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(共56张PPT)
1997年，我国政府首次批准商 业化种植转基因抗虫棉。到2015年， 我国已育成转基因抗虫棉新品种100 多个，减少农药用量40万吨，增收 节支社会经济效益450亿元。
你知道转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗 P77
从社会中来
转基因抗虫棉与普通棉花
普通棉花
(无抗虫特性)
3.将目的基因 导入受体细胞
导入 棉花细胞
表达Bt基因
Bt基因 重组DNA 分子 抗虫棉 4.目的基因的
检测与鉴定
与载体拼接
2.基因表达 载体的构建
1.目的基因的 筛选与获取
苏云金杆菌
提取
第3章基因工程
第2节基因工程的基本操作程序
取出质粒
用限制酶切断DNA
用连接酶连接目的基因
连接酶
高二生物组
本节主要解决的困惑
1.利用PCR获取和扩增目的基因
2.基因表达载体的构建过程
原核细胞
真核细胞
不同点 编码区是 连续_的
编码区是间隔 的 、不连续的
相同点 都由能够编码蛋白质的 编码区和具有调控作用的 非编码区组成的
非编码区：不能编码蛋白质，调控遗
真核细胞基因的结构示意图 传信息的表达
包括：编码区上游编码区下游
点
录
终
转
点
录
起
转
非编码区 编码区(转录区) 非编码区
启动子 终止子
转录 转录
起点 终点
非编码区
非编码区
编码区(转录区)
启动子
终止子
知识回顾1:基因的结构
编码区：编码蛋白质的合成
原核细胞基因的结构示意图
知识回顾1:基因的结构
名称 功能 位置 序列特征 转 录 因 子 结 合 对 g e n e 表 达 的 影 响 启动子 启动gene的转录 gene的5'端上游 具有特定的序列特征，如 原核生物的启动子具 有-10和-35区域，终止子 具有特定的终止信号 与RNA聚合酶及其 他转录因子结合 正向调控gene表达 终止子 终止gene的转录 gene的3'端下游 不需要 负向调控gene表达 内含子 在转录后被剪接掉， 不参与编码蛋白质 gene内部，被外显子分隔 内含子通常在5'和3'端具 有剪接位点，而外显子则 包含编码序列 不需要 两者兼有 外显子 编码蛋白质的序列， 转录后保留在mRNA 中 gene内部，编码区域的一部分 不需要 两者兼有 增强子 增强特定gene的转录 活性 可以位于gene的任何位置，包 括上游、下游或内部 含有特定的调控序列，可 以与转录因子结合 与增强子结合蛋白 (如转录激huo因 子 ) 结 合 正向调控gene表达 沉默子 降低特定gene的转录 活性 可以位于gene的任何位置，包 括远高gene的区域 与沉默因子结合 负向调控gene表达
需要细胞提供能量
需要解旋酶的作用
结果：氢键断裂，双链打开
游离的脱氧核苷酸
5'
DNA解 旋 酶
知识回顾2:DNA的复制过程
2 =2
# # z =4
#####z =8
DNA 聚 合 酶
新合成的子链
DNA 聚 合 酶
合成子链
解 旋
—
知识回顾3:基因的表达
转录
RNA 加工
■AAAA
AAAA
翻译
细胞质
细胞核
内含子 外显子
DNA
mRNA
蛋白质
真核细胞与原核细胞中基因表达过程示意图
mRNA
mRNA
蛋白质
DNA
RNA
转录
翻译
3.同种生物的不同细胞中，由于基因的选择性表达，mRNA的种类和数量 一般是不相同的，但tRNA和rRNA的种类一般没有差异。
