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(共49张PPT)
第1节重组DNA技术的基本工具
第3章基因工程
如果能得到这种到了 晚上自己能发光的树 该多好啊!
发光树 萤火虫：能发光
树：不能发光
思考：如何获得发光树
杂交育种 同种生物之间进行
诱变育种 在原有基因上发生基因突变，
产生新基因——等位基因
不定向
1944年艾弗里等人 通过肺炎链球菌的转 化实验，不仅证明了 遗传物质是DNA, 还证明了DNA 可以 在同种生物个体间转 1961年尼伦伯格 和马太破译了第一 个编码氨基酸的密 码子。截至19666 年，64个密码子均 被破译成功。 1970年科学 家在细菌中发 现了第一个限 制性内切核酸 酶(简称限制 酶 ) 19 7 2 年 ，伯 格首先在体外 进行了DNA 的 改造，成功构 建了第一个体 外重组DNA 分 1982年，第一个基
因工程药物-重组人 胰岛素被批准上市。 基因工程药物成为 世界各国研究和投 资开发的热点。
1953年沃森和 克里克建立了 DNA双螺旋结 构模型并提出 了遗传物质自 我 复 制的 假 说 。 1967年，科学家 发现，在细菌拟核 DNA 之外的质粒 有自我复制能力， 并可以在细菌细胞 间转移。 20世纪70年代初，多 种 限制酶、DNA连接酶和 逆转录酶被相继发现。 这些发现为DNA 的切割、 连接以及功能基因的获 得创造了条件。 1973年，科学家证 明了质粒可以作为基 因工程的载体，并实 现了物种间的基因交 流。至 此 ，基因工程 正式问世。
1 9 8 5 年 ，
穆里斯等人 发 明 PCR, 为获取目的 基因提供了 有效手段。
基因工程的发展历程
项目 S型细菌 R型细菌 菌落 表面 光滑 表面 粗 菌体 多糖 类的 英膜
糙
有无毒性 有 无
一、基因工程的概述
肺炎链球菌
S型细菌 的细胞 提取物
混合
R型细菌 S型细菌
第一组
实验结论
( 1 ) DNA 才是 使R 型细菌 产生稳定 遗传变化 的物质。
(2) 蛋白 质等其 他 物质不 是 遗传物质
混合
R型细菌 S型细菌
第二至四组
混合
只 长R 型细菌
C
第五组
有R型 细菌的 培养液
DNA酶
S型细 菌的细 胞提取
物
一 、基因工程的概述
有R型 细菌的 培养液
S型细 菌的细 胞提取
物
蛋白酶(或RNA酶、酯酶
有R型 细菌的 培养基
DNA 具有热稳定性。加热使蛋白质变性失去活性，DNA 的结构也会 被破坏，但当温度降低到55 ℃左右时，DNA 的结构会恢复，但蛋 白质却不能恢复。
重组
R 型细菌转化
成S型细菌
S型细菌
荚膜
加热 杀死
控制荚膜形
成的X 基因
一、基因工程的概述
R 型细菌转化为S型细菌的实质：基因重组
X基因吸附菌
R型细菌表面
被破坏的 S型细菌
X基因 进入R 型细
四
IIID
I
I
在DNA 分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作DNA 重组技术。
操作对象： 基因(DNA)
操作水平： DNA 分子水平
原理： 基因重
组
结果：创造出人类需要的新的生物类型和生物产品
意义：定向改造生物遗传特性；克服远缘杂交不亲和障碍
光蛋白基因
水母的绿色荧
指按照人们的愿望，进行严格的设计并通过体外DNA 重组和转基因等技术，赋予生物
以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是
一、基因工程的概述
1.基因工程概念
一、基因工程的概述
2.图解“基因工程实质”
萤火虫 发光基因
普通动植
物
探究一 基因工程的理论基础和工具酶
「问题情境」
资料1:生长激素释放抑制激素可用于治疗肢端肥大症，最初只能 从动物下丘脑提取，50万个羊脑才能提取5 mg。科学家以质粒为 载体，将相关基因转入大肠杆菌。利用改造后的工程菌生产的该 激素价格降为原来的几百分之一。
(1)为什么不同生物的DNA 分子能拼接起来
