资源简介

(共117张PPT)
第一节 基因工程及其技术
第三章 基因工程
普通小鼠和巨型小鼠
积极思维： 巨型小鼠是怎样培育的？
事实：
1.1982 年，美国科学家帕米特1942— ）等人采用显微注射法，将带有大鼠生长激素基因的重组DNA 分子导入小鼠受精卵内，将其培育成早期胚胎后再植入代孕小鼠体内继续发育。
2.小鼠妊娠并成功分娩出携带有大鼠生长激素基因的小鼠。在同样生长条件下，这种转入大鼠生长激素基因的小鼠生长快、体型大，成鼠的体重是同一胎中普通小鼠的1.8倍，有“巨型小鼠”之称。
小鼠受精卵
带有大鼠生长激素基因的重组DNA分子
早期胚胎
代孕小鼠
巨型小鼠
胚胎移植
培育
显微注射法
妊娠、分娩
巨型小鼠的基因组比普通小鼠多了大鼠生长激素基因；
巨型小鼠只是基因工程中的案例之一，那么基因工程是如何快速发展的呢？
巨型小鼠培育过程：
一、基因工程是在多学科基础上发展而来的
基因工程是在生物化学、分子生物学和微生物学等学科的基础上发展起来的，正是这些学科的基础理论和相关技术的发展催生了基因工程。
1、1957年,科恩伯格在大肠杆菌中发现了DNA聚合酶，这种可以在体内外催化合成 DNA 的酶是研究DNA 合成的必备工具。
2、1967 年，罗思和海林斯基发现，细菌除拟核外还有一种具有自我复制能力的环状DNA分子，即质粒，它们能在细菌细胞之间转移。这一发现为基因转移找到了一种转运工具。同年，科学家在大肠杆菌细胞中又发现了DNA 连接酶。
3、1970 年，特明和巴尔的摩两位科学家各自在RNA“肿瘤”病毒中发现了逆转录酶。 同年，史密斯等又从流感嗜血杆菌中分离到一种特异性很强的限制性内切核酸酶。
4、1972年，伯格领导的研究小组完成了世界上首次 DNA分子体外重组。他们使用同一种限制性内切核酸酶，在体外对猿猴病毒的DNA和噬菌体的DNA分别进行酶切，再用DNA连接酶将两者的酶切片段连接起来，获得了重组的DNA分子。
5、1973 年，科恩领导的研究小组成功地利用大肠杆菌质粒进行了另一个体外重组DNA分子实验。他们将一种含有卡那霉素抗性基因的大肠杆菌质粒和另一种含有四环素抗性基因的大肠杆菌质粒混合后，加入同一种限制性内切核酸酶，对DNA分子进行切割，用DNA连接酶将酶切片段连接起来形成重组DNA分子。这种重组质粒转化大肠杆菌获得成功。
接着，科恩和美国科学家博耶合作，将非洲爪蟾核糖体蛋白基因的DNA片段与大肠杆菌的质粒进行重组，再用重组质粒转化大肠杆菌，成功转录出相应的mRNA。 这说明真核生物的基因可以在原核生物中进行表达。
6、1976 年，科学家用质粒为载体，将生长激素释放抑制因子基因转入大肠杆菌，并于1977年首次生产出治疗肢端肥大症、巨人症的生长激素释放抑制因子。 在这之前，生长激素释放抑制因子是从动物的下丘脑中提取的，10万只羊的下丘脑仅能提取出1mg。通过基因工程制备的工程菌来生产这种激素只需不到 2L 的培养液便可获得1mg 激素。
肢端肥大症和巨人症都是由生长激素释放过多造成的，因此可以用生长激素释放抑制因子治疗。
7、1977 年，英国科学家桑格测定了一种噬菌体的基因组序列，这是人类首次对完整基因组的核苷酸排列顺序进行测定。
积极思维：我国是棉花的生产和消费大国。棉花在种植过程中，常常会受到一些害虫的侵袭，其中以棉铃虫最为常见。如何能培育出自身就能抵抗虫害的棉花新品种呢？
（已知：苏云金芽孢杆菌含有一种抗虫基因）
普通棉花
转基因抗虫棉
普通棉花
“分子黏合剂”
“分子搬运工”
＋
如何获取目的基因？“分子搬运工”“分子黏合剂”是什么？为什么不能把目的基因直接送进相应细胞里？如何检测目的基因是否表达……
基因工程又称为DNA重组技术，是指在体外通过人工“剪切”和“拼接”等方法，将外源目的基因与载体DNA进行组合形成重组DNA，然后导入受体细胞，并使其在受体细胞中表达，产生人类需要的基因产物的技术。
二、基因工程的基本工具
1、基因工程定义：
①操作环境：
②原理：
③操作对象：
④操作水平：
⑤结果：
体外环境；
基因；
DNA分子水平；
基因重组；
赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品；
定向改造生物性状；克服远缘杂交不亲和障碍；
⑥意义：
2、基因工程操作的理论基础：
①基本组成单位相同：
②双链DNA分子的空间结构相同：
③DNA碱基对之间的关系相同：
①基因的功能特点：
②遗传信息的传递方向都遵循中心法则；
③生物界共用一套遗传密码；
(1)不同生物的DNA分子能拼接起来的原因：
都是四种脱氧核苷酸；
都是规则的双螺旋结构；
均遵循严格的碱基互补配对原则；
(2)外源基因能够在受体内表达，并使受体表现出相应性状的原因：
控制生物体性状的结构和功能单位，具有相对独立性；
（一）“分子剪刀”——限制性内切核酸酶
1、来源：
主要来自原核生物；
2、种类：
数千种（限制酶不是一种酶，而是一类酶）
3、作用：
能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开；
（具有专一性）
（简记：识别并切割）
4、切割方式：
（1）错位切
错位切是在DNA分子两条链的不同部位进行切割，切割后形成的两个DNA分子片段的末端均留下一段游离的单链，这种单链称为黏性末端。
例：限制酶EcoRI的错位切，产生由4个脱氧核苷酸组成的黏性末端；
5'
5'
3'
3'
黏性末端
黏性末端
错位切和平切；
（2）平切
平切是在DNA分子两条链上相同的部位进行切割，切割后形成平末端。
例：限制酶HaeⅢ的平切结果；
5'
5'
3'
3'
平末端
5、限制酶的识别序列的特点：
大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成