基因B
3'- 5'
5'- 3'
基因A 基因C
模板链 非模板链
1 转录时，DNA链完全解开吗 整个DNA都转录 边解旋边转录

转录不是转录整个DNA,是转录其中要表达的基因，以基因的一条链为模板，
2不同基因的模版链是否相同
点拨提升1
不同基因模板链不同
①原核生物细胞里没有相应的 酶 来去除内含子；
②原核生物没有真核的蛋白质 加工系统(如内质网、高尔基 体 等 )
真核基因：编码区(外显子+
内含子)
前体mRNA 一般不能产生原来的蛋白质
【思考1】:如果把一个真核生物的基因导入原核细胞中表达， 一 定会产生原来的蛋白质吗
相应酶去除内含子
成 熟mRN 成熟
翻译 mRNA
A Eis
内含子 外显子
转录
多肽链
蛋白质
深度思考
加工
内含子
外显子
内含子 外显子 内含子 外显子
代nWnwwwn 真核基因：编码区(外显子+内含子
转录 转录 )
前体mRNA
【思考2】:如果把真核基因导入原核细胞中表达，不考虑蛋白质加工的 问题，如何产生与原来结构相同的蛋白质
这种双链DNA 是不含内含子 的DNA, 叫做
cDNA
相应酶 去除内含子
成熟 mRNA
把真核基因的cDNA 导入到原核细胞中表达。
提取 mRN逆转录酶DNA 单链 单 链
深度思考
DNA
双链
酶
与生物抗逆性相关的基因 (Bt 抗虫基因)
与优良品质相关的基因
2. 实 例 ： 与生物药物和保健品相关的基因 ( 胰岛素、干扰素基因)
与毒物降解相关的基因
与工业用酶相关的基因等
( 一 ) 从基因文库中获取；
3.目的基因获取方法： (二)通过DNA合成仪直接合成；
(三)利用PCR技术扩增；
寰
目的基因的筛选与获取
1. 目 的 基 因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或得预期表达产
物等的基因，主要指的是编码蛋白质的基因，也可以是一些具有调控 作 用 的 因 子。
涵：心①
① 0
雾
(一)从基因文库中获取目的基因 (未知序列)
1. 基因文库概念：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入到受体菌的群体中 储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。
2.基因文库类型： 基因组文库 (包含一种生物的所有基因)
部分基因文库(包含一种生物的一部分基因)(cDNA 文库)
某种生物某个时期的mRNA
反转录
cDNA
与运载体连接导入
受体菌群体
部分基因文库 (cDNA 文库)
某生物体内全部DNA
限制酶
许多DNA片段
与运载体连接导入
受体菌群体
基因组文库
(二)人工合成目的基因(已知序列)
1. 前 提 ：基因比较小、核苷酸序列已知
2. 方 法 ：通过DNA合成仪用化学方法直接合成目的基因
DNA 合成仪
DNA复制所需的基本条件 参与的组分 在DNA复制中的作用 解旋酶(体外用高温代替) 打开DNA双链 DNA两条母链 提供DNA复制的模板 4种脱氧核苷酸 合成DNA子链的原料 DNA聚合酶 催化合成DNA子链 与两条母链结合的2种引物 使DNA聚合酶能够从引物3′端连接脱氧核苷酸 作用
1. 概 念 ：PCR是聚合酶链式反应的缩写。
它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分 与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