提示：①DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸。
②DNA分子都遵循碱基互补配对原则。
③双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构。
(2)为什么一种生物的基因可以在另一种生物细胞中表达
提示：①基因是控制生物性状的遗传物质的结构和功能单位。
②遗传信息的传递都遵循中心法则。
③生物界共用一套遗传密码。
(3)基因工程操作导致的基因重组与有性生殖中的基因重组的主 要区别是什么
提示：① 有性生殖中的基因重组是随机的，并且只能在同一物种间
进 行 。
②利用基因工程可以在不同物种间进行基因重组，并且方向性强， 可以定向地改变生物的性状。
一、基因工程的概述
思考： DNA双螺旋的直径只有2nm,对如此微小的分子进行操作，是
一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。
% “分子手术刀” “分 子缝合针” “分子运输车”
将体外重组好的DNA 分子导入受体细胞
准确切割 DNA分
子
将DNA 片段 连接起来
切割DNA 分子的工具是限制性内切核酸酶，又称 限制酶 。
1.来源：主要来自原核生物 2.种类：数千种 限制酶不是一种酶，而是一类酶。
3.作用特点：专一性
能识别 双链DNA分子 的特定核苷酸序列，并使每一条链
中特定部位的磷酸二酯键断开。 一般为4~8个或其他数
量的核苷酸，最常见的
作用部位 为6个核苷酸。
二、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
【问题3】你能根据所掌握的知识，推测限制酶存在于原核生物
中的主要作用是什么吗
原核生物容易受到自然界外源DNA 的入侵，所以它
在长期的进化过程中形成了套完善的防御机制。限制
酶就是它的一种防御性工具。当外源DNA 入侵时，
它会利用限制酶来切割外源DNA, 使之失效，以保
证自身的安全。
为什么限制酶不切割细菌本身的DNA 分子
含某种限制酶的细菌的DNA 分子不具备这种限制酶的识别序列，
或者甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使
限制酶不能将其切开。
二、限制性内切核酸酶—— “分子手术刀”
二、限制性内切核酸酶—— “分子手术刀”
A
C
G
限制酶
A
1'
H
H
5H O
4” H
H3
OH
8n
4'
H
H3
OH
3'
5
OH
0- O
OH
G
1'
H
2
H
5
3'
磷酸二酯键
OH
-O
OH
o—
0
4.识别序列
EcoR I 5’...G-A-A-T-T-C.…3'
3'...C-T-TA-A-G...5'
Sma 5’...C-C-C-G-G-G...3'
I 3'...G-G-G-C-C-C.….5'
BamH 5’...G-G-A-T-C-C…3'
I 3'...C-C-TA-G-G.….5’
Taq I 5..……T-C+G-A……3'
3..…A-GC-T……5'
限制酶所识别的序列的特点是：
呈现碱基互补对称，无论是6
个碱基还是4个碱基，都可以找到 一 条中心轴线，中轴线两侧的双链 DNA 上的碱基是反向对称重复排 列的，称为回 文 序 列。
在切割部位，一条链正向读的 碱基顺序与另一条链反向读的顺序 完全一致。
二、限制性内切核酸酶—— “分子手术刀”
5 .切割结果：
( 1 ) 实 例 1 — —EcoRI 限制酶切割 ( 2 ) 实 例 2 — —Sma I限制酶切割
二 、限制性内切核酸酶 — — “分子手术刀”
DNA 两条单链的切口处，伸出 几个核苷酸，刚好能互补配对， 这样的切口叫黏性末端。
*EcoRI 识别序列为GAATTC
*EcoRI 切割部位为GA之间的磷酸二酯键
*SmaI 识别序列为CCCGGG
*Sma I 切割部位为CG之间的磷酸二酯键
切口处是平整的， 这样的切口叫平 末
GA A
黏性木端T
C C!
