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(共34张PPT)
2.2.2
动物细胞融合技术与单克隆抗体
本节聚焦:
什么是动物细胞融合技术？
单克隆抗体是如何制备的？
单克隆抗体在临床上有哪些应用？
第2节 动物细胞工程
植物体细胞杂交技术
植物细胞融合
植物组织培养
温故而知新
植物体细胞杂交技术打破不同种植物之间生殖隔离的屏障，实现远缘杂交育种，培育出新的作物类型。有没有技术让不同种动物的体细胞杂交，培育出集不同细胞优势于一身的动物细胞呢？
融合细胞
细胞
融合
37℃
40min
正在融合的细胞
红色荧光染料标记膜蛋白
绿色荧光染料标记膜蛋白
人细胞
小鼠细胞
回顾必修一：细胞膜的结构
1970年 人-鼠细胞融合融合实验
（1）动物细胞融合技术：指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术
诱导原生质体融合
物理方法：电融合法、离心法
化学方法：聚乙二醇融合法、
高Ca2+-高pH融合法
（2）原理：细胞膜具有流动性
诱导动物细胞融合
物理方法：电融合法
化学方法：聚乙二醇（PEG）融合法
生物方法：灭活的病毒诱导法
动物细胞工程
2.动物细胞融合
病毒的灭活
是指用物理或化学手段使病毒失去感染能力，但是并不破坏病毒的抗原结构。
仙台病毒
紫外线
灭活
丧失感染活性（不感染细胞）
保留融合活性（诱导细胞融合）
灭活病毒诱导细胞融合的原理
病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝聚，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。
动物细胞工程
2.动物细胞融合
1965年，研究证实了灭活的病毒在适当条件下确实可以诱导动物细胞融合。
（3）过程
动物细胞工程
2.动物细胞融合
杂种细胞经第一次有丝分裂两个核才融合
细胞融合完成的标志:
细胞核融合成一个核
(4) 结果：
形成单核细胞，具有原来两个或多个细胞的遗传信息，可表现出两个或多个亲本的特点。
思考：诱导融合后的细胞一定具有双方的遗传信息吗？为什么？
不一定，诱导A、B两种细胞融合，融合后可能有A、B未融合细胞及AA、AB、BB等多种细胞，因此细胞融合后需要进行筛选。
动物细胞工程
2.动物细胞融合
①突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交成为可能。
②成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育等的重要手段。
③利用细胞融合技术而发展起来的杂交瘤技术，为制造单克隆抗体开辟了新途径。
(5)意义：
植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较
比较项目 植物体细胞杂交 动物细胞融合
原理
融合前处理
诱导融合的方法
意义和用途
克服远源杂交的障碍，
获得杂种植株
细胞膜的流动性
细胞膜的流动性
植物细胞的全能性
去除细胞壁后诱导原生质体融合
使细胞分散后诱导细胞融合
物理：电融合法、离心法
化学：聚乙二醇融合法、
高Ca2+-高pH融合法
物理：电融合法
化学：PEG融合法
生物方法：灭活的病毒诱导法
制备单克隆抗体
动物细胞工程
2.动物细胞融合
【典例1】如图为细胞融合的示意图，下列叙述正确的是( )
A.若a细胞和b细胞是植物细胞，需先去壁再诱导融合
B.若a细胞和b细胞为植物原生质体，则可用灭活的病毒诱导融合
C.c细胞的形成与a、b细胞膜的选择透过性有关
D.c细胞将同时表达a细胞和b细胞中的所有基因
A
动物细胞工程
2.动物细胞融合