①能被限制酶特异性识别的序列，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基反向互补对称的，即回文序列；
②回文序列：在切割部位，一条链从5’往3’读的碱基顺序与另一条链5’往3’读的顺序完全一致；
注：
①同一种限制酶切割形成的黏性末端相同；
②不同的限制酶切割形成的黏性末端也可能相同：同尾酶；例：SpeⅠ和 XbaⅠ；
SpeⅠ
XbaⅠ
6、限制酶作用结果：
产生黏性末端或平末端；
③限制酶不能切开RNA分子的磷酸二酯键；
④要获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切两个切口，产生四个黏性(平)末端；
限制酶是原核生物的一种防御工具，用来切割侵入细胞的外源DNA，以保证自身安全。
限制酶不切割细菌本身的DNA分子的原因：
细菌的DNA分子不具备这种限制酶的识别序列，或者甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。
小知识：
G A A T T C
C T T A A G
G A A T T C
C T T A A G
G
C T T A A
A A T T C
G
G
C T T A A
A A T T C
G
同种限制酶切割(EcoRⅠ)
积极思维：
把两种来源不同的DNA进行重组，应该怎样处理？
缺口怎么办？
G
C T T A A
A A T T C
G
G
C T T A A
A A T T C
G
（二）“分子黏合剂”——DNA连接酶
1、作用
形成磷酸二酯键，把互补黏性末端或平末端的连接起来形成重组DNA分子；
2、种类
种类
来源
特点
E.coli DNA连接酶
T4 DNA连接酶
只能连接黏性末端
既可以连接黏性末端也可以连接平末端（效率低）
大肠杆菌
T4 噬菌体
限制酶和DNA连接酶的作用示意图：
自连
自连
注：DNA连接酶与DNA聚合酶的区别：
项目 DNA连接酶 DNA聚合酶
相同点
不同点 模板
作用过程
作用结果
催化形成磷酸二酯键
不需要模板
需要以DNA的一条链为模板
形成完整的DNA分子
形成DNA的一条链
只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键
在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键
（三）“分子搬运工”——载体
1、载体作用：
将外源基因导入受体细胞，并使其在受体细胞中稳定遗传和表达；
2、种类：
质粒、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。质粒是最早被应用的载体。
注：质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
注：基因工程中需要3种工具，但工具酶只有2种；
3、质粒载体需要满足的条件
①复制原点，保证在受体细胞中进行独立复制；
②适合的标记基因，用于鉴定和筛选重组DNA分子，如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因；
③有一个或多个限制酶切割位点，便于目的基因（外源基因）的插入；
④对受体细胞无害；
小知识：标记基因的筛选原理
载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了载体的受体细胞。如图所示：
2.作为基因的运输工具——载体，必须具备的条件之一及理由是
A.能够在宿主细胞中稳定地保存下来并大量复制，以便提供大量的目的基因
B.具有多个限制酶切点，以便于目的基因的表达
C.具有某些标记基因，以使目的基因能够与其结合
D.对宿主细胞无伤害，以便于重组DNA分子的鉴定和选择
A
习题巩固：
1.下列说法中不正确的有
①限制酶主要是从真核生物中分离纯化出来的　
②DNA连接酶都是从原核生物中分离得到的　
③所有限制酶识别的核苷酸序列均由6个核苷酸组成　
④不同限制酶的识别序列不同　
⑤T4DNA连接酶可以连接平末端，且连接效率较高
A.①②④⑤ B.①②③⑤ C.②③④⑤ D.①③④⑤
B
3．下列关于DNA连接酶的叙述，正确的是
A.DNA连接酶连接的是两个DNA片段碱基对之间的氢键
B.DNA连接酶连接的是DNA单链上的磷酸和脱氧核糖
C.DNA连接酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端
D.E.coli DNA连接酶能将双链DNA片段互补的平末端连接起来
B
4、人们常选用的细菌质粒分子往往带有一个抗菌素抗性基因，该抗性基因的主要作用是
A.提高受体细胞在自然环境中的耐药性
B.有利于对目的基因是否导入受体细胞进行检测
C.增加质粒分子的分子量
D.便于与外源基因连接
B
5.（多选）下列有关限制性内切核酸酶的叙述，错误的是
A．用限制酶切割一个目的基因两端时，被水解的磷酸二酯键有2个
B．限制酶识别序列越短，则该序列在DNA中出现的概率就越大
C．5′—↓ CATG—3′和5′—G↓CATGC—3′序列被限制酶切出的黏性末端可用DNA连接酶连接
D．只有用相同的限制酶处理含有目的基因的片段和质粒，才能形成重组质粒
AD
6.下面是四种不同质粒的示意图,其中ori为复制必需的序列,AmpR为氨苄青霉素抗性基因,Tetr为四环素抗性基因,箭头表示同一种限制酶的酶切位点。下列有关叙述正确的是 　A.基因AmpR和Tetr是一对等位基因,常作为基因工程中的标记基因
B.质粒指细菌细胞中能自我复制的小型环状的DNA和动植物病毒的DNA
C.限制酶的作用部位是DNA分子中特定的两个核苷酸之间的氢键
