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动物细胞工程
第2章细胞工程
2006年，山中伸弥(S.Yamanaka,1962-) 等获得了诱导 多能干细胞。我国科学家利用这种细胞培育出了小鼠。
1978年，小鼠桑葚胚被成功分割。次年， 科学家分割绵羊胚胎获得了同卵羔羊。
1975年，米尔斯坦(C.Milstein,1927-
2002)和科勒(G.K hler,1946-1995) 等 创立了单克隆抗体技术。
1959年试管兔诞生，之
后多种试管动物相继出生。
1951年，张明觉(1908-1991)
等发现哺乳动物精子的获能现象。
1981年，埃文斯(M.J.Evans,1941-) 等成功分离和培养小鼠的胚胎干细胞。
1958年，格 登(J.Gurdon,1933-) 用非洲爪 蟾进行体细胞核移植，成功培育出性成熟个体。 同一时期，童弟周(1902- 1979)等开展了鱼类 细胞核移植工作。
1890年，希普 (W.Heape,1855-
1929)将安哥拉兔的胚胎移入比利时
兔的输卵管内，得到了两只安哥拉兔，
这是世界上胚胎移植成功的首例。
1907年，哈 里 森(R.G.Harrion,1870-1959) 用一滴淋巴液 成功培养了蝌蚪的神经元，首创了动物组织体外培养法。
动物细胞工程(含胚胎工程)
1996年，世界上第一只细胞克隆羊多莉在 英国诞生。随后多种克隆动物相继问世。
2014年，世界上第一个用单细胞基因组测 序进行遗传病筛查的试管婴儿在我国诞生。
2017年，我国科学家首次培 育出体细胞克隆猴。
科技探索之路
从社会中来
在治疗大面积烧伤时，通常采用的方法是取烧伤病人
的健康皮肤进行自体移植。但对这样的病人来说，自体健 康皮肤非常有限，使用他人皮肤来源又不足，而且会产生 免疫排斥反应。那么,怎样才能获得大量的自体健康皮肤 能不能用自体皮肤的单个细胞培养出可供移植的皮肤
可以从病人身上取少量正常、健康的皮肤在体外进行
培养、扩增； ——动物细胞培养
目前，科学家还在研究对皮肤干细胞进行培养，以获
得适合临床上使用的人造皮肤。 ——干细胞培养
通过细胞培养构建的人造皮肤
动物细胞培养
从动物体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后在适宜的培养条
件下，让这些细胞生长和增殖的技术。
分散 单个细胞 适宜条件 细胞生长和增殖
原理： 细胞增殖
地 位 ：动物细胞工程的基础
大 致 过 程 ： 动物体
组织
取出
动物体内的细胞之所以能够维持正常的生命活动，是因为机体给这些细胞提供了
适宜的条件，包括充足的营养和稳定的内环境等。动物细胞培养(模拟体内细胞正常 生长增殖的环境 )也需要满足这些条件。
无菌、无毒的环境；
适宜温度、pH 和渗透压； 适宜的气体环境。
一 、动物细胞培养的条件
动物细胞 培养所需的
基本条件
糖类、氨基酸
、无机盐、维 生素 ……
其他
条件
营养
条件
1.营 养 营养 条件：合成培养基+血清等天然成分
(1)已知营养成分 动物细胞常用的糖类是葡萄糖，与植物组织培养常用蔗糖不同 细胞所需的营养物质(糖类、氨基酸、无机盐、维生素等);
将细胞所需的营养物质按种类和所需量严格配制而成的培养基称为合成培 养 基。
(2)未知营养成分
血清(含人类未知、细胞生长增殖所必需的物质)等天然成分；
(3)培养基的类型(物理性质)
一般使用液体培养基，也称为培养液。
一、动物细胞培养的条件
为什么对动物细胞进行培养时通常要添加血清
1、血清中含有必需氨基酸、维生素、矿物质和其他营养物质，这些都是细胞生长 和代谢所必需的。
2、血清中含有多种细胞生长因子，如上皮生长因子(EGF)、 血小板源生长因子 (PDGF)、 成纤维细胞生长因子(FGF) 等，这些因子可以促进细胞增殖和分化。
3、血清中含有多种激素，如胰岛素和促生长激素，它们可以调节细胞的代谢和生 长。
4、血清中的某些成分(粘附分子)可以帮助细胞粘附到培养容器上，这对于许多 细胞系的生长是必要的。
5、血清中的某些成分可以结合和去除培养基中的有毒物质，起到一定的解毒作用， 减少有毒物质对细胞的毒害。
