资源简介

(共30张PPT)
3.1 重组DNA技术的基本工具
学习目标
1.阐明重组DNA技术所需的三种基本工具的作用。
2.认同基因工程的诞生和发展离不开理论研究和技术创新。
基因工程
科技探索之路
新课导入
番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵袭。当番木瓜被这种病毒侵染后，产量会大大下降。科学家通过精心设计，用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。
转基因番木瓜
DNA双螺旋的直径只有2nm，对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。
那么，科学家究竟用到了哪些“分子工具”？这些“分子工具”各具有什么特征呢？
基因工程
基因工程：是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫 重组DNA技术
1.操作环境：
2.原理：
3.操作对象：
4.操作水平：
5.结果：
体外环境
基因
分子水平
基因重组
赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品
定向改造生物性状；克服远缘杂交不亲和障碍
6.意义：
理论基础
1.DNA的基本组成单位相同(都是四种脱氧核苷酸)
2.都遵循碱基互补配对原则
3.DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构
理论基础
1.基因是控制生物性状的结构与功能单位
2.遗传信息传递都遵循中心法则
3.所有生物几乎共用一套遗传密码
复制
基因工程的理论基础
基因工程的基本工具
那么，科学家究竟用到了哪些“分子工具”？
这些“分子工具”各具有什么特征呢？
工具
分子手术刀
分子缝合针
分子运输车
限制性内切核酸酶：
DNA连接酶：
载体：
准确切割DNA分子
将DNA片段连接起来
将体外重组好的DNA分子导入受体细胞
1.限制性核酸内切酶——“分子手术刀”
基因工程的基本工具
（大部分限制酶切割结果为黏性末端）
EcoRⅠ识别的序列
切点
切点
切点
来源：从微生物（主要是原核生物）体内分离出来
功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。
EcoR Ⅰ
+
1.限制性核酸内切酶——“分子手术刀”
基因工程的基本工具
1.限制性核酸内切酶——“分子手术刀”
识别序列的特点：呈现碱基互补对称，无论是奇数个碱基还是偶数个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。
基因工程的基本工具
结果:
产生黏性末端或平末端
基因工程的基本工具
基因工程的基本工具
推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么？
限制酶是原核生物的一种防御工具，用来切割侵入细胞的外源DNA，以保证自身安全。
为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？
含某种限制酶的细菌的DNA分子不具备这种限制酶的识别序列，或者甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。
练习1、已知限制酶Ⅰ的识别序列和切点是—GGATCC—，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—。
（1）则能被限制酶I切割的DNA，______（能/不能）被限制酶II切割；
（2）能被限制酶II切割的DNA，____________（能/不能/不一定能）被限制酶I切割。
能
不一定能
巩固练习
2.DNA连接酶——“分子缝合针”
(1)作用：将 “缝合”起来，恢复被 切开的两个核苷酸之间的______________。
双链DNA片段
限制酶
磷酸二酯键
DNA连接酶
+
基因工程的基本工具
DNA连接酶的种类：
种类 E·coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶
来源
功能特性
相同点 大肠杆菌
T4噬菌体
只能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来；
既可以连接双链DNA片段互补的黏性末端；
恢复的都是磷酸二酯键
不能连接具有平末端的DNA片段。
又可以连接双链DNA片段的平末端（但连接平末端的效率相对较低）。
基因工程的基本工具
基因工程的基本工具
E·coli DNA连接酶的缝合作用
两个DNA片段要具有相同的黏性末端才能连接起来
把两个DNA片段黏性末端间的缝隙“缝合”起来，
基因工程的基本工具
T4 DNA连接酶还可以把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率相对较低。
T4 DNA连接酶的缝合作用
基因工程的基本工具
C
A
A
T
T
G
A
G
T
A
T
C
DNA聚合酶
以DNA母链为模板，连接单个脱氧核苷酸形成单链
DNA聚合酶作用示意图
基因工程的基本工具
与DNA相关的几种酶的比较
项目 DNA连接酶 限制酶 DNA聚合酶 解旋酶
作用 部位 磷酸二酯键 磷酸二酯键 磷酸二酯键 氢键
作用 对象 DNA片段 DNA 单个的脱氧 核苷酸 DNA
作用 结果 将两个DNA片段连接成完整的DNA分子 切割双链DNA分子 将单个的脱氧核苷酸连接到DNA单链末端 将双链DNA分子局部解旋为单链
