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(共33张PPT)
普通棉花不抗虫
苏云金芽孢杆菌可以合成抗虫毒素——Bt 蛋白 思考：如何生产抗虫棉
杂交育种 同种生物之间进行
诱变育种 在原有基因上发生基因突变，
产生新基因——等位基因
不定向
普通棉花
抗虫棉
第3章基因工程
按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，
创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品，从技术操 作层面看，由于基因工程是在DNA 分子水平上进行设计和施工 的，因此又叫做重组DNA 技术。
原 理 ： 基因重组
操作水平： DNA 分子水平
优 点 ： ①能克服远缘杂交不亲和的障碍；
②定向改造生物的遗传特性。
编码区(连续，不间隔)
编码区—
(间隔，不连续)
外显子 内含子
非编码区
启动子
真核基因：
—非编码区一
与RNA聚合 酶结合位点
原核基因：
DNA
非编码区
终止子 基因
非编码区—
1953年沃森和 克里克建立了 DNA双螺旋 结构模型并提 出了遗传物质 自我复制的假 说 。 1967年，科学家 发现，在细菌拟 核DNA 之外的 质粒有自我复制 能力，并可以在 细菌细胞间转移。 20世纪70年代初，多 种限制酶、DNA 连接 酶和逆转录酶被相继 发现。这些发现为 DNA 的切割、连接以 及功能基因的获得创 造了条件。 1973年，科学家证明 了质粒可以作为基因 工程的载体，构建重 组DNA, 导入受体细 胞，使外源基因在原 核细胞中成功表达， 并实现了物种间的基 因交流。至此， 基因 工程正式问世。
1985年，
穆里斯等 人发明
PCR ,为获 取目的基 因提供了 有效手段。
1944年艾弗里等人 通过肺炎链球菌的 转化实验，不仅证 明了遗传物质是 DNA, 还证明了 DNA 可以在同种生 物个体间转移。 1961年尼伦伯格 和马太破译了第 一个编码氨基酸 的密码子。截至 19666年，64个密 码子均被破译成 功 。 1970年科学 家在细菌中 发现了第一 个限制性核 酸内切酶 (简称限制 酶 ) 1972年，伯格 首先在体外进 行了DNA的 改造，成功构 建了第一个体 外重组DNA 分 子。
1982年，第一个基 因工程药物-重组人 胰岛素被批准上市。 基因工程药物成 为 世界各国研究和投 资开发的热 点。
基因工程发展历程
基因工程诞生的理论基础
1、不同生物的基因为什么能拼接
(1)DNA 的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸
(2)双链DNA 分子的空间结构都是 规则的双螺旋结构
2、外源基因为什么能在受体细胞中表达
(1) 基因 是控制生物性状的独立遗传单位。
(2)遗传信息的传递都遵循 中心法则。
(3)生物界共用一套 遗传密码
DNA
大肠杆菌细胞
质粒
抗菌素抗性基因
控制质粒DNA 转移的基因
3.1重组DNA 技术的基本工具
从社会中来
番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵害。当
番木瓜受到这种病毒感染后，产量会大大下降。 科学家通过精心设计用“分子工具”培育出了 转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。
DNA双螺旋的直径只有2nm。
科学家用到了哪些“分子工具”
这些“分子工具”各具有什么特征呢
非转基因番木瓜
转基因番木瓜
将体外重组好的DNA 分子导入受体细胞
重 组DNA 技术的基本工具
将DNA 片段 连接起来
准确切割 DNA 分子
“分子手术刀”
“分子缝合针”
“分子运输车”
1、来源： 主要从原核生物中分离纯化出来，也有少部分来自真核生物
2、种类： 数千种(限制酶不是一种酶，而是一类酶)
一、限制性内切核酸酶(限制酶)——“分子手术刀”
一 、限制性内切核酸酶(限制酶)—— “分子手术刀”
生物属名的头一个字母与种加词的头两个字母，组成了3个字母
的略语，以此来表示这个酶是从哪种生物中分离出来的。例如，一 种限制酶是从大肠杆菌 (Escherichia coli) 的R 型菌株分离来的，
就用字母EcoR表示；如果它是从大肠杆菌R型菌株中分离出来的第 一种限制酶，则进一步表示成EcoRI 。
粘质沙雷氏杆菌 ( Serratia marcesens)中分离的第一种限制酶即 Sma I ;
流感嗜血杆菌的d菌株 (Haemoph ilus influenzaed) 中先后分离到3种
限制酶，则分别命名为： Hind I 、Hind Ⅱ 、HindⅢ O
一 、限制性内切核酸酶(限制酶)—— “分子手术刀”
1、来源： 主要从原核生物中分离纯化出来，也有少部分来自真核生物
2、种类： 数 千 种 (限制酶不是一种酶，而是一类酶)
3、 作 用 ：