一个捐献者200~300ml的血浆，如果合格，只能治疗2~3个患者，如何大量制备？
动物细胞工程
3.单克隆抗体及其应用
前段时间，全国在抗击COVID-19疫情的时候，我们从新闻里看到很多康复者在捐献血浆，用来治疗其他病人。那么，血浆里到底是什么东西能够治疗新型冠状病毒感染？
能够引起机体产生特异性免疫应答的物质叫做抗原。
例如花粉、病菌、病毒等。
有时自身的组织或细胞也会成为抗原，如癌细胞等。
★什么是抗原？
★什么是抗体？由何种细胞产生？主要分布在哪里 起何作用？
当机体受到抗原刺激后由浆细胞产生的，并且能与该抗原发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白——抗体。
抗体主要分布于血浆中，也分布于组织液及外分泌液中。
动物细胞工程
3.单克隆抗体及其应用
从血清中分离抗体
B细胞
浆细胞
抗原
传统抗血清
(多克隆抗体)
(一种抗原可存在多种抗原决定簇)
增殖分化
（多种）
反复注射刺激
（多克隆抗体）
动物细胞工程
3.单克隆抗体及其应用
（1）早期获得抗体的方法
血清抗体（也称多克隆抗体）
由血清中提取的抗体是由不同浆细胞产生的多种抗体的混合物，可达百万种以上。
特点：产量低、纯度低、特异性差、
反应不够灵敏。
（2）一个大胆的设想
将能够产生特定抗体的B淋巴细胞和具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞融合在一起，形成杂交瘤细胞。那这样就能够提高抗体的产量、同时提高纯度和灵敏性。
杰尼 丹麦
科勒 德国
米尔斯坦 英国
创立抗原选择抗体学说，发明了单克隆抗体技术，因此获得了1984年的诺贝尔生理或医学奖。
动物细胞工程
3.单克隆抗体及其应用
①获得单一的纯抗体？
每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体
②大量？
让B细胞大量繁殖（克隆）就可以产生大量抗体了。
③B细胞不能无限增殖？
癌细胞
动物细胞工程
3.单克隆抗体及其应用
（2）一个大胆的设想
一种B淋巴细胞（只产生一种特定抗体）
能在体外大量增殖的骨髓瘤细胞
动物细
胞融合
杂交瘤细胞
动物细胞培养
大量的特定抗体
阅读P48-49图2-16，思考以下问题：
① 为什么给小鼠注射特定的抗原？
② 会有几种细胞融合方式（只考虑两个细胞融合）？
③ 杂交瘤细胞是如何筛选出来的？
④ 是否所有的杂交瘤细胞都能产生专一性抗体？
⑤ 有几次筛选过程？目的是什么？
⑥如何大规模进行培养得到大量的单克隆抗体？
动物细胞工程
3.单克隆抗体及其应用
（3）单克隆抗体的制备过程
动物细胞工程
3.单克隆抗体及其应用
注射特定的抗原
培养骨髓瘤细胞
多种B淋巴细胞
骨髓瘤细胞
用特定的抗原对小鼠进行免疫，并从该小鼠的脾中得到能产生特定抗体的B淋巴细胞。
多种杂交细胞
诱导融合
用特定的选择培养基进行筛选
① 为什么给小鼠注射特定的抗原？
② 会有几种细胞融合方式（只考虑两个细胞融合）？
资料：细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基喋呤阻断。人淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但一般不分裂增殖。鼠骨髓瘤细胞中只有D途径，没有S途径。
B淋巴细胞
骨髓瘤细胞（A）
合成DNA
D途径
S途径
D途径
氨基喋呤
A、AA、B、BB、AB1、AB2、AB3
骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合
多种杂交细胞
筛选杂交瘤细胞
（3）单克隆抗体的制备过程
动物细胞工程
3.单克隆抗体及其应用
HAT培养基
既能产生抗体，又能大量增殖
③ 杂交瘤细胞是如何筛选出来的？