2.方式： 以指数方式扩增，即_2n_ (n 为扩增循环的次数)
困惑点一：利用PCR获取和扩增目的基因
3.条件：
探究要求： 合作交流
思考以下问题，小组合作交流，派代表展示成果，时间3min。
(1)什么是引物 DNA复制时为什么需要引物
是指两段与待扩增的DNA序列互补的一小段DNA或RNA。
在DNA扩增时，DNA聚合酶不能从头开始合成DNA,只能从引物的3′端延伸
( 1 ) 设 计一 对与目的基因两侧的部分脱氧核苷酸序列互补配对的引物 ( 保证以DNA的两条链为模板进行扩增):
①为方便构建重组质粒，需在引物5'端添加适当的限制酶的识别序列/酶切位点；
② 为保证目的基因与载体正向连接，常在两种引物上设计不同的酶切位点；
③为避免引物自身折叠，设计引物时需避免引物之内部形成碱基互补配对。
④ 为避免引物自连，设计引物时需避免引物之间形成局部碱基互补配对。
PCR过程中，DNA双链解开是在高温下完成的，不需要解旋酶；由于PCR 过程温度较高，所以需要能耐高温的DNA 聚合酶。
b. 复性 (复性55℃-60℃):系统温度降低，引物与DNA模板结合
形成局部双 链
50℃ (5)复性温度与设计的引物(长度、碱基组成)有关：
①长度相同但G—C 含量高的引物需要设定的复性温度较 高 ；②若复性温度过高，则会破坏引物与模板的结合，可 能 导致PCR 反应得不到任何扩增产物。
4.利用PCR 获取和扩增目的基因过程
3'
9 5°℃a.变性 (90℃-95℃):双链DNA模板在热作用下，氢键 断裂，
形成单链DNA
引物1 退火温度低会造成非特异性条带
72℃c. 延伸 (70℃ -75℃):在Taq酶的作用下，合成与模板互补
的DNA链_。
Taq酶
DNA引 物
引物2
Taq酶
引 物 1
DNA引 物
引物之
5'
3'
模 板DNA
比较项目 细胞内DNA复制
PCR技术
区 别 解旋方式 解旋酶催化
DNA在高温下变性解旋
场所 主要在细胞核内
细胞外(主要在PCR扩增仪内)
酶 解旋酶、DNA聚合酶等
热稳定的DNA聚合酶(Taq酶)
温度 细胞内温和条件
控制温度，需在不同温度下进行
结果 合成整个DNA分子
扩增特定的DNA片段或基因
联系 ①模板：均需要脱氧核苷酸双链作为模板 ②原料：均为四种脱氧核苷酸(dATP、dTTP、dGTP、dCTP) ③酶：均需DNA聚合酶 ④引物：都需要引物，使DNA聚合酶从引物开始进行互补链的合成
知识小结：PCR 技术与细胞内DNA复制的比较
90℃以上， DNA 双链解开 50℃左右，引物与DNA 结合
5'
72℃左右，新DNA 合成
第 一 次 循 环
3’
5'
3’
5' [
3’
5'
5'
高温变性、低温复性
3’
5'
第 二 次 循 环
3'
5'
5'
中 温 延 伸
高温变性、低温复性
第 一 次 循 环
3’
5'
5’
中 温 延 伸
次 循 环
第 三
3’
引 物
引 物
待扩增的DNA
(2)图形显示一轮循环产生的子链长度小于模板链的长度，
到第三轮循环时，才开始出现2个两条脱氧核苷酸链等长的子代DN A。
弟 T 牝 发 制(Z 东 从 链 厂 第 乙 牝 发 制 ( 4 东 从 链 厂 第 ○ 机 友 制 0 示 从 旺7
DNA变性
再与引物复性 合成DNA
DNA 变性
再与引物复性 合成DNA
样品DNA 变性 再与引物复性
etc.
etc,
etc.
etc.
etc.
