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第三章第一节 重组DNA 技术的基本工具
gene of
interest clone gene of interest
into T;plasmid(making it recombinant)
results in a
recombinant
plant
recombinant plant
G >C blunt ends
(b)blunt end cutting plant cell
G
cut
C G isolate plasmid
Agrobacterium tumefaciens
transform recombinant DNA back to
A.tumefaciens
T0NA
T;plasmid
infect plant cell
with A.tumefaciens
A
T
C
C
3'
C< G
C< G□
G C
5’
C< G
G
T
A
G
G
5'
cut
sticky ends
G
cut
cut
Haelll C<
C<
3'
C< G
C< G
(a)sticky end cutting
十
G
T(
A
G
T-DNA region
T;plasmid
A
T
C
C
C
>C□
A
T
C
G
A
G
G
cellular DNA
G
G
01 重组DNA技术所需的三种基本工具是什么 他们的作用分别是什么
02 基因工程载体需要具备什么条件
本节聚焦
从社会中来
木瓜是一种非常健康的热 带水果，它富含17种以上 氨基酸及钙、铁等，还含 有木瓜蛋白酶、番木瓜碱 等营养物质，具有抗氧化 功能，可以减少炎症，抗 击疾病，并帮助我们保持 机体年轻功能。
■转基因番木瓜的获得需要依赖什么工程技术 基因工程和植物组织培养技术
■什么是基因工程 DNA 双螺旋的直径仅2nm, 科学家如何操作编辑基因
DNA sequence
of inerest
DNAof
interest
操作对象 ：
Open
vecter
Vecter containing
Wecter DNA cf intereut
结 果 ：
赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品。
定向改造生物性状；克服远缘杂交不亲和障碍。
基因工程
基因工程：是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，
创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品。从技术操作层面看，由于 基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫重组DNA技术。
基因重组
基因
分子水平
操 作 水 平 ：
原 理 ：
意义 ：
基因工程理论基础
■ 为什么不同生物的DNA 分子能拼接起来
(1)DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸。
(2)双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构。
■ 为什么一种生物的基因可以在另一种生物细胞内 表达
(1)基因是控制生物性状的独立遗传单位。
(2)遗传信息的传递都遵循中心法则。
(3)生物界共用一套
剪 接 运
基因在空间上转移并
成功表达
限制性内切核酸酶 — — “分子手术刀”
◆ 来源：主要是从原核生物中分离纯化来的。 限制酶是一类酶
◆ 作用：能够①识别双链DNA 分子的特定核苷酸序列，②并且使每一条链中 特定部位的磷酸二酯键断开。
◆ 结果：
G C
识别序列中轴线两侧两条链分别切开
黏性末端
C
G Haelll
cut
C
C
识别序列的中轴线两条链分别切开
平末端
C
C
sticky ends
A
G
C< G
kcut
C< G
T( A
A T
G C
G
A
T
C
C
C
G
G
cut
cut
5′...GA ATTC...3 EcoR I: 3...CTTA AG...5
5′...ACTAGT..3′
Spe I: 3...TGAT CA...5′
5′...GATATC..3'
3...CT AT AG...5′
5′...AA GCTT..3' Hind III:3...T TCGAA...5′
● 特 点 1:都可以找到一 条中 ( 心 ) 轴 线 ；
● 特点2: 中轴线两侧的双
链DNA上的碱基是反向对
称重复排列的，称为回文
序 列。 中轴线
正向读与另一条链反向读的碱基顺序完全一致。
回文序列
大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成；也有少数限制酶的识别序列由4个
、8个或其他数量的核苷酸组成。
EcoRV:
限制酶名字的由来
属名Escherichia首字母
R 型菌株
EcoR I
从中分离的第一个限制酶
种名coli 前两个字母
酶的专一性
■ 推测限制酶存在于原核生物中 的作用是什么
主要起到切割外源DNA 使之失效， 从而达到保护自身的目的。
■ 为什么限制酶不切割原核生物 自身的DNA 分子
①含某种限制酶的细菌的DNA分 子不具备这种限制酶的识别序列；
②或者甲基化酶将甲基转移到了
限制酶所识别序列的碱基上，使 限制酶不能将其切开。
限制性内切核酸酶—— “分子手术刀”
■ 限制酶能切开RNA 分子的磷酸二酯键吗
不能，限制酶只能识别并切开特定序列的双链
DNA 分子
■ 结合右图，推断限制酶切一次可断开两 个 磷酸二酯键，产生 两 个游离的磷酸基团， 产 生 两 个黏性末端，消耗 两 分子水。
■ 要想获得某个特定性状的目的基因必须要用限 制酶切几个切口 可产生几个黏性(平)末端
要想获得某个特定性状的目的基因，要切2个切
口，产生4个黏性(平)末端。
限制性内切核酸酶—— “分子手术刀”
5 end
5 ond
限制性内切核酸酶 — — “分子手术刀”
2个不同来源的DNA 片段A 和B,A 片段用限制酶SpeI 进行切割，B 片段分别用
限制酶HindⅢ 、Xba I 、EcoRV和Xho I 进行切割。
Spe I HindⅢ Xba I EcoRV Xho I
-ACTAGT- -AAGCTT- -TCTAGA- -GATATC-
-CTATAG-
-TGATCA- -TTCGAA- -AGATCT- -GAGCTC-
■写出限制酶Spe I、HindⅢ、Xba I和Xho I切割形成的黏性末端。
HindⅢ:
一A
-TTCGA
Xba I:
-C
-GAGCT
Spe I:
Xho I :
-TGATC.
