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作业20　重点突破练(四)
(分值：100分)
第1～3题，每题4分；第4～11题，每题5分，共52分。
题组一　基因工程的工具酶和载体
1．(2024·嘉兴海盐二中高二期中)如图表示不同的限制酶在目的基因的提取和基因表达载体的构建中的作用，下列有关叙述错误的是(　　)
A．限制酶沿识别序列的中轴线两侧将DNA两条链切开
B．在图1和图2中将分别产生4个和2个黏性末端
C．限制酶切割的是特定核苷酸序列之间的磷酸二酯键和氢键
D．图示中酶1、酶2和酶3可以为不同种类的限制酶
2．用Xho Ⅰ 和Sal Ⅰ 两种限制性内切核酸酶分别处理同一DNA片段，酶切位点及酶切产物分离结果如图。下列叙述不正确的是(　　)
A．图1中两种酶识别的核苷酸序列不同
B．图2中酶切产物可用于构建重组DNA分子
C．泳道①中是用Sal Ⅰ处理得到的酶切产物
D．图中被酶切的DNA片段是单链DNA
3．作为基因工程的运输工具——载体，必须具备的特征及理由对应不正确的是(　　)
A．含有复制起点，能够独立自主复制并稳定存在，以便目的基因能够在宿主细胞中稳定保存并大量复制
B．具有多个限制酶切割位点，以便于目的基因的插入
C．具有筛选作用的标记基因，以便目的基因能够准确定位与其结合
D．对宿主细胞无伤害，以不影响宿主细胞的正常生命活动
题组二　PCR技术
4．(2023·温州高二期末)研究表明，DNA合成先要沿子链合成方向以DNA为模板合成引物，因为DNA聚合酶只能催化脱氧核苷酸加到已有核酸链的游离3′端羟基上，而不能使脱氧核苷酸自身发生聚合，如图所示。
据图分析，下列关于图中“引物”的叙述，正确的是(　　)
A．是一小段单链DNA
B．在DNA合成后期会被切除
C．合成的方向为3′→5′
D．合成时需DNA聚合酶的催化
5．下列有关PCR技术的叙述，不正确的是(　　)
A．是聚合酶链式反应的简称，是在DNA聚合酶作用下，在体外扩增DNA片段的技术
B．在用PCR技术扩增DNA时，DNA的复制过程与细胞内DNA的复制过程类似
C．PCR反应只需在一定的缓冲溶液中提供DNA模板以及四种脱氧核苷酸
D．PCR一般经历三十多次循环，每次循环分为变性、退火、延伸
6．(2024·宁波高二期末)免疫PCR是对微量抗原的一种检测方法。如图是利用该技术检测牛乳中微量抗生素的流程图：首先将抗体1固定在微板上，冲洗后加入待检的牛乳，再加入DNA标记的抗体2，进行PCR扩增，最后进行电泳检测。下列叙述错误的是(　　)
A．免疫PCR技术适用于微量抗原的检测
B．第三次冲洗不充分可能导致假阳性现象
C．图示中的DNA必须是牛乳基因中的DNA片段
D．PCR扩增产物的量与牛乳中抗生素的量呈正相关
题组三　基因工程的基本操作程序
7．科研人员构建了可表达H－M3融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图所示，其中M3为水母体内的绿色荧光蛋白基因。下列有关叙述正确的是(　　)
A．构建重组质粒须使用T4 DNA连接酶
B．导入受体细胞内的“融合基因”需要两个启动子和两个终止子
C．构建H－M3融合基因的目的是有利于检测H基因能否表达以及表达量
D．为确定H基因定向连接到质粒中，可选择的引物组合有8种
8．(2023·金华高二期末)我国科学家利用链霉菌的靛蓝合成酶基因(idgS)及其激活基因(sfp)构建基因表达载体(如图所示)，通过农杆菌转化法导入白玫瑰细胞中，获得蓝玫瑰。下列叙述错误的是(　　)
A．表达载体中sfp和idgS具有各自的启动子，表达相互独立
B．可从链霉菌的基因文库中获取sfp和idgS
C．在构建表达载体时所需的限制酶是BamH Ⅰ、Spe Ⅰ、Sac Ⅰ
D．若受体白玫瑰细胞不变蓝，则可说明sfp和idgS未成功导入
9．利用基因工程技术可使大肠杆菌生产人的胰岛素。下列相关叙述正确的是(　　)
A．人和大肠杆菌在合成胰岛素时，转录和翻译的场所是相同的
B．DNA连接酶能把两个黏性末端经碱基互补配对后留下的缝隙“缝合”
C．通过检测，大肠杆菌中没有胰岛素产生，则可判断重组质粒导入受体菌后没有表达
D．在培养大肠杆菌的工程菌过程中，获得目的基因的工具酶有限制性内切核酸酶和DNA聚合酶
题组四　蛋白质工程
10．蛋白质工程是新崛起的一项生物工程，又称第二代基因工程。如图表示蛋白质工程流程，下列有关叙述错误的是(　　)
A．蛋白质工程就是根据人们需要，直接对蛋白质进行加工修饰
B．蛋白质工程是通过基因修饰或基因合成等方法，对现有蛋白质进行改造
C．①②过程分别表示转录和翻译
D．蛋白质工程是从④开始的
11．(2024·浙江效实中学高二期中)为心梗患者注射大剂量的t－PA(一种能高效降解血栓的单链糖蛋白，主要由血管内皮细胞合成、分泌并释放进血液)会诱发颅内出血。研究证实，将t－PA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，能显著降低出血等副作用。据此分析，下列说法错误的是(　　)
A．若利用大肠杆菌来生产t－PA，需要对其合成的t－PA进行后期改造
B．改造t－PA的技术属于蛋白质工程
C．欲将t－PA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，应直接对蛋白质(t－PA)进行改造
D．可利用抗原－抗体杂交技术来检测转基因的大肠杆菌是否分泌了t－PA
12．(16分)基因工程自20世纪70年代兴起后，得到了飞速的发展，目前已成为生物科学的核心技术。基因工程的基本操作程序主要包括四个步骤：
