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第二章 第2节 动物细胞工程
第1课时：动物细胞培养
小面积烧伤：患者通过切除 + 植皮(自身)后恢复。
大面积烧伤？
皮肤的自体移植
使用他人皮肤如何？
患者自身的不够用，如何解决？
培养自身细胞？
目前，科学家还在研究对皮肤干细胞进行培养，以获得适合临床上使用的人造皮肤。
通过细胞培养构建的人造皮肤
从社会中来
一、动物细胞培养的条件
动物细胞培养
1.概念
2.原理
从动物体中取出 ，将它分散成 ，然后在适宜的培养条件下，让这些细胞 的技术。
相关的组织
单个细胞
生长和增殖
动物体
组织
单个细胞
细胞生长和增殖
取出
分散成
适宜条件
有丝分裂（细胞增殖）
培育的终点：细胞
将组织块分散成单个细胞后，细胞所需的营养易供应，其代谢废物易排出
3.目的
获得细胞或者细胞产物，不能获得完整动物个体
4.培养对象选择
幼龄动物or老龄动物？Why
一、动物细胞培养的条件
动物细胞培养
幼龄个体细胞分化程度低、分裂能力强、容易培养
4.培养对象选择
胚胎或幼龄动物的细胞
思考：体外培育皮肤细胞实际上是在体外模拟体内的生理条件进行的培养。你还记得为了维持正常的生命活动，机体给细胞提供了哪些适宜的条件吗？
充足的营养
稳定的内环境
一、动物细胞培养的条件
动物细胞培养
5.培养条件
营养条件
其他条件
<
<
糖类
氨基酸
无机盐
维生素
无菌、无毒的环境
适宜温度、pH和渗透压
适宜的气体环境
动物细胞培养基本条件
不能以淀粉、蔗糖为碳源
一、动物细胞培养的条件
动物细胞培养
营养
直接用合成然培养基吗？ Why？
合成培养基 + 血清等天然成分
含人类未知、细胞生长增殖所必需的物质，满足细胞对未知营养成分的需求。
血清等天然成分
将细胞所需的营养物质按种类和所需量严格配制而成的培养基。
合成培养基
一般使用液体培养基也称培养液。
培养瓶
培养皿
一、动物细胞培养的条件
动物细胞培养
无菌、无毒的环境
无毒
无菌
防止微生物污染
清除代谢物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害。
目的：
定期更换培养液
①对培养液和所有培养用具进行灭菌处理
②在无菌环境下进行操作
③添加一定量的 抗生素
如何维持无菌、无毒的环境？
一、动物细胞培养的条件
动物细胞培养
温度、pH、渗透压
与相应动物内环境的理化性质保持一致。
①人体细胞外液的温度一般维持在：
36.5±0.5℃
②正常人的血浆近中性，pH约为：
7.35~7.45
③渗透压：
在37℃时，人的血浆渗透压约为：
770 kPa
人体？
（1）哺乳动物细胞培养的温度多以 为宜
36.5±0.5℃
（2）多数动物细胞生存的适宜pH为 ；
7.2-7.4
目的
维持细胞正常的形态和功能
指溶液中溶质微粒对水的吸引力。
（3）适宜的渗透压：
一、动物细胞培养的条件
动物细胞培养
气体环境
动物细胞培养所需气体主要有_____和______
用培养皿或松盖培养瓶,
在含有___________和____ __的混合气体的________
O2
CO2
细胞代谢所必需的
维持培养液的pH
95%空气
5%CO2
CO2培养箱
①组成
不同气体的作用是什么？
②培养仪器
（95%）O2:
（5%）CO2：
液体培养基
松盖培养瓶
2、用动植物成体的体细胞进行离体培养，下列叙述正确的是(　　)
A.都需要用含95%空气和5%CO2的混合气体的培养箱
B.都需要用液体培养基
C.都要在无菌条件下进行
D.都可体现细胞的全能性
C
1、下列关于动物细胞培养条件的叙述，错误的是(　　)
A.体外培养动物细胞时，培养环境必须保证无菌、无毒
B.在使用合成培养基时，通常还需要加入血清等天然成分
C.细胞培养液需要定时更换，以便清除其中的代谢废物
D.可使用培养皿或松盖培养瓶在25 ℃和纯氧条件下培养
趁热打铁
D
二、动物细胞培养的过程
思考：在适宜的体外培养皮肤细胞培养条件下，怎么培养健皮肤细胞？能直接培养皮肤组织吗？
不能，组织中的细胞与细胞紧密接触在一起，会限制细胞生长和增殖。
