所以需要引物的个数为(2×25－2)＝62(个)。经过5轮复制后，目的基因的个数是(25－2×5)＝22(个)，DNA分子的总数是25＝32(个)，所以其中只含有Bt毒蛋白基因的片段占总DNA片段的比例为11/16。作业18　表达载体的构建和目的基因的导入和检测
(分值：100分)
第1～8题，每题5分；第9～12题，每题6分，共64分。
题组一　利用表达载体构建重组DNA分子
1．(2024·台州高二期中)基因工程的核心步骤是(　　)
A．获取目的基因
B．构建重组DNA分子
C．将重组DNA分子导入受体细胞
D．检测目的基因及其表达产物
2．质粒的示意图如图，其中ori为复制必需的序列，ampr为氨苄青霉素抗性基因，tetr为四环素抗性基因，箭头表示限制性内切核酸酶的酶切位点。若要得到一个能在氨苄青霉素培养基上生长而不能在四环素培养基上生长的含重组质粒的细胞，应选择的合适的酶切位点是(　　)
A　　 　B 　 　　C　　 D
3．下列关于重组DNA分子的说法，不正确的是(　　)
A．真核基因要在细菌中持续高水平地表达，质粒上需要加入细菌的启动子、终止子
B．重组DNA分子包含启动子、目的基因、终止子、标记基因等
C．启动子位于目的基因的“上游”，能够启动翻译
D．不同的目的基因所需的启动子不一定相同
4．(2024·宁波高二期中)图1、图2中箭头表示相关限制酶的酶切位点。下列说法正确的是(　　)
A．重组DNA技术所用的工具酶是限制酶、DNA连接酶和载体
B．不同种限制酶切割DNA产生的黏性末端一定不能互补
C．用图中质粒和外源DNA构建重组质粒，可使用SmaⅠ切割
D．使用EcoRⅠ同时处理质粒和外源DNA，可能会发生质粒或目的基因的自身环化
题组二　将目的基因导入受体细胞
5．基因工程受体细胞可以是细菌、动物或者植物细胞，因此将目的基因导入受体细胞的方法也有所差异。下列叙述错误的是(　　)
A．导入植物细胞常采用农杆菌转化法
B．基因枪法可将目的基因导入植物叶绿体等细胞器中
C．大肠杆菌作为受体细胞时，通常需要使用CaCl2溶液处理
D．显微注射可以将目的基因直接注射给植物体受精卵细胞
6．(2024·浙大附中高二期中)研究人员利用农杆菌将外源基因A导入水稻细胞中，然后通过植物组织培养技术获得了含有外源基因A的第一代水稻植株。如图为重组Ti质粒示意图。下列叙述错误的是(　　)
A．外源基因A必须整合在T－DNA片段内
B．第一代水稻植株中所有细胞都存在外源基因A
C．水稻的组织培养过程中需调整植物激素的比例
D．培养含有外源基因A的水稻细胞不需要添加潮霉素
题组三　检测目的基因及其表达产物
7．检测目的基因是否在转基因生物体内表达成功的常用方法是(　　)
A．核酸分子杂交技术
B．荧光分子标记技术
C．放射性同位素标记技术
D．抗原—抗体杂交技术
8．目的基因导入受体细胞后，需要检测目的基因是否可以维持稳定和表达其遗传特性。下列关于目的基因的检测和鉴定的叙述，正确的是(　　)
A．目的基因能否在受体细胞中稳定遗传的关键是能否转录出mRNA
B．可采用PCR检测目的基因是否转录和翻译
C．可从转基因生物中提取蛋白质来检测目的基因是否翻译成相应蛋白质
D．抗虫、抗病检验用于确定转基因生物是否具备相关性状属于分子水平的检测
9．(2024·杭州学军中学高二月考)科研人员利用农杆菌转化法将抗病毒蛋白基因C 导入番木瓜，培育出转基因抗病毒番木瓜，所用的 Ti 质粒如图所示。下列叙述正确的是(　　)
A．该技术的原理是农杆菌的拟核DNA 与番木瓜基因发生重组
B．构建表达载体需要限制酶和耐高温的Taq DNA 聚合酶
C．可利用 PCR 技术筛选出含有抗病毒蛋白基因C 的受体细胞