(1)获取目的基因
①如果目的基因的核苷酸序列是已知的，可用________________合成目的基因。
②如果目的基因的核苷酸序列是未知的，可以建立一个包括该种生物所有基因的基因组文库，或者通过____________方法建立cDNA文库。
(2)(6分)构建重组DNA分子
对于遗传背景未知的生物，可提取该生物的基因组DNA，用多种__________酶切割成各种不同DNA片段，分别导入大肠杆菌(如图所示)。由于切割后的基因片段大小不一，有的片段可能含有多个基因，不宜直接导入表达载体，所以可以先将它们分别与克隆质粒(如pBR322)连接构建重组载体，利用加入________________的培养基筛选得到多个大肠杆菌菌落，不同的菌落中含有__________________(填“相同”“不同”或“相同或不同”)的基因。将转移到纤维素膜上的细菌裂解，释放出DNA，利用核酸分子杂交技术检测目的基因，依据图示杂交带，可进一步选取________菌落(填写图中字母)继续培养，从而获得含有目的基因的受体菌。再将获得的目的基因与相应的质粒(如pET)连接构建表达载体，pET质粒除含有卡那霉素抗性基因、复制起点外，还必须有__________________________，以利于DNA片段在受体细胞中进行表达。
(3)(4分)将重组DNA分子导入受体细胞
如果目的基因来自真核细胞的基因组DNA序列，转化的受体细胞一般不能为大肠杆菌，若目的基因来自cDNA文库，则受体细胞可不受限制，原因是________________________。
(4)检测目的基因及其表达产物
目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，需要从_____________
和个体性状四个方面来进行检测和鉴定。
13．(16分)(2023·温州高二期末)凝乳酶是食品生产中常用的凝结剂，科研人员从动物体内获得了凝乳酶mRNA，拟利用大肠杆菌通过基因工程生产凝乳酶。据图回答下列问题：
　　
(1)利用凝乳酶mRNA，在________酶的作用下，可以得到凝乳酶的cDNA，进一步通过PCR扩增时需要2种引物，引物的作用是_____________________________________________。
(2)图1和图2是选用的质粒及其几种相关限制酶的识别位点，在构建基因表达载体时，最好选用的限制酶是__________________________________，这样选择的优点是_______________
____________________________________________________________________(答出两点)。
为在凝乳酶基因两侧加上相应的酶切位点，设计引物时需在引物前添加相应酶切位点，PCR过程中至少复制________次可以得到含所需酶切位点的凝乳酶基因。
(3)将构建的重组质粒导入大肠杆菌，需要用CaCl2溶液处理，使大肠杆菌成为______________。
(4)将在添加了青霉素的培养基中得到的4个大肠杆菌菌落，进行进一步检测，检测结果如图3所示，1～4号菌落需要舍弃的是1号和____________。其中舍弃1号菌落的理由是________________________________________________________________________。
14．(16分)(2023·浙江6月选考，23)赖氨酸是人体不能合成的必需氨基酸，而人类主要食物中的赖氨酸含量很低，利用生物技术可提高食物中赖氨酸含量。回答下列问题：
(1)(2分)植物细胞合成的赖氨酸达到一定浓度时，能抑制合成过程中两种关键酶的活性，导致赖氨酸含量维持在一定浓度水平，这种调节方式属于__________。根据这种调节方式，在培养基中添加________________________，用于筛选经人工诱变的植物悬浮细胞，可得到抗赖氨酸类似物的细胞突变体，通过培养获得再生植株。
(2)(14分)随着转基因技术与动物细胞工程结合和发展，2011年我国首次利用转基因和体细胞核移植技术成功培育了高产赖氨酸转基因克隆奶牛。其基本流程：
①构建乳腺专一表达载体。随着测序技术的发展，为获取富含赖氨酸的酪蛋白基因(目的基因)，可通过检索________________获取其编码序列，用化学合成法制备得到。再将获得的目的基因与含有乳腺特异性启动子的相应载体连接，构建出乳腺专一表达载体。
②表达载体转入牛胚胎成纤维细胞。将表达载体包裹到磷脂等构成的脂质体内，与牛胚胎成纤维细胞膜发生________，表达载体最终进入细胞核，发生转化。
③核移植。将转基因的牛胚胎成纤维细胞作为核供体细胞，从牛卵巢获取卵母细胞，经体外培养及去核后作为________________。将两种细胞进行电融合，电融合的作用除了促进细胞融合，同时起到了__________重组细胞发育的作用。
④重组细胞的体外培养及胚胎移植。重组细胞体外培养至________________________，植入代孕母牛子宫角，直至小牛出生。
⑤检测。DNA水平检测：利用PCR技术，以非转基因牛耳组织细胞作为阴性对照，以________________________________为阳性对照，检测到转基因牛耳组织细胞中存在目的基因。RNA水平检测：从非转基因牛乳汁中的脱落细胞、转基因牛乳汁中的脱落细胞和转基因牛耳组织细胞，提取总RNA，对总RNA进行__________处理，以去除DNA污染，再经逆转录形成cDNA，并以此为________________，利用特定引物扩增目的基因片段。结果显示目的基因在转基因牛乳汁中的脱落细胞内表达，而不在牛耳组织细胞内表达，原因是什么？
