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3.2 基因工程的基本操作程序
本节聚焦
1、基因工程的基本操作程序主要包括哪几个步骤？
2、基因工程操作的每一步涉及的技术和方法有哪些？
第二课时
获取了足够量的Bt基因后，下一步就是要让基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代；同时，使Bt基因能够表达和发挥作用。
构建基因表达载体（核心工作）
基因表达载体由哪些部分组成
复习提问
目的基因的筛选与获取
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
第一步
第二步
第三步
第四步
目的基因的检测与鉴定
基因工程的基本操作程序
自主学习：阅读课本相关内容（P81），总结将目的基因导入受体细胞的方法有哪些，各个方法的原理是什么？各自适用于什么生物？
温故知新
将目的基因导入受体细胞的方法
将目的基因导入
植物细胞
将目的基因导入
动物细胞
将目的基因导入
微生物细胞
农杆菌转化法
花粉管通道法
——显微注射法
——Ca2+处理法
我国科学家独创
三、将目的基因导入受体细胞
转化：指目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程。
三、将目的基因导入受体细胞
（一）导入植物细胞
农杆菌转化法
花粉管通道法
(最多)
导入方法
1.花粉管通道法：
我国科学家独创
①用___________将___________________直接注入____中；
微量注射器
含目的基因的DNA溶液
子房
②在植物受粉后的一定时间内，剪去____，将________滴加在________上，使目的基因借助___________进入_____；
柱头
DNA溶液
花柱切面
花粉管通道
胚囊
受体细胞：
受精卵
子房
花粉
柱头
花粉管
精子
卵细胞
胚囊
目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程
2.农杆菌转化法
①转化：
②农杆菌特点：
a.能在自然条件下侵染___________和_________，而对大多数___________没有侵染能力；
双子叶植物
裸子植物
单子叶植物
b.农杆菌细胞内含有______，当它侵染植物细胞后，能将______上的______（___________）转移到被侵染的细胞，并且将其_________________________；
Ti质粒
Ti质粒
T-DNA
可转移的DNA
整合到该细胞的染色体DNA上
将目的基因插入_____________中，通过农杆菌的_____作用，就可以使目的基因___________
③利用农杆菌进行转化的思路：
Ti质粒的T-DNA
转化
进入植物细胞
农杆菌转化法
插入外源基因的DNA
导入农杆菌
两次拼接：
第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上；
第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上。
两次导入：
第一次导入是将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌；
第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA导入受体细胞。
⑤转化的具体方法：
a.可以将新鲜的从叶片上取下的圆形小片_______________，然后_____________，并__________；
受体细胞为_______
与农杆菌共培养
筛选转化细胞
再生成植株
体细胞
b.可以将____直接浸没在________________中一段时间，然后培养植株并获得____，再进行_____、_____等；
受体细胞为_______
花序
含有农杆菌的溶液
种子
筛选
鉴定
受精卵
1.显微注射法
操作程序：
取受精卵
显微注射
胚胎移植
为什么常选用受精卵作为受体细胞呢？
提纯基因表达载体
①体积大，易操作。
②全能性高，易培养成完整个体。
将目的基因导入受体细胞
三
将目的基因导入动物细胞
使用Ca2+处理：
可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。
过程
微生物作为受体细胞的优点：
繁殖快，单细胞，遗传物质相对较少，易于培养操作
Ca2+处理细胞
感受态细胞
表达载体与感受态细胞混合
感受态细胞吸收DNA分子
大肠杆菌细胞
将目的基因导入受体细胞
三
将目的基因导入微生物细胞
原核生物作为受体细胞产生的真核生物的蛋白质通常没有生物活性，需要在体外进行再加工。
生物 种类 植物细胞 动物细胞 微生物细胞
常用 方法 农杆菌转化法; 花粉管通道法 显微注 射法 Ca2＋处理法(感受态细胞法)
受体 细胞 体细胞 受精卵 受精卵 原核细胞
小结：将目的基因导入受体细胞
四、目的基因的检测与鉴定
请大家回顾基因表达的过程，推测可以从哪些方面进行检测与鉴定？
Bt基因
mRNA
Bt抗虫蛋白
抗虫棉
PCR等技术检测
抗原 — 抗体杂交技术
分子
水平
抗虫鉴定
（个体水平）
1.检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因
四、目的基因的检测与鉴定
方法①：PCR扩增
转基因生物
提取DNA
DNA作为模板
PCR操作
是否扩增出目的基因
电泳操作
M：marker；1-阳性质粒；
2：原始品系；3-9转Bt品系；
转Bt基因品系PCR琼脂糖凝胶电泳检测结果
1.检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因
四、目的基因的检测与鉴定
原因：带标记的基因探针，与目的基因DNA单链在一定条件互补配对，结合成双链，从而出现杂交带。
方法②：DNA分子杂交技术
标记的基因探针