T
-AGATC
限制性内切核酸酶—— “分子手术刀”
2个不同来源的DNA 片段A 和B,A 片段用限制酶SpeI 进行切割，B 片段分别用
限制酶HindⅢ 、Xba I 、EcoRV和Xho I 进行切割。
Spe I HindⅢ Xba I EcoRV Xho I
-ACTAGT- -TCTAGA- -GATATC-
-TGATCA- -TTCGAA- -AGATCT- -CTATAG-
■同种限制酶切割产生的黏性末端是否相同 不同限制酶切割产生的黏性末端 是否一定不同
同种限制酶产生的黏性末端相同。不同的限制酶可能会形成相同的黏性末端。
(同尾酶)
限制性内切核酸酶 — — “分子手术刀”
2个不同来源的DNA 片段A 和B,A 片段用限制酶SpeI 进行切割， B 片段分别用
限制酶HindII 、Xba I 、EcoRV和Xho I 进行切割。
Spe I HindⅢ Xba I EcoRV Xho I
■哪种限制酶切割B 片段产生的DNA 片段能与限制酶Spe I切割A 片段产生的DNA 片 段相连接 为什么
■连接完成后，该重组DNA 分子的新连接处能否再被所用的限制酶识别 为什么
Xba I。因 为Xba I 与Spe I 切割产生了相同的黏性末端。不能。因为所用的两
种限制酶均不能识别该重组DNA 分子的新连接处的脱氧核苷酸序列。
-ACTAGT-
-TGATCA-
-TCTAGA-
-AGATCT-
-GATATC-
-CTATAG-
-TTCGAA-
◆ 分 类 ： E·coli DNA连接酶 G A A T T C C T T A A G U
A A !
来源于大 肠 杆 菌； 只连接黏性末端。 T4 DNA连接酶
DNA连接酶——“分子缝合针”
◆ 作用：将两个DNA 片段连接起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的 磷 酸 二 酯 键。
来源于T4 噬菌体；
连接黏性末端和平末端。 一
DNA (水解)酶 切断磷酸二酯键
将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
限制酶 切断磷酸二酯键
将DNA 切成两个片段
DNA 聚合酶 形成磷酸二酯键
将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端
(需要模版)
DNA连接酶 形成磷酸二酯键
将两个DNA 片 段连接为一个DNA 分子
(不需要模版)
名称 作用部位 作用效果
DNA连接酶—— “分子缝合针”
解旋酶 切断碱基对间的氢键 将双链DNA 分子局部解旋为单链
◆ 作用：将外源基因送入受体细胞。
◆ 分类：
动物、植物 动植物病毒
细菌 噬菌体
常用载体 质粒
裸露、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA 外，具有自我复制能
力的环状双链DNA。
基因进入受体细胞的载体—— “分子运输车”
③具有特殊的标记基因
便于重组DNA分子的筛选 Origin
Stance Gene Replication
④对受体细胞无害、易分离
对受体细胞无毒害作用，避免受体细胞受到损伤
◆ 载体需具备的条件：
①稳定存在并能自我复制或整合到受体DNA 上
能使目的基因稳定存在且数量可扩增
②有一个至多个限制酶切割位点点
供外源DNA 片段(基因)插入其中
■有同学认为在含有某种抗生素的培养基中筛选存活的受体细胞不一定是导入 目的基因的受体细胞，这种说法是否合理 请解释。
基因进入受体细胞的载体—— “分子运输车”
selecable Marke,
triction es
Promoter
5……ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC ………3’
3…..…TATCGTACGATAGGTACTTAAGCCGTATG……5”
5….....TCCTAGAATTC TCGGTATGAATTC CATAC………3’
3.….…AGGATCTTAAGAGCCATACTTAAGGTATG…..5
用剪刀模拟EcoRI 识别下面质粒序列和切割位点进行“切割”,将下面DNA 切下的片段
重组到上面DNA 链的切口，并用透明胶条将切口粘连起来。
5...ATAGCATGCTATCCATGAATTCTCGGTATGAATTCGGCATAC...3'
3’...TATCGTACGATAGGTACTTAAGAGCCATACTTAAGCCGTATG...5’