怎样解决这一问题？
放入CO2培养箱中培养
二、动物细胞培养的过程
传代培养
放入CO2培养箱中培养
取动物组织
制成细胞悬液
转入培养液进行原代培养
分瓶
取动物组织
分散成单个细胞
制成细胞悬液
原代培养
传代培养
二、动物细胞培养的过程
分瓶
取动物组织
分散成单个细胞
制成细胞悬液
原代培养
传代培养
1.取动物组织
取材对象:
取材原因:
动物胚胎或幼龄动物的组织、器官。
细胞分化程度低，增殖能力强易培养
2.分散成单个细胞
原因：
①从动物体取出的成块组织中，细胞与细胞靠在一起，彼此限制了生长和增殖。
②利于细胞与培养液充分接触，保证O2与营养供应和有害代谢物的及时排出，更易进行物质交换。
制成细胞悬液
取动物组织
二、动物细胞培养的过程
分瓶
取动物组织
分散成单个细胞
制成细胞悬液
原代培养
传代培养
2.分散成单个细胞
蛋白质
不可以，因为胃蛋白酶的最适PH为1.5左右
细胞膜也含蛋白质，长时间会分解细胞膜蛋白，破坏细胞结构，把细胞消化掉。注意控制时间和酶用量。
①说明动物细胞间的物质主要是什么成分？
②用胃蛋白酶可以吗？
③胰蛋白酶真的不会把细胞消化掉吗，为什么？
机械的方法或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理一段时间
方法:
纤维蛋白、胶原蛋白等
二、动物细胞培养的过程
分瓶
取动物组织
分散成单个细胞
制成细胞悬液
原代培养
传代培养
3.制备细胞悬液
用培养液将细胞制成细胞悬液。
制成细胞悬液
取动物组织
放入CO2培养箱中培养
转入培养瓶或培养皿进行原代培养
将细胞悬液放入培养皿或培养瓶内，置于适宜环境中进行原代培养。
概念:
二、动物细胞培养的过程
分瓶
取动物组织
分散成单个细胞
制成细胞悬液
原代培养
传代培养
4.原代培养
制成细胞悬液
取动物组织
放入CO2培养箱中培养
转入培养瓶或培养皿进行原代培养
悬浮生长类：
贴壁生长类：
培养细胞类型
能够悬浮在培养液中生长增殖。
需要贴附于某些基质表面才能生长增殖。
往往贴附在培养瓶的瓶壁上。
——细胞贴壁
指动物组织经处理后的初次培养。
悬浮生长
细胞贴壁
二、动物细胞培养的过程
分瓶
取动物组织
分散成单个细胞
制成细胞悬液
原代培养
传代培养
4.原代培养
悬浮生长类：
贴壁生长类：
培养细胞类型
能够悬浮在培养液中生长增殖（血细胞、淋巴细胞）
需要贴附于某些基质表面才能生长增殖（多数细胞上皮、纤维、神经细胞等）
指动物组织经处理后的初次培养。
要求：培养瓶或培养皿的内表面光滑、无毒、易于贴附。
细胞贴壁过程
（大多数细胞属于这种类型）
二、动物细胞培养的过程
分瓶
取动物组织
分散成单个细胞
制成细胞悬液
原代培养
传代培养
4.原代培养
指动物组织经处理后的初次培养。
当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞通常会停止分裂增殖
悬浮生长类：
贴壁生长类：
培养细胞类型
会因细胞密度过大、有害代谢物积累和培养液中营养物质缺乏等因素而分裂受阻。
除受以上因素影响外，还会发生接触抑制现象
思考：细胞培养一段时间，分裂会受阻，为什么？怎样解决？
贴壁生长与接触抑制
二、动物细胞培养的过程
分瓶
取动物组织
分散成单个细胞
制成细胞悬液
原代培养
传代培养
4.原代培养
指动物组织经处理后的初次培养。
圆球形细胞刚开始铺展贴壁生长（100×）
培养的动物细胞贴壁生长并进行有丝分裂（100×）
细胞单层贴壁生长铺满瓶壁后接触抑制（100×）
二、动物细胞培养的过程
分瓶
取动物组织
分散成单个细胞
制成细胞悬液
原代培养
传代培养
4.原代培养
指动物组织经处理后的初次培养。
正常细胞增殖到相互接触的时，糖蛋白识别了这种信息，会使细胞停止继续增殖，出现接触抑制现象。某些异常细胞能解除这种现象
肿瘤细胞
正常细胞
瓶壁上的细胞层数是
一层（或单层）
失去接触抑制，可以形成多层细胞
癌细胞的细胞膜上糖蛋白等物质减少
适宜条件下在培养液可以无限增殖下去
二、动物细胞培养的过程
4.原代培养
体外动物细胞培养如何解决细胞分裂受阻的问题呢？
分瓶
取动物组织
分散成单个细胞
