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第一章　第二节　第2课时
基 础 题 组
一、选择题
1．(2024·四川成都高二校联考期中)下图是牛肉膏蛋白胨培养基的配方，据此分析下列相关叙述错误的是( )
成分 蛋白胨 牛肉膏 NaCl
含量 10.0 g 5.0 g 5.0 g
操作 将上述物质溶解后，用蒸馏水定容至1 000 mL，调节pH为7.0～7.2
A.该培养基是液体培养基
B．该培养基是选择培养基
C．该培养基中含有维生素
D．该培养基不适合霉菌生长
答案：B
解析：该培养基成分中无琼脂，是液体培养基，A正确；从功能上说，牛肉膏蛋白胨培养基是通用(基础)培养基，适合绝大多数细菌生长，不具有选择性，B错误；牛肉膏和蛋白胨提供了维生素，C正确；霉菌适合在酸性培养基中生长，D正确。故选B。
2．(2023·山东省烟台市高三适应性测试)噬菌斑是在固体培养基上由一个噬菌体增殖并裂解宿主菌后形成透明的溶菌空斑，不同噬菌体噬菌斑的形态大小不同。工作人员将0.1 mL稀释106倍的噬菌体样品与敏感细菌混合后平铺在平板上培养一段时间，得到如图所示结果。下列叙述错误的是(　　 )
A．噬菌体样品应有足够的稀释度，以保证初期一个细菌最多被一个噬菌体吸附
B．根据培养基上噬菌斑的数量可以计算出敏感细菌和噬菌体的数量
C．若平均每个平板的噬菌斑数量为150，则该样品中实际噬菌体数可能高于1.5×109个/mL
D．根据培养基上噬菌斑的形状等特征可判断是否需要进一步纯化噬菌体
答案：B
解析：由题意“噬菌斑是在固体培养基上一个噬菌体增殖并裂解宿主菌后形成透明的溶菌空斑”可知，噬菌体样品应有足够的稀释度，以保证初期一个细菌最多被一个噬菌体吸附，A正确；分析题意可知，噬菌斑是由噬菌体增殖并裂解宿主菌后形成的，不是细菌增殖造成的，所以不能计算出敏感细菌的数量，B错误；若平均每个平板的噬菌斑数量为150，则该样品中计算出噬菌体数量为：150÷0.1×106＝1.5×109个/mL，但实际过程中，可能一个细菌不止被一个噬菌体吸附，所以该样品中实际噬菌体数可能高于1.5×109个/mL，C正确；由题意“不同噬菌体噬菌斑的形态大小不同”可知，根据培养基上噬菌斑的形状等特征可判断是否需要进一步纯化噬菌体，D正确。故选B。
3．原油中含有大量有害的、致癌的多环芳烃。土壤中有些细菌可以以原油中的多环芳烃为碳源，在培养基中形成分解圈。为筛选出能高效降解原油的菌种，某小组同学设计了相关实验。下列有关叙述不正确的是(　　 )
A．应配制被原油污染土壤的土壤稀释液备用
B．配制以多环芳烃为唯一碳源的选择培养基
C．将土壤稀释液灭菌后接种到选择培养基上
D．在选择培养基上能形成分解圈的为所需菌种
答案：C
解析：被原油污染的土壤中含有更多的能够降解原油的细菌，A正确；为筛选出能高效降解原油的菌种，选择培养基应以多环芳烃作为唯一碳源，在该选择培养基上能形成分解圈的为所需菌种，B、D正确；所需的菌种在土壤稀释液中，土壤稀释液不能进行灭菌，C错误。
4．在做分离分解尿素的细菌实验时，甲同学从对应稀释倍数为106的培养基上筛选出大约150个菌落，而其他同学只筛选出大约50个菌落。下列有关叙述，出现科学性错误的是(　　 )
A．甲同学出现这种结果的原因可能是土样不同，也可能是操作过程出了问题
B．可以将甲同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养作为空白对照，以证明培养基是否受到污染
C．让其他同学用与甲同学一样的土壤进行实验，如果结果与甲同学一致，则可以证明甲同学无误
D．B、C选项的实验思路都遵循了实验的对照原则
答案：D