思考 ·讨论
重 组DNA 分 子
◆ 实验原理：
DNA、RNA、 蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，
可以利用差异，选用适当的物理或化学方法对它们进行提取。
①DNA 不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理， 可以初步分离DNA与蛋白质。
②DNA 在不同浓度的NaCl 溶液中溶解度不同，它能溶于2
mol/L. 的NaCl 溶液(溶解DNA)。
③在 一 定温度下， DNA遇二苯胶试剂会呈现蓝色，因此二苯 胺试剂可以作为鉴定DNA的试剂。
探究 ·实践 DNA 的粗提取与鉴定
◆ 目的要求： ① 了 解DNA 的物理和化学性质，理解DNA 粗提取和鉴定的原理。
② 学 会DNA 粗提取的方法以及用二苯胶试剂对DNA进行鉴定。
NaCI浓度 (mol/L)
称取菜花，切碎，放入研钵，倒入研磨液 ,充分研磨。
在漏斗中垫上纱布过滤研磨液，4℃冰箱中静置后取 上清液 ； 或将研磨液倒入塑料离心管中离心，取上清液。
在上清液中加入体积相等的、 预冷的酒精(95%) ,静置2~3min, 溶液中出现的 白色丝状物就是粗提取的DNA。
要轻缓，以免加剧DNA 断裂，导致DNA 分子不能形成丝状物。
用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物；
或将溶液倒入塑料离心管中离心，取沉淀物晾干。
DNA 的粗提取与鉴定
破碎细胞
DNA 的析出
去除杂质
探究 · 实践
试管编号 A(对照组)
B(实验组)
步骤1 2mol/L的NaC1溶液5mL 步骤2 不进行任何处理
加丝状物或沉淀物
步骤3 加4mL的二苯胺试剂 步骤4 沸水浴加热5min 实验现象 溶液不变蓝色
溶液逐渐变蓝
实验结论 DNA在沸水浴下遇二苯胺试剂会被染成蓝色
探究 · 实践 DNA 的粗提取与鉴定
DNA 的鉴定 将丝状物或沉淀物溶于2 mol/L的NaCl 溶液中，
加入 二苯胺 试剂，混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。
■ 选什么样的材料实验更易成功 为什么强调充分研磨
选择DNA含量较高的生物组织易成功。
研磨不充分，会使DNA 分子不能从细胞核中释放出来，影响提取的DNA 含量
■猪血和鸡血，哪个适合用作提取DNA 的材料 操作时如何防止血液凝固
猪血(哺乳动物的成熟红细胞)无细胞核，不适合；
鸡血中红细胞有核DNA, 且核DNA的量较多，适合。
可以在鸡血中加入柠檬酸钠，防止血液凝固。
■ 如果用鸡血动物细胞做材料，也需要研磨裂解释放细胞中的DNA 吗
鸡血中加入清水，让细胞吸水胀破，释放DNA。
探究 · 实践
DNA 的粗提取与鉴定
探究 · 实践 DNA 的粗提取与鉴定
■ 实验中进行了2次静置或离心，目的是将DNA 和 杂质分子 分开。
■ 第1次操作后， DNA 存在于 上 清 液 中；第2次操作后DNA 存在于 析出的白色丝状物 或 离心管沉淀 中。
■ 基于细胞中化合物分析，研磨液应该具有什么样的特性和功能
SDS: 使蛋白质变性与DNA 分离；
EDTA: 是一种DNA 酶的抑制剂，可防止细胞破碎后DNA 酶降解DNA;
Tris: 提供缓冲体系， DNA在这个缓冲体系中呈稳定状态。
■ 研磨后用纱布过滤得到滤液，可以用滤纸代替吗
不可以，因为DNA会被吸附到滤纸上而大量损失。
■ 你提取出白色丝状物或沉淀物了吗 用二苯胺试剂鉴定的结果如何
观察提取的DNA的颜 色，如果不是白色丝状物，说明DNA中 的杂质较多。
二苯胺试剂鉴定呈现蓝色说明实验基本成功；如果不呈现蓝色，可能的原因有 所提取的DNA 含量低，或者在实验操作过程中出现了失误等。
■ 你能分析出粗提取的DNA 中可能含有哪些杂质吗
本实验粗提取的DNA可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质。
■与其他同学提取的DNA 进行比较，实验结果有何不同，分析产生差异的原因。
本实验可以采取分组的方式进行。各组由于选取不同的实验材料、提取DNA 的方法等多方面原因最终使得DNA 的纯度(颜色)、DNA 含量(二苯胺试剂
显色的深浅) 等存在差异。
探究 · 实践
DNA 的粗提取与鉴定

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