四、目的基因的检测与鉴定
2.检测目的基因是否转录出了mRNA
转基因生物
PCR操作
是否扩增出目的基因
逆转录
cDNA
提取RNA
mRNA作为模板
方法①：PCR扩增
RNA分子杂交(Northern Blot)流程图
提取RNA
转基因生物
方法②：RNA分子杂交技术
四、目的基因的检测与鉴定
3.检测目的基因是否翻译成蛋白质
方法:
过程:
抗原-抗体杂交技术
若出现杂交带，则目的基因成功翻译出蛋白质。
苏云金芽孢杆菌
提取
Bt毒蛋白
注射小鼠体内
抗体
标记抗体
抗原
抗体
杂交
提取蛋白
电泳分离
转基因生物
四、目的基因的检测与鉴定
转基因生物 鉴定方法 成功标志
抗虫植物
抗病毒（菌）植物
抗盐植物
抗除草剂植物
饲喂害虫（抗虫接种实验）
害虫死亡
病毒（菌）感染（抗病接种实验）
未出现病斑
盐水浇灌
正常生长
喷洒除草剂
正常生长
4.个体水平：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
类型 步骤 检测内容 方法
分子检测 第一步 转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因 PCR等技术
第二步 目的基因是否转录出mRNA PCR等技术
第三步 目的基因是否翻译形成蛋白质 抗原-抗体杂交技术
个体水平鉴定 抗虫或抗病的接种实验抗性以及抗性程度 抗性检测； 基因工程产品与天然产品的功能活性比较 功能活性。
目的基因的检测与鉴定
四
总结
1.目的基因的筛选和获取-前提
利用PCR获取和扩增
化学方法人工合成
2.构建基因表达载体-核心
目的基因、启动子、终止子、标记基因
3.将目的基因导入受体细胞-关键
农杆菌转化法(植物)、显微注射法(动物) 、
Ca2+处理法(微生物);
4.目的基因的检测与鉴定-保证
分子检测：是否插入、转录、翻译
个体水平：是否具有抗性以及抗性强度等。
基因工程的基本操作程序（4个步骤）
有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。
使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用。
载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。
才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。
探究实践
——DNA片段的扩增及电泳鉴定
PCR仪
DNA分子电泳
一、实验原理：
（1）PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合，PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器。
1、利用PCR在体外进行DNA片段扩增的原理：
（2）PCR扩增DNA片段还利用了DNA半保留复制的原理。一次PCR一般要经历30次循环。
变性
90 C
延伸
72 C
退火
50 C
2、DNA片段电泳鉴定的原理：
（1）DNA分子具有________________，在一定的________下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向着_______________________的电极移动，这个过程就是_______；
可解离的基团
pH
电泳
与它所带电荷相反
（2） PCR的产物一般通过__________________来鉴定；
（3） 在凝胶中DNA分子的迁移速率与___________、________________和_____等有关
（4） 凝胶中的DNA分子通过_____，可以在波长为________的______下被检测出来。
琼脂糖凝胶电泳
凝胶的浓度
DNA分子的大小
构象
染色
300nm
紫外灯
琼脂糖凝胶电泳
探究实践
——DNA片段的扩增及电泳鉴定
（二）实验步骤
移液
用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分。
离心
待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率）。
反应
参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。
循环程序 变性 复性 延伸
预变性 94℃,5min / /
30次 94℃,30s 55℃,30s 72℃,1min
最后一次 94℃,1min 55℃,30s 72℃,1min
预变性：使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合
可根据目的片段长度适当调整延伸时间。
1.DNA片段扩增的具体过程
DNA片段的扩增及电泳鉴定
DNA片段的电泳鉴定
配制琼脂糖溶液
根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀
制备凝胶
将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜
加样
将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物
电泳
接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳
观察记录
取出凝胶置于紫外灯下观察和照相
DNA片段的扩增及电泳鉴定——注意事项
1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
4.在进行操作时，一定要戴好一次性手套。
5.PCR扩增不能随意加大试剂用量。
DNA片段的扩增及电泳鉴定——结果分析与评价
1.你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？