_____________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________。
答案精析
1．C　[由题图可知，限制酶切割产生的是黏性末端，所以限制酶在它识别序列的中轴线两侧将DNA的两条链分别切开，A正确；图1中含有酶1和酶2，能产生4个黏性末端，图2中含有酶3，能产生2个黏性末端，B正确；限制酶切割的是特定核苷酸序列之间的磷酸二酯键，不会切割氢键，C错误；限制酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开，图示中酶1、酶2和酶3可以为不同种类的限制酶，D正确。]
2．D　[酶具有专一性，不同的限制酶识别并切割不同的核苷酸序列，A正确；分析图1可知，限制酶Sal Ⅰ有三处切割位点，切割后产生4个DNA片段，故泳道①中是用Sal Ⅰ处理得到的酶切产物，C正确；图中被酶切的DNA片段是双链DNA，D错误。]
3．C　[作为载体必须具备的特征之一是具有筛选作用的标记基因，以便能够通过表型鉴别含有载体的细胞，C错误。]
4．B　[据题图可知，图中“引物”中含有U，因此推测该“引物”是一小段单链RNA，A错误；“引物”的作用是作为DNA复制开始时DNA聚合酶的结合位点，只有通过“引物”，DNA才可以开始进行复制，“引物”在DNA合成后期会被切除，B正确；DNA聚合酶只能催化脱氧核苷酸加到已有核酸链的游离3′端羟基上，因此“引物”合成的方向为5′→3′，C错误；图中“引物”RNA的合成不需要DNA聚合酶，D错误。]
5．C　[PCR反应需在一定的缓冲溶液中进行，需提供DNA模板、引物、四种脱氧核苷三磷酸及耐高温的Taq DNA聚合酶等，C错误。]
6．C　[如果第三次冲洗不充分，可能使残留的、呈游离状态的抗体2上的DNA也作为PCR的扩增模板参与扩增，会出现假阳性现象，B正确；免疫PCR中所用的DNA不选用受检样品(牛乳)中可能存在的DNA，若图示中的DNA用牛乳基因中的DNA片段，经过PCR扩增后的产物中，不仅有抗体2上的DNA扩增产物，还可能有牛乳中本身含有的牛乳基因片段的扩增产物，使检测结果偏大，C错误；微量抗原抗体反应是通过PCR技术扩增抗体2上连接的DNA，最后通过检测扩增产物DNA的量来确定抗生素的量的方法，PCR扩增产物的量与牛乳中抗生素的量呈正相关，D正确。]
7．C　[E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶都能连接黏性末端，另外T4 DNA连接酶还可以连接平末端，构建重组质粒可使用T4 DNA连接酶或E.coli DNA连接酶，A错误；导入受体细胞内的“融合基因”需要一个启动子和一个终止子，保证基因表达的正常进行，B错误；构建H－M3融合基因的目的是有利于检测H基因能否表达及表达量，若发现有绿色荧光则说明可正常表达，绿色荧光越深，表达量越高，C正确；为确定H基因定向连接到质粒中，可选择的引物组合有4种，即F3－R1、F2－R1、F1－R2、F1－R3，D错误。]
8．D　[分析题图可知，表达载体中sfp的启动子为启动子1，idgS的启动子为启动子2，两者表达相互独立，A正确；若受体白玫瑰细胞不变蓝，可能是sfp和idgS未成功导入或成功导入但表达不成功，D错误。]
9．B　[人体中胰岛素基因转录的场所是细胞核，而翻译的场所是细胞质，A错误；DNA连接酶能把两个黏性末端经碱基互补配对后的缺口进行“缝合”形成磷酸二酯键，B正确；若大肠杆菌中没有胰岛素产生，也可能是重组质粒未导入受体菌，C错误；获得目的基因的工具酶有限制性内切核酸酶和DNA连接酶，D错误。]
10．A　[蛋白质工程是通过设计和改造编码蛋白质的基因获得特定功能的蛋白质，A错误。]
11．C　[大肠杆菌只有核糖体一种细胞器，不含内质网和高尔基体，无法对t－PA进行加工，故需要对其合成的t－PA进行后期改造，A正确；该技术是将t－PA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，属于蛋白质工程，B正确；欲将t－PA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，应对相应的基因进行改造，C错误；t－PA是一种能高效降解血栓的单链糖蛋白，可利用抗原－抗体杂交技术来检测转基因的大肠杆菌是否分泌了t－PA，D正确。]
12．(1)①化学合成法　②逆转录　(2)限制　氨苄青霉素　相同或不同　b　启动子和终止子　(3)cDNA序列无内含子，真核细胞基因序列中含有内含子，大肠杆菌等原核细胞无法对内含子转录片段进行剪切修饰　(4)DNA、RNA、蛋白质
13．(1)逆转录　与模板单链结合延伸子链　(2)EcoR Ⅰ、Bgl Ⅱ或EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ　避免标记基因被破坏、质粒自身环化和目的基因的反向连接　3
(3)感受态细胞　(4)2号、3号　目的基因未导入
