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(共37张PPT)
我国是棉花的生产和消费大国。棉花在种植过程中，常常会
受到一些害虫的侵袭，其中以棉铃虫最为常见。棉铃虫可以使棉 花产量减少三分之一，严重时，甚至能使一片棉田绝收。大量使
用农药杀虫不仅会提高生产成本，还可能造成农产品和环境的污 染。要是能培育出自身就能抵抗虫害的棉花新品种，这一问题就 会迎刃而解，我国拥有自主知识产权的转基因抗虫棉就是在这样 的背景下产生的。为什么传统的杂交育种方法培育不出抗虫棉， 基因工程却可以呢 基因工程是如何进行操作的 它给我们的生 产和生活带来了怎样的影响
基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生
物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的生物类型和生物产品。 从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA 分子水平上进行设 计和施工的，因此又叫做重组DNA 技术。
基因工程 是指按照人们的愿望，通过转基因等技术赋予生物新的遗传特性，
创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因 工程是在DNA 分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做重组DNA 技术。
>操作对象：基因 (DNA)
>操作水平：DNA 分子水平
> 原 理 ： 基因重组
> 结 果 ： 创造出人类需要的新的生物类型和生物产品
> 意 义 ： 定向改造生物遗传特性；彻底打破种间界限
基因工程
分析基因工程的理论基础
1.基因工程操作导致的基因重组与有性生殖中的基因重组的主要区别是什么
有性生殖中的基因重组是随机的，并
且只能在同一物种间进行重组；
基因工程可以实现遗传物质在不同物 种间进行重组，并且方向性强，可以 定向地改变生物的性状。
减数分裂I前期：同源染色体上非 姐妹染色单体间的互换；
减数分裂I后期：非同源染色体上 非等位基因的自由组合。
2. 为什么不同生物的DNA 分子能拼接起来
① DNA 的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸。
② 双链DNA 分子的空间结构都是规则的双螺旋结构。
3.为什么一种生物的基因可以在另一种生物细胞内表达
① 基因是控制生物性状的独立遗传单位。
② 遗传信息的传递都遵循中心法则。
③ 生物界共用一套遗传密码。
分析基因工程的理论基础
第三章
基因工程
第1节
重组DNA 技术的基本工具
露 生 物
生 物 学 (人教版)
选择性必修三 生物技术与工程
番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵袭。当番
木瓜被这种病毒侵染后，产量会大大下降。科学 家通过精心设计，用“分子工具”培育出了转基 因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。
DNA 双螺旋的直径只有2 nm, 对如此微小 的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需 要专门的“分子工具”。那么,科学家究竟用到 了哪些“分子工具” 这些“分子工具”各具有 什么特征呢
从社会中来
△ 转基因番木瓜(左)与非转基因番木瓜(右)
外源 DNA 片段难以进入细胞内，即
使进入也很难稳定存在、复制并表达。
在培育转基因番木瓜时，既要在体 外对含有所需基因的DNA 分子“切割”、 改造和“拼接” ;又要将重组 DNA 分子 导入番木瓜体细胞内，并使其在细胞中
表 达 。
>思考：你认为完成基因工程的操作可
能需要哪些关键性的工具
“分子运输车”“分子手术刀”“分子缝合针”
基因工程的基本工具
含目的基因的DNA
目的基因
重组DNA
“分子运输车”
主要是从原核生物中分离纯化出来的
数千种 (限制酶不是一种酶，而是一类酶)
能够识别双链DNA 分子的特定核苷酸序列，并且
