资源简介

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第1章 发酵工程
第2节 微生物的培养技术及应用
—微生物的选择培养和计数
本节聚焦
问题一
问题二
问题三
怎样运用生物与环境相适应的观点来理解选择培养的原理？
如何通过调整培养基的配方来有目的培养某种微生物？
测定微生物数量的常用方法？
纯培养
纯培养物
配制培养基
灭菌
接种
分离
培养
由单一个体繁殖所获得的微生物群体
提出问题
如何从自然界中分离出需要的特定微生物？
自然界中微生物数量繁多，种类庞杂，要想从中分离出需要的特定微生物并不容易，尤其当要分离的微生物在混合的菌群中不是优势种群时，仅通过一般的平板划线法或稀释涂布法很难实现。该怎么办？
课程导入
1. 微生物分离的实例
水生栖热菌的筛选
水生
栖热菌
提取
耐高温
DNA聚合酶
用于
PCR
① 水生栖热菌的应用
② 筛选原理
水生栖热菌能在70~80℃高温条件下生存，绝大多数微生物在此条件下不能生存。
一、选择培养基
2. 筛选原则
耐热微生物
根据微生物对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。
一、选择培养基
筛选
耐寒微生物
筛选
石油分解菌
筛选
有利于目的菌生长的条件有哪些？
营养、温度和pH等
3. 实验室微生物的筛选
人为提供有利于目的菌生长的条件（包括营养、温度和pH等），同时抑制或阻止其他微生物的生长。
营养
以尿素为唯一
碳源的培养基
以淀粉为唯一
碳源的培养基
以石蜡油为唯一
碳源的培养基
筛选出能分解尿素的细菌
筛选出能分解淀粉的细菌
筛选出能分解石油的细菌
一、选择培养基
3. 实验室微生物的筛选
人为提供有利于目的菌生长的条件（包括营养、温度和pH等），同时抑制或阻止其他微生物的生长。
温度
高温
筛选出耐高温的细菌
pH
高pH
筛选出耐pH的细菌
无氧
筛选出厌氧细菌
高盐
筛选出耐高浓度盐的细菌
一、选择培养基
4. 选择培养基的定义
① 加富性选择培养基
在微生物中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类的微生物生长的培养基，称为选择培养基（Selective medium）
在培养基中加入分离对象“嗜好”的营养物质。
② 抑制性选择培养基
在培养基中加入分离对象对能够抵抗的某种抗菌物质。
一、选择培养基
思考·讨论
选择培养基配方的设计
尿素[CO(NH2)2]含氮量高，化学性质相对稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素施入土壤后，会被土壤中的某些细菌分解成NH3，NH3再转化成NO3-、NH4+等被植物吸收。而这些细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶，脲酶催化尿素分解产生NH3，NH3可作为细菌生长的氮源。
CO(NH2)2
+ H2O
CO2
+ 2NH3
NO3-
NH4+
脲酶
转化
一、选择培养基
1. 如果让你配制一种培养基，让土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出
来，培养基的配方该如何设计？
设计一种选择培养基，用尿素作为唯一氮源，可以将分解尿素的细菌分离出来。
一、选择培养基
讨论
尿素
一、选择培养基
讨论
尿素
2. 该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？
这种培养基与普通培养基相比，只是用尿素作为唯一氮源，培养基的其他营养成分基本相同。
二、微生物的选择培养
1. 选择培养基的作用
分离并计数某种微生物的数量（例如，能分解尿素的细菌）。
2. 微生物选择培养获取纯培养物的方法
由于土壤中细菌的数量庞大，要想得到能分解尿素的细菌的纯培养物，必须要对土样进行充分稀释，然后再将菌液涂布到制备好的培养基上，也就是要采用稀释涂布平板法。
选择培养基
+
稀释涂布平板
单菌落
第1步：
取样并稀释10倍
10 g
铲取土样，将样品装入纸袋中。
1
将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶，充分摇匀。
2
90 mL的无菌水
3. 稀释涂布平板操作过程
二、微生物的选择培养
3. 稀释涂布平板操作过程
第2步：
梯度稀释
取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。
3
1 10
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 103
1 104
1 105
1 106
1 107
1 102
9mL无菌水
二、微生物的选择培养
3. 稀释涂布平板操作过程
1 107
取0.1mL菌液，
滴加到培养基表面
4
将涂布浸入再盛有
酒精的烧杯中
5
将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。
6
用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。
7
第3步：
涂布平板
二、微生物的选择培养
4. 微生物培养
待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30~37℃的恒温培养箱中培养1~2d。
在涂有合适浓度菌液的平板上就可以观察到分离的单菌落。
稀释涂布平板操作后分裂得到的单菌落
二、微生物的选择培养
5. 结果评价
① 培养基的制作是否合格
如果未接种的培养基在恒温箱中保温1~2d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。