D.用质粒4将目的基因导入大肠杆菌,该菌不能在含四环素的培养基上生长
D
培育转基因抗虫棉的具体操作步骤:
与载体拼接
普通棉花
棉花细胞
抗虫棉 （有抗虫特性）
导入
抗虫基因
重组DNA分子
1.目的基因的筛选与获取
2.基因表达载体的构建
3.将目的基因导入受体细胞
4.目的基因的 检测与鉴定
核 心
基因工程的一般操作程序主要包括四个步骤：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。
1、目的基因的筛选与获取
4、目的基因的检测与鉴定
2、基因表达载体的构建
3、将目的基因导入受体细胞
基因工程的基本操作程序
三、基因工程的基本操作程序
（一）目的基因的筛选与获取
1、目的基因：主要是指编码蛋白质的基因，如与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。
抗虫棉中的Bt抗虫蛋白基因
转基因鱼中的荧光蛋白基因
如何获取目的基因呢？
非编码区
非编码区
启动子：RNA聚合酶的识别和结合位点，开始转录
编码区
终止子：终止转录
原核生物基因：
真核生物基因：
启动子
终止子
能够编码蛋白质的序列叫做外显子；
不能够编码蛋白质的序列叫做内含子；
内含子：
外显子：
连续
不连续
2、获取目的基因的方法
（1）化学方法直接人工合成目的基因
①DNA合成仪人工合成：
对于比较小的目的基因，在明确脱氧核苷酸序列后，可以通过DNA合成仪人工合成。
DNA合成仪
②半合成法
a、适用对象：全基因或较大基因。采用全部化学合成成本昂贵，使用半合成法可以降低成本。
在dNTP存在的条件下，通过Klenow酶合成相应的互补链
在适当条件下退火得到模板——引物复合体
合成基因的部分寡核苷酸片段（3′末端具有10~14个互补碱基）
b、半合成法过程：
用相应的DNA连接酶修复缺口，获得两条完整的互补双链
是能将双链DNA的突出5′端补平的DNA聚合酶
（1）基因文库：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，每个受体菌可能分别含有该种生物的不同基因，称为基因文库。包括基因组文库和cDNA文库。
2、通过基因文库获取目的基因
①基因组文库：是指含有某种生物体全部基因片段的重组DNA的克隆群体；
限制酶
DNA连接酶
体外包装、转染
a、基因组文库构建过程
b、从基因组文库筛选目的基因方法：一般采用核酸探针杂交的方法，将某基因的已知片段作为筛选的探针，在基因组文库中筛选含有目的基因的菌落，进行扩增、分离回收而获得目的基因。
②cDNA文库：包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。
a、 cDNA文库构建过程
注：cDNA文库的基因中不含有启动子、终止子、内含子等结构。
3、利用PCR获取和扩增目的基因
PCR由穆里斯等人于1985年发明，为此，穆里斯于1993年获得诺贝尔化学奖。
① PCR含义：
聚合酶链式反应简称PCR，是目的DNA片段(目的基因)的体外扩增技术。
通过这项技术可在短时间内大量扩增目的基因。
整个过程是在体外进行，故又叫做体外DNA扩增技术。
②PCR的原理：
DNA半保留复制；
PCR仪
③反应条件
条件 作用
一定量的模板DNA
引物对
4种脱氧核苷酸dNTP
缓冲液
热稳定DNA聚合酶（Taq酶）
Mg2+
作为DNA复制的模板
使DNA聚合酶能从引物3′端开始连接脱氧核苷酸（ 5 ′→3′延伸 ）
作为合成DNA子链的原料，还可以水解为PCR反应提供能量
提供相对稳定的pH环境
催化合成DNA子链
真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活
引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。
3’
5’
DNA母链1
3’
5’
DNA母链2
3’
5’
引物1
3’
5’
引物2
小知识：①什么是引物？
3’
5’
DNA母链1
3’
5’
DNA母链2
引物可以是DNA单链，细胞外（PCR）一般以DNA单链为引物；
也可以为RNA单链，细胞内的DNA复制通常以RNA单链为引物；
用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸。
引物结合在模板链的3’端
注：进行PCR的前提条件是：已知目的基因两端的核苷酸序列以便合成一对引物。
小知识：② 什么是dNTP ？
dNTP是脱氧核苷三磷酸的缩写，N是指A、T、G、C四种含氮碱基，包括dATP、dGTP、dTTP、dCTP。它们是由两个磷酸分子和一个脱氧核苷酸组成的，其结构简式如下：
A
T
C
G
P ~ P ~ P
脱氧核糖
含氮碱基
磷酐键
脱氧核苷酸
③PCR过程
待扩增的DNA片段
第一步：变性
3’
3’
5’
5’
3’
5’
3’
5’
变性
在约94℃高温下，作为模板的双链DNA解旋（变性）为两条单链DNA；
第二步：复性
引物1
引物2
3’
5’
3’
5’
5’
5’
3’
3’
反应体系的温度降至约55℃，2条引物分别与对应单链DNA上的特定部位配对。
第三步：延伸
引物1
引物2
Taq酶
Taq酶
3’
5’
3’
5’
5’
5’
3’
3’
3’
3’
反应体系的温度回升到约72℃（Taq酶催化作用的最适反应温度），4种脱氧核苷三磷酸根据碱基互补配对原则，在Taq酶的作用下连接到引物3′端之后，使引物链延伸，并形成互补的DNA双链。
思考：PCR一轮后获得的两个DNA分子的两条链等长吗？若不等长，那么在第几轮会出现两条链等长的DNA分子？
思考：下图是某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)，都不合理，请分别说明理由。