氨基喋呤
动物细胞工程
3.单克隆抗体及其应用
对上述经选择培养的杂交瘤细胞进行克隆化培养和抗体检测，经多次筛选，就可获得足够数量的能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。
（3）单克隆抗体的制备过程
【原理】将杂交瘤细胞培养液稀释后滴入多孔板，如果稀释度足够高，多孔板的一个孔里就可能只有1个杂交瘤细胞，培养之后(即克隆化培养)，用标记的抗原检测每个小孔上清液里是否含有我们需要的特异性的抗体（抗原抗体能结合即为阳性孔）。这样经过多次克隆化培养以及有限稀释法的筛选，就能选出需要的那种杂交瘤细胞。
多孔细胞培养板
抗体检测板
阳性孔
④ 是否所有的杂交瘤细胞都能产生专一性抗体？
注射到小鼠腹腔内
体外培养
⑤ 有几次筛选过程？目的是什么？
⑥如何大规模进行培养得到大量的单克隆抗体？
两次
一筛：筛选出既能迅速大量增殖，又能产生抗体的杂交瘤细胞
二筛：筛选出能分泌所需抗体的杂交瘤细胞
将抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞在体外条件下大规模培养，或注射到小鼠腹腔内增殖。
从细胞培养液或小鼠腹水中获取大量的单克隆抗体。
动物细胞工程
3.单克隆抗体及其应用
单克隆抗体
二筛
杂交细胞
杂交瘤细胞
体外
细胞培养
小鼠腹腔内增殖
一筛
骨髓瘤细胞
诱导细胞融合
能分泌所需抗体的杂交瘤细胞
培养液中提取
经过免疫的B淋巴细胞
动物细胞融合技术
动物细胞培养技术
特点：既能产生专一抗体又能大量繁殖
特点：特异性强灵敏度高可大量制备
注射抗原
免疫
结合课文P53-54页“单克隆抗体制备”部分和图2-24，构建单克隆抗体制备过程模型图：
动物细胞工程
3.单克隆抗体及其应用
单克隆抗体
腹水中提取
HAT培养基
克隆化培养
抗体检测
动物细胞工程
3.单克隆抗体及其应用
（4）单克隆抗体的应用
①作为诊断试剂——最广泛应用
资料1.用抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体做成的"早早孕诊断试剂盒"，在妊娠第8天就可以作出诊断，这比原来的诊断方法提前了10 d左右，可以避免孕妇在不知道妊娠的情况下因服用药物而对胎儿造成不利影响。该方法检测的准确率在90%以上。
单克隆抗体能准确地识别抗原的细微差异，与特定抗原发生特异性结合，并且可以大量制备。用于多种疾病的诊断和病原体鉴定。
甲胎蛋白（AFP）是一种特异性较强的肿瘤标志物，用甲胎蛋白作为______免疫小鼠，制备__________________，并与含有放射性同位素的标记物连接，单克隆抗体携带放射性标记物通过血液可到达全身几乎所有组织。由于肿瘤细胞表面的______会和单克隆抗体特异性的结合，所以放射性同位素标记物就不断积累在______上。通过一定的显影技术就可以发现肿瘤所在。
抗原
抗AFP单克隆抗体
AFP
肿瘤
动物细胞工程
3.单克隆抗体及其应用
（4）单克隆抗体的应用
资料2.使用高效的细胞毒素类药物进行化疗可以有效杀伤肿瘤细胞。但细胞毒素没有特异性，在杀伤肿瘤细胞的同时还会对健康细胞造成伤害，这限制了它在临床上的应用。抗体—药物偶联物（ADC）通过将细胞毒素与能特异性识别肿瘤抗原的单克隆抗体结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤。ADC通常由抗体、接头和药物（如细胞毒素）三部分组成，它的作用机制如下图所示。
②用于治疗疾病和运载药物
动物细胞工程
3.单克隆抗体及其应用
（4）单克隆抗体的应用
1.ADC和抗体和药物各具有有什么作用？
2.除了细胞毒素，还有那些无知理论可以作为ADC偶联的药物？