空白对照
稀释104倍
稀释105倍
稀释106倍
二、微生物的选择培养
5. 结果评价
② 接种操作是否符合无菌要求
如果培养基上生长的菌落的颜色、性状、大小基本一致，并符合目的菌的菌落的特点，则说明接种操作是符合要求的，如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习。
二、微生物的选择培养
1. 稀释涂布平板计数法计数（活菌计数）
原理
当样品的稀释足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测除样品中大约含有多少活菌。
原则
一般选择菌落数在30~300的平板就行计数。
同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后求平均值。
三、微生物的数量测定
1. 稀释涂布平板计数法计数（活菌计数）
缺点
统计的菌落数往往比活菌的实际数目低。这是因为当两个或多个细胞连在一起，平板上观察到的只是一个菌落。
因此，统计结果一般用菌落数而不用活菌数来表示。
三、微生物的数量测定
1. 稀释涂布平板计数法计数（活菌计数）
计算公式
每g样品中的菌落数 = ( C ÷ V ) M
代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数
代表涂布平板时所用的稀释液的体积（mL）
代表稀释倍数
某同学再稀释倍数为106的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每g样品中的菌落数时（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1mL）（ ）
A. 2.34 108 B. 2.34 108 C. 234 D. 23.4
例
三、微生物的数量测定
2. 显微镜直接计数（细菌总数计数）
原理
利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积的样品中微生物的数量，统计的结果一般是活菌数和死菌数的总和。
原则
快速、直观、设备简单
能观察微生物的形态特征。
缺点
不能区分死菌和活菌，统计结果会偏大；
为了避免上述缺点，可以染色后进行显微镜计数。
三、微生物的数量测定
探究·实践
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
提出问题
① 如何分离土壤中能分解尿素的细菌？
② 如何计算每克土壤样品中有多少分解尿素的细菌？
三、微生物的数量测定
探究·实践
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
基础知识
绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。
利用尿素作为唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。
组分 含量
KH2PO4 1.4
Na2HPO4 2.1g
MgSO4·7H2O 0.2g
葡萄糖 10.0g
尿素 1.0g
琼脂 15.0g
H2O 定容至1000mL
三、微生物的数量测定
实验设计
土壤取样
样品的稀释与涂布
微生物的培养
观察并记录结果
菌落计数
三、微生物的数量测定
探究·实践
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
① 土壤取样
细菌适宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长，绝大多数分布在距地表3~8cm的土壤层。取样时，一般要铲去表层土。
取样时用的铁铲和取样纸袋在使用前都需要灭菌，操作完整后，一定要洗手。
公园里、街道旁、花盆中
城市：
农田里、菜园里
农村：
三、微生物的数量测定
探究·实践
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
② 样品系列稀释与涂布
9 mL无菌水
0.1mL
0.1mL
0.1mL
测定土壤中细菌的数量，一般选用1 104、 1 105、 1 106倍稀释倍数进行平板培养。
三、微生物的数量测定
② 样品系列稀释与涂布
不同微生物在土壤中含量不同，分离不同的微生物采用不同的稀释度，以保证获得菌落数在30～300之间，适于计数的平板。
选择一个比较宽的范围，将1×103～1×107倍稀释的稀释液分别涂布到平板上培养，以保证能从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数。
在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，怎样做才能保证从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数？
三、微生物的数量测定
③ 微生物的培养与观察
每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。
不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌一般在30-37℃的温度下培养1-2d。
一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等
三、微生物的数量测定
将涂布器从酒精中取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后再放在火焰上灼烧。不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃酒精。
操作提示
三、微生物的数量测定