第1组： ；
第2组： 。
引物Ⅰ和引物Ⅱ会因局部发生碱基互补配对而失效
引物Ⅰ′自身折叠后会因出现局部碱基互补配对而失效
注：
①PCR中两种引物都结合在DNA模板链的3’端，使用的两种引物的序列不相同；引物自身不应存在互补序列；两条引物之间不应存在互补序列；
③需在引物的5’端加上限制酶的酶切位点；
② PCR复制n次，产生的DNA分子数 ； 含引物的DNA分子数 ；
只含一种引物的DNA分子数 ；
同时含两种引物的DNA分子数 ；
共消耗引物的对数 ；
含脱氧核苷酸链等长的DNA分子数 ；
2n
2n
2
2n－2
2n－1
2n－2n
比较项目 PCR 细胞核内DNA复制
场所 试管中 细胞内
方式 半保留全连续局部区域复制 半保留半不连续全链复制
起始位点 引物3'端 复制起始位点
酶 仅一种DNA聚合酶（Taq酶） 多种酶
反应条件 温度变幅大 温和
解旋 高温解旋 解旋酶解旋
引物 DNA片段，保留在复制的子链中 RNA 片段，不保留在复制的子链中
产物 引物界定的片段 核基因组
循环次数 人为设置 与细胞分裂同步
总结：PCR与细胞内DNA复制的比较
④PCR技术的应用
(1)广泛应用于医学及分子生物学领域，如：病原体鉴定、遗传病诊断、免疫学研究、癌基因探索及某些疾病治疗等。
(2)在古生物学、法医学等方面也有广泛的应用。
判断：
(1)PCR反应中温度的周期性改变是为了DNA聚合酶催化不同的反应(　　)
(2)用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列(　　)
(3)PCR技术中，DNA模板链上碱基G和C的比例越高，DNA变性解链的温度就越高(　　)
×
√
√
1.下列有关PCR技术的说法，错误的是
A.PCR是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术
B.PCR技术的原理是DNA分子半保留复制
C.退火过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则
D.PCR过程中只需要用到模板DNA、两种引物分子、4种脱氧核苷三磷酸原料
D
2.下列关于基因工程及应用的叙述，正确的是
A.从cDNA文库中能获取某种生物的全部基因
B.一种核酸探针能从基因组文库中筛选出多种基因
C.利用半合成法合成全基因时只需要DNA连接酶的作用
D.构建cDNA文库需要用到逆转录酶
D
3.聚合酶链式反应(PCR)被广泛用于遗传疾病的诊断、刑事侦查、古生物学和基因工程等领域。利用PCR技术可快速扩增目的基因。下列有关叙述错误的是
A.扩增目的基因的前提条件是要有一段已知目的基因的核苷酸序列
B.PCR技术需要使用Taq酶的原因是其耐高温
C.PCR技术扩增时，两种引物的碱基序列要尽可能互补
D.若目的基因扩增5次，则需要消耗62个引物分子
C
4.甲、乙两图表示从细菌细胞中获取目的基因的两种方法，以下说法中错误的是
A.甲方法可建立该细菌的基因组文库
B.乙方法可建立该细菌的cDNA文库
C.甲方法中的b过程要以脱氧核苷酸为原料
D.乙方法需要逆转录酶参与
C
思考：能不能直接将目的基因导入受体细胞，为什么？如果不能，如何避免该结果的发生呢？
析：游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解，且游离的DNA片段不能稳定遗传。
构建基因表达载体（核心工作）
（二）基因表达载体的构建（核心步骤）
1、构建基因表达载体的目的：
（1）使目的基因在受体细胞中稳定存在，且可以遗传给下一代；
（2）使目的基因能够在受体细胞中表达和发挥作用。
2、基因表达载体组成：
①目的基因：
控制特定性状或表达特定产物；
②启动子：
功能：是RNA聚合酶识别、结合的部位，始驱动基因转录出mRNA；
位置：位于目的基因的上游；
③终止子：
④标记基因：
位置：位于目的基因的下游；
功能：终止转录；
检测并筛选含目的基因的受体细胞；
⑤复制原点：
要能与特定的受体细胞相匹配，使外源基因在受体细胞中能稳定复制并遗传；
注：
①目的基因应该插入启动子和终止子之间；
②载体与表达载体区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构。
③启动子、起始密码子、终止子、终止密码子的比较：
启动子：位于DNA上，是RNA聚合酶的结合位点，转录
的起始点；
起始密码子：位于mRNA上，是翻译的起始点（AUG：甲
硫氨酸））
终止子：位于DNA上，是转录的终点；
终止密码子：位于mRNA上，翻译的终点（有UAA、UGA、
UAG三种，不编码氨基酸)
3、基因表达载体的构建过程
3、基因表达载体的构建过程
载体
（质粒）
DNA分子
（含目的基因）
同一种限制酶（或能产生相同黏性末端的限制酶）处理
带有黏性末端或平末端的切口
带有相同黏性末端或平末端的目的基因片段
DNA连接酶
重组DNA分子（重组质粒）
积极思维：请结合下图，回答问题：
（1）构建基因表达载体时，能否用SmaⅠ限制酶切割质粒？为什么？
不能，
因为SmaⅠ切割会破坏质粒的抗生素抗性基因；
质粒上的抗性基因是标记基因，便于重组DNA分子的筛选，若被破坏，无法进一步筛选。
（2）只使用EcoRⅠ分别切割质粒和外源DNA，能否构建基因表达载体？
如果能，有何弊端？
能
单酶切产生的黏性末端相同，所以可能会产生以下几种连接方式:
①质粒重新环化；
②目的基因自身环化；
③质粒与目的基因反向连接；
例：质粒与目的基因正向连接：
质粒与目的基因反向连接：
（3）与只使用EcoRⅠ相比较，使用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点是什么？