合成DNA
复 制 次 数 1 2
3
D N A 分 子 数 2 4
8
含 引 物 的 D N A 分 子 数 2 4
8
含 其 中 一 种 引 物 的 D N A 分子数 1=2 -1 3=2 -1
7=2 -1
同 时 含 两 条 引 物 的 D N A 分子数 0=2 -2 2=2 -2
6=2 -2
共 消 耗 引 物 的分子数 2=2 -2 6=2 -2
14=2 -2
含 脱 氧 核 苷 酸 链 等 长 的 D N A 分 子 数 0=2 -2 O=2 -4
2=2 -6
点拨提升1:PCR中的数量关系
例 1 6 利 用PCR 将某小段含目的基因的 DNA 分子扩增循环
n 次，则 B
A. 需要已知目的基因的全部序列以便设计引物
B.共需2"+1-2个引物参与子代 DNA 分子的合成
C.应向反应体系中加入解旋酶、DNA 聚合酶、缓冲液等
D. 理论上第4轮循环产物中含两种引物的 DNA 片段占15/16 解析 只需要已知目的基因两端的序列便可设计引物，A 错 误；扩增循环n 次，需一种引物的数量为2”-1,常规 PCR 共需 两种引物的数量为2×(2”-1)=2"+ -2,B 正确；不需向 PCR 的反应体系中加入解旋酶，C 错误；理论上第4轮循环产物中含两
种引物的 DNA 片段占(2 -2)/16=7/8,D 错误。
答案 B
学以致用1
d.标记基因 检测目的基因是否导入受体细胞 (抗生素抗性基因)
e、复制原点： DNA聚合酶结合位点
2.基因表达载体的构建过程
困惑点二：基因表达载体的构建 (核心)
探究要求： 合作交流
表达特定性状
位于基因的首端，是RNA聚合酶结合位点， 基因转录的开始
位于基因的末端，终止转录
思考基因表达载体的组成的相关问题，小组合作交流，派代表展示成果，时间3min。
表达载体
终止子
复制原点
抗生素基因
a.目的基因
b. 启动子
c.终止子
1.基因表达载体的组成
插人基因
启动子
启 动 子
2.基因表达载体的构建过程
质粒
标记基因-
(1)用一定的限制酶 切割质粒，
使其出现一个切口，露出
黏性末端。
( 2 ) 用同一种限制酶 切断目的基 因，使其产生 相同的黏性末端_。
终止子
目的基因
复制原点
限制酶切割位点
C限制酶 限制酶
获取目的基因
D 连接酶
重组 DNA 分子
基因表达载体构建模式图
(3)再加入适量DNA连接酶,将切下的目的基因片段插入质粒的 切 口 处，形成了一个重组DNA 分子(重组质粒)。
限制酶切割位点
DNA 分 子
限制酶处理
两个切口
获得目的基因
质粒
同种
一个切口
两个黏性末端
限制酶切割位点
限制酶
获取目的基因
标记基因一
限制酶
2.基因表达载体的构建过程
限制酶切割位点
启动子、 终止子
重组DNA分子
(重组质粒)
连接酶
重 组DNA 分 子
DNA连 接 酶
目的基因
复制原点
质粒
【思考1】使用一种DNA 限制酶进行切割，是否只会得到目的基因与
载体结合的这一种重组DNA
目的基因自连
自连
质粒自连
目的基因与质粒连接
质粒与质粒连接
目的基因与目的基因连接
目的基因
L2
2
深度思考
21
1'
2'
21'
1
2'
片段间的 连接
载体
双酶切
· 防止质粒重新环 化
· 防止质粒与目的 基因反向连接
· 防止目的基因自 身环化
【思考2】如何防止目的基因和质粒的自身环化以及目的基因的反
深度思考
自的基因(4 AGR
G
SA
向连接
山
表达载体
表达载体
复制 原点
8g/n
EcoR I
EcoR I
复制 原点
BglII
oe
A6
点拨提升2
①载体与表达载体的区别：
二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。
表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构。
