资源简介

(共30张PPT)
3.2 基因工程的基本操作程序
DNA合成仪
显微注射技术
1.酶切
同种限制酶
防止倒连、自连→两端选择两种限制酶
防止切断目的基因等→载体和目的基因选同尾酶
注意：限制酶特性
二、构建基因表达载体
（1）限制酶的识别序列
限制酶所识别序列的特点是：呈现碱基互补对称，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的 ，称为回文序列
在切割部位，一条链正向读的碱基顺序与另一条链反向读的顺序完全一致。
能被限制性内切酶特异性识别的切割部位都具有回文序列：
DNA连接酶
2.连接
①PCR法（注意引物的设计）
②双抗生素抗性基因鉴定
③测序法
3.鉴定
质粒的多克隆位点整合在lacZ基因中，在多克隆位点插入外源目的基因，破坏了lacZ基因的结构，大肠杆菌形成白色的克隆。
否则形成蓝色克隆。
典型例题
三、将目的基因导入受体细胞
1.将目的基因导入植物细胞
（1）农杆菌转化法
①特点：
Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。
易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力。
Ti质粒
目的基因
构建
表达载体
导入
植物细胞
插入
植物细胞染色DNA
表达
新性状
转入
农杆菌
②转化过程:
具有趋化性（酚）
注意：大多基因表达载体在受体细胞内是独立存在的！
两次拼接：第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上；第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上。
两次导入：第一次导入是将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌；第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA导入受体细胞。
将目的基因导入到植物细胞中方法------ 农杆菌转化法
（2）花粉管通道法
用微量注射器将含有目的基因的DNA溶液直接注入子房中
在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。
2.将目的基因导入动物细胞
方法：显微注射法
提纯含目的基因表达载体
受精卵
显微注射
移植到输卵管或子宫
受精卵发育
新性状动物
（2）操作:
显微注射技术
3.将目的基因导入微生物细胞
（1）微生物作受体细胞原因：
（2）常用法：
Ca2+处理
常用菌：
大肠杆菌
（3）过程：
Ca2+处理大肠杆菌
感受态细胞
表达载体与感受态细胞混合
感受态细胞吸收DNA
繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少。
（感受态细胞法）
实例：利用转基因大肠杆菌生产药物
原核生物作为受体细胞产生的真核生物的蛋白质通常没有生物活性，需要在体外进行再加工。
四、目的基因的检测与鉴定
检测—
鉴定——
③检测目的基因是否翻译成蛋白质
抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
——检查是否成功
②检测目的基因是否转录出了mRNA
①检测转基因生物染色体的DNA 上是否插
入了目的基因
常用PCR技术检测DNA水平和RNA水平
用抗原抗体杂交技术检测蛋白质水平
DNA分子杂交
基因探针
待测DNA
单链DNA或RNA片段，带有某种标记，能与目标DNA或RNA的一条链发生碱基互补配对。
抗原—抗体杂交
分子杂交
（2）方法:RNA分子杂交
（3）方法:抗原—抗体杂交
鉴定——
抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。
（4）个体生物学水平鉴定
基因编辑
1.CRISPR/Cas9
①设计合适的向导序列
②将向导序列和Cas9基因构建基因表达载体
③转化
④表达并组装Cas9/gRNA复合体
⑤定点切割（敲除绝大部分外显子/敲除个别外显子，移码突变）
⑥鉴定（PCR：扩增出的条带小或者无条带/分子杂交/测序）
② Cre-lox 介导的基因组特定位点重组
1、两个loxP位点位于同一条DNA链上且方向相同，Cre重组酶敲除loxP间的序列；
2、两个loxP位点位于同一条DNA链上且方向相反，Cre重组酶诱导loxP间的序列翻转；
3、两个loxP位点位于不同的DNA链或染色体上，Cre重组酶诱导两条DNA链发生交换或染色体易位。
DNA的粗提取与鉴定
探究和实践
探究-实践
DNA的粗提取与鉴定
（一）基础知识
利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质上的差异，提取DNA，去除其他成分。
2、提取DNA分子的基本思路是什么？
1、提取大分子的基本思路是什么？
选用一定的物理、化学方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。
资料：当氯化钠的物质的量浓度为 2 mol／L时，DNA的溶解度最大
在NaCl溶液浓度低于0.14 mol/L时，DNA的溶解度随NaCl溶液浓度的增加而逐渐降低；在0.14 mol/L时，DNA溶解度最小；当NaCl溶液浓度继续增加时，DNA的溶解度又逐渐增大。
如何通过控制NaCl溶液的浓度使DNA在盐溶液中溶解或析出？
先用2mol/L NaCl溶液溶解DNA，再加入蒸馏水，使其溶液浓度从2mol/L下降到0.14 mol/L，使DNA在盐溶液中析出。
① 描述DNA在NaCl溶液中的溶解度曲线。
将DNA和蛋白质进一步分离
酒精是一种常用有机溶剂，但DNA却不能溶于酒精（特别是95％冷却酒精），但细胞中蛋白质可溶于酒精。
问：采用DNA不溶于酒精的原理，可以达到什么目的？
3、DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性
①蛋白酶—水解蛋白质，对DNA没有影响。
②高温—大多数 在60～80℃时变性沉淀,而 在80℃以上才会变性。
③洗涤剂—溶解细胞膜，
去除 ;
但对DNA没有影响。
蛋白质
DNA
脂质、蛋白质
4、DNA的鉴定
在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色，因此用二苯胺试剂鉴定DNA分子。
DNA
+
二苯胺
沸水浴
蓝色
30g洋葱加10ml研磨液充分研磨
过滤，4℃放置几分钟，取上清液（也可离心1500r/min，5min）
加入等体积预冷酒精（95%），静置2-3min
玻璃棒卷起丝状物，吸去水分（或者离心10000r/min，5min）
溶于5ml，2mol/L的NaCl中，加入4ml二苯胺试剂，沸水浴5min
方法步骤
3-4mL体积分数为95%的冷却的酒精
取5 g菜花+ 2-3mL研磨液
研钵（加研磨液充分研磨，直至出现大量泡沫）
过滤至塑料烧杯
轻轻震荡，出现白色絮状物
2cm长度香蕉，剪碎
加入10ml温水，2g食盐，5滴洗洁精，研磨
过滤
加入2g嫩肉粉，混合均匀，55-60℃水浴5-10min
冷却，加入等体积预冷酒精
静置2-3min，挑取白色絮状析出物

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