①可以防止质粒、目的基因的自身环化连接；
②还可以防止目的基因与载体的反向连接。
注：在基因工程实际操作中，可利用产生不同黏性末端的的限制酶切割质粒和含目的基因的外源DNA，以防止质粒和含目的基因的外源DNA自身环化或反向连接；
1．下列有关体内DNA复制与PCR技术比较的叙述，错误的是
A．二者子链的延伸方向相同，均为5′端→3′端
B．二者均需要解旋酶破坏氢键来实现解旋
C．体内DNA复制需要能量，PCR反应也需要能量
D．二者遵循的碱基互补配对原则相同
B
习题巩固：
2.下列有关基因表达载体的叙述，不正确的是
A.具有复制原点，使目的基因能在受体细胞内扩增
B.具有启动子，作为核糖体识别、结合的部位
C.具有标记基因，有利于重组DNA的鉴定和选择
D.具有目的基因，以获得特定的基因表达产物
B
3．图甲、乙中的箭头表示三种限制性内切核酸酶的酶切位点，Amp R表示氨苄青霉素抗性基因，neo表示新霉素抗性基因。下列叙述错误的是
A．在构建重组质粒时，可用PstⅠ和HindⅢ切割质粒和外源DNA
B．在酶切过程中，不能破坏质粒中全部的标记基因
C．若只用PstⅠ处理质粒和外源DNA分子片段，无法避免自身环化和反向连接
D．导入重组质粒的大肠杆菌可以在含氨苄青霉素的培养基中生长
D
由于不同转基因产品所需要的目的基因不同，受体细胞又有植物、动物、微生物之分，因此基因表达载体的构建方法不是千篇一律的,将目的基因导入受体细胞的方法也不是完全相同的。
构建好的重组表达载体要如何导入受体细胞？
（三）将目的基因导入受体细胞
转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，称为转化。
(2)农杆菌
①感染对象：能在自然条件下感染双子叶植物或裸子植物，但不会感染大多数单子叶植物。
②感染原因：当双子叶植物或裸子植物受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量的酚类化合物，吸引农杆菌向伤口处移动。
③特点：农杆菌含有Ti质粒，上面有一段转移DNA(T－DNA)，能进入受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。
(1)主要方法：
1、将目的基因导入植物细胞
农杆菌转化法；
T-DNA
Ti质粒
大型环状DNA
农杆菌
将目的基因插到农杆菌Ti质粒的T－DNA特定区段上，再通过T－DNA将其插入植物细胞染色体的DNA上，使目的基因得到稳定的遗传和表达；
(3)农杆菌转化法的原理：
(3)农杆菌转化法过程：
注：农杆菌转化法中有两次拼接和两次导入:
第一次拼接: 将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上；
第二次拼接(非人工操作): 插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上。
第一次导入: 是将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌；
第二次导入(非人工操作):是指含目的基因的T-DNA导入受体细胞。
用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；
补充：将目的导入植物细胞的方法-----花粉管通道法
操作方式：
在植物受粉后一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴在花柱切面，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。
花粉管通道法是我国科学家周光宇在1987年独创的。将重组DNA滴加到植物受粉后形成的花粉管通道内，进入卵细胞、合子或早期胚胎细胞中。此方法直接、简便且经济，已应用于水稻、小麦、棉花、大豆等多种植物中。
2、将目的基因导入哺乳动物细胞
构建基因表达载体并提纯
利用显微注射将基因表达载体注入动物的受精卵中
胚胎移植（移植到同期发情的母畜子宫内）
获得具有新性状的动物
（1）
显微注射法；
（2）病毒感染法
用病毒DNA与目的基因一起构建的载体，去感染受体动物细胞，也能使目的基因导入动物细胞内。
普通鼠与生长速度加快的转基因鼠
①受体细胞：
微生物（常用大肠杆菌）
优点：
繁殖周期短
体积小易于培养操作
多为单细胞
遗传物质相对较少
（3）将目的基因导入微生物细胞：
大肠杆菌细胞
②感受态细胞
经过适当的处理，如用Ca2+（CaCl2）处理后，细胞质膜对DNA的通透性会发生改变，细胞变得容易接受外来的DNA，处于这种状态的细胞称为感受态细胞。
Ca2+处理法
Ca2+处理微生物细胞
感受态细胞
将重组的基因表达载体与感受态细胞混合在缓冲液中
在适当的条件下完成转化
培养基上筛选带目的基因的微生物
③过程：
种类项目 　　 植物细胞 动物细胞 微生物细胞
常用方法
受体细胞
转化过程 目的基因插入Ti质粒的T-DNA上→导入植物细胞→整合到受体细胞DNA中→表达 目的基因表达载体提纯→取受精卵→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 Ca2＋处理细胞→感受态细胞→表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸DNA分子
小结：
农杆菌转化法；
花粉管通道法
显微注射法
Ca2＋处理法
体细胞或受精卵
受精卵
原核细胞
（四）目的基因的检测与鉴定
1、分子水平的检测（人教版）
如：检测棉花的染色体DNA上是否插入了Bt基因或检测Bt基因
——通过PCR等技术检测