D．可利用卡那霉素抗性基因检测是否成功构建抗病毒番木瓜
阅读下列材料，完成第10、11小题。
研究发现，利用抗体抑制肿瘤细胞表面的CD47蛋白的活性，可促进巨噬细胞吞噬肿瘤细胞。为制备抗CD47抗体，研究人员先利用基因工程制备CD47蛋白，如图为含CD47基因的外源DNA、质粒DNA的有关信息，EcoRⅠ、BamHⅠ、SalⅠ、XhoⅠ均为限制酶，Kanr、tetr分别为卡那霉素抗性基因、四环素抗性基因。
10．为了形成合适的重组质粒，切割外源DNA和质粒DNA时应该选用的限制酶是(　　)
A．EcoRⅠ和XhoⅠ B．BamHⅠ和XhoⅠ
C．EcoRⅠ和SalⅠ D．BamHⅠ和SalⅠ
11．重组质粒导入大肠杆菌的成功率很低，需经筛选才能获得导入成功的大肠杆菌，以下菌种为所需菌种的是(　　)
A．能在含卡那霉素的培养基上生长的菌种
B．能在含四环素的培养基上生长的菌种
C．能在含卡那霉素的培养基上生长、而不能在含四环素的培养基上生长的菌种
D．能在含四环素的培养基上生长、而不能在含卡那霉素的培养基上生长的菌种
12．某课题组为得到青蒿素高产品系，将青蒿素合成过程中的某一关键酶基因(fps)通过图示方法，使该基因在细胞内的表达增加，以实现转基因青蒿中青蒿素含量的显著提高。下列叙述正确的是(　　)
A．可用PCR技术直接扩增青蒿总RNA来获取目的基因
B．通过PCR技术可检测fps基因是否表达出蛋白质
C．酶1、酶2和酶3作用的部位都是磷酸二酯键
D．含有fps基因的青蒿植株即为所需新品系
13．(16分)抗虫棉可有效减少棉铃虫对幼铃的危害，而使棉花生殖生长相对增强。转基因单价抗虫棉是将苏云金芽孢杆菌中专门破坏棉铃虫消化道的Bt毒蛋白基因经过改造后利用农杆菌转入棉花细胞中研制而成的。请回答下列有关问题：
(1)获取Bt毒蛋白基因的方法有很多，例如：根据Bt毒蛋白的__________序列，推导出其基因序列，再利用化学方法合成目的基因；用已获得的纯度高的Bt毒蛋白作为抗原，通过______________________________技术获得特异性探针，并将苏云金芽孢杆菌________________中所有基因进行表达，然后利用该探针，找出与之对应的目的基因。用PCR扩增目的基因时，为了能与酶切后的质粒进行连接，需要在扩增前设计的引物上添加______________________，然后利用工具酶可获取重组质粒(表达载体)。
(2)培育该转基因抗虫棉的核心环节是____________________________，重组质粒进入受体细胞与质粒上的________基因有关。
(3)转入Bt毒蛋白基因的棉花的愈伤组织细胞，主要有两条再生植株的途径：一是由愈伤组织先分化产生芽和根后再形成一个完整植株的____________途径；二是由愈伤组织产生____________后再萌发形成完整植株的发生途径。
14．(20分)(2024·台州高二期中)B基因存在于水稻基因组中，仅在体细胞(2n)和精子中正常表达，在卵细胞中不转录。为研究B基因表达对卵细胞的影响，设计了如图所示的实验来获取能够在卵细胞中表达B基因的转基因植株。Luc基因是荧光素酶基因，能催化荧光素产生荧光。请据图回答下列问题：
(1)(6分)从水稻体细胞中提取总RNA，在____________酶的催化下构建____________文库，进而获得B基因编码蛋白的序列。要想快速、大量获得该B－Luc融合基因可以采用PCR技术，该技术的原理是______________________，该过程中需加入模板、引物、dNTP和酶等，其中，被不断消耗的物质有______________，dNTP的作用是________________________。