取土样时用的铁铲和取样纸袋再使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手。
④ 操作提示
三、微生物的数量测定
本实验使用的平板和试管较多，为了避免混淆，最好再使用前做好标记。
④ 操作提示
例如：在标记培养皿时应该注明组别，培养日期和平板上培养样品的稀释度。
三、微生物的数量测定
如果1个平板的计数结果与另2个相差太远（不在30~300范围内），说明在操作过程中可能出现了错误，因此，不能简单地将3个平板的计数值用来求平均值。
0.1mL
0.1mL
0.1mL
1 104
1 105
1 106
④ 操作提示
三、微生物的数量测定
0.1mL
0.1mL
0.1mL
1 104
1 105
1 106
空白对照设置：
将未接种的培养基同时进行培养，以判断培养基是否有杂菌污染。
④ 操作提示
三、微生物的数量测定
完全培养基对照设置：接种在完全培养基上同时进行培养，以判断选择培养基是否具有筛选作用。
0.1mL
0.1mL
0.1mL
1 104
1 105
1 106
④ 操作提示
三、微生物的数量测定
结果分析与评价
1. 结合对照组，分析培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选
出一些菌落？
如果没有接种的培养基上没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。
如果接种后的完全培养基上的菌落明显多于选择培养基的菌落数，说明培养基筛选除了一些尿素分解菌。
三、微生物的数量测定
结果分析与评价
2. 你是否获得了某一稀释度下菌落数为30~300的平板？在这一稀释度下，
是否至少有2个平板的菌落数接近？
如果得到了两个或多个菌落数为30~300的平板，说明稀释度合格，操作比较成功，能够进行菌落的计数。
三、微生物的数量测定
结果分析与评价
3. 你统计的每克土样中能分解尿素的细菌的菌落是多少？与其他同学统
计的结果接近吗？如果差异大，可能是什么原因引起的？
如果用同一土样进行操作，数据应该比较接近。如果差异很大，就需要从操作是否规范、培养基配制是否合理等方面查找原因。
三、微生物的数量测定
进一步探究
本活动只是初步筛选了能分解尿素的细菌，对分离的菌种进行鉴定还需要借助生物化学的方法。
鉴定培养基
土壤中分解尿素的细菌的鉴定
三、微生物的数量测定
活菌计数技术广泛应用于食品卫生、水源污染度的检验和土壤含菌量的测定等方面。如果你感兴趣，可以从下列项目中选做一个，并走访相关部门或企业，了解它们是如何进行检测的。
到社会中去
1. 空气中微生物总数的检测
2. 水中细菌的分离与计数
3. 牛奶中细菌的分离与计数
4. 土壤中真菌（或放线菌）的分离与计数
一、检测检测
练习与应用
1. 研究人员用无机盐、琼脂和石油配制的培养基从被石油污染的土壤中
筛选出了一种石油降解菌。判断下列相关表述是否正确。
(1) 这种培养基是一种选择培养基 （ ）
(2) 利用这种石油降解菌可以降解石油，修复土壤 （ ）
(3) 相对于未被污染的土壤，从被石油污染的土壤中更容易分离到
石油降解菌 （ ）
√
√
√
一、检测检测
练习与应用
2. 用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数时，通过统计平板上的菌落
数就能推测出样品中的活菌数，原因是 （ ）
A. 菌落中的细菌数目是恒定的
B. 平板上的一个菌落就是一个细菌
C. 通过此方法统计的菌落数与活菌的实际数目相同
D. 平板上的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌
D
二、拓展应用
练习与应用
1. 反刍动物，如牛和羊，具有特殊的器官——瘤胃。在瘤胃中生活着多
种微生物，其中许多微生物能分解尿素。请你设计一个实验，从瘤胃
中分离出能够分解尿素的微生物。
反刍动物的瘤胃中有大量的微生物,其中就有分解尿素的微生物。由于痛胃中的微生物多为厌氧菌,接触空气后会死亡,因此外离其中能分解尿素的微生物除了需要准备选择培养基、还应该参照厌氧菌的培养方法进行实验设计。
练习与应用
2. 地球上的植物每年产生的纤维素超过70亿吨,其中40%~60%能被土壤中某些微生物分解利用,这是因为它们能够产生纤维素酶。对这些微生物的研究与应用,使人们能够利用秸秆等生产酒精，用纤维素酶处理服装面料等。已知刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不
与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种反应。
当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，
刚果红与纤维素形成红色复合物;；而当纤维素
被纤维素分解菌分解后，复合物就无法形成，
培养基中会出现以这些菌为中心的透明卷(如
下图所示)。请回答下列问题。
几种纤维素分解菌在刚果红培养基上形成的透明圈
练习与应用
(1) 现在要从土壤中分离纤维素分解菌，请你给出详细的实验方案。
①土壤取样
②样品系列稀释与涂布(培养基以纤维素为唯一碳源，并加入刚果红)③培养
④观察并记录结果
练习与应用
(2) 你打算到什么环境中去寻找纤维素分解菌 为什么
纤维素分解菌大多分布在富含纤维素的环境中，采集土样时，可以选择纤维素丰富的环境，如树林中多年落叶形成的腐殖土等。
(3) 有同学说,可以把滤纸埋在土壤中,经过一段时间后,再从已腐烂的滤纸
上筛选纤维素分解菌。请你评价这一做法。
这是人工设置适合纤维素分解菌生存的环境,腐烂的滤纸上很可能有纤维素分解菌。

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