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四 mmngm
第一章发酵工程
第2节 微生物的培养技术及应用
人教版 ·选择性必修3
问题探究
纯培养
配制培养基
灭菌
具
接种
几
分离
具
培养
自然界中微生物数量繁多，种类庞杂，要想从中
分离出需要的特定微生物并不容易，尤其当要分离的
微生物在混合的菌群中不是优势种群时，仅通过一般 的平板划线法或稀释涂布平板法很难实现。该怎么办
由单一个体繁殖
所获得的微生物 群体 。
> 如何从自然界中分离出需要的特定微生物
纯培养物
聚合酶链式反应(PCR) 是一种在体外扩增DNA 片段的技术，
此项技术要求使用耐高温的DNA 聚合酶。1973年，科学家布鲁克 从美国黄石国家公园的热泉中筛选出水生栖热菌(Taq 细 菌 ) , 进 而提取出耐高温的DNA 聚合酶(Taq 酶 ) 。这种酶目前已被广泛用 于聚合酶链式反应(PCR)。
> 讨论：
1.筛选水生栖热菌的思路是什么样的
耐高温的酶寻我→ 耐高温生物体 寻找 高温环境(热泉、火山口)
2.为什么水生栖热菌能从热泉中筛选出来呢
这是因为水生栖热菌能在70-80℃的高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。
问题探究
美国黄石公园
启示：寻找目的菌种时要根据它对 生存环境 的要求，到相应的环境中去寻找。
1.在被石油污染的土壤中可以筛选_分解石油 微生物。
2.在冰川冻土层可以筛选 耐 寒 微生物。
3.以纤维素为唯一碳源培养基_ 纤维素分解菌 o
实验室筛选微生物原理：人为提供有利于目的菌生长的条件(包括营养、温度和
pH) 等，同时抑制或阻止其他微生物生长。 选择培养基应运而生。
一、选择培养基
(1) 原 理 ：人为提供有利于目的菌生长的条件(包括营养、温度和pH 等),同时抑制或阻止其他微 生物的生长。
( 2 ) 概 念 ：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长 的培养基，称为选择培养基。
( 3 ) 实 例 ：
> 70~80℃的高温 —→ 分离耐热菌 改变培养条件
> 不加碳源的培养基 — → 分离出自养微生物
营养缺陷
> 不加氮源的培养基 —→ 分离固氮微生物
> 加青霉素的培养基 — → 分离真菌(青霉素能杀死细菌、放线菌) 添加某种化
学物质
> 加高浓度食盐 — → 分离金黄色葡萄球菌
> 加石油为唯一碳源 — → 分离出分解石油的分解菌 特殊碳、氮源
一、选择培养基
培养基 培养基+氨苄青霉素
培养基中加氨苄青霉素
没有抗氨苄青霉素
能力的菌落被淘汰 具有抗氨苄
青霉素能力 的细菌
问题：怎么证明一个选择培养基具有选择性呢
选择培养基 怎样选择出抗氨苄青霉素能力的细菌
一、选择培养基
没有氨苄 青霉素抗
性的细菌 能够生长
思考讨论： 怎么证明一个选择培养基具有选择性呢
应该设置基础培养基(如牛肉膏蛋白胨培养基)或完全培养基作为对照，若
基础培养基或完全培养基中生长的菌落数菌多于该选择培养基，则该选择培养基 具有选择性。
基础培养基 选择培养基
问题：如果让你配制一种培养基，让土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出
来，培养基的配方该如何设计
一、选择培养基
> 思考 · 讨论：选择培养基配方的设计
尿素[CO(NH ) ] 含氮量高，化学性质相对稳定，是现代农业生产中 一种重要的氮肥。尿素施入土壤后，会被土壤中的某些细菌分解成NH ,
NH 再转化成NO 、NH + 等被植物吸收。而这些细菌之所以能分解尿素， 是因为它们能合成脲酶 ，脲酶催化尿素分解产生NH ,NH 可作为细菌生 长的氮源。
> 怎样才能将分解尿素的细菌从土壤中分离出来 尿 素
设计一种选择培养基，用尿素作为唯一氮源，可以将分解尿素的细菌分离出来。
> 该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点
这种培养基与普通培养基相比，只是用尿素作为唯一氮源，培养基的其他营养成分基本相同。
一、选择培养基
尿素的立体结构
1.从物理性质来讲，两者属于固体培养基，判断 依据是添加了凝固剂琼脂 ;该类培养基的主要 用途为分离、鉴定、计数、保存。
2.从用途上来讲， 培养基二 属于选择培养基， 目的是为了获得 能分解尿素的微生物
3.两种培养基共有的培养基成分有：
碳源、氮源、无机盐、水。
培养基一的主要碳源为 牛肉膏，主要氮源为 蛋白胨 .