至今血清中仍有许多对细胞生长有利的因子未研究清楚。
血清中含有多种未知的促细胞生长因子等营养物质，这是细胞生长和增殖所必需的。
2.无菌、无毒的环境
( 1 ) 无 菌 ： · 培 养 液、培养用具灭菌处理；
· 无菌操作；
· 适量添加抗生素。
( 2 ) 无 毒 ： · 定期更换培养液。
清除代谢物，防止代谢物积累对细胞自身造成危害。
一、动物细胞培养的条件
3.温度、pH 和渗透压
( 1 ) 温 度 ：哺乳动物细胞培养的温度多以36.5±0.5℃ 为宜；
(2)pH: 多数动物细胞生存的适宜pH 为 ；
(3)渗透压：适宜的渗透压维持细胞正常的形态和功能。
一、动物细胞培养的条件
4.气体环境 O : 细胞代谢所必需
(1)气体的组成及作用： 95%空气 + 5%CO ;
(2)培养装置：培养皿或 松盖培养瓶
(3)培养仪器： CO 培养箱养
一、动物细胞培养的条件
CO : 维持培养液的pH
松盖培养瓶
培养皿
取动物组织
分散成单个细胞
制成细胞悬液
原代培养
传代培养
二、动物细胞培养的过程
分散成单个细胞
转入培养液进
放入CO 培养箱中培养
放入CO 培养箱中培养
制成细胞悬液
行原代培养
取动物组织
传代培养
取材对象：一般取材于动物胚胎或幼龄动物的组织、器官。
取材原因：细胞分化程度低，增殖能力强，容易培养。
二、动物细胞培养的过程
取动物组织
分散成单个细胞
制成细胞悬液
原代培养
传代培养
取动物组织
将动物组织块剪碎 胰蛋白酶处理
制成细胞悬液 或胶原蛋白酶
思考：1.为什么要分散成单个细胞
动物细胞与细胞靠在一起，彼此限制了生长和增殖 ( 接
原代培养 触抑制);
细胞与培养液充分接触，有利于细胞生长和增殖。
传代培养 2.用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理说明动物细胞间的物质
主要是什么成分 蛋白质
二、动物细胞培养的过程
取动物组织
分散成单个细胞
方法：机械方法或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理一段时间。
将动物组织块剪碎 胰蛋白酶处理
或胶原蛋白酶
思考：3.可以用胃蛋白酶来处理组织吗
不可以，因为胃蛋白酶的最适PH为1.5左右；
4.胰蛋白酶处理时间过长，会怎样
长时间会分解细胞膜蛋白，破坏细胞结构，把 细 胞 消化掉。注意控制时间和酶用量。
二、动物细胞培养的过程
方法：机械方法或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理一段时间。
制成细胞悬液
原代培养
传代培养
取动物组织
分散成单个细胞
二、动物细胞培养的过程
取动物组织
分散成单个细胞 制成细胞悬液
制成细胞悬液
操作：往分散的单个细胞中加入培养液将细胞制成细胞悬液。
原代培养
传代培养
原代培养：指动物组织经处理后的初次培养。
体外培养的动物细胞类型：
制成细胞悬液
原代培养
传代培养
细胞密度过大、
有害代谢物积累、 营养物质缺乏等
接触抑制
能够悬浮在培养液
中生长增殖；
需要贴附于某些基
质表面才能生长增 殖。(大多数)
取动物组织
分散成单个细胞
二、动物细胞培养的过程
转入培养瓶进行原代培养
直接在培养皿进行原代培养
细胞分裂受阻
细胞悬液
转入培养瓶进行原代培养
直接在培养皿进行原代培养
原代培养细胞呈现的特点： 瓶壁上的细胞是单层细胞。
细胞贴壁 接触抑制
取动物组织
分散成单个细胞
制成细胞悬液
原代培养
传代培养
二、动物细胞培养的过程
细胞悬液
对细胞进行分瓶培养，让 细胞继续增殖。
培养瓶或培养皿的内表面 光滑、无毒、易于贴附。
二、动物细胞培养的过程
388222 传代培养
取动物组织
分散成单个细胞
传代培养： 分瓶后的细胞培养。
思考：如何收集原代培养的细胞进行传代培养
悬浮生长的细胞直接用离心法收集；
贴壁生长的细胞先用胰蛋白酶等处理，使之分散成单个细 胞，然后再用离心法收集。
制成细胞悬液
原代培养
传代培养
传代培养： 分瓶后的细胞培养。
思考：细胞可以一直进行传代培养吗