解析　(1)由mRNA得到cDNA，应该通过逆转录酶的作用。进行PCR扩增时，需要2种引物，引物会与DNA聚合酶结合，即引物分别与两条DNA模板链复制起始端互补配对成小段双链。(2)选择限制酶首先坚持的原则是不能破坏标记基因，所以首先排除EcoR Ⅴ，第二要防止质粒自身环化和目的基因的反向连接，所以要选择两种限制酶，产生两种不同的黏性末端，防止其自身连接。由题图可知，Bgl Ⅱ和BamH Ⅰ会产生相同的黏性末端，故在构建基因表达载体时，最好选用的限制酶是EcoR Ⅰ、Bgl Ⅱ或EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ。PCR扩增的第一次循环扩增出来的新片段很长，第二次循环以新的长片段为模板进行，但新片段的一端是引物开头的，所以第二次循环得到的片段就是我们需要的长度，但只是一条链，所以还不能分离出目的基因。第三次循环当以第二次循环得到的新片段为模板时，这个片段的长度就是需要扩增的长度，故第三次循环完成时能得到双链DNA，即PCR过程中至少复制三次可以得到含所需酶切位点的凝乳酶基因。(3)CaCl2溶液处理可以使大肠杆菌细胞膜的通透性增大，使大肠杆菌成为感受态细胞。(4)在青霉素培养基中得到的菌落都含有青霉素抗性基因，但1号进行DNA－DNA分子杂交没有结果，说明1号菌落目的基因未导入，应舍去；2号菌落含有目的基因，也可以正常转录，但翻译生成的蛋白质无法与相应抗体结合，应舍弃；3号菌落虽然含有目的基因，但不能与RNA进行杂交，说明该目的基因不能正常转录，应舍弃。
14．(1)负反馈调节　一定浓度的赖氨酸类似物　(2)①基因组文库　②融合　③受体细胞　激活　④桑葚胚或囊胚(阶段)　⑤含有目的基因的牛耳组织细胞　DNA酶　PCR的模板　构建的表达载体只含有乳腺特异性启动子，只能在乳腺细胞中表达，而在牛耳组织细胞中不能表达
解析　(1)题干所述的调节方式属于负反馈调节。如果想得到抗赖氨酸类似物的细胞突变体，可在培养基中添加一定浓度的赖氨酸类似物。(2)①从基因组文库中获取目的基因：把某种生物的基因组DNA切成适当大小，分别与载体组合，导入微生物细胞，形成克隆，基因组中所有DNA序列克隆的总汇被称为基因组文库。当需要某一片段时，根据目的基因的有关信息，如基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物以及基因的表达产物蛋白质等特性来获取目的基因。②将表达载体包裹到磷脂等构成的脂质体内，根据细胞膜成分，其与牛胚胎成纤维细胞膜发生融合。③以去核的卵母细胞作为受体细胞，因为卵母细胞中含有促使细胞核表达全能性的物质和营养条件。电融合除了能促进细胞融合，同时还能激活重组细胞发育。④胚胎发育到适宜阶段可取出向受体移植。牛、羊一般要培养到桑葚胚或囊胚阶段，再植入代孕母牛子宫内，直至小牛出生。⑤阳性对照：按照当前实验方案一定能得到正面预期结果的对照实验。阳性对照是已知的对测量结果有影响的因素，目的是确定实验程序无误。阴性对照和阳性对照相反，按照当前的实验方案一定不能得到正面预期结果的对照实验。排除未知变量对实验产生的不利影响。本实验以非转基因牛耳组织细胞作为阴性对照，为了检测转基因牛耳组织细胞中是否存在目的基因，应该以含有目的基因的牛耳组织细胞为阳性对照。为了除去DNA污染，可以用DNA酶使其水解。经逆转录形成cDNA，并以此为PCR的模板进行扩增。目的基因在转基因牛乳汁中的脱落细胞内表达，而不在牛耳组织细胞内表达，原因是构建的表达载体只含有乳腺特异性启动子，只能在乳腺细胞中表达，而在牛耳组织细胞中不能表达。(共50张PPT)
重点突破练(四)
第四章 基因工程
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题组一　基因工程的工具酶和载体
1.(2024·嘉兴海盐二中高二期中)如图表示不同的限制酶在目的基因的提取和基因表达载体的构建中的作用，下列有关叙述错误的是
A.限制酶沿识别序列的中轴线两侧将
DNA两条链切开
B.在图1和图2中将分别产生4个和2个
黏性末端
C.限制酶切割的是特定核苷酸序列之间的磷酸二酯键和氢键
D.图示中酶1、酶2和酶3可以为不同种类的限制酶
√
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由题图可知，限制酶切割产生的是
黏性末端，所以限制酶在它识别序
列的中轴线两侧将DNA的两条链分
别切开，A正确；
图1中含有酶1和酶2，能产生4个黏性末端，图2中含有酶3，能产生2个黏性末端，B正确；
限制酶切割的是特定核苷酸序列之间的磷酸二酯键，不会切割氢键，C错误；
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限制酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开，图示中酶1、酶2和酶3可以为不同种类的限制酶，D正确。
2.用XhoⅠ和SalⅠ两种限制性内切核酸酶分别处理同一DNA片段，酶切位点及酶切产物分离结果如图。下列叙述不正确的是
A.图1中两种酶识别的核苷酸序列不同
B.图2中酶切产物可用于构建重组DNA分子
C.泳道①中是用SalⅠ处理得到的酶切产物
D.图中被酶切的DNA片段是单链DNA
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酶具有专一性，不同的限制酶识别并切割不同的核苷酸序列，A正确；
分析图1可知，限制酶SalⅠ有三处切割位点，切割后产生4个DNA片段，故泳道①中是用SalⅠ处理得到的酶切产物，C正确；
图中被酶切的DNA片段是双链DNA，D错误。
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3.作为基因工程的运输工具——载体，必须具备的特征及理由对应不正确的是
A.含有复制起点，能够独立自主复制并稳定存在，以便目的基因能够在