②工具酶： 限制酶、 DNA连接酶
两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键。
③启动子、终止子对于目的基因表达必不可少。
④目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。
游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解，就算可以进行转录并翻译成蛋 白 质 ，游离的DNA 片段也无法随着细胞分裂而进行复制，导致子代细胞中不再含有 目的基因。若将目的基因插入载体，由于载体可以在细胞内复制，随着细胞分裂， 载体会带着目的基因存在于每个子代细胞中 。这 样 ，基因工程才有意义。
点拨提升3:重组载体的筛选
载体上的 一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵
抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性 基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素 的培养基上，能够生存的是被导入了载体的受体细胞。
肠 杆 菌 1 : 未 吸 收
肠 杆 菌 2 : 吸 收 了
肠 杆 菌 3 : 吸 收 了
限 n 是 的 因am2
卤 方向
启 子 眼 终止上
质 粒
复 制原 点
未导入
广 粒
拟 核DNA
大 肠 杆 菌 1
图 2
复 原 点
晶命覆I
螺
拟 核DN
大 肠 杆 菌 2
亚 组 质 粒 子 入 大 肠 杆 首
任 何 质 粒 。
重 组 质 粒 。
空 质 粒 。
目 的 越 因
双 n 切 t 切
目 的 基 因
重
制 原
窟
行 饰 选
组 质 粒
点
检
拟 核DN 大 肠 杆 菌 3
眼 制n2
双 的 切
切 吉 粒 压 粒
露
并 进
标记基因
制n的1
大 大 天
4 . 2 0
)
)
)
1
2
3
(
(
(
子
菌
宣
我 们 需 要 的 是 大 肠 杆 菌 2 , 那 么 如 何 将 大 肠 杆 菌 1 和 大 肠 杆 菌 3 淘 汰 掉
首 先 ， 我 们 要 把 大 肠 杆 菌 1 和 大 肠 杆 菌 2 以 及 大 肠 杆 菌 3 进 行 区 分 。 这 个 很 简 单 的 ，
因 为 我 们 的 质粒 上携 带 有 标 记 基 因 ， 如 图 2 4 . 2 0 中 所 示 的 氨 苄 青 霉 素 的 抗 性 基 因 AmpR。 这
个 基 因 的 存 在 ， 就 可 以 赋 予 它 的 宿 主 细 胞 一 种 能 够 多 抵 抗 氨 苄 青 霉 素 的 能 力 ， 即 能 够 在 含 有
苄 青 霉 素 的 培 养 基 上 生 长 的 能 力 。 所 以 我 们 可 以 把 得 到 的 全 部 大 肠 杆 菌 稀 释 涂 布 在 含 有 p 的 选 择 培 养 基 上 ， 大 肠 杆 菌 1 无 法 生 长 ， 生 长 出 来 的 菌 落 不 是大 肠杆 菌 2 就 是 大 肠
* 菌 3 。
我们的目的基因一定要插入LacZ 基因的内部，即由于目的基因的插入，要将LacZ 基 因破坏掉。这样，我们只需要将得到的大肠杆菌涂布在含有氨苄青霉素以及X-gal 的培养 基上：
① 大肠杆菌1被氨苄青霉素杀死了；
② 大肠杆菌2由于LacZ 基因已经被破坏了，所以无法降解X-gal, 形成白色的菌落；
③ 大肠杆菌3由于没有目的基因插入， LacZ 基因可以表达，所以可以降解X-gal, 形成蓝色的菌落，如图24.21所示。
的基因插入其中一个标记基因的内部，如Te 基因的内部。由于目的基因的插入，导致
Te 基因被破坏了，也就不再能够赋予宿主细胞抗四环素的能力了。所以现在的情况是：
① 大肠杆菌1既不能抗氨苄青霉素，也不能抗四环素；
