资源简介

(共32张PPT)
第1节
重组DNA技术的基本工具
第3章　基因工程
高考考点分析：
24年：T13 DNA的粗提取与鉴定
T25 ①黏性末端 ②重组载体的筛选
23年：T25 质粒适于作基因运载体的特点和条件
22年：T13 DNA的粗提取与鉴定
T25 限制酶的作用
21年：T13 DNA的粗提取与鉴定
T25 限制酶、DNA连接酶的作用
20年：T25 限制酶、DNA连接酶
学习目标
1.通过资料分析，阐明基因工程的理论基础。
2.通过模拟制作活动，阐明限制酶、DNA连接酶和载体的作用。
3.通过了解基因工程的发展历程，认同基因工程的诞生和发展离不开多个学科的理论研究和技术创新。
抗虫棉
情境视频
棉花细胞
普通棉花
(无抗虫特征)
(含抗虫基因)
棉花植株
(有抗虫特征)
基因工程
抗虫基因
提取
苏云金芽孢杆菌
(有抗虫特征)
1944年艾弗里等人通过肺炎链球菌的转化实验，不仅证明了遗传物质是DNA，还证明了DNA可以在同种生物个体间转移。
1961年尼伦伯格和马太破译了第一个编码氨基酸的密码子。截至1966年，64个密码子均被破译成功。
1970年科学家在细菌中发现了第一个限制性核酸内切酶（简称限制酶）
1972年，伯格首先在体外进行了DNA的改造，成功构建了第一个体外重组DNA分子。
1982年，第一个基因工程药物-重组人胰岛素被批准上市。基因工程药物成为世界各国研究和投资开发的热点。
1953年沃森和克里克建立了DNA双螺旋结构模型并提出了遗传物质自我复制的假说。
1967年，科学家发现，在细菌拟核DNA之外的质粒有自我复制能力，并可以在细菌细胞间转移。
20世纪70年代初，多种限制酶、DNA连接酶和逆转录酶被相继发现。这些发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。
1973年，科学家证明了质粒可以作为基因工程的载体，构建重组DNA，导入受体细胞，使外源基因在原核细胞中成功表达，并实现了物种间的基因交流。至此，基因工程正式问世。
1985年，穆里斯等人发明PCR,为获取目的基因提供了有效手段。
基因工程的建立过程
一
基因工程的概念和工具酶
一
基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做重组DNA技术。
主要在生物体外
基因（DNA）
DNA分子水平
创造出人类需要的新的生物类型和生物产品
基因重组
定向改造生物遗传特性；彻底打破种间界限
基因工程的概念
别名：
操作环境：
操作对象：
操作水平：
结果：
原理：
特点：
【归纳定义】
重组DNA技术
有性生殖中的基因重组是随机的，并且只能在同一物种间进行重组；基因工程可以实现遗传物质在不同物种间进行重组，并且方向性强，可以定向地改变生物的性状。
基因工程的理论基础
任务一
1. 为什么不同生物的DNA分子能拼接起来？
2. 为什么一种生物的基因可以在另一种生物细胞内表达？
(1)DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸。
(2)双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构。
(1)基因是控制生物性状的独立遗传单位。
(2)遗传信息的传递都遵循中心法则。
(3)生物界共用一套遗传密码。
在培育转基因抗虫棉时，既要在体外对含有所需基因的DNA分子“切割”、改造和“拼接”；又要将重组DNA分子导入棉花体内，并使其表达。DNA双螺旋的直径只有2nm，对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。
科学家究竟用到了哪些“分子工具”？这些“分子工具”各具有什么特征呢？
一
基因工程的概念和工具酶
一
EcoRI 限制酶
大肠杆菌(E.coli)的EcoRⅠ限制酶能特异性识别____________序列，并切割_____和_____之间的______________。
GAATTC
G
A
磷酸二酯键
当限制酶在它的识别序列的中心轴线两侧将DNA分子的两条链分别切开时，产生的是黏性末端。
中轴线
3
结果：
一
基因工程的概念和工具酶
一
“分子手术刀”
5'
5'
3'
3'
黏性末端
限制酶
SmaI 限制酶
SmaI 限制酶只能识别 序列，切割 和 之
间的 。
CCCGGG
C
G
磷酸二酯键
当限制酶在它的识别序列的中心轴线处切开时，产生的是平末端
中轴线
3
结果：
一
基因工程的概念和工具酶
一
“分子手术刀”
5'
5'
3'
3'
平末端
限制酶
限制性内切核酸酶(限制酶)
任务二
②推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么？
限制酶是原核生物的一种防御工具，用来切割侵入细胞的外源DNA，以保证自身安全。
思考：（1）①为什么限制酶主要从原核生物中分离纯化而来？