宿主细胞中稳定保存并大量复制
B.具有多个限制酶切割位点，以便于目的基因的插入
C.具有筛选作用的标记基因，以便目的基因能够准确定位与其结合
D.对宿主细胞无伤害，以不影响宿主细胞的正常生命活动
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作为载体必须具备的特征之一是具有筛选作用的标记基因，以便能够通过表型鉴别含有载体的细胞，C错误。
题组二　PCR技术
4.(2023·温州高二期末)研究表明，DNA合成先要沿子链合成方向以DNA为模板合成引物，因为DNA聚合酶只能催化脱氧核苷酸加到已有核酸链的游离3′端羟基上，而不能使脱氧核苷酸自身发生聚合，如图所示。
据图分析，下列关于图中“引物”的叙述，正确的是
A.是一小段单链DNA
B.在DNA合成后期会被切除
C.合成的方向为3′→5′
D.合成时需DNA聚合酶的催化
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据题图可知，图中“引物”中含有U，因此推测该“引物”是一小段单链RNA，A错误；
“引物”的作用是作为DNA复制开始时DNA聚合酶的结合位点，只有通过“引物”，DNA才可以开始进行复制，“引物”在DNA合成后期会被切除，B正确；
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DNA聚合酶只能催化脱氧核苷酸加到已有核酸链的游离3′端羟基上，因此“引物”合成的方向为5′→3′，C错误；
图中“引物”RNA的合成不需要DNA聚合酶，D错误。
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5.下列有关PCR技术的叙述，不正确的是
A.是聚合酶链式反应的简称，是在DNA聚合酶作用下，在体外扩增DNA
片段的技术
B.在用PCR技术扩增DNA时，DNA的复制过程与细胞内DNA的复制过程
类似
C.PCR反应只需在一定的缓冲溶液中提供DNA模板以及四种脱氧核苷酸
D.PCR一般经历三十多次循环，每次循环分为变性、退火、延伸
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PCR反应需在一定的缓冲溶液中进行，需提供DNA模板、引物、四种脱氧核苷三磷酸及耐高温的Taq DNA聚合酶等，C错误。
6.(2024·宁波高二期末)免疫PCR是对微量抗原的一种检测方法。如图是利用该技术检测牛乳中微量抗生素的流程图：首先将抗体1固定在微板上，冲洗后加入待检的牛乳，再加入DNA标记的抗体2，进行PCR扩增，最后进行电泳检测。下列叙述错误的是
A.免疫PCR技术适用于微量抗原的检测
B.第三次冲洗不充分可能导致假阳性现象
C.图示中的DNA必须是牛乳基因中的DNA片段
D.PCR扩增产物的量与牛乳中抗生素的量呈正相关
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如果第三次冲洗不充分，可能使残留
的、呈游离状态的抗体2上的DNA也
作为PCR的扩增模板参与扩增，会出
现假阳性现象，B正确；
免疫PCR中所用的DNA不选用受检样品(牛乳)中可能存在的DNA，若图示中的DNA用牛乳基因中的DNA片段，经过PCR扩增后的产物中，不仅有抗体2上的DNA扩增产物，还可能有牛乳中本身含有的牛乳基因片段的扩增产物，使检测结果偏大，C错误；
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微量抗原抗体反应是通过PCR技术扩增抗体2上连接的DNA，最后通过检测扩增产物DNA的量来确定抗生素的量的方法，PCR扩增产物的量与牛乳中抗生素的量呈正相关，D正确。
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题组三　基因工程的基本操作程序
7.科研人员构建了可表达H－M3融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图所示，其中M3为水母体内的绿色荧光蛋白基因。下列有关叙述正确的是
A.构建重组质粒须使用T4 DNA连接酶
B.导入受体细胞内的“融合基因”需要
两个启动子和两个终止子
C.构建H－M3融合基因的目的是有利于检测H基因能否表达以及表达量
D.为确定H基因定向连接到质粒中，可选择的引物组合有8种
√
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E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶都
能连接黏性末端，另外T4 DNA连接酶
还可以连接平末端，构建重组质粒可使
用T4 DNA连接酶或E.coli DNA连接酶，
A错误；
导入受体细胞内的“融合基因”需要一个启动子和一个终止子，保证基因表达的正常进行，B错误；
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构建H－M3融合基因的目的是有利于
检测H基因能否表达及表达量，若发
现有绿色荧光则说明可正常表达，绿
色荧光越深，表达量越高，C正确；
为确定H基因定向连接到质粒中，可选择的引物组合有4种，即F3－R1、F2－R1、F1－R2、F1－R3，D错误。