分瓶培养后的细胞一般传至10代左右，细胞的生长、分裂就 会出现停滞，大部分细胞衰老死亡，但也有极少数细胞能存 活下来，并可传至40-50代，这种传代细胞称为细胞株。
当细胞株传至50代以后会再次出现停滞，不能继续传代，但 有部分细胞的细胞核型(遗传物质)发生了改变，并带有癌变 的特点，从而有可能在适宜培养条件下无限传代下去，这种 传代细胞叫作细胞系。
二、动物细胞培养的过程
388222 传代培养
取动物组织
分散成单个细胞
制成细胞悬液
原代培养
传代培养
植物组织培养
动物细胞培养
原理 植物细胞的全能性
细胞增殖
培养前处理 离体
用机械法或胰蛋白酶、胶原蛋
白酶将组织细胞分散开
取材 离体植物器官、组织、细胞
动物胚胎或幼龄动物的组织、
器官
培养基的物理性质 固体
液体(又称培养液)
培养基的成分 水、有机营养成分、无机营 养成分、植物激素
糖类、氨基酸、无机盐、维生素 等营养物质及血清等天然成分
特有成分 植物激素
血清
相同点 细胞分裂方式都是有丝分裂；都要严格的进行无菌操作。
动物细胞培养和植物组织培养的比较
3.分 类 ：
干细胞分类
按来源 按分化潜能
胚胎干细胞 成体干细胞 全能干细胞 多能干细胞 专能干细胞
1.概 念 ：干细胞是指动物和人体内仍保留的少数具有分裂和分化能力的细胞。 在一定条件下，干细胞可以分化成其他类型的细胞。
2.分 布 ：早期胚胎、骨髓和脐带血等多种组织和器官中。
三、干细胞培养及其应用
早期胚胎中
具 有分化为成年动物体内的任何一种类型的细胞 ，并
进一步形成机体的所有组织和器官甚至个体的潜能。
在体外分化成心肌细胞、神经元和造血干细胞等。
必须从胚胎中 获 取 ，涉及伦理问题。
4.胚胎干细胞
分布
特点
应用实例
ES细 胞
局限性
三、干细胞培养及其应用
胚胎干细胞
造血干细胞 ( 骨髓、外周血和脐带血中 )
神经干细胞 (神经系统中)
精原干细胞 (睾丸中)
具有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织， 不具有发育成完整个体的能力
治疗白血病及一些恶性肿瘤放 疗或化疗后引起的造血系统、 免疫系统功能障碍等疾病
治疗神经组织损伤和神经系统 退行性疾病 (如帕金森病、阿 尔茨海默病等)
5.成体干细胞
分布 成体组织或器官内
三、干细胞培养及其应用
造血干细胞 →
神经干细胞 →
举例
特点
成体干细胞
应用实例
通过体外诱导成纤维细胞、 T细胞和B细胞等得到的类似 胚胎干细胞的一种细胞
将特定基因，特定蛋白导入细胞；用小分子化合物诱导
形 成 。
诱导过程无须破坏胚胎；可以避免免疫排斥反应。
可治疗镰状细胞贫血症；在治疗阿尔兹海默病、心血管
疾病等领域的研究也取得新进展
来源
制备方法
优点
应用实例
Osteocytes
Neurons
Cardiac Cells
Enterocytes
三、干细胞培养及其应用
6.诱导多能干细胞
诱导多能干细胞
iPS细胞
iPS Cells
Hepatocytes
Sox2 KIf4
OOc-Myc
Fibroblasts Oct4( IO iPSC
Pathological molecular
pathways
"P/an
Differentiation in the tissue
of interest
New drugs
Toxicity test
2006年，日本科学家山中伸弥，从24个对胚胎干细胞维持十分重要的基因 中筛选出4个基因组合(Oct4、Sox2、c-myc 和KLF4), 在小鼠的成纤维细胞 中诱导表达，成功诱导出一种多能干细胞，称“诱导多能干细胞” (iPS 细 胞 ) , 并用iPS细胞治疗了小鼠的镰状细胞贫血。
2012年山中伸弥与约翰 ·戈登一起获得诺贝尔生理学奖或医学奖。
iPSC reprogramming
c-Myc 作为原癌基因 ，一方面促进细胞的
自我更新，另一方面也增加了细胞的成瘤性。
Klf4
Oct3/4 Sox2
肿瘤细胞
RNA水平的重编程避免了 因为基因插入而导致的成瘤 风险
抗体诱导 微流体技术大规 模诱导
山中伸弥首次将Oct3/4, Sox2 、c-Myc 和KIf4四种 转录因子转入细胞
日本完成世界首例iPS细 胞移植手术，治疗老年 黄斑变性