因为原核细胞容易受到外源DNA的入侵。
③为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？
含某种限制酶的细菌的DNA分子不具备这种限制酶的识别序列，或者被修饰（甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上），使限制酶不能将其切开。
限制性内切核酸酶(限制酶)
任务二
(1)限制酶能切开RNA分子的磷酸二酯键吗？
（2）限制性内切核酸酶的作用是否都体现了酶的专一性？
不能。
可断开2个磷酸二酯键；
产生2个游离的磷酸基团；
产生2个黏性末端；
消耗2分子水。
限制酶只能识别并切开双链DNA分子
酶的专一性
(2)请结合图示，推断限制酶切割一次可断开几个磷酸二酯键？
产生多少个游离的磷酸基团？产生几个黏性末端？消耗几分子水？
限制性内切核酸酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开，体现了酶的专一性。
限制性内切核酸酶(限制酶)
任务二
(3)上图中中间部位为“目的片段”，在切割含“目的片段”的DNA分子时，需用限制酶切割______次此DNA分子，断裂______个磷酸二酯键,产生______个末端,新出现______个游离的磷酸基团。
2
4
4
4
（4）图1和图2分别表示的是EcoRⅠ限制酶和SmaⅠ限制酶的作用示意图。
图1
图2
限制性内切核酸酶(限制酶)
任务二
①EcoR Ⅰ限制酶识别的碱基序列及切割的位点？切割产生的末端序列为？是哪类末端？
--GAATTC-- 切割位点在G和A之间 --G 粘性末端
--CTTAAG-- --CTTAA
（4）图1和图2分别表示的是EcoRⅠ限制酶和SmaⅠ限制酶的作用示意图。
图1
图2
限制性内切核酸酶(限制酶)
任务二
②SmaⅠ限制酶识别的碱基序列及切割的位点？切割产生的末端序列为？是哪类末端？
--CCCGGG-- 切割位点在G和C之间 --CCC 平末端
--GGGCCC-- --GGG
（5)观察下列限制酶的识别序列和切割位点，回答：
①写出这四种限制酶切割形成的末端。
②不同的限制酶能否切割形成相同的黏性末端？
限制性内切核酸酶(限制酶)
任务二
--G --G AGCTT-- GATCT--
--CCTAG --CTTAA A-- A--
可以 如Bam I 与 Bgl II产生的末端相同
识别DNA 分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。
限制性内切核酸酶(限制酶)
任务二
(6)若要在外源DNA片段上切割下来目的基因能否利用BamH I 为什么？
不能 因为会破坏目的基因。
将两个DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
02
一
基因工程的概念和工具酶
一
“分子缝合针”
DNA连接酶
1
作用：
两DNA片段要具有互补的黏性末端才能拼起来
可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键。
用DNA连接酶连接两个片段之间的磷酸二酯键
种类 ___________________
___________________
来源 大肠杆菌 T4噬菌体
作用 差别 E.coli DNA连接酶连接具有平末端的DNA片段的效率要远远低于 T4 DNA连接酶 E.coli DNA连接酶
T4 DNA连接酶
都能将双链DNA片段“缝合“起来，
恢复被限制酶切开的磷酸二酯键。
一
基因工程的概念和工具酶
一
“分子缝合针”
2
种类：
A A T T G
C
A
A
T
T
A
A
T
T
DNA聚合酶
DNA聚合酶
DNA聚合酶
DNA聚合酶
旁栏思考：DNA连接酶和DNA聚合酶是一回事吗？为什么？
只能将单个核苷酸连接到已有的核苷酸链上，形成磷酸二酯键
DNA聚合酶作用示意图：
一
基因工程的概念和工具酶
一
“分子缝合针”
核心归纳
与DNA相关的几种酶的比较
项目 DNA连接酶 DNA聚合酶 限制酶 解旋酶 DNA水解酶 RNA聚合酶
作用部位 形成磷酸二酯键 形成磷酸二酯键 破坏磷酸二酯键 破坏氢键 破坏磷酸二酯键 形成磷酸二酯键
作用对象 DNA片段 单个的脱氧核苷酸 DNA DNA DNA DNA
作用结果 将两个DNA片段连接成重组DNA分子 将单个的脱氧核苷酸连接到DNA单链末端 切割DNA分子形成黏性末端或平末端 将双链DNA分子局部解旋为单链 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸 将单个核糖核苷酸依次连接到单链末端
一
基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
四
质粒
将外源基因送入受体细胞。
动植物病毒
噬菌体
拟核DNA
质粒
大肠杆菌细胞
目的基因插入位点