② 大肠杆菌2只能抗氨苄青霉素；
③ 大肠杆菌3既能抗氨苄青霉素，也能抗四环素。
所以我们可以把得到的大肠杆菌涂布在含有氨苄青霉素的培养基上，大肠杆菌1无法
生长，得到的菌落是大肠杆菌2或大肠杆菌3。然后我们把这些菌落原位转印到含有四环 素的培养基上，有些菌落可以生长(大肠杆菌3),有些菌落无法生长(大肠杆菌2)。我们 需要的就是在氨苄青霉素的培养基上可以生长而在四环素的培养基上无法生长的那些大肠 杆菌。
(2)蓝白斑筛选法：这种方法是目前实验至经常使用的方法，原理说起来有点麻烦，但 操作很简单。我们选用的质粒，除了有Amp 外，还有一个LacZ 基因。LacZ 基因编码的 β-半乳糖苷酶，该酶可以将X-gal 降解为X 和gal 。X-gal 就是5-溴-4-氯-3-吲哚- β-D- 吡喃半乳糖苷。X-gal 本身无色，被β-半乳糖苷酶水解得到5-溴-4氯-3-羟基-吲哚和 半乳糖。5-溴-4-氯-3-羟基-吲哚本身无色，但在空气中会自发二聚并氧化为5,5'-二溴-4,4'- 二氯靛染料，是一种不溶的深蓝色产物。半乳糖本身无色。
蓝色菌落舍掉，白色菌落有的是需要
的菌落，有的并不是所需菌落，所以
后续一般还需要PCR等方式确认。
其次，如何区分大肠杆菌2和大肠杆菌3的问题。我们常用的做法有两种：双抗筛选
法和蓝白斑筛选法。
(1)双抗筛选法：这种方法是传统的方法，其原理很简单，操作稍麻烦。我们选用的质 应，除了有Am 外，还有一个抗生素的抗性基因，如四环素的抗性基因TeP 。将我们的
学以致用2
1.如图是利用基因工程技术培育转基因植物，生产可食用疫苗 的部分过程示意图，其中PstI 、SmaI 、EcoR I 、Apal 为四种 限制酶。下列说法错误的是( C )
A. 图示对质粒和目的基因切割用到了两种限制酶
B.抗卡那霉素基因的存在有利于将含有抗原基因的细胞筛选出来
C. 构建基因表达载体时需要用到限制酶Sma l
D . 除图示组成外，表达载体中还应该含有启动子和终止子等结构
PstI SmaI EcoRI
含抗原基
因的DNA
PstI
霉 质粒
ApaI
RI
aI
co
m
E
S
素基因
抗卡那
抗原基因
表达 载体
第三步：将目的基因(重组质粒)导入受体细胞
探究要求： 合作交流
思考有关转化的相关问题，小组合作交流，派代表展示成果，时间3min。
1.转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳 定 和表达_的过程
将目的基因导入 农杆菌转化法(最多)
植物细胞
花粉管通道法
2.方 法 ：将目的基因导入
将 入 ——感受态细胞 (Ca+处理)
微生物细胞
目的基因导
动物细胞 ——显微注射法
使用Ca +处理可使细胞处于一种能吸收周围环境中
DNA分子的生理状态。 (感受态细胞)
◆ 过 程
微生物作为受体细胞的优点：
繁殖快，单细胞，遗传物质相对较少 ，易于培养操作
Ca +转化法(导入微生物)
表达载体与感受 态细胞混合
感受态细胞吸 收DNA分子
Ca +处 理 细胞
感受态 细胞
为什么常选用受精卵作为受体细胞呢
取受精卵 显微注射 胚胎移植
①体积大，易操作。
②全能性高，易培养
成完整个体。
操作程序：
提纯基因表达载体
显微注射法(导入动物细胞)
病毒介导法(主要用于导入动物细胞)
科学家也用病毒DNA与目的基因一起构建的载体，去感染受体动物
细胞，也能使目的基因导入动物细胞内。 如用腺病毒载体，搭载新冠 病毒S基因，进入人体内，使人体产生对S蛋白的免疫记忆。
二 三 Adenoines Hest cels
△ 日 △m
Htecu na Wl Veoo1
腺 病 毒 包 装 腺 病 毒 感 染 细 胞
10 dsy
o
会
Ncalntegrabao
ct bat ce
以 《
①用微量注射器将含目的基因的 DNA溶液直接注入子房中 ；