使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开
(核苷酸之间的磷酸酯键)
磷酸二酯键
限制性内切核酸酶(限制酶)—— "分子手术刀"
1.来 源 ： 2.种类：
3. 作 用 ：
4.结 果 ：
限制性内切核酸酶(限制酶)—— "分子手术刀"
>当限制酶在它的识别序列的中心轴线两侧将 DNA 分子的两条链分别切开时，产
生的是黏性末端。
① EcoRI 限制酶：能特异性识别5'-GAATTC-3 '序列，并在G 与 A 之间切割
黏性末端
(5'AATT-3')
中轴线
限制性内切核酸酶(限制酶)—— "分子手术刀"
② SmaI 限制酶： 能特异性识别5'-CCCGGG-3'序列，并在C 与G 之间切割
>当限制酶在它的识别序列的中心轴线处切开时，产生的是平末端。
平末端
3'
5'
>大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成；
也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数 量的核苷酸组成。
>限制酶所识别的序列的特点是：都可以找到一条
中心轴线，中轴线两侧的双链DNA 上的碱基是 反向对称重复排列的，称为回文序列。正向读 与另一条链反向读的碱基顺序完全一致。
3'
G
A A G
5'
中轴线
5' 3'
G G
G
3' 5'
中轴线
核心归纳
>DNA 分子经限制酶切割产生的DNA 片段末端通常有两种形式——黏性末端和平
末 端。
EcoRI
Sma I
A
T
A
T
3'
5'
属名Escherichia 首字母
R 型菌株
EcoR I
种名coli前两个字母
从中分离的第一个限制酶
资料卡 限制酶名字的由来
例如：流感嗜血杆菌
(Haemophilus influenzae)
d株中先后分离到3种限制 酶，则分别命名为：
Hind I、Hind IⅡ、Hind IⅢ
1.根据上述所学，推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么
限制酶是原核生物的一种防御工具，当外源DNA 入侵时，它会利用限制酶来切割
侵入细胞的外源DNA, 使之失效，以保证自身安全。
甲基 限制酶的识别序列
( 被 甲 基 化 修 饰 )
细菌A
限制酶A
噬菌体
细菌的限制一修饰作用
使侵入的外源DNA 被切 割(噬菌体失去繁殖能力) 而自身DNA 得到保护
2.为什么限制酶不切割细菌本身的DNA 分 子
含某种限制酶的细菌的DNA 分子不具备这
种限制酶的识别序列，或者甲基化酶将甲基 转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限 制酶不能将其切开。
思考 · 讨论
限制酶的识别序列
(未被甲基化修饰)
思考 ·讨论
3.有2个不同来源的DNA 片段A 和 B,A 片段用限制酶Spe I 进行切割，B 片段
分别用限制酶Hind IⅢ、Xba I、EcoR V 和Xho I 进行切割。各限制酶的识别序 列和切割位点如下。
(1)A 片段经限制酶切割一次可断开2个磷酸二酯键，产生2个游离的磷酸基
团，产生 2 个黏性末端，其黏性末端是 5'CTAG-3' o
思考 · 讨论
3. 有2个不同来源的DNA 片段A 和 B,A 片段用限制酶 Spe I 进行切割， B 片 段
分别用限制酶Hind IⅢ、Xba I、EcoR V 和Xho I 进行切割。各限制酶的识别序 列和切割位点如下。
(2)同种限制酶切割产生的黏性末端是否相同 不同限制酶切割产生的黏性末端
是否一定不同
相同；不一定，不同的限制酶切割可能会形成相同的黏性末端，如SpeI 和XbaI。
> 识 别DNA 分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。
思考 · 讨论
3.有2个不同来源的DNA 片段A 和B,A 片段用限制酶Spe I 进行切割，B 片段
分别用限制酶Hind IⅢ、Xba I、EcoR V 和Xho I 进行切割。各限制酶的识别序 列和切割位点如下。
