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选择性必修三《生物技术与工程》
第2章 细胞工程
第2节 动物细胞工程
（动物细胞培养）
1890年，希普（W. Heape，1855-1929）将安哥拉兔的胚胎移入比利时兔的输卵管内，得到了两只安哥拉兔，这是世界上胚胎移植成功的首例。
1907年，哈里森（R. G. Harrion，1870-1959）用一滴淋巴液成功培养了蝌蚪的神经元，首创了动物组织体外培养法。
1951年，张明觉（1908-1991）等发现哺乳动物精子的获能现象。
1958年，格登（J. Gurdon，1933-）用非洲爪蟾进行体细胞核移植，成功培育出性成熟个体。同一时期，童弟周（1902-1979）等开展了鱼类细胞核移植工作。
1959年试管兔诞生，之后多种试管动物相继出生。
1975年，米尔斯坦（C. Milstein，1927-2002）和科勒（G. K hler，1946-1995）等创立了单克隆抗体技术。
1978年，小鼠桑葚胚被成功分割。次年，科学家分割绵羊胚胎获得了同卵羔羊。
1981年，埃文斯（M. J. Evans，1941-）等成功分离和培养小鼠的胚胎干细胞。
1996年，世界上第一只细胞克隆羊多莉在英国诞生。随后多种克隆动物相继问世。
2006年，山中伸弥（S. Yamanaka，1962-）等获得了诱导多能干细胞。我国科学家利用这种细胞培育出了 小鼠。
2014年，世界上第一个用单细胞基因组测序进行遗传病筛查的试管婴儿在我国诞生。
2017年，我国科学家首次培育出体细胞克隆猴。
动物细胞工程（含胚胎工程）
一、动物细胞培养
（一）概念：
从动物体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后在适当的培养条件下，让这些细胞生长和增殖的技术。
目的：
获得细胞或细胞产物；不能获得完整动物个体。
原理：
细胞增殖（有丝分裂）
动物细胞培养需要哪些条件？
动物细胞培养的基本操作过程是怎样的？
怎样客观分析干细胞在临床上的应用所产生的效益与风险？
（二）动物细胞培养的条件
动物细胞培养所需的基本条件
营养条件
其他条件
糖类、
氨基酸、
无机盐、
维生素等
无菌、无毒的环境
适宜的温度、PH和渗透压
适宜的气体环境
(1)合成培养基:将细胞所需的营养物质按_____________严格配制而成。
(2)在使用合成培养基时，通常需要加入 等一些天然成分
(3)培养动物细胞一般使用_____培养基,即培养液
1.营养:营养物质主要包括：糖类、氨基酸、无机盐、维生素、促生长因子、微量元素等。
种类和所需量
血清
液体
由于人们对细胞所需的营养物质尚未全部研究清楚，因此在使用合成培养基时，通常需要加血清等一些天然成分。
注意：这里的糖类不能是淀粉、蔗糖
为什么对动物细胞进行培养时通常要添加血清？
2.无菌、无毒的环境
(1)培养液和培养用具_____处理，_____环境下操作。
(2)定期更换培养液
原因: 。
灭菌
无菌
清除代谢物,防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害
4.气体环境:动物细胞培养所需气体主要是O2和CO2
(1)O2作用:_________________。
(2)CO2的主要作用: 。
3.温度、pH和渗透压:
(1)适宜的温度:哺乳动物动物细胞培养的温度多以__________ ℃为宜。
(2)适宜的pH:多数细胞生存的适宜pH为_________。
(3)适宜的渗透压。
36.5±0.5
7.2～7.4
细胞代谢所必需的
维持培养液的pH
进行动物细胞培养时，通常采用培养皿或松盖培养瓶，置于95%空气和5%CO2的CO2培养箱中进行培养。
制成细胞悬液
接触抑制
机械法、胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理，将组织分散成单个细胞
转入培养液中进行原代培养
放入CO2培养箱中培养
取动物组织
动物胚胎或幼龄动物的组织、器官