培养基二的碳源为 葡萄糖 ，氮源为 尿素 。
KH PO
1.4g
NaH PO
2.1g
MgSO ·7H O
0.2g
葡萄糖
10.0g
尿素CO(NH )
1.0g
琼脂
15.0g
蒸馏水
定容到1000ml
牛肉膏
5.0g
蛋白胨
10.0g
NaCl
5.0g
琼脂
20.0g
蒸馏水
定容到1000ml
巩固练习
培养基二
培养基一
> 稀释涂布平板法：
将菌液进行一系列梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分
别涂布到固体培养基的表面，进行培养。在稀释度足够高的菌 液里，聚集在一起的微生物被分散成单个细胞，从而能在培养 基表面形成单个菌落。
选择培养基 + 稀释涂布平板 单菌落
如果想知道1g土壤中有多少能分解尿素的细菌，需要解决哪2个问题
① 选择培养：获得能分解尿素的细菌的纯培养物。
② 计数：土壤菌液进行充分稀释及科学的微生物数量测定方法—稀释涂布平板法。
二、微生物的选择培养
1mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL
1×10 1×103 1×104 1×105 1×106 1×107
1×10
2、稀释涂布平板操作过程
第 1 步 ： 取 样 并 稀 释 1 0 倍 ② 将10g 土样加入盛有
90mL 无菌水的锥形 瓶，充分摇匀。
第 2 步：系列梯度稀释
3 取 1mL上清液加入盛有 9mL 无菌水的试管中， 依次等比稀释。
二、微生物的选择培养
① 铲取土样，将样品
装入纸袋中。
取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都
90 mL的无菌水
9mL 无 菌 水
需要灭菌。
10g
6 将涂布器放在火焰上灼 烧，
待酒精燃尽、 涂布器冷却 后，再进行涂布。
不要将过热的涂布器放在盛有酒精
的烧杯中，以免引燃其中的酒精。
9mL 无菌水
用涂布器将菌液均匀地涂布在
培养基表面。涂布时可转动培 养皿，使涂布均匀。
2、稀释涂布平板操作过程
第3 步：涂布平板
二、微生物的选择培养
涂布结束后，要将涂布器灼烧灭菌。
⑤ :将涂布器浸入再盛 有酒 精的烧杯中
取出时，要让多余的 酒精在烧杯中滴尽。
④ 取0 . 1mL 菌 液 ，
滴加到培养基表面
X0 区0 区 区m 区 0 区 0
1mL 1mL 1mL
1mL 1mL
1mL
耳
1×10
3、微生物培养
○待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30~37℃ 的恒温培养箱中培
养1~2d 。 注意事项：涂布结束后，应将一个未接种的培养基和已接种
的培养基放在一起培养，以检测培养基是否灭菌彻底。
○ 在涂有合适浓度菌液的平板上就可以观察到分离的单菌落。
二、微生物的选择培养
稀释106倍
稀释105倍
稀释104倍
空白对照
恒温培养箱
当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样
品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测除样品
恰当的稀释度、涂布是否均匀是成功统计菌落数目的关键。
减少实验误差，保证实验结果更准确
的平板进行计数。
中大约含有多少活菌。
一般选择菌落数在30~300
因为当两个或多个细胞连在一起，平板 上观察到的只是一个菌落。
缺 点 统计的菌落数往往比活菌的实际数目低 。
同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后取其平均值。
三、微生物的数量测定
因此，统计结果一般用 菌落数而不用活菌数来表示。
4、稀释涂布平板计数法计数( 间 接 计 数 )
原 理
原 则
> 思考：平板划线法能否达到对细菌进行计数的目的 为什么
不能，平板划线法最开始的划线
很可能菌类会长成一片，导致无
法计数，此外灼烧接种环的时候
也会杀死一部分菌类。
二、微生物的选择培养
方法 平板划线法
稀释涂布平板法
纯化原理 连续划线
梯度稀释→涂布平板
接种工具 接种环
涂布器
单菌落的获得 从最后划线区挑取
稀释度合适的整个平板上都可找
到单菌落
用途 分离纯化菌种， 获得单菌落
①分离纯化菌种，获得单菌落
②用于计数
效果图
相同点 ①都能分离纯化菌种；②都在固体培养基上进行
二、微生物的选择培养
平板划线法与稀释涂布平板法的比较
5、显微镜直接计数(直接计数)
原 理 利用特定的 细菌计数板 或 血细胞计数板 , 在显微镜下观察、计
数，然后再计算一定体积的样品中微生物的数量。
○细菌计数板 — 较薄，对细菌等较小的细胞进行观察和计数。
○血细胞计数板 — 较厚，用于相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数。 优 点 快速、直观、设备简单；能观察微生物的形态特征。
也可选择用台盼蓝染色法来区分活菌和死菌。
三、微生物的数量测定
缺 点 ①不能区分死菌和活菌，统计结果会偏大
②不适于运动的和个体小的细菌
量制滤字 02270113號
QIUJING B
XB.K.25 0.10mm 1/400mm
MC
无碳培养基+油烟污染物
A.图中①~③的过程为梯度稀释
B.在培养基中加入油烟污染物，其作用是为微生物提供碳源和能源