抗体主要发挥靶向运输作用，即通过特异性结合靶细胞表面的抗原，将连接的药物输送到靶细胞；药物发挥治疗效应，如杀伤靶细胞。
可以用放射性同位素标记单克隆抗体进行靶向放疗。
一些作用于细胞信号转导通路的药物 可以通过阻断肿瘤细胞的信号通路来抑制其生长，理论上也可以将这些药物与单克隆抗体结合进行治疗。
动物细胞工程
3.单克隆抗体及其应用
（4）单克隆抗体的应用
P50 思考与讨论
单克隆抗体诊断试剂盒中的单克隆抗体只与特定的抗原反应，因此检测的特异性强和灵敏度高。
ADC能够协同发挥抗体特异性识別的靶向作用和细胞毒素对肿瘤细胞的杀伤作用，因此它在临床上具有靶点清楚、毒副作用小等优点。
3.单克隆抗体诊断试剂盒和ADC在临床应用上各具有什么优势？
动物细胞工程
3.单克隆抗体及其应用
（4）单克隆抗体的应用
P50 思考与讨论
A.特异性强、灵敏度高
生物导弹
——单克隆抗体＋抗癌药物
B.疗效高、毒副作用小
动物细胞工程
3.单克隆抗体及其应用
（4）单克隆抗体的应用
②用于治疗疾病和运载药物
本堂小结
一.动物细胞工程
1.下列有关动物细胞融合与植物体细胞杂交比较的叙述，错误的是( )
A.它们的原理都涉及细胞膜的流动性
B.都可以用电融合法或PEG融合法诱导融合
C.融合前都需用纤维素酶或果胶酶处理细胞
D.前者主要是为了获得细胞产品，后者主要是为了获得杂种植株
c
一.概念检测
练习与应用
2.科学家以SARS病毒的核衣壳蛋白为抗原，制备出了单克隆抗体。下列相关叙述正确的是( )
A.利用该单克隆抗体可以诊断是否感染SARS病毒
B.体外培养单个B淋巴细胞可以获得针对SARS病毒的单克隆抗体
C.将等量B淋巴细胞和骨髓瘤细胞混合，经诱导后融合的细胞即为杂交瘤细胞
D.将纯化的核衣壳蛋白反复注射到小鼠体内，从小鼠血清中分离出的抗体为单克隆抗体
A
假如你掌握了动物细胞融合技术，你想用这种技术来解决哪些问题？解决这些问题的大致思路是怎样的？这样做会有什么风险？请查阅相关资料，完善自己的思路，并形成文字报告，与同学交流。
可以利用动物细胞融合技术培育多倍体胚胎，研究其发育机制，甚至可能培育出新的物种。但是，目前相关技术还不成熟，存在融合率低、胚胎死亡率高等问题，并且还可能带来一些伦理方面的问题。
二、拓展应用
练习与应用
概述
应用
动物细胞融合
技术
过程
结果
意义
原理
融合方法
原理
应用
单克隆抗体的制备
免疫处理
第一次筛选
诱导融合
第二次筛选
大规模培养
诊断试剂
运载药物
治疗疾病
克隆化培养
抗体检测
体外培养
小鼠腹腔
课堂小结
①未融合的细胞②多种杂交细胞
杂交瘤细胞
抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞（能产生特定抗体的杂交瘤细胞）
用特定的选择培养基
第一次筛选
克隆化培养、抗体检测
第二次筛选（可进行多次）
注射到小鼠腹腔内
体外培养
获取单克隆抗体
从小鼠腹水中
从细胞培养液中
注射特定的抗原
多种B淋巴细胞
骨髓瘤细胞
诱导融合
动物细胞融合
动物细胞培养
补充了解——克隆化培养和抗体检测
★
有限稀释法
每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞
侧面模拟图
克隆化培养一段时间
取上清液进行抗体检测
补充了解——不同水平的克隆及实例
分子水平
细胞水平
个体水平
DNA复制、PCR技术
动物细胞培养
植物组织培养、动物细胞核移植
细胞水平
单克隆抗体的制备涉及什么水平的克隆？
思考
补充了解——不同水平的克隆及实例
分子水平
细胞水平
个体水平
DNA复制、PCR技术
动物细胞培养
植物组织培养、动物细胞核移植
细胞水平
单克隆抗体的制备涉及什么水平的克隆？
思考

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