制成细胞悬液
原代培养
传代培养
指动物组织经处理后的初次培养。
制成细胞悬液
取动物组织
放入CO2培养箱中培养
转入培养液进行原代培养
放入CO2培养箱中培养
传代培养
需要对细胞进行分瓶培养，让细胞继续增殖。
——传代培养
二、动物细胞培养的过程
5.传代培养
体外动物细胞培养如何解决细胞分裂受阻的问题呢？
需要对细胞进行分瓶培养，让细胞继续增殖。
——传代培养
即分瓶后的细胞培养。（细胞由原代培养瓶中分离稀释后，转到新的培养瓶中继续培养的过程）
概念:
收集细胞
将收集的细胞制成细胞悬液，分瓶培养
过程:
分瓶
取动物组织
分散成单个细胞
制成细胞悬液
原代培养
传代培养
二、动物细胞培养的过程
5.传代培养
分瓶
取动物组织
分散成单个细胞
制成细胞悬液
原代培养
传代培养
收集细胞
悬浮生长类：
直接用离心法收集
贴壁生长类：
将收集的细胞制成细胞悬液，分瓶培养
过程:
重新用胰蛋白酶等处理，使之分散成单个细胞，然后再用离心法收集
判断依据：是否分瓶！
动物细胞的整个培养过程中可能多次用到胰蛋白酶或胶原蛋白酶：
第一次:
贴壁细胞传代培养时：
使组织细胞分散开
使细胞从瓶壁上脱离下来，分散成单个细胞，便于分瓶后继续培养。
二、动物细胞培养的过程
动物组织块
分散成单个细胞
解决
悬浮生长
贴壁生长
(大多数）
细胞密度过大、有害代谢物积累、营养物质缺乏等
接触抑制
传代培养
用机械法或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理
制成细胞悬液
原代培养
分瓶
培养
①原代培养：指动物组织经处理后的初次培养。
②细胞贴壁：某些细胞需要贴附于某些基质表面才能增殖，这类细胞往往贴附在培养瓶的瓶壁上。
③接触抑制：当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞停止分裂增殖的现象。
④传代培养：分瓶后的细胞培养。
加培养液
在培养皿或培养瓶内
细胞分裂受阻
②制成细胞悬液，分瓶培养
①收集细胞
注意：相关酶可使细胞裂解，应注意用量和时间
二、动物细胞培养的过程
比较项目 植物组织培养 动物细胞培养
原理
培养基性质
培养基特有成分
培养结果
是否体现全能性
相同点 植物组织培养和动物细胞培养的比较
否
常用固体培养基
完整的植株
葡萄糖、动物血清
常用液体培养基
细胞增殖
细胞的全能性
许多细胞
是
蔗糖、植物激素
1.培养过程中细胞都进行有丝分裂，不涉及减数分裂
2.均需无菌操作，需要适宜的温度、pH等条件
二、干细胞培养及应用
干细胞
1.概念
2.分布
3.分类
动物和人体内仍保留的少数具有分裂和分化能力的细胞。
在一定条件下，干细胞可以分化成其他类型的细胞。
干细胞存在于 、 和 等多种组织和器官中。
早期胚胎
骨髓
脐带血
胚胎干细胞
成体干细胞
受精卵
原始胚胎干细胞
囊胚
胎儿
成人
胚胎干细胞
成体干细胞
二、干细胞培养及应用
1.胚胎干细胞(简称ES细胞)
1.分布
2.特点
3.应用实例
4.局限性
早期胚胎中
目前科学家已分离出了小鼠、兔、牛、猴和人等的ES细胞，在体外培养可分化分化成心肌细胞、神经元细胞和造血干细胞等
必须从胚胎中获取，涉及伦理问题；因而限制了在医学上的应用。
(1)形态上：
(2)功能上：
具有分化为成年动物体内的 类型的细胞，并进一步形成机体的所有组织和器官甚至 的潜能。
任何一种
个体
体积小、细胞核大、核仁明显。
具有发育的全能性。
二、干细胞培养及应用
2.成体干细胞
1.分布
2.常见类型
3.特点
5.应用实例
成体组织或器官内
造血干细胞（骨髓、外周血和脐带血中）
神经干细胞（神经系统中）
精原干细胞（睾丸中）
具有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织，不具有发育成完整个体的能力
治疗神经组织损伤和神经系统退行性疾病（如帕金森病、阿尔茨海默病等）
治疗白血病及一些恶性肿瘤放疗或化疗后引起的造血系统、免疫系统功能障碍等疾病
造血干细胞
神经干细胞
发现最早、研究最多、应用最成熟
4.作用
有着自我更新能力 及分化潜能的干细胞，与组织、器官的 、 和