平末端
G G
T 黏性志端
C
G
BamHI GATC EcoRI AATT HindⅢ AGCT BglⅡ GATC 思 考 ：同种限制酶切割的黏性末端一定相同吗 不同种限制酶切出的黏 性末端一定不同吗
①不同DNA 分子用同一种限制酶切割形成的黏性末端都相同。 【解析：酶具有专一性，识别的序列相同】
②不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端。 ( 比 如BamHI 、BglⅡ )
EcoR I Hind Ⅲ
—GAATTC— —AAGCTT—
—CTTAAG一 —TTCGAA 一
个
Bgl Ⅱ
↓
—AGATCT—
—TCTAGA—
个
BamH I
—GGATCC 一
—CCTAGG 一
1.写出下列限制酶切割形成的黏性末端
课堂练习
(1)用EcoR I 酶切，能得到 2 种DNA 片段；
(2)用PstI 完全酶切，能得到 3 种DNA 片段；
(3)要想获得抗病基因必须要用限制酶切几个切口 可产生几个黏性末端 要切两个切口，产生四个黏性末端。
2.结合右图，推断限制酶切一次可断开 两个磷酸二酯键，Q 5' 产生2 个游离的磷酸基团，消耗两分子水。
3.下图甲是一个DNA 片段，箭头处代表不同限制酶的切点
,据图回答：
PstI
抗病基因
图 甲
二、限制性内切核酸酶—— “分子手术刀”
3'
5
Smal
R I
+-
T T
缺口怎么办
DNA 连接酶一 “分子缝合针”
课堂练习
3.把两种来源不同的DNA 分子进行拼接，应该怎样处理呢
用同种限制酶切割(EcoR
A
T
只能用同种
酶切割吗
完全互补的黏性 末端能通过氢键 暂时连接在一起， 但并不稳定。
恢复被限制酶切开的磷酸二酯
T T A C T
G L A A T T C G
L)
G
C
建
切
TT
A G
3'
切
口
5'
A
A G
3'I
1. 概念 将两个双链DNA 片段“连接”起来的酶
2.作用 将两个DNA 片段连接起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之 间的磷酸二酯键。
三、DNA连接酶—— “分子缝合针”
口 A
T
G G G
G G
G
C
A
3'
5'
5'
5'
5'
5'
A
3'
3'
3'
3'
3'
5'
5'
G
A A T T C
5' 5
CTT A A
5′ 5′
5′ 3'
E.coli DNA
连接酶
3′
5′
3. 种 类 ：(1) E.coli DNA连接酶：连接平末端的效率远远低于T4 DNA连 接酶
(2)T4 DNA连接酶
三、DNA 连接酶—— “分子缝合针”
T4 DNA 连接酶
5' G
3
T4 DNA
连接酶 5'
5 5 G
3′
5′
5'
G
类型 E.coli DNA连接酶
T4 DNA连接酶
来源 大肠杆菌
T4噬菌体
功能 缝合 黏性末端和平末端； (连接平末端效率远低于T4 DNA连接酶)
缝合 黏性末端 和 平末端(效率低)
结果 恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的 磷酸二酯键
★DNA 连接酶没有识别特异性(相同或互补的黏性末端以及平末端都能连接)
3.种类：E.coli DNA连接酶、T4 DNA连接酶
三、DNA 连接酶—— “分子缝合针”
旁栏思考(P72): DNA 连接酶与DNA 聚合酶是一回事吗 为什么
相 同 点 ：都是催化磷酸二酯键形成的酶。
不 同 点 ：DNA 聚合酶连接的是游离的脱氧核苷酸，需要模板；
DNA 连接酶连接的是DNA 片 段 ，不需要模板。
三、DNA 连接酶—— “分子缝合针”
项目 DNA连接酶 限制酶 DNA聚合酶 解旋酶
DNA酶
作用 部位 磷酸二酯键 磷酸二酯键 磷酸二酯键 氢键
磷酸二酯键
作用 对象 DNA片段 DNA 单个的脱氧 核苷酸 DNA
DNA
作用 结果 将两个DNA 片段连接成 完整的DNA 分子 切割双链 DNA分子 将单个的脱 氧核苷酸连 接到DNA 单链末端 将双链 DNA分子 局部解旋 为单链
将DNA片
段水解为
单个脱氧
核苷酸
三、DNA连接酶——“分子缝合针”
DNA连接酶、限制酶、 DNA 聚合酶、解旋酶、DNA 酶的比较
A.切断a处的酶为 ①
B.连接a处的酶为 ③④
C.切断b处的酶为 ②
思考：根据所学知识，完成以下填空：
①限制酶②解旋酶③DNA 连接酶④DNA 聚合酶 ⑤RNA 聚合酶
三、DNA连接酶——“分子缝合针”
b
a
a: 磷酸二酯键；b: 氢键
资 料2:如图为不同的限制酶识别序列和切割位点。
探究案 ·互动探究
预习案 · 自主学习
(4)限制酶的全称是 限制性内切核酸酶,作用 能识别双链DNA
是 分子的特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键 断开
O