解析：甲同学获得的菌落数远大于其他同学，可能是由于所取的土样不同，也可能是由于操作过程中被污染，A正确；被污染可能是因为培养基灭菌不彻底，或操作过程中没有保证无菌操作，将甲同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养作为空白对照，可以证明培养基是否受到污染，B正确；若题述结果是土样不同造成的，让其他同学用与甲同学一样的土壤进行实验，如果结果与甲同学一致，则可以证明甲同学操作正确，C正确；B选项的实验思路遵循了实验的对照原则，C选项的实验思路遵循了实验的重复原则，D错误。
5．用10、102和103倍稀释液进行涂布培养细菌后，其菌落平均数为2 890、270和50，则每毫升样品中菌落总数(涂布平板时所用的稀释液体积为0.1 mL)为(　　 )
A．2.89×105个 B．3.85×105个
C．6.0×105个 D．2.7×105个
答案：B
解析：计数时一般选择平均菌落数在30～300之间的平板，题中所给菌落数在30～300之间的为270和50，应取二者的平均值进行计算，根据公式每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M，故每毫升菌落总数为(270÷0.1×102＋50÷0.1×103)÷2＝3.85×105(个)。
6．(2024·福建省漳州市教学质量检测)某学者用“影印培养法”研究大肠杆菌抗药性形成与环境的关系：将原始敏感菌种接种在1号培养基上，培养出菌落后，将灭菌绒布在1号上印模，绒布沾上菌落并进行转印，使绒布上的菌落按照原位接种到2号和3号培养基上。待3号上长出菌落后，在2号上找到对应的菌落，然后接种到不含链霉素的4号培养基中，培养后再接种到5号培养基上，重复以上步骤。实验过程如图所示。下列相关叙述错误的是(　　 )
A．大肠杆菌抗链霉素的变异可能是由基因突变引起的
B．1号和5号采用稀释涂布平板法将菌种接种在相应的培养基上
C．4号、8号、12号培养基中抗性菌落(株)的比例最大的是4号
D．大肠杆菌抗药性的形成是在施加链霉素之前，而发生选择作用是在施加链霉素之后
答案：C
解析：大肠杆菌是原核生物，大肠杆菌抗链霉素的性状可能是由基因突变引起的，A正确；由图可知，1号和5号采用稀释涂布平板法将菌种接种在相应选择培养基上，B正确；4号、8号、12号培养基中，大肠杆菌抗链霉素菌株的比例逐渐增大，因此抗性菌落(株)的比例最大的是12号，C错误；微生物的抗药性突变是自发产生的，环境只能对抗药性突变进行选择，因此大肠杆菌抗药性的形成是在施加链霉素之前，而发生选择作用是在施加链霉素之后，D正确。故选C。
二、非选择题
7．(2023·湖北宜昌高二校联考期中)研究者从温泉中筛选出高效产生耐高温淀粉酶的嗜热菌，其筛选过程如图1所示。回答下列问题：
(1)该培养基中必须以________作为唯一的碳源。
(2)Ⅰ号、Ⅱ号培养基都属于固体培养基，配置时__________________(填“先调pH后灭菌”或“先灭菌后调pH”)。Ⅱ号培养基上的接种方法为__________，从其上挑取单个菌落进行液体培养后，可借助特定的__________________或____________________采用__________进行直接计数，该方法是一种常用的、快速直观的测定微生物数量的方法。
(3)挑选出能产生耐高温淀粉酶的嗜热菌菌落的鉴别方法是：将得到的菌悬液转接于同时含有葡萄糖和淀粉为碳源的固体培养基上培养，得到若干菌落后用________作显色处理，得到如图2所示结果，可判断图中________________的菌落含有所需菌种。
答案：(1)淀粉
(2)先调pH后灭菌　平板划线法　细菌计数板　血细胞计数板　显微镜
(3)碘液　周围不显蓝色