(3)哪种限制酶切割B 片段产生的DNA 片段能与限制酶 Spe I 切割A 片段产生的DNA 片段相连 接 为什么 连接完成后，该重组DNA 分子的新连接处能否再被所用的限制酶识别 为什么
限制酶XbaI; 因为限制酶 XbaI 与 SpeI 切割产生了相同的黏性末端。
不能；因为所用的两种限制酶均不能识别该重组DNA 分子的新连接处的脱氧核苷酸序列。
切口
5'
A
3'
切口
5'
G T
A
3'
DNA连接酶——"分子缝合针"
1.作用：将两个DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸
二 酯 键。
C G G G G G
C
G
C
G
G
G
G
3'
3'
3'
3'
3'
3'
5'
5'
5'
5'
5'
5'
种类 E.coli DNA连接酶
T4 DNA连接酶
来源 大肠杆菌
T4噬菌体
相同点 都能将双链DNA片段"缝合"起来，恢复被限制酶切开 的磷酸二酯键 不同点 E.coli DNA连接酶连接具有平末端的DNA片段的效率要 远远低于T4 DNA连接酶
DNA连接酶——"分子缝合针"
2.种 类 ：
由于黏性末端的碱基是互补的，在连接时，黏性末端可以通过碱基互补配对形
成氢键，加快 DNA 连接酶的连接速度，而平末端则不能。所以T4 DNA 连接酶连 接黏性末端的速度比平末端的速度更快。
o
DNA连接酶——"分子缝合针"
> 为 什 么T4 DNA连接酶连接平末端的效率相对较低
5'
3'
3'
5'
心：6
TAA
(;6
(1)DNA 聚合酶只能催化单个核苷酸加 到已有的核酸片段3'末端的羟基上，形成 磷酸二酯键；而DNA 连接酶是催化两个 DNA 片段之间形成磷酸二酯键。
(2)DNA 聚合酶以一条 DNA 链为模板， 催化形成与模板链互补的DNA 链；而
DNA 连接酶催化具有互补黏性末端或平末 端的DNA 片段连接起来，不需要模板。
此外，它们虽同为蛋白质，但组成、 性质等各不相同。
游离的核苷酸 DNA聚合酶
前导链
解旋酶
后随链
复制叉
DNA聚合酶
DNA 连接酶和 DNA 聚合酶是一回事吗 为什么
▲ DNA 复制中DNA 聚合酶发挥作用
项目 限制酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 解旋酶
DNA水解酶
作用对象 D N A 分 子 D N A 分 子 片 段 脱氧核苷酸 D N A 分 子
D N A 分 子
作用部位 磷酸二酯键 磷酸二酯键 磷酸二酯键 氢键
磷酸二酯键
作用结果 形成黏性末 端或平末端 形成重组 D N A 分 子 形成新的 D N A 分 子 形成单链 D N A 分 子
形成
脱氧核苷酸
核心归纳
与DNA 相关的几种酶的比较
基因进入受体细胞的载体——"分子运输车"
1.作 用 ：将外源基因送入受体细胞，并在受体细胞内对目的基因进行大量复制
2.种类：质粒 、噬菌体、动植物病毒等
利用病毒对宿主细胞的侵染性 拟 核DNA 质 粒
是一种裸露的、结构简单、独立于真 核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA
之外，并具有自我复制能力的环状双 链DNA。
>真正被用作载体的质粒，都是在天
然质粒的基础上进行过人工改造的。
目的基因 插入位点
-复制原点
▲ 大肠杆菌及质粒结构模式图
氨苄青霉素- 抗性基因
大肠杆菌细胞
基因进入受体细胞的载体——"分子运输车"
3.载体需具备的条件：
(1)有一个至多个限制酶切割位点 (便于插入目的基因)
(2)能在受体细胞中复制并稳定保存 (使目的基因稳定存在且数量可扩增)
(3)具有特殊的标记基因 (便于重组DNA 分子的筛选/将含有目的基因的 受体细胞筛选出来)
(4)对受体细胞无害、易分离 (避免受体细胞受到损伤)
自我复制，或整合到受体DNA 上，随受体DNA 同步复制
1.若用家蚕作为某基因表达载体的受体细胞，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不
选用噬菌体作为载体，其原因是什么
噬菌体的宿主细胞是细菌，而不是家蚕。
2.根据标记基因的作用，有同学认为在含有某种抗生素的培养基中筛选存活的受体
细胞不一定是导入目的基因的受体细胞，这种说法是否合理 并说明理由