(5)限制酶存在于原核生物中的作用是 原核生物容易受到外源DNA 的入侵，原核生物中的限制酶能够切割入侵的外源DNA而保护自身。
(6)若某链状DNA分子中含有两个HindⅢ的识别序列，该DNA分子将 被切成 3 个片段，断裂 4 个磷酸二酯键。
预习案 · 自主学习 探究案 ·互动探究
(8)哪两个限制酶切割形成的黏性末端互补 可以用哪种DNA连接
酶连接 画出连接后的DNA分子片段。
提示：Spel 、Xba l 。T4 DNA连接酶、E.coli DNA连接酶。
-A CTAGT- -TGATC A- Spe l
-GAT ATC-
-CTA TAG- EcoRV
预习案 · 白主学习
I 、EcoRV切割后产生的末端图。
探究案 ·互动探究
-TCTAGT 一
—AGATCA 一。
-ACTAGA
-TGATCT
(7)画出Spe
一或
限制酶 名称 识别序列和 切割位点 限制酶 名称
识别序列和 切割位点
BamH I G↓GATCC Kpn I
GGTAC↓C
EcoR I G↓AATTC Sau3A I
↓GATC
Hinc Ⅱ GTY↓RAC Sma I
CCC↓GGG
注：Y=C或T,R=A或G。
A.一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列
B. 若两种限制酶的识别序列相同，则形成的末端一定能通过DNA连接酶相互连接
C.不同的限制酶切割DNA 分子后可以形成相同的黏性末端
D.限制酶EcoR I 进行一次切割，会切断2个磷酸二酯键，形成1个游离的5′末端
2.下表为常用的限制酶及其识别序列和切割位点，由此推断以下说法正确的是(
探究案 ·互动探究
预习案 · 自主学习
质粒
动植物病毒
噬菌体
大肠杆菌细胞
质粒是一种裸露的、结构简单、独立于
真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA 之
外，并具有自我复制能力的环状双链
DNA分子。
四、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
1.作 用 ：将外源基因送入受体细胞，在受体细胞内对目的基因进行大量复制.
目的基因 插入位点
复制原点
氨苄青霉素 抗性基因
拟核DNA 质粒
2.种类
3.运载体需具备的条件：
问题1:载体要与外源基因连接，需要具备什么条件
条件①:具有一个或多个限制酶切割位点；供外源基因插入其中
问题2:要使携带的外源基因在受体细胞中稳定存在，载体需要具备什么条件
条件② :能在受体细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制；
使外源基因在受体细胞中稳定存在并复制，以扩增外源基因的数量 问题3:我们用肉眼看不到载体是否进入受体细胞，为了便于筛选重组DNA 分子， 载体需要具备什么条件
条件③:具有标记基因，便于重组DNA分子的筛选。
如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因等
条件④:对受体细胞无害。
四、基因进入受体细胞的载体—— “分子运输车”
录过程中起调控作用。
有切割位点(酶切位点)
DNA 复制的起始位点，
并带着插入的目的基因一 起复制
拟核DNA 质粒
质粒DNA 分子质量一般
为拟核的0 .5%~3%
四、基因进入受体细胞的载体—— “分子运输车”
启动子：转录的起点，在RNA
聚合酶识别和结合的部位，驱
动基因的转录。
万 终止子：转录的终点，在转
有标记基因的存在，可用 含青霉素的培养基鉴别。
不能被酶切破坏
便于重组DNA 筛选与鉴
真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过 人 工 改造的。
大肠杆菌细胞
氨苄青霉素
抗性基因
4.最常用的载体 — — 质粒：
目的基因 插入位点
一复制原点
大肠杆菌及质粒结构模式图
加入氨苄青霉素
目的基因
重组
质粒
amp
抗氨苄青
霉素基因
拓展延伸：标记基因的筛选原理
载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素
的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达， 受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，导入了载体并成功表达了 的受体细胞才能够生存。如图所示：
四、基因进入受体细胞的载体—— “分子运输车”
导入
受体细胞
未导入
未导入
培养
导入
(1)在基因工程的操作中，不宜选用Smal, 原因是Smal 会破坏 目的基因 和 质粒上的抗生素抗性基因
(2)在基因工程的操作中，不宜选用EcoRI, 原因是用EcoRI切割外源
DNA 片段后， 目的基因只有一侧含有黏性末端，不能插入到质粒中
1.图甲是含有目的基因的外源DNA 片段，图乙是用于将目的基因导入受
