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(共25张PPT)
3.2 基因工程的基本操作程序
本节聚焦
1、基因工程的基本操作程序主要包括哪几个步骤？
2、基因工程操作的每一步涉及的技术和方法有哪些？
第一课时
1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。
你知道转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗？
培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？
例如：培育转基因抗虫棉的简要过程
提取
棉花细胞(含抗虫基因)
苏云金芽孢杆菌
抗虫基因
与运载体DNA拼接
导入
普通棉花(无抗虫特性)
棉花植株(有抗虫特性)
基因工程的基本操作程序：
获：目的基因的筛选与获取
构：基因表达载体的构建
导：将目的基因导入受体细胞
检：目的基因的检测和鉴定
（核心）
从社会中来
一、目的基因的筛选与获取
1、目的基因的概念：
在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等相关的基因。
根据不同的需要，目的基因不同，主要是指编码蛋白质的基因。
如：与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。
资料：苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（Bt 抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。
科学家将“杀虫基因”转入棉花中，棉花产生Bt 抗虫蛋白抵抗虫害。
目的基因
2. 筛选合适的目的基因（1）
已知结构和功能清晰
（2）利用测序技术、序列数据库（如GenBank）、序列对比工具（如BLAST）等，找到合适的目的基因。
测定：核酸和蛋白质序列
查找：存储和共享在序列数据库中的碱基顺序或氨基酸残基顺序及其注释信息。
比对：查询核酸序列（氨基酸序列）与数据库中的相似序列。
提取
苏云金芽孢杆菌
抗虫基因
？
快速获得大量抗虫基因
明确了目的基因后，该怎么获得它？
3. 目的基因的获取方法
PCR
基因文库
适用于：较小且全部序列已知的目的基因。
例：我国首批转基因抗虫棉的培育使用
PCR基因扩增仪
PCR技术由穆里斯等人于1985年发明，为此，穆里斯于1993年获得诺贝尔化学奖。
什么是PCR？
4. 利用PCR获取和扩增目的基因
（1）PCR: ①原理、②操作环境、③目的
①原理
②操作环境
③目的
④优点：
可以在短时间内大量扩增目的基因
⑤实质：
在体外模拟体内DNA复制过程
p77
耐高温的DNA聚合酶
（Taq酶）
DNA模板
引物（2种）
稳定的缓冲溶液
（一般添加Mg2+）
②PCR条件:
一.目的基因的筛选与获取
四种脱氧核苷酸(dNTP)
激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶
3.利用PCR获取和扩增目的基因
什么是引物？引物的作用是什么？
思考讨论
定义：引物是一小段能与DNA母链的一小段碱基序列互补配对的短单
链核酸。（长度通常为20-30个核苷酸）
作用：引物为DNA聚合酶提供了游离的3’端，使DNA聚合酶从3’端开
始拼接单个的核苷酸进行PCR扩增。
什么是引物？引物的作用是什么？
（2）PCR扩增过程
待扩增的DNA片段
引物
耐高温的DNA聚合酶
4种脱氧核苷酸
变性
温度上升到90℃以上，双链DNA解旋为单链
复性
当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
延伸
当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
（2）PCR扩增过程
第一轮循环的产物作为第二轮反应模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环产物。
第二轮循环的产物作为第三轮反应模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮循环产物。
（3）PCR小结
变性
复性
延伸
温度：90℃以上
过程：目的基因DNA双链受热变性后解聚为单链
温度：50℃左右