（三）动物细胞培养过程
传代培养
机械法、胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理，将组织分散成单个细胞
传代
培养
1、体外培养的细胞有两类：
一类：细胞能够悬浮在培养液中生长增殖；
另一类：是需要贴附于某些基质表面才能生长增殖，大多数细胞属于这种类型，这类细胞往往贴附在培养瓶的瓶壁生长，这种现象叫 细胞贴壁。
培养过程中相关知识
要求：（培养瓶（皿）内表面光滑、无毒、易于贴附）
细胞贴壁—
悬液中分散的细胞贴附在瓶壁生长的现象；
①悬浮培养的细胞会因细胞密度过大、有害代谢物积累和培养液中营养物质缺乏等因素而分裂受阻。
②贴壁细胞在生长增殖时，除受上述因素的影响外，还会发生接触抑制现象
2、培养过程中细胞不能继续增殖的原因（原代培养到什么状态时，需要传代培养？）
细胞的接触抑制
接触抑制—
当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖的现象（长成单层细胞,有接触抑制现象）
因此动物细胞培养过程中会出现细胞贴壁和接触抑制的特点
人们通常将分瓶之前的细胞培养，即动物组织处理后的初次培养。
4、原代培养：
在进行传代培养时，悬浮培养的细胞直接用离心法收集；贴壁细胞需用胰蛋白酶处理分散成单个细胞后，再用离心法收集。之后，将收集的细胞制成细胞悬液，分瓶培养。
分瓶后的培养称为传代培养
5、传代培养：
当原代培养的细胞贴满瓶壁时，重新用胰蛋白酶处理，使细胞从瓶壁脱落，加培养液制成细胞悬液，分装到2个或2个以上的培养瓶中继续培养，叫传代培养
思考讨论
动物细胞培养的过程
取动物组织（动物胚胎或幼龄动物）
用机械的方法，或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶处理
单个细胞
加培养液
细胞悬液
原代培养
在培养皿或培养瓶中
传代培养
悬浮培养的细胞直接用离心法收集；贴壁细胞需用胰蛋白酶处理分散成单个细胞后，再用离心法收集
思考2.培养前为什么分散成单个细胞？
①成块组织中细胞与细胞靠在一起，彼此限制了生长与增殖；②利于与培养液充分接触，保证O2与营养供应和代谢物及时排出。
幼龄动物的细胞更易于培养，原因：幼龄动物的细胞增殖能力强，有丝分裂旺盛
分化程度低的细胞更易于培养，原因：分化程度低的细胞增殖能力强，易于培养
思考1.幼龄动物的细胞与老龄动物的细胞比较，分化程度低的细胞与分化程度高的细胞比较，那个更易于培养？
取动物组织（动物胚胎或幼龄动物）
用机械的方法，或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶处理
单个细胞
加培养液
细胞悬液
原代培养
在培养皿或培养瓶中
传代培养
悬浮培养的细胞直接用离心法收集；贴壁细胞需用胰蛋白酶处理分散成单个细胞后，在离心法收集
思考3.将组织分散成单个细胞时为什么要用胰蛋白酶（或胶原蛋白酶）处理？胃蛋白酶可以吗？
胰蛋白酶可以将动物组织细胞间的蛋白质分解，将组织分散成单个细胞。
不能用胃蛋白酶处理，原因：pH不适宜。胃蛋白酶作用的适宜pH约为2，当pH大于6时，胃蛋白酶就会失去活性。多数动物细胞培养的适宜pH为7.2~ 7.4,胃蛋白酶在此环境中没有活性，所以胃蛋白酶不行
思考4：用胰蛋白酶两次处理的目的分别是什么？
第一次使用的目的是使组织细胞分散开；第二次使用的目的是使细胞从瓶壁上脱离下来，便于分散后继续培养。
纤维蛋白、胶原蛋白等
细胞膜含有蛋白质，长时间处理会损伤细胞，要控制好时间。
思考5.在用胰蛋白酶处理组织时应注意什么？
5.动物细胞培养的过程跟踪练习
1.过程①处理方法有:_____________________。
2.过程②为_____________________________
3.培养的动物细胞有两类:
①悬浮在_______中生长增殖;
②___________________生长增殖。
4.过程③为_____培养,进行过程③的原因主要有:细胞密度过大、 积累、 缺乏和接触抑制等。