体细胞的质粒(阴影部分表示抗生素抗性基因),相关限制酶的作用部 位如图所示，现欲培养转基因抗病植株，回答下列问题。
课堂练习
图乙
图甲
图甲 图乙
(3)由于反应体系中含有大量的外源DNA 片段和质粒，加入PstI一种
限制酶后，会得到大量的目的基因片段和质粒片段，再加入DNA 连接 酶后，除了会形成目的基因与质粒连接的环状产物外，还会形成 质粒片段与质粒片段 连接的环状产物以及 目的基因与目的基因 连接的环状产物。此外，目的基因与质粒的连接既可以是正向连接，也 可以是 反向连接 ,后者可能会导致目的基因无法正常表达。
课堂练习
I Sma I
抗病基因
Pst I
EcoRI
Pst
SmaI
来源：主要存在于原核生物中
特点：具有专一性(能识别双链DNA 分子的特定核苷酸序列)
作用部位：切开DNA 分子的磷酸二酯键
作用结果：产生黏性末端或平末端
E.coli DNA连接酶
种类 ·
T4 DNA连接酶
作用部位：磷酸二酯键
①对受体细胞无害
② 能自我复制或整合到宿主DNA 上。
③有一个至多个限制酶切割位点
④常有特殊的标记基因
限制酶
DNA 连 接酶
种类：质粒、噬菌体、动植物病毒
运载 工具
课堂小结
条件
8
DNA 不溶于酒精，
但某些蛋白质溶于酒精
DNA 能溶于物质的量浓度为
2 mol/L的NaCl 溶液
在一定温度下，
DNA 被二苯胺试剂染成蓝色
一、实验原理
利用DNA与RNA 、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的
差异，提取DNA, 去除其他成分。
初步分离
DNA 和蛋白质
溶解DNA
鉴定DNA
探究 ·实践：DNA 的粗提取与鉴定
NaCI 浓度(mol/L)
D N A 溶 解 度
(1)选什么样的材料实验更易成功
含DNA 的生物材料都可以，选取DNA 含量相对较高的生物组织，成功率更大。
(2 )猪血和鸡血，哪个适合用作提取DNA 的材料 操作时如何防止血液凝固
猪血(哺乳动物的成熟红细胞)无细胞核和线粒体，几乎不含DNA, 不适合； 鸡血中红细胞有核DNA ,且核DNA 的量较多，适合。
鸡血中加入柠檬酸钠，可防止血液凝固。
二、材料用具
1.选材：DNA含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等。
探究 · 实践：DNA 的粗提取与鉴定
体积分数为95%的酒精
2mol/L 的NaCl溶
液
二苯胺 鉴定DNA,
烝喵
zk
二、材料用具
2.试 剂 ：
研磨液 溶解并提取DNA
析出DNA
溶解DNA
要现配现用
北705a 嘉德 技有限公=5ize:100
二苯胺试剂(1.5%
230216 Storage:4
n1a s,hou ode
研磨液成分
SDS
EDTA
Tris-HCl缓冲液
作用
使蛋白质变性
抑制DNA 酶
稳定DNA
探究 ·实践：DNA 的粗提取与鉴定
试 剂
一 起 来 做
高 中 生 物 学 实 验
探究 ·实践：DNA 的粗提取与鉴定
三、实验步骤
1.破碎细胞—— 称取洋 葱，切碎，放入研钵，倒入研磨液，充分研磨。
目 的 ：裂解细胞，释放DNA
2.过滤 — — 在漏斗中垫上纱 布过滤研磨液，4℃冰箱中静置后取上 清 液 ；
或将研磨液倒入塑料离心管中离心，取上 清 液 。
思考：此步骤获得的上清液中可能含有 哪些细胞成分
可能含有DNA、RNA 以及蛋白 质、脂质、糖类等。
思考：过滤能否用滤纸代替纱布
不可以。因为DNA 会被 吸附到滤纸上而大量损失， 影响最终提取的DNA 量。
探究 ·实践：DNA 的粗提取与鉴定
三、实验步骤
三、实验步骤
3.DNA 的粗提取 · 在上清液中加入体积相等的预冷的酒精 溶液，静置 2~3min, 溶液中出现的 白色丝状物 就是粗提取 的DNA。
①可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA 降解；
②抑制分子运动，使DNA 易形成沉淀析出；
③低温有利于增加DNA分子的柔韧性，减少其断裂。
探究 ·实践：DNA 的粗提取与鉴定
使蛋白质等溶解在酒精中，DNA 不溶于酒精而析出。
预冷的 酒精的 优点
思考：酒精预冷的作用
用冷却的酒精 析出DNA
思考：此步骤的目的是
三、实验步骤
3.DNA 的粗提取 用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝_ 状 物 ,并用滤 纸吸去上面的水分：或将溶液倒入塑料离心管中离心
, 耽 淀 物晾 干 。
思考：搅拌时应轻缓、并沿一个方向目的
减少DNA 断裂，以便获得较完整的DNA 分子
探究 ·实践：DNA 的粗提取与鉴定
析出DNA
三、实验步骤
4.DNA 的鉴定——将丝状物或沉淀物溶于2 mol/L 的NaCl 溶液中，加入 二苯胺试剂，混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min
现配现用!