合理，因为仅导入载体的和导入插入了目的基因的载体的受体细胞均能在该培养基
中存活 。
分析载体的种类和载体需具备的条件
载体上的标记基因一 般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生
素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内 表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是 被导入了载体的受体细胞。如图所示：
在含有氨苄
进入受 青霉素的培
Amp 体细胞 养基上培养
归纳：标记基因的筛选原理
只有含有载体，并 且载体上的抗性基 因表达的大肠杆菌 才能存活并增殖
含有氨苄青霉素 抗性基因的载体 (如质粒)
大肠杆菌中有的 有载体进入，有
的没有载体进入
目的基因
LacZ 基因表达产生的β-半乳糖甘酶能够分解 X-gal
产生蓝色物质，从而使菌落呈蓝色；否则菌落呈白色。
请分析下列3种大肠杆菌在含 X-gal 和青霉素的固 体
培养基上的存活情况及菌落颜色。
归纳：标记基因的筛选原理
>标记基因进行筛选重组DNA 分子举例
氨苄青霉素 抗性基因
存活；蓝色
存活；白色
无法存活
lacZ 基因
思考 · 讨论 重组DNA 分子
5'-ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC-3'
3'-TATCGTACGATAGGTACTTAAGCCGTATG-5'
5'-TCCTAGAATTCTCGGTATGAATTCCATAC-3'
3'-AGGATCTTAAGAGCCATACTTAAGGTATG-5'
讨论：1.剪刀和透明胶带分别代表哪种
“分子工具”
2.你制作的黏性末端的碱基能不能互补配 对 如果不能，可能是什么原因造成的
3.你插入的DNA 片段能称得上一个基因 吗
请你在上述序列中找到EcoR I 的识
别序列和切割位点。然后，用剪刀进行 “切割”。待切割位点全部切开后，将 从下面那条DNA 链上切下的片段重组到 上面那条DNA 链的切口处，并用透明胶 带将切口粘起来。
5'- TCCTAG -3' 5'-AATTCTCGGTATG-3' 5'- AATTCCATAC-3'
3'-AGGATCTTAA-5' 3'-GAGCCATACTTAA-5' 3'-GGTATG-5'
5'- ATAGCATGCTATCCATGAATTCTCGGTATGAATTCGGCATAC -3'
3'- TATCGTACGATAGGTACTTAAGAGCCATACTTAAGCCGTATG-5'
个 个
胶带 胶带
5'-ATAGCATGCTATCCATG-3'
3'-TATCGTACGATAGGTACTTAA-5'
思考 ·讨论 重组DNA 分子
5'-AATTCGGCATAC-3'
3'-GCCGTATG-5'
1.实验思路：
裂解细胞使核酸分子释放出来
从释放出来的细胞成分中分离核酸分子
纯化获得核酸分子
探究 · 实践 DNA 的粗提取与鉴定
2.实验原理：
( 1 ) 提 取 DNA 的原理： DNA、RNA、 蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存 在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法 对它们进行提取。
>DNA 不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精
>DNA 在不同浓度的NaCl 溶液中溶解度不
同，能溶于2 mol/L 的 NaCl 溶液
> 初步分离DNA 和蛋白质
DNA 溶解度
溶解 DNA
o 0.14
NaCl 浓度(mol/L)
探究 · 实践 DNA 的粗提取与鉴定
( 2 ) 鉴 定DNA 的原理：在一定温度下，DNA 遇二苯胺试剂会呈现蓝色。
3.材料用具：
( 1 ) 选 材 ：DNA 含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪
肝等 。
注意：不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核