②在植物授粉后一定时间内， 剪去柱 头， 将DNA溶液滴在花柱切面，使目 的基因通过花粉管通道进入胚囊。
花粉管通道法(我国独创)
适用生物：开花植物
农杆菌细胞内含有的Ti质粒上的T-DNA 可转 移至受体细胞，并且将其整合到该受体细胞染 色体 DNA 上
将目的基因插入
染色体的DNA 中
表现出新性 植物组织培养 状的植株
两次转化
转入
农杆菌
T-DNA
构建基因 表达载体
(Ti质 粒)
目的基因
农杆菌转化法
导入 植物 细 胞 、
两次拼接
重组
Ti质粒
知识小结：受体细胞的选择
①转基因植物用 体细胞(叶、芽、根)或受精卵
②转基因动物用 受精卵 (一般不能用体细胞); 原因是：受精卵有发育的全能性 。
③微生物常用大肠杆菌、酵母菌 等。微生物作为受体细胞的优点 是_繁殖快，单细胞，遗传物质相对较少，易于培养操作 _。
④要合成糖蛋白、有生物活性的分泌蛋白等则受体细胞为真核细胞 原因是_ 分泌蛋白等需内质网、高尔基体等的加于
⑤一定不能用哺乳动物成熟的红细胞，
原因是 _ 无核，无器，不能合成蛋白质 O
细胞种类 植物细胞 动物细胞
微生物细胞
常用 方法 农杆菌转化法、 基因枪法、花 粉管通道法 显微注射 技术
Ca +处理法
受体细胞 体细胞或受 受精卵
原核细胞
转 化 过 程 精卵 以农杆菌转化 法为例： 将 目 的 基 因 插 入 T i 质 粒 的 T - D N A 上 → 农 杆 菌 → 导 入 植 物 细 胞 → 整 合 到 受 体 细 胞 的 D N A 上→表达 将含有目的基 因的表达载体 提纯→取受精 卵→显微注射 →受精卵发育 →获得具有新 性状的动物
Ca +处理细胞 →
感受态细胞→重
组表达载体与感
受态细胞混合→
感受态细胞吸收
DNA分子
基因枪技术：
又被称为生物弹道技术 或微粒轰击技术，是用火 药爆炸或者高压气体加 速将包裹了DNA的球状金 粉或者钨粉颗粒直接送 入完整的组织或者细胞 中的一种技术。它是基 因转移技术中的一种方 法。
其基本原理就是采用一 种微粒加速装置，使裹着 外源基因的微米级的金 或钨(它们比重大，而且 化学性质都很稳定)颗粒 获得足够的动量打入靶 细胞或组织。
点拨提升4
目的基因导入受体细胞
1.在将目的基因导入受体细胞的相关操作中，叙述正确的是( C )
A.导入植物细胞时均采用农杆菌转化法
B.转基因动物的获得多数运用基因枪法
C.大肠杆菌作为受体细胞时通常需要使用Ca + 处理
D.导入目的基因的动物受精卵在培养液中发育成转基因动物
学以致用3
定
2.是否可以确定目的基因一定能够进行表达
3.是否可以确定得到了新的性状
不一定!
按前面三个步骤进行了操作，
1.是否可以确定目的基因进入了受体细胞并能维持稳
如何判断
类型 检测内容 方法
结果显示
分子水 平检测 目的基因是否插入 受体细胞染色体的 D N A 上 DNA分子杂交技术 (DNA和DNA之间)
是否显示出杂 交带(分子探
杂交后显
是否转录出mRNA 分子杂交技术 (DNA和mRNA之间)
同上(分子探 杂交后显
是否翻译出蛋白质 抗原一抗体杂交
同上
个体水 平鉴定 包括抗虫或抗病的接种实验，以确定是否有抗性以及抗 性程度；基因工程产品与天然产品进行活性比较，以确 定功能是否相同等
第四步：目的基因的检测与鉴定
翻译
蛋白质 个 体
目的基因 转录 是否插入 |
针与DNA 示出来)
针与mRNA 示出来)
mRNA
知识拓展：基因探针
(1)定义：
是一段带有检测标记 (荧光或同位素标记),且顺序已知的，与目 的基因能互补的核酸序列 (DNA 或RNA)。
(2)特点：
①应是单链，若为双链，必须先行变性处理成单链。
②应带有容易被检测的标记。它可以包括整个基因，也可以仅仅是 基因的一部分；可以是DNA本身，也可以是由之转而来的RNA。
(3)核酸杂交： 互补的两条核酸单链通过复性形成双链的过程。