2006 2008 2009 2011
2014 2017 2019
Kim 通过机械牵张刺激成功使 体细胞重编程为iPSCs
非整合型附着体载体方法 获得的iPSC
人纤维蛋白原在诱导psc 效率提高
Nakagawa 将四种转录 因子去掉c-Mye
山中伸弥发现Oct3/4是 最重要
潜能扩展的多能 干细胞
细胞衰老
iPS细胞
体细胞
c-Myc
选项 提供物质
作用
A 抗生素
主要防止动物细胞在培养过程中被病毒感染
B 血清
补充合成培养基中缺乏的物质
C 氧气
满足细胞代谢的需要
D 二氧化碳
维持培养液的酸碱度
下列有关动物细胞培养时所提供的物质及其作用的描述不正确的是( A )
课堂巩固
A.步骤①的操作不需要在无菌环境中进行
B.步骤②中用盐酸溶解细胞间物质使细胞分离
C.步骤③到④的分瓶操作前常用胰蛋白酶处理
D.步骤④培养过程中不会发生细胞癌变
如图为动物成纤维细胞的培养过程示意图。下列叙述正确的是( C)
课堂巩固
②制备细 ③原代培养 胞悬浮液
①切取
组织
④传代培养
A. 甲→ 乙过程通常需要剪碎后，用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理
B. 在丙中培养的细胞通常在10代以内， 一般未发生癌变
C. 丁过程表示传代培养，大多细胞一般能增殖10～50代
D. 培养过程中应提供5%CO 和95%O 的气体环境，以维持培养液正常的pH
课 堂 巩 固
下图为幼鼠肾脏上皮细胞培养过程示意图，下列有关叙述错误的是(D)
肾脏组织块
0
甲 乙 丙 丁
左图为动物细胞培养过程示意图，请回答以下几个问题：
( 1 ) 容 器A中的动物器官或组织首先要剪碎，然后用胰蛋白酶 处理，其目的是 使组织分散成单个细胞 _ ;
(2)培养先在B瓶中进行。瓶中的培养基成分有葡萄糖、 氨基酸、无机盐、维生素和 动物血清 等。当细胞分裂生长 到 相互接触时，就会停止增殖，需用胰蛋白酶处理后分瓶继续 培养，称为传代培养。
(3)有一类不正常的动物细胞，体外培养不受接触抑制 机制的制约而表现为“疯长”,这类细胞最可能是癌 细 胞。
课堂巩固
练习与应用
一、概念检测
1.判断下列有关动物细胞培养的表述是否正确。
(1)培养环境中需要O , 不需要CO 。( *
(2)细胞要经过脱分化形成愈伤组织。( ×)
(3)培养液中通常含有糖类、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清。( √)
(4)培养瓶中的细胞需定期用胰蛋白酶处理，分瓶后才能继续增殖。( ×)
2.干细胞有着广泛的应用前景。下列相关叙述错误的是( A)
A.干细胞是从胚胎中分离提取的细胞
B、造血干细胞可以分化为各种血细胞
C.不同类型的干细胞，它们的分化潜能是有差别的
D.由iPS细胞产生的特定细胞，可以在新药的测试中发挥重要作用
现在关于iPS细胞的研究正在不断深入。请你从以下两个方面来查阅资料进行思考。
(1)由于诱导iPS细胞、促使其分化都需要时间，因此用某人特异的iPS细胞进行医 疗只限于时间比较充裕的情形。从实际事故、疾病发生的不可预测性方面考虑，如果 要将这些细胞用于紧急情况，应该提前采取什么措施
像建立骨髓库一样，有研究团队正在尝试建立HLA多态性丰富的iPS细胞库，可 以为需要的人找到HLA匹配度较高的iPS细胞，这样不仅可以节省时间、成本，还能 减轻异体干细胞移植后发生的免疫排斥反应。
(2)如果诱导iPS细胞定向分化为生殖细胞的技术发展成熟，该技术可能会有哪些应 用 又可能带来哪些问题
该技术可能被用于治疗不孕症；获得足够量的生殖细胞来进行濒危物种的克隆 研究；获得生殖细胞进行转基因操作，再经过受精、胚胎发育等过程来获得转基因 动 物 。
该技术可能带来一系列的伦理问题。例如，如果用同一个人的iPS细胞分别诱 导形成精子和卵子，两者受精可能培育出“单亲”婴儿；有的人还可能有目的地选 择iPS细胞，从而“设计”婴儿。
练习与应用~~~~~~~~~~~~
二、拓展应用

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