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(共33张PPT)
生物学（新人教版）
生物技术与工程
第三章 基因工程
第 1 节
重组DNA技术的基本工具
Biology
　　指按照人们的愿望,进行严格的设计并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性,创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。
【归纳定义】工程别名：
操作对象：
操作水平：
工程实质：
什么是基因工程？
重组DNA技术
基因
DNA分子水平
基因重组
从社会中来
番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵袭。当番木瓜被这种病毒感染后，产量会大大下降。科学家通过精心设计，用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。DNA双螺旋的直径只有2nm,对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。
转基因番木瓜（左）与非转基因番木瓜（右）
三种“分子工具”
“分子手术刀”
“分子缝合针”
“分子运输车”
准确切割DNA分子
将DNA片段连接起来
将体外重组好的DNA分子导入受体细胞
一、限制性内切核酸酶（限制酶） ——分子手术刀
1、来源：
主要是从原核生物中分离纯化出来的。
2、种类：
数千种
（限制酶不是一种酶，而是一类酶）
3、作用：
识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。（专一性）
1’
2’
3’
4’
5’
G
限制酶
1’
2’
3’
4’
5’
A
磷酸二酯键
T
G
C
C
G
T
A
A
5'
3'
5'
3'
一、限制性内切核酸酶（限制酶） ——分子手术刀
EcoR I
(在G与A之间切割)
Sma I
(在G与C之间切割)
5'
5'
5'
5'
3'
3'
3'
3'
5'
5'
3'
3'
5'
5'
3'
3'
4、识别序列：
大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。
5、切割结果：
产生黏性末端或平末端
一、限制性内切核酸酶（限制酶） ——分子手术刀
黏性末端　　　　
黏性末端
只能识别GAATTC序列,并在G和A之间切开。
EcoRI 限制酶的切割：
一、限制性内切核酸酶（限制酶） ——分子手术刀
平末端　　　平末端
只能识别CCCGGG序列,并在C和G之间切开
Sma I限制酶的切割：
课堂练习：写出下列限制酶切割形成的黏性末端
BamHⅠ ______ EcoRⅠ_____
HindⅢ _____ BglⅡ _____
GATC
AATT
AGCT
GATC
思考：你从中发现什么现象了？
不同的限制酶可能切割形成相同的黏性末端
根据你所掌握的知识你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么？
旁栏思考
限制酶就是细菌的一种防御性工具。当外源DNA入侵时，它会利用限制酶来切割外源DNA，使之失效，以保证自身的安全。
【反馈练习】
1.下面哪项不具有限制酶识别序列的特征（ ）
A．GAATTC B．GGGGCCCC
CTTAAG CCCCGGGG
C．CTGCAG D．CTAAATC
GACGTC GATTTAG
D
二、DNA连接酶 ——分子缝合针
1、作用：
将双链 DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键 。
2、种类：
种类 E·coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶
来源
功能特性
相同点 大肠杆菌
T4噬菌体
只能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来，不能连接具有平末端的DNA片段
既可以连接双链DNA片段互补的黏性末端，又可以连接双链DNA片段的平末端（但连接平末端的效率相对较低）
恢复的都是磷酸二酯键
两DNA片段要具有互补的黏性末端才能拼起来
可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，
注意: DNA连接酶可连接双链DNA中的DNA单链缺口，但不能连接单链DNA；也不能连接RNA！
二、DNA连接酶 ——分子缝合针
T4 DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率较低
二、DNA连接酶 ——分子缝合针
DNA连接酶和DNA聚合酶是一回事吗？为什么？
A A T T G
C
A
A
T
T
A
A
T
T
DNA聚合酶
DNA聚合酶
DNA聚合酶
DNA聚合酶
相同点：都是催化磷酸二酯键形成的酶。
不同点：DNA聚合酶连接的是游离的脱氧核苷酸，需要模板；
DNA连接酶连接的是DNA片段。
3.几种相关酶的比较
名称 作用部位 作用结果
限制酶
DNA连接酶
DNA聚合酶
DNA(水解)酶
解旋酶
磷酸二酯键
碱基对之间的氢键
将DNA切成两个片段
磷酸二酯键
将两个DNA片段连接为一个DNA分子
磷酸二酯键
将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端
磷酸二酯键
将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
将双链DNA分子局部解旋为单链
二、DNA连接酶 ——分子缝合针
根据所学知识，完成以下填空：
①限制酶 ②解旋酶 ③DNA连接酶 ④DNA聚合酶 ⑤RNA聚合酶
b
a
A.切断a处的酶为_______
B.连接a处的酶为_______
C.切断b处的酶为_______
①
③④
②
a：磷酸二酯键；b：氢键
【反馈练习】
二、DNA连接酶 ——分子缝合针
质粒
将外源基因送入受体细胞, 在受体细胞内对目的基因进行大量复制.