可以用于检测目的基因：将待测DNA与目的基因探针混合，
如果发生了核酸杂交，则说明有目的基因。
1.制作出与目的基因序列相同的有同位素标记的DNA片 段 (基因探针), 并 用PCR 扩 增 ；
2. 提取受体细胞全部DNA并用PCR扩增，与基因探针置于同一培养液；
3.高温变性处理，使之全部变为单链，观察是否出现杂交DNA片段。
第四步：目的基因的检测与鉴定
方法1: PCR扩增
方法2: DNA分子杂交技术
基本思路：
原理： DNA半保留复制
原理： 碱基互补配对
①.检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因
②.检测目的基因是否转录出了mRNA
方法：PCR扩增或DNA分子杂交技术
基本思路：
1. 制作出与目的基因序列相同的有同位素标记的DNA(cDNA)片 段 (基因探针), 并用PCR扩增；
2. 提取受体细胞全部RNA, 直接与基因探针置于同一培养液；
3.高温变性处理，使之全部变为单链，观察是否出现分子杂交片段
第四步：目的基因的检测与鉴定
第四步：目的基因的检测与鉴定
方法：抗原-抗体杂交技术
苏云金杆菌
o
O
原理：抗原抗体的特异性结合
标记抗体
③.检测目的基因是否翻译成蛋白质
抗原
提取蛋白
电泳分离
转基因生物
Bt抗虫蛋白
二 二
杂交
提取
DNA分子 限制酶切 ① 琼脂糖凝- 胶电泳 硝酸纤- 维素膜 ⑦ 放射 自显影 DNA 片段
②电泳
③↓变性
④↓转膜
⑤ 加入特异 V性探针
⑥| 洗膜
SDS- 聚丙烯- 酰胺凝胶电泳 硝酸纤- 维素膜 ⑤放射 自显影 ①电泳
② 转膜
③、加入标记
④|洗膜
琼脂糖凝- 胶电泳 硝酸纤— 维素膜 ⑤放 射 自显影 ①电 泳
② 转膜
③ 加入特异 V性探针
④| 洗膜
点拨提升四
抗原一抗体杂交
各种蛋白质
分子杂交
各种RNA
DNA分子杂交
V的抗体
类型 检测内容
方法
个体生物学 个体是否具有相应性状
抗虫、抗病的接种实验
水平的鉴定 或产物是否具有功能活性
产品功能活性比较
第四步：目的基因的检测与鉴定
2.个体水平的检测
虫没有死
没有表达
虫被杀死
目的基因表达
没有抗虫基 因的棉植株
有抗虫基因 的棉植株
实例：如何鉴定转基因抗虫棉是否培育成功
接种
棉铃虫
非转基因
转Bt基因
转基因生物 鉴定方法
成功标志
抗虫植物 饲喂害虫(抗虫接种实验)
害虫死亡
抗病毒(菌)植物 病毒(菌)接种实验
未染病
抗盐碱植物 一定浓度的盐水浇灌
正常生长
抗除草剂植物 喷洒除草剂
正常生长
获取目的基因产物 的转基因生物 提取细胞产物与天然产 品进行功能活性比较
功能、活性 正常
个体生物学水平的鉴定具体方法举例
阶段 I 阶 段 Ⅱ →
A. 阶段 I、Ⅱ 应用的技术分别是重组DNA技术、植物组织培养技术
B. 对耐盐基因表达产物的检测可采用抗原抗体杂交技术
C. 可用抗生素抗性基因作为探针来检测受体细胞中是否导入了目的基因
D. 可用PCR检测受体细胞中的耐盐基因是否转录出mRNA
1.如图为科学家利用耐盐碱植物中的耐盐基因培育耐盐水稻
新品系的过程。下列相关说法错误的是( C )
抗生素抗性基因
水稻 细胞
C
耐盐基因
b
学以致用4
耐盐基因
d
a
筛选合适的目的基因
利 用PCR技术扩增目的基因
组成：启动子、目的基因、 终止子、标记基因等
构建：限制酶切割、 DNA 连接酶连接
植物细胞：花粉管通道法、
农杆菌转化法
动物细胞：显微注射法
原核生物细胞： Ca +处理法等
目的基因的
筛选与获取「
基因表达载
体的构建
基因工
程的基
本操作
程序
将目的基因导 入受体细胞
分子水平的检测
个体生物学水平的鉴定
整体建构
DNA
片段 的扩 增及 电泳 鉴定
目的基因的 检测与鉴定

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