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8.(2023·金华高二期末)我国科学家利用链霉菌的靛蓝合成酶基因(idgS)及其激活基因(sfp)构建基因表达载体(如图所示)，通过农杆菌转化法导入白玫瑰细胞中，获得蓝玫瑰。下列叙述错误的是
A.表达载体中sfp和idgS具有各自的启动子，
表达相互独立
B.可从链霉菌的基因文库中获取sfp和idgS
C.在构建表达载体时所需的限制酶是BamHⅠ、
SpeⅠ、SacⅠ
D.若受体白玫瑰细胞不变蓝，则可说明sfp和idgS未成功导入
√
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分析题图可知，表达载体中sfp的启动
子为启动子1，idgS的启动子为启动子
2，两者表达相互独立，A正确；
若受体白玫瑰细胞不变蓝，可能是sfp
和idgS未成功导入或成功导入但表达
不成功，D错误。
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9.利用基因工程技术可使大肠杆菌生产人的胰岛素。下列相关叙述正确的是
A.人和大肠杆菌在合成胰岛素时，转录和翻译的场所是相同的
B.DNA连接酶能把两个黏性末端经碱基互补配对后留下的缝隙“缝合”
C.通过检测，大肠杆菌中没有胰岛素产生，则可判断重组质粒导入受体
菌后没有表达
D.在培养大肠杆菌的工程菌过程中，获得目的基因的工具酶有限制性内
切核酸酶和DNA聚合酶
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√
人体中胰岛素基因转录的场所是细胞核，而翻译的场所是细胞质，A错误；
DNA连接酶能把两个黏性末端经碱基互补配对后的缺口进行“缝合”形成磷酸二酯键，B正确；
若大肠杆菌中没有胰岛素产生，也可能是重组质粒未导入受体菌，C错误；
获得目的基因的工具酶有限制性内切核酸酶和DNA连接酶，D错误。
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题组四　蛋白质工程
10.蛋白质工程是新崛起的一项生物工程，又称第二代基因工程。如图表示蛋白质工程流程，下列有关叙述错误的是
A.蛋白质工程就是根据人们需要，直接对蛋白质进行加工修饰
B.蛋白质工程是通过基因修饰或基因合成等方法，对现有蛋白质进行改造
C.①②过程分别表示转录和翻译
D.蛋白质工程是从④开始的
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蛋白质工程是通过设计和改造编码蛋白质的基因获得特定功能的蛋白质，A错误。
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11.(2024·浙江效实中学高二期中)为心梗患者注射大剂量的t－PA(一种能高效降解血栓的单链糖蛋白，主要由血管内皮细胞合成、分泌并释放进血液)会诱发颅内出血。研究证实，将t－PA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，能显著降低出血等副作用。据此分析，下列说法错误的是
A.若利用大肠杆菌来生产t－PA，需要对其合成的t－PA进行后期改造
B.改造t－PA的技术属于蛋白质工程
C.欲将t－PA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，应直接对蛋白质(t－PA)进行
改造
D.可利用抗原－抗体杂交技术来检测转基因的大肠杆菌是否分泌了t－PA
√
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大肠杆菌只有核糖体一种细胞器，不含内质网和高尔基体，无法对t－PA进行加工，故需要对其合成的t－PA进行后期改造，A正确；
该技术是将t－PA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，属于蛋白质工程，B正确；
欲将t－PA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，应对相应的基因进行改造，C错误；
t－PA是一种能高效降解血栓的单链糖蛋白，可利用抗原－抗体杂交技术来检测转基因的大肠杆菌是否分泌了t－PA，D正确。
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12.基因工程自20世纪70年代兴起后，得到了飞速的发展，目前已成为生物科学的核心技术。基因工程的基本操作程序主要包括四个步骤：
(1)获取目的基因
①如果目的基因的核苷酸序列是已知的，可用___________合成目的基因。
②如果目的基因的核苷酸序列是未知的，可以建立一个包括该种生物所有基因的基因组文库，或者通过_______方法建立cDNA文库。
化学合成法
逆转录
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(2)构建重组DNA分子
对于遗传背景未知的生物，可提取该生物的基因组DNA，用多种_______酶切割成各种不同DNA片段，分别导入大肠杆菌(如图所示)。由于切割后的基因片段大小不一，有的片段可能含有多个基因，不宜直接导入表达载体，所以可以先将它们分别与克隆质粒(如pBR322)连接构建重组载体，利用加入____________的培养基筛选得到多个大肠杆菌菌落，
限制
氨苄青霉素