RNA聚合酶
磷酸二酯键
DNA
将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
DNA酶
3.基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
载体的作用
最常用载体：质粒
将外源基因送入受体细胞。
裸露、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA外，具有自我复制能力的环状双链DNA。
在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。
大肠杆菌及质粒结构模式图
基因工程的基本工具
目的基因是一个DNA片段，不含有复制原点、不含有启动子和终止子。
为什么需要载体
3.基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
思考：形成一个重组质粒会形成几个磷酸二酯键？
四
基因工程的基本工具
3.基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
种类：质粒、噬菌体、动植物病毒等。
它们的来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小上也有很大差别。
载体必须具备的条件
①具一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段（基因）插入其中。
②能够在宿主细胞中自我复制或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。
③具有某些标记基因，便于重组DNA分子的筛选。
标记基因通常有
抗生素的抗性基因，如：抗氨苄青霉素基因(ampr)、抗四环素基因(tetr)。
荧光蛋白基因，如：绿色荧光蛋白基因(GFP)、红色荧光蛋白基因(RFP)。
基因工程的基本工具
基因工程的基本工具
载体要与外源DNA片段连接，需要具备什么条件？
要使携带的外源DNA片段在受体细胞中稳定存在，载体需要具备什么条件？
我们用肉眼看不到载体是否进入受体细胞，为了便于筛选重组DNA分子，载体需要具备什么条件？
具有一个或多个限制酶切割位点，供外源DNA片段插入其中。
能在受体细胞中自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制，这样它携带的外源DNA片段才能在受体细胞中复制，不至于丢失。
具有标记基因，便于重组DNA分子的筛选。
基因工程的基本工具
DNA连接酶
用一种限制酶切（单酶切）
A
T
G
C
A
A
C
G
T
T
A
T
AGCTT
A
GGATCCA
CCTAGGTTCGA
Bt基因
基因工程的基本工具
用两种限制酶切（双酶切）
质粒与质粒连接后的运载体过大，导致转化难以发生，故不予考虑
避免自身环化，增大目的基因和运载体连接的概率，
能避免反向连接
DNA连接酶
基因工程的基本工具
课堂小结
课后练习
3．基因运输工具——载体，必须具备的条件之一及理由均正确的是 （　 　）
A．能够复制，以便目的基因插入其中
B．具有多个限制酶切割位点，便于目的基因的表达
C．具有某些标记基因，便于重组DNA的筛选
D．对受体细胞无害，便于重组DNA的筛选
C
课后练习
4.某细菌质粒上有标记基因如图所示，通过标记基因可以推知外源基因（目的基因）是否转入成功。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况也不同，如图所示是外源基因插入位置（插入点有a、b、c）示意图，请根据表中提供的细菌生长情况，推测①②③三种重组后细菌的外源基因插入点，正确的一组是 （ 　 　）
插入点 细菌在含氨苄青霉素的培养基上的生长状况 细菌在含四环素的培养基上的生长状况
① 能生长 能生长
② 能生长 不能生长
③ 不能生长 能生长
A.①是c；②是b；③是a B．①是a和b；②是a；③是b
C．①是a和b；②是b；③是a D．①是c；②是a；③是b
A
课后练习
3. 图甲是含有目的基因的外源DNA片段，图乙是用于将目的基因导入受体细胞的质粒（阴影部分表示抗生素抗性基因），相关限制酶的作用部位如图所示，现欲培养转基因抗病植株，回答下列问题。
（1）在基因工程的操作中，不宜选用SmaI，原因是SmaI会破坏__________和__________________________。
（2）在基因工程的操作中，不宜选用EcoRI，原因是用EcoRI切割外源DNA片段后，________________________________________________________。
目的基因
质粒上的抗生素抗性基因
目的基因只有一侧含有黏性末端，不能插入到质粒中
（3）由于反应体系中含有大量的外源DNA片段和质粒，加入PstI一种限制酶后，会得到大量的目的基因片段和质粒片段，再加入DNA连接酶后，除了会形成目的基因与质粒连接的环状产物外，还会形成______________________连接的环状产物以及_____________________连接的环状产物。此外，目的基因与质粒的连接既可以是正向连接，也可以是____________，后者可能会导致目的基因无法正常表达。
目的基因与目的基因
质粒片段与质粒片段
反向连接
课后练习

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