(2)(4分)融合基因必须插入Ti质粒的__________中，并连接到启动子和终止子之间，其中启动子是______________的结合位点。图中卡那霉素抗性基因作为标记基因，用于检测________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)过程①常对农杆菌进行__________处理。若借助Luc基因的表达产物来完成图中第二次鉴定筛选，则具体方法是________________________________________________。
(4)(6分)从转基因水稻植株未成熟种子中分离出胚，观察到细胞内仅含一个染色体组，判定该胚是由未受精的卵细胞发育形成的，而一般情况下水稻卵细胞在未受精时不进行发育，由此表明B基因的表达能使卵细胞______________________________，该转基因水稻产生的所有卵细胞中不一定都含有B－Luc融合基因的原因有___________________________
_______________________________________________________________(合理即可)。
答案精析
1．B
2．D　[图A中酶切位点在ori序列上，该序列被破坏，重组质粒将无法进行复制，因此含重组质粒的细胞既不能在四环素培养基上生长，也不能在氨苄青霉素培养基上生长，A不符合题意；图B中酶切位点没有破坏三个基因，因此含重组质粒的细胞既能在四环素培养基上生长，也能在氨苄青霉素培养基上生长，B不符合题意；图C中酶切位点在氨苄青霉素抗性基因上，氨苄青霉素抗性基因被破坏，则含重组质粒的细胞能在四环素培养基上生长而不能在氨苄青霉素培养基上生长，C不符合题意；图D中酶切位点在四环素抗性基因上，四环素抗性基因被破坏，则含重组质粒的细胞能在氨苄青霉素培养基上生长而不能在四环素培养基上生长，D符合题意。]
3．C　[重组DNA分子包括启动子、终止子、目的基因、标记基因，其中启动子位于目的基因的“上游”，是启动转录的一段DNA，终止子位于目的基因末端，B正确，C错误；不同的目的基因具有不同的核苷酸序列，其启动子也不一定相同，D正确。]
4．D　[载体不是工具酶，A错误；某些不同的限制酶切割DNA也可能产生相同的黏性末端，这些黏性末端可以互补，B错误；由于目的基因内部和抗生素抗性基因内部都含有SmaⅠ的酶切位点，故不能使用SmaⅠ切割目的基因和外源DNA，C错误；使用EcoRⅠ同时处理质粒和外源DNA，可能会发生质粒或目的基因的自身环化，一般用两种限制酶切割质粒和外源DNA，防止自身环化，D正确。]
5．D　[将目的基因导入植物细胞采用最多的方法是农杆菌转化法，此外还有基因枪法和花粉管通道法等，A正确；基因枪法可将目的基因导入叶绿体等细胞器中，这样可以避免目的基因随着花粉进行传播，B正确；将目的基因导入微生物细胞，如大肠杆菌时，常用CaCl2溶液处理法，即需要使用CaCl2溶液处理大肠杆菌细胞，使之成为感受态细胞，C正确；显微注射可以将目的基因的重组DNA片段通过显微操作仪注射到动物受精卵内还未融合的雄性细胞核中，体外培养一段时间后再将胚胎移植到雌性动物子宫内，从而可获得转基因动物，D错误。]
6．B　[Ti质粒的T－DNA片段可以整合到受体细胞的染色体DNA中，故外源基因A必须整合在T－DNA片段内，A正确；第一代水稻植株进行减数分裂时，同源染色体分离，产生的配子细胞可能不含有外源基因A，B错误；水稻组织培养过程中需调节植物激素的种类和比例，以保证愈伤组织再分化并得到完整的植株，C正确。]