C.④使用的是固体培养基，需加入琼脂作为微生物生长繁殖的营养物质
D.过程④可采用稀释涂布平板法或平板划线法分离菌种并进行计数
土壤样品
培 养 培养
I Ⅱ
① ② ③
1.油烟污染由多种有害物质组成，不易降解。某同学从长期受到油烟污染的环
境中分离出油烟降解菌，其筛选分离过程如图所示。下列叙述正确的是(B)
培 养
④ ⑤
巩固提高
④
选取
①, ② 固体 ⑤ _ ⑥-
B.过程②可采用平板划线法接种
C.过程③应选择黄色菌株进行富集培养
D.培养基中添加β-紫罗酮起选择作用
平③液体培养
接种
2. (2022 ·黑龙江鸡西高二期末)如图为选育高产β-胡萝卜素的布拉霉菌的过程。
随β-胡萝卜素含量增加，菌体颜色从黄色加深至橙红色。未突变菌不能在含有 β-紫罗酮的培养基上生长。下列有关叙述错误的是(C)
A.过程①属于诱变育种 板培养
接种
紫外线照射
巩固提高
胡萝 卜素 的鉴 定
1.实验目的：(1)从土壤中分离出能够分解尿素的细菌
(2)统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌
2.实验原理： 绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才 能分解尿素。利用以尿素作唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中 分离出分解尿素的细菌。
常见的分解尿素的微生物：芽孢杆菌、小球菌、棒状杆菌等细菌，某些真菌和
放线菌也能分解尿素。
四、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
脲酶
2NH +CO
CONH ) +H O
3.实 验 设 计 ：
(1)土壤取样
细菌宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长，绝大部分分布在距地表3~8 cm 的土
(2)制备培养基
①选择培养基：以尿素为唯一氮源。
②牛肉膏蛋白胨培养基：
作为对照组，来判断选择培养基是否具有选择作用。
葡萄糖
10.0g
尿素
1.0g
KH PO
1.4g
Na HPO
2.1g
MgSO ·7H O
0.2g
琼脂
15.0g
蒸馏水
1000ml
四、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。操作 完成后，一定要洗手。
壤层。铲去表层土3cm 左右，取样，将样品装入事先准备好的信封中。
注意
300 之间，适于计数的平板。
1mL 1mL 1mL 1mL 1mL
102 10 104 105 106 107 10
立
10g 土样 0 L水
1 10 10
2 ⑩ 106 3 10 109
⑩ 10
A组 B组 C组
(3)样品的稀释与稀释涂布平板法接种
不同微生物在土壤中含量不同，分离不同的微生物采用不同的稀释度，以保证获得菌落数在30~
选择培养基(平行重复)
牛肉膏蛋白胨培养基(用以判断选择 培养基是否具有选择作用)。
在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，怎样做才能保证
从中选择出菌落数在30~300的平板进行计数 预实验
测细菌数：一般用104 、10 、106 稀释液
测放线菌：一般用10 、10 、105 稀释液
测真菌数：一般用102 、10 、104 稀释液
四、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
选择一个比较宽的范围，将1×10 ~1×107倍稀 释的稀释液分别涂布到平板上培养，以保证能从 中选择出菌落数在30~300的平板进行计数。
9mL 无菌水
107
107
107
(4)微生物的培养与观察
① 培养条件：不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。
(细菌一般在30-37℃的温度下培养1-2d)
② 观察：每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。以防止 因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。
稀释度 10 10 106 107 1 2 3 平均值 1 2 3 平均值 1 2 3 平均值 1 2 3
平均值
菌落数/ 平板
四、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
思考：得到的菌落一定是分解尿素的细菌吗 不一定，还需要进一步的鉴定。
在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PH 升 高 ，
指示剂将变 红，说明该细菌能够分解尿素。
①液体培养基可以直接看液体的变色情况；
②固体培养基上可以观察菌落周围是否出现红色环带，红色环 带直径与菌落直径比值越大，说 明分解能力越强。
资料：细菌合成的脲酶将尿素分解为NH , NH 会使培养基的碱性增强，pH 升高，因此可以通过 检测培养基pH 的变化来判断是否发生了该化学反应，进而判断该菌是否为尿素分解细菌。
四、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
pH 升高，酚红指示剂变红
4.进一步探究