和线粒体，几乎不含 DNA。
(2)试剂： ①研磨液
②体积分数为95%的酒精
③ 2 mol/L的NaCl 溶液
④ 二苯胺试剂
⑤ 蒸馏水
探究 ·实践 DNA 的粗提取与鉴定
→ 提取、溶解DNA
→ 析出D NA
→ 溶 解DNA
→ 鉴 定DNA (要现配现)
4.方法步骤：
取材、研磨 称取30g 洋葱，切碎，然后放入研钵中，
倒入10mL 研磨液，充分研磨。
> 研 磨 目 的 ：破碎细胞，使核物质容易溶
解在研磨液中。
探究 · 实践 DNA 的粗提取与鉴定
研磨洋葱
方法一：在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中， 在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。
方法二：直接将研磨液倒入塑料离心管中，1500r/min的转速 下离心5min, 再取上清液放入烧杯中。
>思考：①上清液中除DNA 之外，可能含有哪些杂质
可能含有核蛋白、多糖等杂质
②低温放置几分钟有什么作用
抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA 降解；
抑制DNA 分子运动，使DNA 易形成沉淀析出。
4.方法步骤：
取材、研磨
过滤或离心
探究 · 实践 DNA 的粗提取与鉴定
方法一：在上清液中加入体积相等的、 预冷的酒精溶
液(体积分数为95%),静置2-3min, 溶液中出现的
白色丝状物就是粗提取的DNA 。用玻璃棒沿一个方向
搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分；
> 思考：①搅拌时应轻缓、并沿一个方向
减少DNA 断裂，以便获得较完整的DNA 分子
②酒精预冷的作用
低温可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA 降解； 用冷却的酒精析出DNA 低温抑制DNA 分子运动，使DNA 易形成沉淀析出；
低温有利于增加DNA 的柔韧性，减少断裂。
方法二：将溶液倒入塑料离心管中，在10000r/min的转速下离心5min, 弃上清液，将管底的沉淀物(粗提取的DNA) 晾 干。
探究 · 实践 DNA 的粗提取与鉴定
取材、研磨
过滤或离心
分 离
4.方 法 步 骤 ：
DNA 的粗提取与鉴定
取两支20 mL 的试管，各加入2mol/L 的NaCl 溶液5mL 。将 丝
状物或沉淀物溶于其中一 支试管的NaCl 溶液中。向两支试 管中各加入4mL 的 二苯胺试剂。 混合均匀后，将试管置于沸 水中加热5min 。待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜 色 的 变 化。
对照组 实验组
溶液蓝色的
深浅与溶液
中DNA 的
含量的多少
有 关 。
鉴定DNA 鉴定结果
探究 · 实践
4.方法步骤：
取材、研磨
过滤或离心
分 离
鉴 定
> 思考讨论
1.如果选用鸡血细胞进行实验，如何快速破碎细胞
将鸡血细胞置于蒸馏水中，待细胞涨破后，收集滤液。
2.有时会在DNA 滤液中添加嫩肉粉(木瓜蛋白酶),这样有什么好处
利用蛋白酶分解杂质蛋白，但不分解 DNA, 有利于DNA 与蛋白质分开。
3. 有时还会反复利用不同浓度的NaCl 溶液来溶解、析出DNA, 试猜想该操作的目
的
进一步纯化DNA—— 用高盐浓度的溶液溶解 DNA, 能除去在高盐溶液中不能溶解
的杂质；用低盐溶液使DNA 析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过 反复溶解与析出 DNA, 就能够除去与DNA 溶解度不同的多种杂质。
探究 · 实践 DNA 的粗提取与鉴定
重组DNA技术的基本工具
分子缝合针： 分子运输车：基因进 DNA连接酶 入受体细胞的载体
载体：质粒、噬
菌体、动植物病
毒等
课堂小结
分子手术刀：
限制性内切 核酸酶
作用 部位 磷酸二酯键
作为载体
的条件

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