等密切相关。
发育
再生
修复
二、干细胞培养及应用
3.诱导多能干细胞(iPS细胞)
1.概念
2.制备方法
3.优点
4.应用
通过体外诱导小鼠成纤维细胞得到的类似胚胎干细胞的一种细胞
②用小分子化合物诱导形成。
①诱导过程无须破坏胚胎；
②iPS细胞可取自病人的体细胞，理论上可以避免免疫排斥反应。
可治疗镰状细胞贫血症；
在治疗阿尔兹海默病、心血管疾病等领域的研究也取得新进展。
所以，科学家普遍认为iPS细胞的应用前景优于胚胎干细胞。
①将特定基因或蛋白导入细胞（成纤维细胞、已分化的T细胞、B细胞）。
二、干细胞培养及应用
iPS细胞应用
移植
取成纤维细胞等
iPS细胞
转入相关因子
细胞发生转化
分化
胰岛细胞
神经元
血细胞
肠上皮细胞
心肌细胞
肝细胞
病人
iPS细胞用于治疗人类疾病示意图
取成纤维细胞
转入相关因子
转化为iPS细胞
诱导iPS细胞定向分化为多种组织细胞
移植回病人体内
二、干细胞培养及应用
干细胞将在再生医学、药物安全性与有效性检测等领域发挥大作用。
面临的问题：存在导致肿瘤发生的风险。
应用展望：
面临的问题及展望
二、干细胞培养及应用
来源或存在 功能、特点 局限性
胚胎干细胞(ES细胞)
成体干细胞
诱导多能干细胞(iPS细胞)
早期胚胎
能够分化成为动物体内的任何细胞，并进一步形成组织、器官甚至生物个体
成体组织或器官，如造血干细胞、神经干细胞和精原干细胞等
体外诱导体细胞产生
能分化成为具有特定功能的细胞来治疗疾病。无须破坏胚胎，且避免免疫排斥反应。
具有组织特异性，能分化成特定的细胞或组织
不具有发育成完整个体的能力
需从胚胎中获取，涉及伦理问题，限制了它在医学上的应用
技术不成熟。
三种干细胞的比较
总结
动物细胞培养
动物细胞培养的概念和原理
动物细胞培养的条件
动物细胞培养的过程
原理：细胞的增殖
在适当的培养条件下，让这些细胞生长和增殖的技术
(1)营养条件
(2)无菌、无毒的环境
(3)温度、pH和渗透压
(4)气体环境
取动物组织
单个细胞
细胞悬液
原代培养
传代培养
干细胞培养及其应用
干细胞的分布
干细胞的类型
干细胞的应用
胚胎干细胞（ ES细胞）
成体干细胞
早期胚胎、骨髓和脐带血等多种组织和器官中
主要应用在医学上
1.判断下列有关动物细胞培养的表述是否正确。
(1)培养环境中需要O ，不需要CO 。 ( )
(2)细胞要经过脱分化形成愈伤组织。 ( )
(3)培养液中通常含有糖类、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清。 ( )
(4)培养瓶中的细胞需定期用胰蛋白酶处理，分瓶后才能继续增殖。 ( )
×
√
×
×
教材课后习题·概念检测
2.干细胞有着广泛的应用前景。下列相关叙述错误的是 ( )
A.干细胞是从胚胎中分离提取的细胞
B、造血干细胞可以分化为各种血细胞
C.不同类型的干细胞，它们的分化潜能是有差别的
D.由iPS细胞产生的特定细胞，可以在新药的测试中发挥重要作用
A
教材课后习题·概念检测
现在关于iPS细胞的研究正在不断深人。请你从以下两个方面来查阅资料进行思考。
(1)由于诱导产生iPS细胞、促使其分化都需要时间，因此用某人特异的iPS细胞进行医疗只限于时间比较充裕的情形。从实际事故、疾病发生的不可预测性方面考虑，如果要将这些细胞用于紧急情况，应该提前采取什么措施
建立iPS细胞库（HLA多态性丰富的iPS细胞库），
可以为需要的人找到HLA匹配度较高的iPS细胞
教材课后习题·拓展应用
(2)如果诱导iPS细胞定向分化为生殖细胞的技术发展成熟，该技术可能会有哪些应用 又可能带来哪些问题
可以用来治疗不孕症；可以用来进行濒危物种的克隆；
可以对获得的生殖细胞进行转基因操作，再经过受精、胚胎发育等过程来获得转基因动物；
可能会带来一系列的伦理问题，例如用同一个人的iPS细胞分别诱导形成精子和卵子，两者受精可能培育出“单亲”婴儿，有的人还可能有目的地选择iPS细胞，从而”设计”婴儿
教材课后习题·拓展应用

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