解析：(1)分析题意，本实验目的是筛选高效产生耐高温淀粉酶的嗜热菌，则应以淀粉为唯一碳源，在该培养基上只有能分解淀粉的微生物能生长。(2)为避免杂菌污染，配置时应先调pH后灭菌；据图可知，Ⅱ号培养基中是划线分布，故接种方法是平板划线法；微生物的直接计数方法是细菌计数板(适用于细胞小的)或血细胞计数板(适用于细胞大的)；常用的、快速直观的测定微生物数量的方法是显微镜直接计数。(3)淀粉与碘液反应呈蓝色，但如果淀粉分解菌中的淀粉酶将淀粉水解后就不能呈蓝色，则会出现无色的透明圈，故图乙所示情况中周围不显蓝色的菌落含有所需菌种。
能 力 提 升
一、选择题
1．下表为培养某种微生物的培养基配方，下列相关叙述错误的是( )
成分 NaNO3 K2HPO4 KCl MgSO4·7H2O FeSO4 (CH2O) H2O 青霉素
含量 3 g 1 g 0.5 g 0.5 g 0.01 g 30 g 1 L 0.1万单位
A.依物理性质划分，该培养基属于液体培养基
B．由培养基的原料可知，所培养微生物的同化作用类型是异养型，培养的微生物可以是酵母菌
C．培养基中的唯一碳源是(CH2O)，唯一氮源是NaNO3
D．若用该培养基培养纤维素分解菌，则应除去(CH2O)，再添加纤维素
答案：D
解析：由培养基配方表可知，该培养基中没有加入琼脂，属于液体培养基，A正确；(CH2O)属于有机碳源，因此所培养微生物的同化作用类型是异养型，培养的微生物可以是酵母菌，B正确；能为微生物的生长繁殖提供所需碳元素的物质叫碳源，能为微生物的生长繁殖提供所需氮元素的物质叫氮源，该培养基中唯一碳源是(CH2O)，唯一氮源是NaNO3，C正确；纤维素分解菌是细菌，青霉素对其具有杀灭作用，故若用该培养基培养纤维素分解菌，则应除去(CH2O)和青霉素，再添加纤维素，D错误。
2．某小组的同学为了调查湖水中细菌的污染情况而进行了实验，包括制备培养基、灭菌、接种及培养、菌落观察与计数。下列与此实验相关的叙述中，正确的是(　　 )
A．实验用过的带菌培养基经过加热后才能倒掉
B．利用平板划线法对细菌进行分离纯化并计数
C．观察细菌培养的实验中，最好是在另一平板上接种清水作为对照实验
D．培养基中含有的蛋白胨、淀粉可分别为细菌培养提供氮源和碳源
答案：D
解析：实验用过的带菌培养基，需要用湿热灭菌(高压蒸汽灭菌)法灭菌后才能倒掉，以免污染环境，A错误；利用平板划线法可以对细菌进行分离纯化，但是不能计数，应利用稀释涂布平板法对细菌进行分离纯化并计数，B错误；要使该实验所得结果可靠，还应该同时在另一平板上接种无菌水作为对照实验，C错误；培养基中含有的蛋白胨、淀粉可分别为细菌培养提供氮源和碳源，蛋白胨也可以提供碳源，D正确。
3．下列关于测定土壤中微生物数量的叙述，不正确的是(　　 )
A．显微镜直接计数计算的结果比实际值偏大
B．当样品的稀释度足够高时，一个活菌会形成一个菌落
C．采用稀释涂布平板计数法获得的菌落数往往少于实际的活菌数
D．统计菌落数目时，只要菌落数目在30～300的平板都可以计数，并以它们的平均值作为统计结果
答案：D
解析：利用稀释涂布平板法计数时，当稀释倍数适宜的情况下才可以计数其菌落数在30～300的平板，稀释倍数不足或过大时，会影响计数结果，所以D错误。
4．某些土壤细菌可将尿素CH4N2O分解为CO2和NH3，供植物吸收和利用，但分解物CO2不能为该菌提供营养。下列关于配制分离这一菌种的选择培养基的成分符合要求的是(　　 )
A．仅尿素 B．尿素＋葡萄糖
C．仅葡萄糖 D．牛肉膏蛋白胨
答案：B
解析：配制该培养基时应选尿素为唯一氮源，同时，该菌不能以分解物CO2为营养，即该菌为异养的，应加入葡萄糖来提供碳源，因此应选B。
5．(2024·浙江校联考)嗜热菌又称高温细菌，是一类生活在高温环境中的微生物。研究者从温泉中筛选高效产生高温淀粉酶的嗜热菌，其筛选过程如图1所示。将得到的菌悬液转接于同时含有葡萄糖和淀粉作碳源的固体培养基上培养，得到若干菌落后用碘液作显色处理，结果如图2所示。下列说法正确的是(　　 )
A．甲、乙试管为液体培养基，液体培养基能分离获得嗜热菌单菌落
B．只有能产生淀粉酶的微生物才能在I、Ⅱ号培养基上生长