识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，
并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
3'端 5'端
一 、限制性内切核酸酶(限制酶)—— “分子手术刀”
识别序列：大多数由6个核苷酸组成；少数由4个、8个或其他数量组成。
BamHI Taql
T
T
特点：
1.都可以找到一条中(心)轴线；
两条链5'-3'读取的碱基
顺序是完全一样的。
EcoRI
HindlII
L
中轴线
一 、限制性内切核酸酶(限制酶)—— “分子手术刀”
4 、结果 实例1——EcoRI 限制酶
识别特定序列为GAATTC ; 切割特定部位为G 、A 之间的磷酸二酯键
(1) 黏性末端： 黏性末端
G + --1--+-1 ; I C T T A AG
当限制酶在它识别序列
的中轴线两侧将DNA分 子的两条链分别切开时。
黏性末端
一 、限制性内切核酸酶(限制酶)—— “分子手术刀”
4、结果 实例2——SmaI 限制酶
识别特定序列为CCCGGG; 切割特定部位为C、G 之间的磷酸二酯键
(2)平末端：
当限制酶在它识别序列
的中轴线处将DNA 分子 的两条链分别切开时。
C C G
0 一 )
平末端 平末端
指
写出下列限制酶切割形成的黏性末端
BamH I EcoR I Hind Ⅲ Bgl Ⅱ
山 V
—GGATCC— —GAATTC— —AAGCTT— —AGATCT—
—CCTAGG— —CTTAAG— —TTCGAA— —TCTAGA—
—G -G —A —A
BamH I—CCTAG EcoR ]-CTTAA HindⅢ -TTCGA Bgl I—TCTAG
思考：从中你发现了什么 不同的限制酶可能切割形成相同的黏性末端。
即时训练
1、你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗
原核生物易受自然界外源DNA 的入侵，但生物在长期的进
化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害 。
限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA 侵入时，
会利用限制酶将外源DNA 切割掉，以保证自身的安全。所以， 限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA 、 使之失效，从而 达到保护自身的目的。
一、限制性内切核酸酶(限制酶)——“分子手术刀”
2 、为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA
通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其DNA
分子中不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶 将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。
这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA 被切断， 并且可以防止外源DNA 的入侵。
一、限制性内切核酸酶(限制酶)——“分子手术刀”
1.要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口
可产生几个黏性末端
要切两个切口，产生四个黏性末端。
限 制 酶 切 一 次 可 产 生幺 个 末 端 和 增 加 2 个 游 离 的 磷 酸 基 团
2.如果把两种来源不同的DNA 用同一种限制酶来切割，会怎样呢
会产生相同的黏性末端
一、限制性内切核酸酶(限制酶)——“分子手术刀”
A A T T
C T T A A
A A T T
C T T A A
思考：把两种来源不同的DNA 进行重组，应该怎样处理
A A T T
G C T
用同种限制酶切割(EcoR
T T
I
4—
6—— (
—— ○
A T
…
G
T
G A A T T C
C T T A A G
A A T T C
C T T A A G
缺口怎么办
—— 6
E ·coli DNA连接酶
T4 DNA连接酶
来源 大肠杆菌
T4噬菌体
连接的 末端类型 黏性末端和平末端(连接平末 端效率远低于T4 DNA连接酶)
黏性末端
和平末端
相同点 恢复被限制酶切开的磷酸二酯键
二、DNA连接酶 —“分子缝合针”
1.作用：将两个DNA 片段连接起来，恢复被限制酶切开 的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
注意：不是连接氢键! ( 氢键的形成不需要酶的催化)
2.种类：
两DNA 片段要具有互补的黏性末端才能拼起来
A T A
C T T A A
二、DNA连接酶 —“分子缝合针”
3 、E·coli DNA连接酶连接黏性末端
C
G
X