5.进行过程③时,悬浮培养的细胞直接用_______收集;贴壁细胞需要使用_____________________等处理,然后用_______收集。
机械法或胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理的方法
转入培养液中进行原代培养
培养液
贴附于某些基质表面
离心法
胰蛋白酶或胶原蛋白酶
离心法
传代
有害代谢物
营养物质
动物胚胎或幼龄动物的组织、器官
细胞悬浮液
胰蛋白酶
原代培养
传代培养
大量细胞
单个细胞
加培养液
离体的植物器官、组织或细胞
愈伤组织
根、芽
植物体
脱分化
再分化
接种至培养基
动物细胞培养
植物组织培养
思考5：动物细胞培养与植物组织培养有什么相同和不同之处？
过程不同
比较项目 植物组织培养 动物细胞培养
原理
培养基性质
培养基特有成分
培养结果
培养目的
获得细胞及代谢产物
细胞的全能性
大量细胞
植物体
快速繁殖、作物脱毒等
葡萄糖、动物血清
蔗糖、植物激素
液体培养基
固体培养基
细胞增殖
相同点①都需要人工条件下的无菌操作，无菌培养；②都需要配制合成培养基；③都需要适宜的温度、pH等条件
（四）干细胞培养及其应用
3.干细胞类型_____________________________________
2.干细胞存在于____________________________________________
早期胚胎、骨髓和脐带血等多种组织和器官中
（1）胚胎干细胞（ ES细胞）
①分布：
②功能：
③成功案例：
胚胎干细胞（ ES细胞）和成体干细胞
早期胚胎
具有分化成为成年动物体内任何一种类型的细胞，并进一步形成机体的所有组织和器官甚至个体的潜能。
ES细胞可以在体外分化成心肌细胞、
神经元和造血干细胞等细胞
1、干细胞是动物和人体内少数具有 的细胞，在一定条件下干细胞可以分化成 的细胞
分裂和分化能力
其他类型
（2）成体干细胞：
①分布：
②包括 骨髓中的造血干细胞、神经系统中的神经干细胞、睾丸中的精原干细胞等
③特点：
成体组织或器官内
具有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织，不具有发育成完整个体的潜能。
造血干细胞是发现最早、研究最多、应用也最为成熟的一类成体干细胞，主要存在于成体的骨髓、外周血和脐带血
是成体组织或器官内的干细胞
诱导多能干细胞 来源：体外诱导体细胞产生
（iPS细胞） 应用：分化形成各种功能细胞，用于治疗疾病
应用优点：
避免发生免疫排斥反应
胚胎干细胞必须从胚胎中获得，这涉及到伦理问题因而限制了它的应用。
于是科学家通过体外诱导小鼠成纤维细胞，获得了类似胚胎干细胞的诱导多能干细胞
体外诱导小鼠成纤维细胞
诱导多能干细胞
iPS细胞
临床治疗人类疾病 如：白血病、帕金森病、阿而茨海默病等
多种体细胞
定向诱导分化
诱导多能干细胞（iPS细胞）的应用
3.干细胞的应用
（1）在医学上有着广泛应用。原因是
干细胞有着自我更新能力及分化潜能，与组织、器官的发育、再生和修复等密切相关。
（2）实例
类型 应用 优点
造血干细胞
神经干细胞 诱导多能干细胞 （iPS细胞） 治疗白血病及一些恶性肿瘤放疗或化疗后引起的造血系统、免疫系统功能障碍等疾病
治疗神经组织损伤和神经系统退行性疾病（如帕金森病、阿尔茨海默病等）
可治疗小鼠的镰状细胞贫血症，在治疗阿尔兹海默病、心血管疾病等领域的研究也取得了新进展
来源于病人自身的体细胞，将它移植回病人体内后，理论上可以避免免疫排斥反应
人的核移植胚胎干细胞经诱导分化，形成相应的组织、器官后，可用于组织器官的移植。（见右图）
干细胞将在再生医学、药物安全性与有效性检测等领域发挥大作用。
思考2：干细胞用于临床治疗面临的问题有什么？
如存在导致肿瘤发生的风险
人的核移植胚胎干细胞的应用
判一判:基于干细胞的类型和应用,判断下列说法的正误。
(1)胚胎干细胞和成体干细胞都具有形成机体的所有组织和器官,甚至个体的
潜能( )
(2)造血干细胞是发现最早、研究最多、应用最为成熟的一种成体干细胞( )