C．丙试管中嗜热菌数量迅速增加，培养过程中需保证充足的营养和室温条件
D．图2中周围不显蓝色的菌落含有所需的嗜热菌
答案：D
解析：甲、乙试管为液体培养基，液体培养基不能分离出单菌落，A错误；结合题干可知，只有能产生高温淀粉酶的微生物才能在I、Ⅱ号培养基上生长，B错误；结合题干可知，丙中噬热菌数量迅速增加，培养过程中需保证充足的营养和高温条件，C错误；图2中周围不显蓝色的菌落，说明其产生的淀粉酶可以在高温下分解淀粉，所以周围不显蓝色的菌落含有所需的嗜热菌，D正确。故选D。
6．(2024·河北模拟预测)酿酒酵母菌种的性能是决定果酒品质的重要因素。如图表示从土壤中筛选酿酒酵母的过程。下列叙述正确的是(　　 )
A．图示接种方法为稀释涂布平板法，据结果推测1 g土壤中酵母菌数最多为1.6×106(个)
B．分离、纯化酵母菌时，还可采用平板划线法且该方法也需要进行③步骤操作
C．获得酿酒酵母纯培养物的关键是防止杂菌污染，故应对土壤、培养基及用具进行灭菌
D．进行步骤⑤时，应用液体培养基培养④中的酵母菌，并检测酵母菌的数量和酒精含量
答案：D
解析：图示接种方法为稀释涂布平板法，据结果推测1 g土壤中酵母菌数为1.6×106(个)，该方法估算值低于真实数值，故1 g土壤中酵母菌数最少为1.6×106(个)，A错误；分离、纯化酵母菌时，还可采用平板划线法但该方法不需要进行③步骤操作，B错误；对土壤灭菌可将其中的酿酒酵母杀死，将不能获得酿酒酵母的纯培养物，C错误；用经过④纯化的菌种，需要检测酵母菌的数量和酒精含量，然后进行步骤⑤，D正确。故选D。
二、非选择题
7．金黄色葡萄球菌具有高度耐盐性，在血平板(培养基中添加适量血液)上生长时，可破坏菌落周围的红细胞，使其褪色。下面是某研究小组测定某水样中金黄色葡萄球菌浓度的实验操作。请回答下列问题：
(1)金黄色葡萄球菌的培养基为质量分数为7.5%的NaCl牛肉膏蛋白胨培养基，此培养基能为金黄色葡萄球菌的生长提供__________________________。培养基中加入质量分数为7.5%的NaCl利于金黄色葡萄球菌的筛选，原因是__________________________________________________。
(2)上述培养基的灭菌方法是______________________________。在制作血平板时需等平板________后，方可加入血液，以防止__________________。
(3)现将10 mL菌液进行梯度稀释，依次稀释成10、102、103、104倍的4个稀释样液，再取4个稀释样液各0.1 mL分别接种到4组血平板上(每组3个，每个接种0.1 mL)，所用方法是__________________。在血平板上，金黄色葡萄球菌菌落的周围会出现_____________________。若在103倍稀释液的3个血平板上，金黄色葡萄球菌菌落数分别为35、36和37，则每升水样中的活菌数约为_______________。
答案：(1)碳源、氮源、水和无机盐　不影响金黄色葡萄球菌生长的同时抑制其他菌的生长
(2)湿热灭菌(高压蒸汽灭菌)法　冷却　高温破坏血细胞
(3)稀释涂布平板法　透明圈(溶血圈) 　3.6×108个
解析：(1)培养基能为微生物的生长提供碳源、氮源、水和无机盐。因为金黄色葡萄球菌具有高度耐盐性，培养基中加入质量分数为7.5%的NaCl不影响金黄色葡萄球菌的生长，但会抑制其他菌的生长，因此利于金黄色葡萄球菌的筛选。(2)对培养基灭菌常用湿热灭菌法或高压蒸汽灭菌法。在制作血平板时需等平板冷却后，方可加入血液，以防止高温破坏血细胞。(3)现将10 mL菌液进行梯度稀释，依次稀释成10～104倍的4个稀释样液，再取4个稀释样液各0.1 mL分别接种到4组血平板上(每组3个，每个接种0.1 mL)，则所用方法是稀释涂布平板法。金黄色葡萄球菌在血平板(培养基中添加适量血液)上生长时，可破坏菌落周围的红细胞，使其褪色。因此在血平板上，金黄色葡萄球菌菌落的周围会出现透明圈(溶血圈)。若在103组的3个血平板上，金黄色葡萄球菌菌落数分别为35、36和37，则每升水样中的活菌数约为×103××1 000＝3.6×108(个)。