可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。进行电泳鉴定的结果应该是一条条带，该片段大小约为750bp。
探究实践
——DNA片段的扩增及电泳鉴定
（四）实验结果
2.你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。
如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。
如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；复性温度过低；DNA聚合酶的质量不好，模板DNA出现污染；Mg2＋浓度过高等。
1.在实际种植过程中，棉铃虫是否对转Bt基因的抗虫棉产生了严重的抗性？证据是什么？
科研人员对长江流域种植的转基因抗虫棉进行了监测，2011年的数据显示，大部分转基因抗虫棉品种的抗虫性属于中抗及高抗水平；2013年的数据表明，如果棉田周围存在大量天然庇护所，靶标害虫棉铃虫、红铃虫等并未对转Bt基因的抗虫棉产生明显抗性。在我国、澳大利亚、印度等国的多个实验室中，通过毒素的连续抗性筛选，已经培育出多个高抗水平的转基因抗虫棉品种。
到社会中去
2.科研工作者在没有发现棉铃虫出现抗性之前，就应该想办法应对。他们想出的延缓棉铃虫对Bt抗虫蛋白产生抗性的措施有哪些？这些措施的原理是什么？有效吗？
科研人员想出的延缓棉铃虫对Bt抗虫蛋白产生抗性的措施有很多，主要可以分为以下几个方面。
（1）基因策略。该策略是在分子水平上提高转基因抗虫棉的抗虫性和抗虫持久性。包括在棉花中转入多个杀虫基因、构建组织特异性表达的启动子、提高杀虫基因的表达量等。
（2）田间策略。这是在种植时采取的措施，如提供庇护所、与其他作物（非抗品种）轮作或套种等。
（3）国家宏观调控策略。该策略包括实施分区种植管理、加强抗性监测、 进行严格的安全生评价等。
到社会中去
1.研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因afp整合到土壤农杆菌的Ti质粒上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。判断下列相关表述是否正确。
（1）afp基因是培育抗冻番茄用到的目的基因。 （ ）
（2）构建含有afp基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶和核酸酶（ ）
（3）只要检测出番茄细胞中含有afp基因，就代表抗冻番茄培育成功（ ）
2.利用PCR既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。下列有关PCR的叙述错误的是 （ ）
A.PCR用的DNA聚合酶是一种耐高温酶
B.变性过程中双链DNA的解开不需要解旋酶
C.复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则
D.延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP和 4种核糖核苷酸
√
×
×
练习与应用（P83）
一.概念检测
D
1.研究人员在研究转基因烟草中外源卡那霉素抗性基因的遗传稳定性时，发现44株转基因烟草中有4株该基因的遗传不符合孟德尔遗传规律，在它们的自交后代中出现了较多的没有卡那霉素抗性的植株。请查找相关资料，尝试对这个问题作出解释。
外源基因插入基因组中可能为单位点插入，或者同一染色体多位点插入，或者不同染色体多位点插入。大多数情况下，插入的位点难以做到定点插入；插入的拷贝数也是随机的。因此，外源基因在转基因植物中的遗传是很复杂的。例如，科研人员在对转GUS基因(β-葡糖醛酸糖苷酶基因)的烟草进行基因表达分析时，发现部分转基因植株的染色体DNA中整合了多个拷贝的基因，从而导致GUS基因失活。除此之外，外源基因丢失、基因重排等也都可能影响外源基因的稳定性。
练习与应用（P83）
二、拓展应用
2.八氢番茄红素合酶（其基因用psy表示） 和胡萝卜素脱饱和酶（其基因用crtⅠ表示）参与β-胡萝卜素的合成。pmi为磷酸甘露醇异构酶基因，它编码的蛋白质可使细胞在特殊培养基上生长。科学家将psy和crtⅠ基因转入水稻，使水稻胚乳中富含β-胡萝卜素，由此生产出的大米称为 “黄金大米”。请根据以上信息回答下列问题。
【这项研究成果发表在《自然 生物技术》（Nature Biotechnology ）杂志上】
练习与应用（P83）
二、拓展应用
（1）科学家在培育“黄金大米”时，将ctrⅠ和psy基因导入含pmi基因的质粒中，构建了质粒pSYN12424。该项研究的目的基因是______ ，标记基因是_____ ，质粒pSYN12424的作用是______ 。
ctrⅠ基因和psy基因
pmi基因
将目的基因送入水稻细胞
（2）在构建质粒载体时，目的基因序列中能否含有用到的限制酶的识别序列？为什么？
不能。
如果目的基因序列中含有用到的限制酶的识别序列，限制酶可能将它切断。
练习与应用（P83）
二、拓展应用
(3)请查找相关资料，了解科学家为什么 要培育“黄金大米”以及当前关于“是否要推广 '黄金大米’”的各种争论。你还可以提出自己的看法，并与同学交流讨论。
维生素A在人体内具有非常重要的生理功能，对视力、骨骼生长、免疫功能等都有调节作用。但是，人体不能合成维生素A，需要从食物中摄取。维生素A缺乏症是南亚地区常见的由营养不良导致的疾病，该地区的居民一般以籼稻作为主食。β-胡萝ト素是维生素A的前体，在人体内它可以转化为维生素A。因此，科学家将两个参与β-胡萝ト素合成的酶的基因转入了籼稻中，使其胚乳中富含β-胡萝ト素，期望让人们通过日常食用主食就能补充足够量的维生素A，从而降低维生素A缺乏症的患病率。关于“是否要推广'黄金大米'”的争论主要围绕其安全性、有效性等方面展开
练习与应用（P83）
二、拓展应用

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