复制原点
氨苄青霉素抗性基因
大肠杆菌及质粒结构模式图
裸露、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA外，具有自我复制能力的环状双链DNA。
1
作用：
2
种类:
真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。
载体——“分子运输车”
思考：若用家蚕作为某基因表达载体的受体细胞，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用噬菌体作为载体，其原因是什么？
噬菌体的宿主细胞是细菌，而不是家蚕。
背诵：
1、“分子手术刀”是指什么？简称？
大多数 识别的序列由几个碱基组成？少数有几个？
2、常见的两种上述物质是？切割后分别产生什么末端？
3、“分子缝合针”是指？常见的有哪两种？
连接黏性末端用？连接平末端用？为什么？
4、“分子运输车”是指？（常见3种）
质粒作为载体需具备的条件？
拟核DNA
质粒
大肠杆菌细胞
目的基因插入位点
复制原点
氨苄青霉素抗性基因
大肠杆菌及质粒结构模式图
条件 原因
能自我复制或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制
有一个至多个限制酶切割位点
具有特殊的标记基因
无毒害作用
能使目的基因稳定存在且数量可扩增
供外源DNA片段（基因）插入其中
便于重组DNA分子的筛选
对受体细胞无毒害作用，避免受体细胞受到损伤
3
载体需具备的条件:
一
基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
二
核心归纳
标记基因的筛选原理
载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了载体的受体细胞。如图所示：
思考：根据标记基因的作用，有同学认为在含有某种抗生素的培养基中筛选存活的受体细胞不一定是导入目的基因的受体细胞，这种说法是否合理？并说明理由。
这种说法合理；因为仅导入载体的和导入目的基因的受体细胞均能在该培养基中存活。
核心归纳
如何提高筛选的准确性
当质粒上有两个标记基因时，可将目的基因插入其中一个标记基因中，也就是重组质粒上只含一个标记基因，普通质粒上含有两个标记基因。则没有导入质粒的受体细胞不具有标记基因控制的性状，导入普通质粒的受体细胞具有两个标记基因控制的性状，导入重组质粒的受体细胞只具有一个标记基因控制的性状。这样可根据标记基因控制的性状准确筛选出含有重组质粒的受体细胞。
4.图(a)中的三个DNA片段上依次表示出了EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三种限制性内切酶的识别序列与切割位点，
①EcoRⅠ切割后产生的末端为__________________。BamHⅠ切割后产生的末端为
_________________。
Sau3AⅠ切割后产生的末端为__________________。
GATC--
--
②BamHⅠ和Sau3AⅠ识别的碱基序列一样吗______。这两种限制酶切割后产生的末端能否被DNA连接酶连接_______
③仅用BamHⅠ能否将目的基因切割下来_______；仅用EcoRⅠ能否将目的基因切割下来______。
④仅用Sau3AⅠ能否将目的基因切割下来_________；切割后的目的基因能否自己链接成环_____。
不一样
能
不能
不能
能
能
⑤用Sau3AⅠ和EcoRⅠ共同作用能否将目的基因切割下来____，切割后的目的基因能否自己连接成环_____。
⑥与仅用Sau3AⅠ切割目的基因相比用Sau3AⅠ和EcoRⅠ共同切割目的基因的优点是
_____________________________________________________.
⑦若仅用Sau3AⅠ切割目的基因，则应用________________________切割质粒。
⑧若用Sau3AⅠ和EcoRⅠ共同切割目的基因，则应用________________________切割质粒。
能
不能
可以防止目的基因自身成环
BamHⅠ
EcoRⅠ、BamHⅠ
练习：1.下列操作中选用哪种限制酶切割构建重组DNA分子最好？为什么？
(注：AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，neo表示新霉素抗性基因)
Hind Ⅲ和PstⅠ；
防止目的基因的自身环化；防止目的基因反向连接到载体。
2.选用下图载体将目的基因导入细菌中并将含有目的基因的细菌筛选出来
①在培养细菌的培养基中添加抗生素B，则应选择的限制酶为______
②在培养细菌的培养基中添加抗生素A，则应选择的限制酶为______
①或②
①
课堂小结

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