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第1章　发酵工程
第2节　微生物的培养技术及应用
第2课时　微生物的选择培养和计数
知识点一　发酵与传统发酵技术
基础知识·双基夯实
1．概念：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。
2．实例：筛选土壤中分解尿素的细菌的选择培养基以___________
______。
3．原理：人为提供有利于目的菌生长的条件(包括营养、温度和pH等)，同时抑制或阻止其他微生物的生长。
氮源
尿素为唯一
1．选择分解尿素的细菌的培养基为液体培养基。(　　 )
2．可以筛选出石油降解菌的培养基为鉴别培养基。(　　 )
×
×
1.要分离出分解纤维素的微生物，应在什么样的环境中取土样？应配制什么样的培养基？
提示：应从富含纤维素的环境中取土样，如树林中多年落叶形成的腐殖土。应配制以纤维素为唯一碳源的培养基。
2．根据选择培养基的原理，如何筛选出耐酸菌？
提示：可将培养基的pH调至酸性，再接种培养。
课内探究·名师点睛
1．选择培养微生物的四种方法及其实例
选择培养原理 具体处理 分离菌种
利用营养缺陷型选择培养基进行的选择培养 不加含碳有机物的无碳培养基 分离自养型微生物
无氮培养基 分离自生固氮微生物
选择培养原理 具体处理 分离菌种
利用微生物(目的菌)对某种营养物质的特殊需求，使该营养物质成为某类微生物的唯一供给者 石油作为唯一碳源的培养基 分离能消除石油污染的微生物
尿素作为唯一氮源的培养基 分离能分解尿素的微生物
在完全培养基中加入某些化学物质，利用加入的化学物质抑制部分微生物生长或利于部分微生物生长 加入青霉素等抗生素 分离酵母菌和霉菌等真菌，同时抑制细菌、放线菌的生长
加入高浓度的食盐 分离金黄色葡萄球菌
选择培养原理 具体处理 分离菌种
在高盐环境中 可分离耐盐菌，其他菌在高盐浓度下易失水而不能生存
在高温环境中 可分离得到耐高温的微生物，其他微生物在高温环境中因酶失活而无法生存
2.尿素分解菌的鉴定
在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将尿素分解成了NH3。NH3会使培养基的碱性增强，pH升高。在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红，则可初步说明该种细菌能够分解尿素。
3．鉴别培养基
(1)特点：根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品。
(2)用途：鉴别不同种类的微生物(如可用伊红—亚甲蓝琼脂培养基鉴别饮用水或乳制品中是否有大肠杆菌。若有，菌落呈现深紫色)。
1.选择培养基可以从混杂的微生物群体中分离出所需的微生物，通过不含有机物的培养基、缺氮培养基、含尿素(不含其他氮源)的培养基，可从土壤中分离出的微生物依次是(　　 )
A．硝化细菌、放线菌、根瘤菌
B．根瘤菌、青霉菌、固氮菌
C．异养细菌、放线菌、硝化细菌
D．自养细菌、固氮菌、分解尿素的细菌
答案：D
解析：不含有机物的培养基可以选择自养微生物，缺少氮元素的培养基可以选择固氮微生物，含尿素(不含其他氮源)的培养基可以选择能分解尿素的微生物。
能在选择培养基上生长的不一定是所需要的目的菌。原则上选择培养基只允许特定种类的微生物生长，但实际上，微生物的培养是一个非常复杂的问题，有些微生物可以利用其他微生物的代谢产物生长繁殖，因此能在选择培养基上生长的微生物不一定都是所需的微生物，还需进一步的鉴定。