过程：两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合
温度：72℃左右
过程：4种脱氧核苷酸在耐高温DNA聚合酶的催化下，根据碱基互补配对原则，添加在引物的3’端，合成新的DNA链。
反复循环
结果：
1个模板DNA分子经过n轮PCR，以指数方式扩增，可以扩增出2n个DNA片段。
（2）PCR扩增过程
【典例】下图表示PCR的前三个循环，目的基因位于模板DNA分子中与两种引物所对应的位置之间，请据图回答下列问题：
(1)经过第几轮扩增后，扩增出的含有目的基因的DNA片段才不含黏性末端？比例是多少？
第3轮；1/4。
(2)PCR扩增的是完整的模板DNA分子吗？
不是，PCR扩增的仅仅是两种引物之间所对应的特定DNA片段。
(3)如果已知某目的基因的序列和结构，利用PCR筛选和扩增出该目的基因的关键是什么？
根据目的基因两端的核苷酸序列设计引物。
习题巩固
1.下列有关体内DNA复制与PCR技术比较的叙述，错误的是
A.二者子链的延伸方向相同，均为5′端→3′端
B.二者均需要解旋酶破坏氢键来实现解旋
C.体内DNA复制需要能量，PCR反应也需要能量
D.二者遵循的碱基互补配对原则相同
√
如何对产物进行鉴定？
思考讨论
琼脂糖凝胶电泳
原理：
DNA分子具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向着它所带电荷相反的电极移动，这个过程就叫电泳。
较小的DNA片段在凝胶中的移动相对容易，较大的DNA片段移动难。通过比较DNA样品所在的位置和一系列已知大小的DNA片段的位置(标准)，这些已知大小的片段称为DNA分子量标准样。
－
最短
最长
Bt基因
导入
棉花细胞
若将Bt基因直接导入棉花细胞不是更简便嘛？那么能否这么做？这么做会导致什么结果？？？
游离的DNA进入细胞体,一般会直接被分解,就算可以进行转录——翻译成蛋白,游离DNA也无法跟着细胞分裂进行复制,导致子代细胞中不再含有目的基因
能够直接导入
基因表达载体的构建——核心
二、基因表达载体的构建
1.基因表达载体的目的
（1）使目的基因在受体细胞中稳定存在，且可以遗传给下一代；
（2）使目的基因能够在受体细胞中表达和发挥作用。
2.基因表达载体的组成
位置：
功能：
RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质。
基因的首端（一段有特殊结构的DNA片段）
人们所需要的基因
位置：
功能：
基因的尾端（一段特殊的DNA片断）
终止mRNA的转录
用来鉴别或筛选含有重组DNA分子的细胞
基因表达载体的构建
二
启动子和起始密码子、终止子和终止密码子的区别
总结
项目 启动子 终止子 起始密码 终止密码
化学成分 DNA片段 DNA片段 mRNA上三个相邻碱基 mRNA上三个相邻碱基
位置 目的基因首端 目的基因尾端 mRNA首端 mRNA尾端
作用 RNA聚合酶识别和结合的部位,驱动基因转录出RNA 决定转录 的结束 翻译的 起始信号 决定翻译过程的结束
3.基因表达载体的构建过程
基因表达载体构建模式图
载体
（质粒）
DNA分子
（含目的基因）
限制酶处理
带有黏性末端或平末端的切口
带有相同黏性末端或平末端的目的基因片段
DNA连接酶
重组DNA分子
（重组质粒）
同一种
基因表达载体的构建
二
培育抗虫棉的简要过程
使用一种DNA限制酶进行切割，共有几种连接情况？
选择2种不同的限制酶同时对目的基因和质粒切割，减少自连情况出现；
载体
目的基因
自连
片段间的连接
目的基因自连
质粒自连
目的基因与质粒连接
目的基因与目的基因连接
质粒与质粒连接
正向连接 反向连接
1
1’
2
2’
1
2
2’
1’
2
2’
1’
1
如何解决这一问题？
二、基因表达载体的构建
二、基因表达载体的构建
②双酶切的优点
A、防止质粒重新环化
B、防止质粒与目的基因反向连接
C、防止目的基因自身环化
1.如图是利用基因工程技术培育转基因植物，生产可食用疫苗的部分过程示意图，其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ为四种限制性内切核酸酶。下列说法错误的是(　　 )
B
A.卡那霉素抗性、基因的存在有利于将含有抗原基因的细胞筛选出来
B.表达载体构建时需要用到限制酶SmaⅠ
C.图示过程是基因工程的核心步骤
D.除图示组成外，表达载体中还应该含有启动子和终止子等结构

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