PCR操作
是否扩增出目的基因
M：marker； 1-阳性质粒；
2：原始品系； 3-9转Bt品系；
PCR琼脂糖凝胶电泳检测结果
电泳操作
① 检测目的基因是否导入
提取DNA
如：检测Bt基因是否翻译出mRNA
——通过PCR等技术检测
10个PCR阳性棉花植株中，有四株Bt基因发生转录
② 检测目的基因是否转录
（四）目的基因的检测与鉴定
(1)从DNA方面进行检测
①检测方法：
②检测原理：具有一定同源性的两条DNA单链，在一定条件下(适宜的温度等)可以按照碱基互补配对原则形成双链；
1、分子水平的检测（苏教版）
③基因探针：用放射性同位素或荧光标记的已知DNA片段；
④结果分析：若待测DNA中有能与基因探针互补的特异性DNA片段，用于示踪的放射性同位素标记或荧光标记会指示出其所在的位置（形成杂交带），表明目的基因已经插入转基因生物的DNA分子中。
DNA分子杂交法；
⑤检测过程
形成杂交带
(2)从RNA方面进行检测
①检测目的：检测目的基因是否能发挥其功能，即是否转录出相应的mRNA分子；
②检测方法：
③检测过程：
从待测转基因生物细胞中提取mRNA分子，用已标记的目的基因片段作为探针与mRNA杂交，如果有杂交带出现，表明目的基因转录出相应的mRNA分子；（Northern印迹）
分子杂交技术；
(3)从蛋白质方面进行检测：
①检测方法：
②检测过程：
从待测转基因生物中提取蛋白质，再用相应的
抗体进行抗原—抗体杂交；
③结果分析：
如果有杂交带出现，说明目的基因已经表达出相应的蛋白质。
检测目的基因是否翻译成相应的蛋白质；
抗原—抗体杂交法；
2、个体水平的检测
(1)检测目的：
(2)实例：
①对于导入某种鱼的抗冻蛋白基因的转基因番茄进行个体检测，需要栽培转基因番茄获得果实后，再与天然产品比较，确定其是否具有了抗冻性状；
②抗虫棉的培育成功与否可以直接接种棉铃虫，和普通棉花进行对照，以确定棉花是否真的具有了抗虫特性；
对生物的某些特定性状进行鉴定；
转基因生物 检测方法 成功标志
抗虫植物
抗病毒(菌)植物
抗盐植物
抗除草剂植物
获取目的基因产物的转基因生物
常见转基因生物在个体水平上鉴定、检测的方法（列举如下表）
饲喂害虫（抗虫接种实验）
害虫死亡
病毒（菌）感染（抗病接种实验）
未出现病斑
盐水浇灌
正常生长
喷洒除草剂
正常生长
提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较
功能、活性正常
检测水平 检测内容 方法 结果显示
分子水平的检测 DNA
RNA
蛋白质
个体水平的检测
小结：
检测转基因生物的染色体上是否插入了目的基因
DNA分子杂交法（基因探针+待测转基因生物的DNA）
是否显示出杂交带
检测目的基因是否转录
分子杂交技术（基因探针+待测转基因生物的mRNA）
检测目的基因是否翻译成蛋白质
抗原—抗体杂交
包括抗虫、抗病的接种试验，抗冻的耐寒试验，以确定是否有抗性及抗性程度；基因工程产品需要与天然产品进行活性比较等
1.下列关于将目的基因导入受体细胞的说法中，正确的是(多选)
A.农杆菌在自然条件下不侵染单子叶植物的原因是单子叶植物产生的酚类化合物有刺激性
B.将目的基因导入动物细胞采用最多的方法是显微注射法
C.为使大肠杆菌易吸收DNA分子，应先用一定浓度的CaCl2溶液进行处理
D.在显微注射法中，不需要先构建基因表达载体
BC
习题巩固：
2．运用转基因技术，将奶牛细胞中编码凝乳酶的基因转移到大肠杆菌细胞中，达到大规模生产凝乳酶的目的。下图表示用作运载体的质粒和目的基因所在DNA片段。下列操作与实验目的不符的是
B
A．用限制酶BamH Ⅰ、Pst Ⅰ和DNA连接酶构建基因的表达载体
B．用含氨苄青霉素的培养基筛选出的即为导入目的基因的细菌
C．可用PCR技术大量扩增目的基因
D．用Ca2+处理大肠杆菌使其易于转化
3.下图为科学家通过基因工程培育抗虫棉时，从苏云金杆菌中提取抗虫基因“放入”棉花细胞中，与棉花的DNA分子“结合起来”而发挥作用的过程示意图。以下相关说法不正确的是
A.图中Ⅰ是质粒，步骤①需要用到限制酶和DNA连接酶
B.图中Ⅱ是含目的基因的重组质粒，步骤②是将重组质粒导入棉花细胞
C.图中Ⅲ是农杆菌，通过步骤③将目的基因导入植物细胞
D.剔除培育成功的抗虫棉体内的四环素抗性基因不会影响抗虫基因的表达
B
4．为了增加菊花花色类型，研究者从其他植物中克隆出花色基因C（图1），拟将其与质粒（图2）重组，再借助农杆菌导入菊花中。下列操作与实验目的不符的是
A．用限制性核酸内切酶EcoR Ⅰ和连接酶构建重组质粒
B．用含C基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织，将C基因导入细胞
C．在培养基中添加卡那霉素，筛选被转化的菊花细胞
D．用DNA分子杂交方法检测C基因是否整合到菊花染色体上
C
5．下图是利用基因工程培育抗虫植物的示意图。以下相关叙述正确的是
A．②的构建需要限制性内切核酸酶和DNA聚合酶参与
B．③侵染植物细胞后，重组Ti质粒整合到④染色体上
C．④染色体上若含抗虫基因，则⑤就表现出抗虫性状
D．⑤只要表现出抗虫性状就表明植株发生了可遗传变异
D
实验：DNA的粗提取和鉴定
不同生物、不同组织细胞的DNA提取方法不同。提取DNA也应考虑对DNA纯度的要求和实验条件选择不同的方法。例如，提取质粒DNA常用碱裂解法获取质粒再提取DNA。
（一）实验原理
1、提取DNA
利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分；
（1）DNA在NaCl溶液中的溶解性：
DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，0.14mol/L时，DNA溶解度最小；高于或低于这一浓度，DNA的溶解度都会逐渐增大。