1.作用：
动植物病毒
噬菌体
2.种类：
质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
三、基因进入细胞的载体——分子运输车
大肠杆菌及质粒结构模式图
3、运载体需具备的条件
（1）有复制原点能够在宿主细胞中复制并稳定地保存
（2）有一个至多个限制酶切点
（3）有某些标记基因
（4）对受体细胞无害、易分离
能进入受体细胞并在受体细胞内复制并表达；
便于与不同目的基因结合
便于鉴定和筛选
三、基因进入细胞的载体——分子运输车
重组DNA分子
…TATCGTACGATAGGTACTTAA
…ATAGCATGCTATCCATG
AATTCGGCATAC…
GCCGTATG…
…TCCTAG
…AGGATCTTAA
GAGCCATACTTAA
AATTCTCGGTATG
AATTCCATAC…
GGTATG…
GAGCCATACTTAA
AATTCTCGGTATG
重组DNA分子
1.剪刀和透明胶条分别代表哪种“分子工具”？
剪刀代表限制酶；透明胶条代表DNA连接酶。
2.你制作的黏性末端的碱基能不能互补配对 如果不能，可能是什么原因造成的？
如果制作的黏性末端的碱基不能互补配对，可能是剪切位点或连接位点选得不对，也可能是其他原因。
3.你插入的DNA片段能称得上一个基因吗？
不能，因为基因的长度一般在100个碱基对以上。
限制酶
DNA连接酶
载体
①对受体细胞无害；
②有一个至多个限制酶切割位点；
③有特殊的标记基因；
④能自我复制或能整合到宿主DNA上。
质粒、λ噬菌体衍生物 、动植物病毒
基因工程的基本工具
作为载体的条件
种类：
磷酸二酯键
来源：
主要来源于原核生物
特点：
作用部位：
具有专一性
结果：
形成黏性末端或平末端
连接部位：磷酸二酯键
种类： E.coliDNA连接酶、T4 DNA连接酶
作用： 把两条双链DNA片段拼接起来
课堂小结
　　思考：
　　如何将DNA提取出来，并进行鉴定呢
四、DNA的粗提取与鉴定
1、基本思路
2、提取DNA的方法
选用一定的物理或化学方法，分离具有不同物理或化学性质的生物大分子
利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。
四、DNA的粗提取与鉴定
3、实验原理
DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精
DNA能溶于物质的量浓度为2 mol/L的NaCl溶液
在一定温度下，DNA被二苯胺试剂染成蓝色
初步分离DNA和蛋白质
溶解DNA
鉴定DNA
0
0.14
NaCI浓度（mol/L）
四、DNA的粗提取与鉴定
4、材料用具
DNA含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等。
（注意：不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA。）
（1）选材：
（2）试剂：
①研磨液
②体积分数为95%的酒精
③2mol/L 的NaCl溶液
④二苯胺试剂
⑤蒸馏水
——溶解并提取DNA
——析出DNA
——溶解DNA
——鉴定DNA，要现配现用
四、DNA的粗提取与鉴定
称取 ，切碎，放入研钵，倒入 ，充分研磨。
在漏斗中垫上纱布过滤研磨液，4℃冰箱中静置后取 ；或将研磨液倒入塑料离心管中离心，取 。
在上清液中加入体积相等的、 溶液, 静置2~3min，溶液中出现的 就是粗提取的DNA 。
（2）去除杂质——
（3）DNA的析出——
（1）破碎细胞——
洋葱
研磨液
上清液
上清液
预冷的酒精
白色丝状物
思考：如何评价结果？
——看提取物颜色
——看与二苯胺反应颜色的深浅
DNA纯度
DNA的量
用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物；或将溶液倒入塑料离心管中离心，取沉淀物晾干。
析出DNA
四、DNA的粗提取与鉴定
5、方法步骤
将丝状物或沉淀物溶于 溶液中，加入
试剂，混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min
（4）DNA的鉴定——
二苯胺
2mol/L的NaCl
空白对照组：
在等体积的NaCl溶液中加入二苯胺试剂，将试管置于同等沸水浴中加热5min。
四、DNA的粗提取与鉴定
5、方法步骤
四、DNA的粗提取与鉴定
思考讨论
1、选什么样的材料实验更易成功？用洋葱做材料，为什么要充分研磨？
含DNA的生物材料都可以，选取DNA含量相对较高的生物组织，成功率更大。
充分研磨，可以破坏细胞壁，裂解细胞，释放DNA。
四、DNA的粗提取与鉴定
2、猪血和鸡血，哪个适合用作提取DNA的材料？操作时如何防止血液凝固？
思考讨论
猪血（哺乳动物的成熟红细胞）无细胞核，不适合；
鸡血中红细胞有核DNA，且核DNA的量较多，适合。
鸡血中加入柠檬酸钠，可防止血液凝固。
3、如果用鸡血动物细胞做材料，也需要研磨裂解释放细胞中的DNA吗？
加入清水，让细胞吸水胀破，释放DNA。
如果是猪肝呢？
谢谢观看

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