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不同的菌落中含有____________(填“相同” “不同”或“相同或不同”)的基因。将转移到纤维素膜上的细菌裂解，释放出DNA，利用核酸分子杂交技术检测目的基因，依据图示杂交带，可进一步选取_____菌落(填写图中字母)继续培养，从而获得含有目的基因的受体菌。
相同或不同
b
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再将获得的目的基因与相应的质粒(如pET)连接构建表达载体，pET质粒除含有卡那霉素抗性基因、复制起点外，还必须有_________
________，以利于DNA片段在受体细胞中进行表达。
启动子和
终止子
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(3)将重组DNA分子导入受体细胞
如果目的基因来自真核细胞的基因组DNA序列，转化的受体细胞一般不能为大肠杆菌，若目的基因来自cDNA文库，则受体细胞可不受限制，原因是_________________________________________________________
_____________________________________________。
(4)检测目的基因及其表达产物
目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，需要从____________________和个体性状四个方面来进行检测和鉴定。
cDNA序列无内含子，真核细胞基因序列中含有内含子，大肠杆菌等原核细胞无法对内含子转录片段进行剪切修饰
DNA、RNA、蛋白质
13.(2023·温州高二期末)凝乳酶是食品生产中常用的凝结剂，科研人员从动物体内获得了凝乳酶mRNA，拟利用大肠杆菌通过基因工程生产凝乳酶。据图回答下列问题：
(1)利用凝乳酶mRNA，在________酶的作用下，可以得到凝乳酶的cDNA，进一步通过PCR扩增时需要2种引物，引物的作用是___________
______________。
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逆转录
与模板单链
结合延伸子链
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由mRNA得到cDNA，应该通过逆转录酶的作用。进行PCR扩增时，需要2种引物，引物会与DNA聚合酶结合，即引物分别与两条DNA模板链复制起始端互补配对成小段双链。
(2)图1和图2是选用的质粒及其几种相关限制酶的识别位点，在构建基因表达载体时，最好选用的限制酶是__________________________
_________，这样选择的优点是_____________
____________________________________________(答出两点)。为在凝乳酶基因两侧加上相应的酶切位点，设计引物时需在引物前添加相应酶切位点，PCR过程中至少复制____次可以得到含所需酶切位点的凝乳酶基因。
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EcoRⅠ、BglⅡ或EcoRⅠ、
BamHⅠ
被破坏、质粒自身环化和目的基因的反向连接
避免标记基因
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选择限制酶首先坚持的原则是不能破坏标记基因，所以首先排除EcoRⅤ，第二要防止质粒自身环化和目的基因的反向连接，所以要选择两种限制酶，产生两种不同的黏性末端，防止其自身连接。由题图可知，BglⅡ和BamHⅠ会产生相同的黏性末端，故在构建基因表达载体时，最好选用的限制酶是EcoRⅠ、BglⅡ或EcoRⅠ、BamHⅠ。
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PCR扩增的第一次循环扩增出来的新片段很长，第二次循环以新的长片段为模板进行，但新片段的一端是引物开头的，所以第二次循环得到的片段就是我们需要的长度，但只是一条链，所以还不能分离出目的基因。第三次循环当以第二次循环得到的新片段为模板时，这个片段的长度就是需要扩增的长度，故第三次循环完成时能得到双链DNA，即PCR过程中至少复制三次可以得到含所需酶切位点的凝乳酶基因。
(3)将构建的重组质粒导入大肠杆菌，需要用CaCl2溶液处理，使大肠杆菌成为___________。
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感受态细胞
CaCl2溶液处理可以使大肠杆菌细胞膜的通透性增大，使大肠杆菌成为感受态细胞。
(4)将在添加了青霉素的培养基中得到的4个大肠杆菌菌落，进行进一步检测，检测结果如图3所示，1～4号菌落需要舍弃的是1号和__________。其中舍弃1号菌落的理由是________________。
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2号、3号
目的基因未导入
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在青霉素培养基中得到的菌落都含有青霉素抗性基因，但1号进行DNA－DNA分子杂交没有结果，说明1号菌落目的基因未导入，应舍去；2号菌落含有目的基因，也可以正常转录，
但翻译生成的蛋白质无法与相应抗体结合，应舍弃；3号菌落虽然含有目的基因，但不能与RNA进行杂交，说明该目的基因不能正常转录，应舍弃。