DNA不溶于酒精溶液，但细胞中某些蛋白质则溶于酒精。利用这一原理，可初步分离DNA与蛋白质。
（2）DNA不溶于酒精溶液
2、DNA的鉴定
在酸性条件下，DNA与二苯胺发生反应，溶液呈蓝色。
（二）实验材料的选取
原则上，凡是含有DNA的生物材料都可以考虑；选用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大。
一般选取鸡血来提取DNA，鸡血中血细胞含量高，DNA含量丰富，材料易得，细胞易吸水涨破。也可以选用植物细胞如洋葱等，只是破碎植物细胞比较麻烦，提取洋葱DNA时，需先将洋葱切碎，然后加入一定量的洗涤剂（洗涤剂溶解或破坏细胞膜，有利于DNA的释放）和食盐（利用盐析法去除蛋白质，有利于获取较纯净的DNA），进行充分搅拌和研磨，过滤后收集研磨液。
注：该实验中不能选用猪血等哺乳动物的血，因为哺乳动物成熟的红细胞没有细胞核和各种细胞器。
烧杯、量筒、玻璃棒、研钵、纱布、漏斗、试管、试管架、试管夹、酒精灯、石棉网、三脚架、火柴、刀片和天平等。
1、制备鸡血细胞液
（四）实验步骤
取质量浓度为0.1ｇ/mL的柠檬酸钠溶液（防止血液凝固）100ｍＬ和新鲜鸡血180ｍＬ，注入500ｍL烧杯中，充分搅拌。将混合均匀的鸡血细胞液置于４ ℃冰箱内，静置１天（或离心），使血细胞沉淀，去除上清液。
（三）实验用具
2、破碎细胞
取出准备好的鸡血细胞液５～10ｍL，注入50ｍL烧杯中，并向烧杯中加入20ｍL蒸馏水，搅拌 5min。用垫有纱布的漏斗过滤，取其滤液。
3、获取含DNA的滤液
取物质的量浓度为2mol/L的NaCl溶液40 mL加入滤液中，用玻璃棒沿同一方向轻轻搅拌，使其混合均匀，使滤液中的DNA充分溶解。
4、析出DNA
取适量蒸馏水沿烧杯内壁缓缓加入，同时用玻璃棒沿同一方向轻轻搅拌（防止DNA发生断裂）。随蒸馏水的不断加入，NaCl溶液浓度会降低，DNA的溶解度会降低，烧杯中会有丝（絮）状物（含有一定杂质的DNA）出现。当丝状物含量不再增加时，停止加入蒸馏水。
5、提纯DNA
将分离的丝状物放入物质的量浓度为2 mol/L的NaCl溶液中，使其溶解，再加入适量冷却的、体积分数为95%的乙醇溶液时，DNA的絮状物会从滤液中析出。
析出DNA
注：冷却的酒精溶液(体积分数95％)作用：
①进一步提纯DNA；
②抑制核酸水解酶活性，防止DNA降解；
③低温有利于增加DNA分子柔韧性，减少断裂。
6、DNA的鉴定
将分离的丝状物放入物质的量浓度为2 mol/L的NaCl溶液中，使其溶解，利用二苯胺、冰醋酸、浓硫酸配制二苯胺试剂。向上述溶液中加入二苯胺试剂，沸水浴加热数分钟，溶液出现蓝色。（对照组除了不加丝状物，其他条件与实验组相同）
总结：不同试剂的作用
试剂 作用
蒸馏水
NaCl溶液
乙醇
二苯胺
柠檬酸钠
加到鸡血细胞液中，使血细胞吸水涨破
加到含DNA的2 mol·L-1的NaCl溶液中，使其浓度下降析出DNA
2 mol·L-1的NaCl溶液可以溶解DNA
冷却的、体积分数为95%的乙醇可以除去杂质以提纯DNA
鉴定DNA的试剂
抗凝剂，防止血液凝固
0.14 mol·L-1的NaCl溶液可以析出DNA
1.在“DNA的粗提取和鉴定”实验中，实验原理是DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同。DNA的溶解和析出与图中所示曲线的对应点符合的是
A.a点浓度最适合析出DNA
B.b点浓度最适合析出DNA
C.c点浓度最适合溶解DNA
D.d点浓度最适合析出DNA
B
习题巩固：
2.下列有关“DNA的粗提取和鉴定”实验原理的叙述，正确的是
A.DNA在NaCl溶液中的溶解度随NaCl溶液浓度的升高而减小
B.利用DNA不溶于乙醇的性质，可除去细胞中溶于乙醇的物质而得到较
纯的DNA
C.DNA是大分子有机物，易溶于水也溶于某些有机溶剂
D.在沸水浴中，DNA遇二苯胺试剂会出现紫色反应
B
3．图1、2分别为“DNA的粗提取和鉴定”实验中部分操作示意图，下列叙述不正确的是
A．图1中完成过滤后应向滤液中加入一定量的柠檬酸钠溶液
B．图2完成后要将玻璃棒上丝状物重新溶解到2 mol/L的NaCl溶液中进行后续鉴定
C．图1、2中加入蒸馏水的目的不同
D．图1、2中搅拌的目的不同
A
4．（多选）提取生物大分子的基本思路是选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子，如提取DNA就要利用它与RNA、蛋白质等在物理和化学性质方面的差异，去除其他成分。下列有关DNA的粗提取与鉴定的叙述，错误的是
A．可用新鲜猪血代替鸡血做实验材料
B．鉴定DNA时将丝状物直接加入到二苯胺试剂中并沸水浴加热
C．收集、保存好剩余的二苯胺试剂，以备以后实验时继续使用
D．纯化提取DNA时，要控制NaCl溶液的浓度，以溶解和析出DNA
ABC
实验：利用PCR技术扩增DNA片段并完成电泳鉴定
一、实验目的
1、尝试运用PCR仪扩增DNA片段；
2、关注PCR技术的应用；
3、学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段的方法和技术；
二、实验原理
（1）扩增DNA片段的过程包括变性、退火和延伸等步骤的多次循环。理论上，每经过一个循环，样本中DNA片段的数量增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过n个循环后，DNA片段数量可扩增至原来的2n倍。