思考：DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗 为什么
二、DNA连接酶 —“分子缝合针”
4 、T4 DNA连接酶连接平末端
o-c
G
C
g
c
DNA DNA DNA DNA DNA
A 聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶
A T
T
DNA连接酶
DNA聚合酶
相同点 作用实质 都能催化形成磷酸二酯键 化学本质 都是蛋白质 不 同 点 模板 不需要
需要DNA的一条链作模板
作用对象 在两个DNA片段之间 形成磷酸二酯键
只能将单个核苷酸连接到已有的 DNA片段上，形成磷酸二酯键
作用结果 形成完整的重组DNA分子
形成DNA的一条链
用途 基因工程
DNA复制
二、DNA连接酶 —“分子缝合针”
5.DNA连接酶与DNA聚合酶的比较
如图为DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化，
图中依次表示限制性内切酶、DNA聚合酶、DNA连 接酶、解旋酶作用的正确顺序是 ( C )
① → ②
④ < A.①②③④
B.①②④③
C.①④②③
D.①④③②
习题巩固
1.作用：将外源基因送入受体细胞，在受体细胞内对目的基因进行大量复制。
2.种类：质粒(最常用)、噬菌体、动植物病毒
来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以
插入外源DNA 片段的大小也有很大差别。
质粒： 一 中裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞
拟核DNA 之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA 分子。
三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
便于重组DNA分子的筛选，如四环素抗性基因、
氨苄青霉素抗性基因、产物具有颜色反应的基因
(4 ) 无毒害作用，不影响受体细胞正常生命活动
在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，
氨苄青霉素 抗性基因
都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。
3、运载体需具备的条件
( 1 ) 能在细胞中进行自我复制或整合到受体DNA
(2) 有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA
(3)常有特殊的标记基因
上，随受体DNA 同步复制
片段(基因)插入
拟核DNA 质粒
三、基因进入受体细胞的载体— “分子运输车”
目的基因 插入位点
复制原点
实例：重组DNA分子的模拟操作
...ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC...
...TATCGTACGATAGGTACTTAAGCCGTATG...
...TCCTAGAATTCTCGGTATGAATTCCATAC...
...AGGATCTTAAGAGCCATACTTAAGGTATG...
…ATAGCATGCTATCCATGAATTCTCGGTATGAATTCGGCATAC...
…TATCGTACGATAGGTACTTAAGAGCCATACTTAAGCCGTATG...
...TCCTAG
...AGGATCTTAA
AATTCCATAC...
GGTATG ...
选择酶切位点的原则：
1、选目的基因两端和运载体都有的酶切位点；
2、所选酶切位点不能破坏目的基因以及标记基因
1.用图中外源DNA 和质粒构建重组质粒，不能使用Sma I 切割，
原因是 Sma I会破坏抗性基因和外源DNA 中的目的基因 O
2.使用BamHI 和Hind Ⅲ两种限制酶切割，而不用EcoR I 一 种限制酶切
割，是为了防且的基因、质粒自身环化及反向连接 o
抗生素
抗性基因
Sma H 质粒
图1
EcoR I 目的基因
BamH I Sma I
图2
下列操作中选用哪种限制酶切割来构建重组质粒 Hind III 和 BamH I
EcoR I
外源DNA
HindI
BamH I
HindII
—EcoR I
来源： 主要来源于原核生物
限制酶 特点： 具有专一性
作用部位：磷酸二酯键
结果： 形成黏性末端或平末端
作用： 把两条双链DNA 片段拼接起来
DNA连接酶 连接部位：磷酸二酯键
种类： E.coli DNA连接酶、T4 DNA连接酶
①能自我复制或能整合到宿主D NA 上
作为载体 ②有一个至多个限制酶切割位点
的条件 ③有特殊的标记基因
④对受体细胞无害
种类：质粒、噬菌体、动植物病毒
基因工程的基本工具
课堂小结
载体
人

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