14.(2023·浙江6月选考，23)赖氨酸是人体不能合成的必需氨基酸，而人类主要食物中的赖氨酸含量很低，利用生物技术可提高食物中赖氨酸含量。回答下列问题：
(1)植物细胞合成的赖氨酸达到一定浓度时，能抑制合成过程中两种关键酶的活性，导致赖氨酸含量维持在一定浓度水平，这种调节方式属于__________。根据这种调节方式，在培养基中添加__________________
_____，用于筛选经人工诱变的植物悬浮细胞，可得到抗赖氨酸类似物的细胞突变体，通过培养获得再生植株。
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负反馈调节
一定浓度的赖氨酸类
似物
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题干所述的调节方式属于负反馈调节。如果想得到抗赖氨酸类似物的细胞突变体，可在培养基中添加一定浓度的赖氨酸类似物。
(2)随着转基因技术与动物细胞工程结合和发展，2011年我国首次利用转基因和体细胞核移植技术成功培育了高产赖氨酸转基因克隆奶牛。其基本流程：
①构建乳腺专一表达载体。随着测序技术的发展，为获取富含赖氨酸的酪蛋白基因(目的基因)，可通过检索____________获取其编码序列，用化学合成法制备得到。再将获得的目的基因与含有乳腺特异性启动子的相应载体连接，构建出乳腺专一表达载体。
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基因组文库
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从基因组文库中获取目的基因：把某种生物的基因组DNA切成适当大小，分别与载体组合，导入微生物细胞，形成克隆，基因组中所有DNA序列克隆的总汇被称为基因组文库。当需要某一片段时，根据目的基因的有关信息，如基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物以及基因的表达产物蛋白质等特性来获取目的基因。
②表达载体转入牛胚胎成纤维细胞。将表达载体包裹到磷脂等构成的脂质体内，与牛胚胎成纤维细胞膜发生______，表达载体最终进入细胞核，发生转化。
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融合
将表达载体包裹到磷脂等构成的脂质体内，根据细胞膜成分，其与牛胚胎成纤维细胞膜发生融合。
③核移植。将转基因的牛胚胎成纤维细胞作为核供体细胞，从牛卵巢获取卵母细胞，经体外培养及去核后作为_________。将两种细胞进行电融合，电融合的作用除了促进细胞融合，同时起到了______重组细胞发育的作用。
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受体细胞
激活
以去核的卵母细胞作为受体细胞，因为卵母细胞中含有促使细胞核表达全能性的物质和营养条件。电融合除了能促进细胞融合，同时还能激活重组细胞发育。
④重组细胞的体外培养及胚胎移植。重组细胞体外培养至_____________
_______，植入代孕母牛子宫角，直至小牛出生。
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桑葚胚或囊胚
(阶段)
胚胎发育到适宜阶段可取出向受体移植。牛、羊一般要培养到桑葚胚或囊胚阶段，再植入代孕母牛子宫内，直至小牛出生。
⑤检测。DNA水平检测：利用PCR技术，以非转基因牛耳组织细胞作为阴性对照，以____________________________为阳性对照，检测到转基因牛耳组织细胞中存在目的基因。RNA水平检测：从非转基因牛乳汁中的脱落细胞、转基因牛乳汁中的脱落细胞和转基因牛耳组织细胞，提取总RNA，对总RNA进行________处理，以去除DNA污染，再经逆转录形成cDNA，并以此为___________，利用特定引物扩增目的基因片段。结果显示目的基因在转基因牛乳汁中的脱落细胞内表达，而不在牛耳组织细胞内表达，原因是什么？_______________________________________
__________________________________________________。
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含有目的基因的牛耳组织细胞
DNA酶
PCR的模板
构建的表达载体只含有乳腺特异性启动子，只能在乳腺细胞中表达，而在牛耳组织细胞中不能表达
阳性对照：按照当前实验方案一定能得到正面预期结果的对照实验。阳性对照是已知的对测量结果有影响的因素，目的是确定实验程序无误。阴性对照和阳性对照相反，按照当前的实验方案一定不能得到正面预期结果的对照实验。排除未知变量对实验产生的不利影响。本实验以非转基因牛耳组织细胞作为阴性对照，为了检测转基因牛耳组织细胞中是否存在目的基因，应该以含有目的基因的牛耳组织细胞为阳性对照。为了除去DNA污染，可以用DNA酶使其水解。
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经逆转录形成cDNA，并以此为PCR的模板进行扩增。目的基因在转基因牛乳汁中的脱落细胞内表达，而不在牛耳组织细胞内表达，原因是构建的表达载体只含有乳腺特异性启动子，只能在乳腺细胞中表达，而在牛耳组织细胞中不能表达。
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