（2）PCR反应体系包括：DNA模板、反应缓冲液、dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、人工合成的DNA引物对、Taq酶等。在不同阶段，还需要控制PCR仪反应系统的不同温度。
1、利用PCR在体外进行DNA片段扩增的原理
2、DNA片段电泳鉴定的原理
（1）DNA分子具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。
（2）PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。
（3）在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小（DNA分子量越大，迁移的越慢）和构像等有关。
（4）凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。
三、实验器材和试剂
1、仪器
2、试剂
PCR仪、琼脂糖凝胶电泳系统、凝胶成像仪或紫外透射仪、微孔加热器(微量恒温仪)等。
DNA模板、dNTP混合物、Taq酶、双蒸水、10×PCR缓冲液等。
PCR仪
微量离心管
微量移液器
电泳装置
1、PCR扩增目的基因
（1）配制反应体系：
四、实验步骤
用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分：
待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率）；
参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。
（2）按程序进行扩增。
①94 ℃预变性5 min
②94 ℃变性1 min
③55 ℃退火1 min
④72 ℃延伸2 min
⑤重复②～④,30个循环
⑥72 ℃延伸7～10 min；
注：
预变性作用：使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合；
（1）配制琼脂糖溶液
根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%-1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀；
（2）制备凝胶
①将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔；
③将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜；
②待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内；
2、DNA片段的电泳鉴定
（3）加样
将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物（Marker）；
（4）电泳
接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1-5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳；
（5）观察记录
取出凝胶置于紫外灯下观察和照相；
注：
①为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理；
②该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化；
③在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换；
④在进行操作时，一定要戴好一次性手套；
⑤PCR扩增不能随意加大试剂用量；
思考：你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？
转Bt基因品系PCR琼脂糖凝胶电泳检测结果
(M：marker；1-阳性质粒；2：原始品系；3-9转Bt品系；)
DNA标准样液
(Marker)
阳性
对照
阴性
对照
待测样品
注：
阴性对照作用：用于检测是否存在含有其他序列的DNA污染；
注：
（1）未出现扩增条带的原因主要有：
①Taq酶失活； ②引物出现质量问题；
③Mg2＋浓度过低； ④变性时的温度低，变性时间短。
（2）出现非特异性扩增条带的原因主要有：
①模板DNA出现污染。
②引物特异性不强或形成引物二聚体。
③Mg2＋浓度过高。
④退火时的温度过低等。
（3）若PCR反应中变性时温度低、时间短可能导致未出现扩增条带；
（4）退火时的温度过低对可能导致出现非特异性扩增条带；
1.下列有关体内DNA复制与PCR技术比较的叙述，错误的是
A.二者子链的延伸方向相同，均为5′端→3′端
B.二者均需要解旋酶破坏氢键来实现解旋
C.体内DNA复制需要能量，PCR反应也需要能量
D.二者遵循的碱基互补配对方式相同
B
习题巩固：
2.用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到以下电泳图谱，其中1号为DNA标准样液(Marker)，10号为蒸馏水，PCR时加入的模板DNA如图所示。据此作出的分析，不合理的是
A.PCR产物的分子大小在250～500 bp之间
B.3号样品为不含目的基因的载体DNA
C.9号样品对应植株不是所需的转基因植株
D.10号确定反应体系等对结果没有干扰
B
3．PCR是一种体外扩增DNA的技术，模拟了体内的DNA复制过程。下图为PCR技术的原理示意图，对于图中物质和过程的说明，错误的是
A．物质a：游离的dNTP
B．过程①：氢键断裂
C．过程②：边解旋边复制
D．过程③：遵循碱基互补配对原则

展开更多......

收起↑