评价结果：
(1)DNA 纯度 看提取物颜色
(2)DNA 的量
看与二苯胺反应颜色的深浅
空白对照：在等体积的NaCl 溶液中加入二苯胺试剂，将试管置于同等沸水 浴中加热5min。
探究 ·实践：DNA 的粗提取与鉴定
四、结果分析与评价
1.你提取出白色丝状物或沉淀物了吗 用二苯胺试剂鉴定的结果如何
观察提取 的DNA 的颜 色， 如果不是白色丝状物，
说明DNA 中 的杂质较多。
二苯胺试剂鉴定呈现蓝 色说明实验基本成功；如果
不呈现蓝色，可能的原因有所提取的DNA 含量低，或者 在实验操作过程中出现了失误等。
探究 ·实践：DNA 的粗提取与鉴定
四、结果分析与评价
2.与其他同学提取的DNA进行比较，看看实验结果有何不同，分析产生差
异的原因。
①材料中的核物质没有充分释放出来， 如研磨不充分或蒸馏水的量不够。
②加入酒精后摇动或搅拌时过猛， DNA 被破坏。
③二苯胺最好现用现配，否则二苯胺变成浅蓝色，影响鉴定效果。
以血液为实验材料时：
每100 mL血液中需要加入3g 柠檬酸钠，防止血液凝固。
利用动物细胞提取DNA破碎细胞的方法：
动物细胞无细胞壁，可直接吸水涨破。
探究 ·实践：DNA 的粗提取与鉴定
课堂练习
2.图1表示含有目的基因D 的 DNA 片段长度(bp 即碱基对)和部分碱基序列， 图2表示 一 种质粒的结构和部分碱基序列。现有MspI、BamHI、MboI、
S maI4 种限制性内切核酸酶切割的碱基序列和酶切位点分别为 CCGG、 GGATCC、↓GATC、CCC'GGG。 请回答下列问题：
GGATCC
目的基因D
GCCGGG CCCGGG GGATCC
GGGccc GGGCCC CC TAGG
796 bp一 —658 bp一
图 1
末端是 平 末端，其产物长度为537 bp、790 bp、661 bp。
(1)若用限制酶Sma I完全切割图1中DNA 片段，产生的
启动子、
CCGG
GGCC
抗生素B
抗性基因
CC
质粒
GATC
CTAG
GGATCC
CCTAGG
534 bp—
抗生素A 抗性基因
图 2
课堂练习
(2)若图1中虚线方框内的碱基对被T—A 碱基对替换，那么基因D 就突变为
基因d 。从杂合子分离出图1及其对应的DNA 片段，用限制酶Sma I 完全切 割，产物中共有4 种不同DNA 片段。
(3)若将图2中质粒和目的基因D 通过同种限制酶处理后进行连接，形成重组 质粒，那么应选用的限制酶是BamH I 。在导入重组质粒后，为了筛选
出含重组质粒的大肠杆菌， 一般需要用添加抗生素B 的培养基进行培养。
经检测，部分含有重组质粒的大肠杆菌菌株中目的基因D 不能正确表达，其 最可能的原因是同种限制酶切割形成的末端相同，部分目的基因D与质粒反向连接

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