(3)iPS细胞称为诱导多能干细胞,与胚胎干细胞类似,也需从胚胎中获取( )
(4)不同类型的干细胞分化能力不同,胚胎干细胞的分化能力最强( )
(5)干细胞将在再生医学、药物安全性、有效性检测、疾病治疗等领域发挥重
要作用( )
提示:成体干细胞具有组织特异性,只能分化成特定的细胞或组织,不具有发育成完整个体的能力。
提示:iPS细胞来源于自身的体细胞诱导,无须从胚胎中获取。
√
×
√
√
×
一、概念检测
1.判断下列有关动物细胞培养的表述是否正确。
(1)培养环境中需要O2, 不需要CO2。（ ）
(2)细胞要经过脱分化形成愈伤组织。（ ）
(3)培养液中通常含有糖类、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清。（ ）
(4)培养瓶中的细胞需定期用胰蛋白酶处理，分瓶后才能继续增殖。（ ）
练习与应用
√
×
×
×
2.干细胞有着广泛的应用前景。下列相关叙述错误的是（ ）
A.干细胞是从胚胎中分离提取的细胞
B.造血干细胞可以分化为各种血细胞
C.不同类型的干细胞，它们的分化潜能是有差别的
D.由iPS细胞产生的特定细胞，可以在新药的测试中发挥重要作用
A
二、拓展应用
现在关于iPS细胞的研究正在不断深人。请你从以下两个方面来查阅资料进行思考。
(2)如果诱导iPS细胞定向分化为生殖细胞的技术发展成熟，该技术可能会有哪些应用 又可能带来哪些问题
(1)由于诱导产生iPS细胞、促使其分化都需要时间，因此用某人特异的iPS细胞进行医疗只限于时间比较充裕的情形。从实际事故、疾病发生的不可预测性方面考虑，如果要将这些细胞用于紧急情况，应该提前采取什么措施
提示：像建立骨髓库一样， 有研究团队正在尝试建立HLA( human leucocyte antigen,人类白细胞抗原)多态性丰富的iPS细胞库，可以为需要的人找到HLA匹配度较高的iPS细胞，这样不仅可以节省时间、成本，还能减轻异体干细胞移植后发生的免疫排斥反应。
提示：该技术可能被用于治疗不孕症;获得足够量的生殖细胞来进行濒危物种的克隆研究;获得生殖细胞进行转基因操作，再经过受精、胚胎发育等过程来获得转基因动物。
该技术可能带来一系列的伦理问题。例如，如果用同一个人的iPS细胞分别诱导形成精子和卵子，两者受精可能培育出“单亲”婴儿；有的人还可嫩有目的地选择iPS细胞，从而“设计”婴儿
动物细胞培养
课堂小结
动物细胞培养的概念和原理
干细胞培养及其应用
营养条件；无菌、无毒的环境；温度、pH和渗透压；气体环境
原理：细胞增殖
在适当的培养条件下，让这些细胞生长和增殖的技术
干细胞的分布
干细胞的类型
干细胞的应用
胚胎干细胞（ ES细胞）
成体干细胞
动物细胞培养的条件
动物细胞培养的过程
取动物组织
单个细胞
细胞悬液
原代培养
传代培养
早期胚胎、骨髓和脐带血等多种组织和器官中
主要应用在医学上
为什么对动物细胞进行培养时通常要添加血清？
1、血清中含有蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素等，
2、氨基酸有多种，是细胞合成蛋白质的基本成分，其中有些氨基酸动物
细胞本身不能合成（称为必需氨基酸），必须由培养液提供。
3、血清激素有胰岛素、生长激素等及多种生长因子；血清还含有多种未
知的促细胞生长因子、 促贴附因子及其他活性物质，能促进细胞的
生长、增殖和贴附。
4、因此，细胞培养时，要保证细胞能够顺利生长和增殖，一般需添加
10%～20%的血清。
血清中含有多种未知的促细胞生长因子等营养物质，这是细胞生长和增殖所必需的。
补充资料
（四）干细胞培养及其应用
3、干细胞类型：
1、胚胎干细胞：
存在于早期胚胎中，具有分化成为成年动物体内任何一种类型的细胞，并进一步形成机体的所有组织和器官甚至个体的潜能。
2、干细胞分布：
早期胚胎、骨髓和脐带血等多种组织和器官中
胚胎干细胞
（ ES细胞）
成体干细胞
全能干细胞
多能干细胞
专能干细胞
干细胞培养培养

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