7．D
8．C　[目的基因导入受体细胞后，首先要检测转基因生物(染色体)DNA上是否插入了目的基因，这是目的基因能否在受体细胞中稳定遗传的关键，A错误；PCR可用于检测目的基因是否转录，检测目的基因是否翻译用抗原—抗体杂交技术，B错误；抗虫、抗病检验用于确定转基因生物是否具备相关性状，属于个体生物学水平的鉴定，D错误。]
9．C　[和番木瓜基因发生重组的是农杆菌Ti质粒上的基因，A错误；构建表达载体需要限制酶和DNA连接酶，B错误；可利用 PCR 技术扩增目的基因，进而筛选出含有抗病毒蛋白基因C的受体细胞，C正确；因为转入番木瓜的是重组Ti质粒的T－DNA，其中不含卡那霉素抗性基因，因此转基因抗病毒番木瓜中不含有卡那霉素抗性基因，D错误。]
10．B　[由题图可知，当用EcoRⅠ和XhoⅠ切割质粒时，质粒上的两个标记基因均被破坏，故构建重组质粒不能选用EcoRⅠ和XhoⅠ，A不符合题意；用BamHⅠ和XhoⅠ构建重组质粒时，既可以获得完整的目的基因，又可以获得含有卡那霉素抗性基因的重组质粒，B符合题意；由于目的基因内含有SalⅠ的酶切位点，所以不能用SalⅠ切割目的基因，C、D不符合题意。]
11．C　[根据分析可知，用BamHⅠ和XhoⅠ构建重组质粒时，重组质粒中的四环素抗性基因被破坏，而卡那霉素抗性基因未被破坏，所以重组质粒导入成功的大肠杆菌中含有卡那霉素抗性基因，而不含四环素抗性基因，故所需菌种能在含卡那霉素的培养基上生长、而不能在含四环素的培养基上生长，C符合题意。]
12．C　[提取青蒿总RNA后需要逆转录形成cDNA才能利用PCR技术扩增得到目的基因，PCR不能直接扩增RNA，A错误；是否表达出蛋白质需要用抗原－抗体杂交技术检测，B错误；据题图可知，酶1是逆转录酶，酶2是限制酶，酶3是DNA连接酶，它们的作用部位都是磷酸二酯键，C正确；含有fps基因的青蒿植株表示成功导入目的基因，但还需要最终检测出转基因青蒿中青蒿素含量的显著提高才表示得到了所需新品系，D错误。]
13．(1)氨基酸　单克隆抗体制备　基因组文库　限制(性内切核酸)酶识别序列　(2)构建重组DNA分子　T－DNA　(3)器官发生　胚状体
14．(1)逆转录　cDNA　DNA的半保留复制　引物和dNTP(缺一不可)　提供原料和能量　(2)T－DNA　RNA聚合酶　B－Luc融合基因是否成功导入农杆菌细胞　(3)CaCl2　检测加入荧光素的细胞中是否发出荧光
(4)不经受精直接发育成胚　若B－Luc融合基因只整合到水稻的一条染色体上，减数分裂后只有部分卵细胞含有B－Luc融合基因[或转基因水稻形成卵细胞的过程中B－Luc融合基因发生了突变(丢失)]
解析　(2)融合基因必须插入Ti质粒的T－DNA中，并连接到启动子和终止子之间；启动子是RNA聚合酶的结合位点。图中卡那霉素抗性基因作为标记基因，用于检测B－Luc融合基因是否成功导入农杆菌细胞。(3)过程①常对农杆菌用CaCl2进行处理，使其成为感受态细胞，便于转化。因为Luc基因能催化荧光素产生荧光，若借助Luc基因的表达产物来完成图中第二次鉴定筛选，则具体方法是检测加入荧光素的细胞中是否发出荧光。(4)由题意可知，B基因的表达能使卵细胞不经受精直接发育成胚；该转基因水稻产生的所有卵细胞中不一定都含有B－Luc融合基因的原因：若B－Luc融合基因只整合到水稻的一条染色体上，减数分裂后只有部分卵细胞含有B－Luc融合基因；转基因水稻形成卵细胞的过程中B－Luc融合基因发生了突变(丢失)。

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