脲酶 cO +2NH
CO(NH ) +H O
在培养基中加入某种指示剂或化学药品(不影响微生
物正常生长),使微生物的某种代谢产物与培养基中的特 定指示剂或化学药品发生反应。从而达到鉴定的作用。
> 几种常用的鉴别培养基
拓展应用
大肠杆菌菌落呈现深紫色
伊红—美蓝培养基鉴别大肠杆菌
鉴别培养基：
伊红—亚甲蓝琼脂培养基
念珠菌群显色培养基
尿路菌群显色培养基
淀粉培养基
普通培养基上所有菌种
都能生长
选择培养基上部分菌种
才能生长
目的菌周围出现特殊现象
非目的菌周围无明显现象
混合样品
目的菌
非目的菌
> 培养基按用途分
选择培养基
拓展应用
鉴别培养基
纤维素分解菌的筛选
纤维素其中40%~60%能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为
它们能够产生纤维素酶。已知刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这 样的多糖物质形成红色复合物，但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等 发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红 与纤维素形成红色复合物；而当纤维素被纤维素分解菌分解后，复合物 就无法形成，培养基中会出现以这些菌为中心的透明圈(如图所示)。
(1)筛选纤维素分解菌的方法 刚果红染色法 。该方法可以通过颜色 反应直接筛选。
(2)菌落周围 有(有/没有)透明圈，说明是纤维素分解菌。
几种纤维素分解菌在刚果红 培养基上形成的透明圈
拓展应用
下列有关本实验的叙述，错误的是( C )
A.培养基除淀粉外还含有氮源等其他营养物质
B. 筛选分解淀粉的细菌时，菌液应稀释后涂布
C.以上两种细菌均不能将淀粉酶分泌至细胞外 D.H/C 值反映了两种细菌分解淀粉能力的差异
菌种 菌落直径： C(mm) 透明圈直径： H(mm)
H/C
细菌I 5.1 11.2
2.2
细菌Ⅱ 8.1 13.0
1.6
1.筛选淀粉分解菌需使用以淀粉为唯一碳源的培养基。接种培养后，若细菌能分解
淀粉，培养平板经碘液处理，会出现以菌落为中心的透明圈(如图),实验结果见下表。
巩固提高
透明圈
1. (2021 · 襄阳五中调研)下列关于“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”实
验操作的叙述，错误的是( B )
A.利用稀释涂布平板法准确估计菌落数目的关键是有恰当的稀释度
B.若要判断选择培养基是否起到了选择作用需要设置未接种的牛肉膏蛋白胨 培养基作为对照
C.该实验应采用稀释涂布平板法
D.用以尿素为唯一氮源且添加了酸碱缓冲剂的培养基来培养该细菌后不会使 酚红指示剂变红
巩固提高
2. (2021 · 山东淄博月考)下列关于土壤中分解尿素的细菌的分离与计数的叙述.正确的是( A )
A.只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素
B.统计样品中的活菌数目一般用平板划线法
C.筛选分解尿素的细菌时，应以尿素作为培养基中唯一的营养物质
D.在以尿素为唯 一 氮源的培养基中加入酚红指示剂，若指示剂变蓝，则表明筛选到了分解 尿 素 的 细 菌
3.(2 021 · 四川绵阳期末)某同学将1 mL土壤样液稀释100倍，在3个平板上用稀释涂布平板法分别接入
0.1 mL稀释液，经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为56、57和58。下列叙述错误的是( D )
A.可得出土壤样液中活菌大约为5.7×107个/L
B.此方法统计的菌落数往往比实际的活菌数目低
C.一般选择菌落数为30~300的平板进行计数
D.显微镜直接计数法统计的是稀释液中的活菌数
巩 固 提 高
【概念检测】
1.研究人员用无机盐、琼脂和石油配制的培养基从被石油污染的土壤中筛选出了一种
石油降解菌。判断下列相关表述是否正确。
(1)这种培养基是一种选择培养基。( √ )
(2)利用这种石油降解菌可以降解石油，修复土壤。( √ )
(3)相对于未被污染的土壤，从被石油污染的土壤中更容易分离到石油降解菌 ( √ )
2.用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数时，通过统计平板上的菌落数就能
推测出样品中的活菌数，原因是( D )
A. 菌落中的细菌数目是恒定的
B.平板上的一个菌落就是一个细菌
C. 通过此方法统计的菌落数与活菌的实际数目相同
D. 平板上的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌
练习与应用
选择培养基的作用
微生物选择培养获取纯培养物的方法——稀释涂布平板法
稀释涂布平板法的操作过程
间接计数法—稀释涂布平板法
直接计数—计数板计数法
科学实例
选择培养基 筛选原则
选择培养基的概念及举例
①土壤取样
②样品的稀释
③稀释涂布平板法接种
④微生物的培养与观察
微生物的选择培养
微生物的数量测定
培养基的制备
实验设计
实验结果
土壤中分解尿素的细菌 的分离与计数
微生物的选择培养和计数
课堂小结

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