变式训练 (2024·锦州期末)大肠杆菌的含量是国家饮用水重要检测指标之一，如图所示，用滤膜法和伊红—亚甲蓝琼脂培养基(EMB培养基)测定水中大肠杆菌含量的大致流程为准备工作→用滤膜过滤待测水样→将滤膜转移到EMB培养基上→培养→观察并统计菌落数目。下列叙述正确的是(　　 )
伊红—亚甲蓝琼脂培养基配方
基础培养基　　　　　　　 100 mL
　20%乳糖溶液 2 mL
　2%伊红水溶液 2 mL
　0.5%亚甲蓝水溶液 1 mL
　琼脂 1.5 g
A．EMB培养基从用途来分属于选择培养基
B．配方的基础培养基中除水外还必须含有无机盐和碳源
C．观察并统计菌落数目时，应选择培养基上的深紫色菌落进行计数
D．选用滤膜孔径的大小不会影响实验结果
答案：C
解析：EMB培养基从用途来分属于鉴别培养基，A错误；配方的基础培养基中除水外还必须含有无机盐和氮源，乳糖可作为碳源，B错误；大肠杆菌在EMB培养基上可呈深紫色，并有金属光泽，观察并统计菌落数目时，应选择培养基上的深紫色菌落进行计数，C正确；选用滤膜孔径过大可能会导致实验结果比实际值偏小，D错误。
知识点二　微生物数量测定方法分析
基础知识·双基夯实
一、微生物的选择培养
1．菌液稀释
(1)将10 g土样加入盛有_______mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀，得到稀释10倍的菌液。
(2)取1 mL上清液加入盛有9 mL无菌水的试管中，得到稀释102倍的菌液，依次等比稀释。
90
2．稀释涂布平板法的操作步骤
涂布平板：用涂布器将_______均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀
3．待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30～37 ℃的恒温培养箱中培养1～2 d。
4．结果：在涂布有合适浓度菌液的平板上观察到分离的单菌落。
菌液
二、微生物的数量测定
1．常用方法：_________________和显微镜直接计数法。
2．稀释涂布平板法统计样品中活菌的数目
(1)为了保证结果准确，同一稀释度下，应至少设3个平板，一般选择菌落数在_________________________的平板进行重复计数，并取平均值。
(2)统计的菌落数往往比活菌的实际数目少，因为________________
_____________，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。
稀释涂布平板法
30～300，适于计数
当两个或多个细胞
连在一起时
3．利用显微镜进行直接计数
(1)工具：特定的细菌计数板或血细胞计数板。
(2)统计的结果一般是活菌数和死菌数的总和。
特别提醒：显微镜直接计数法本身不能区分细菌的死活，因此一般用来统计总菌数。但是，通过一定的辅助处理，可以实现活菌计数，如在计数前用台盼蓝染液进行染色，可以通过统计无色细胞的个数来对活菌进行计数。
1．用平板划线法培养计数，应选择菌落数在10～100的平板。(　　 )
2．利用稀释涂布平板法统计菌落数目的理论依据是当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落来源于样品稀释液中的一个活菌。(　　 )
×
√
1.为什么一般选择菌落数为30～300的平板进行计数？
提示：若平板上菌落数过多，说明稀释度过低，菌体的密度大，就会出现更多的两个或两个以上的菌体形成的菌落，结果不准确，且计数较困难。若平板上菌落数过少，菌落形成的偶然性大，结果也不准确。
2．稀释涂布平板法和显微计数法对微生物计数产生的实验误差如何？试分析原因。
提示：稀释涂布平板法计数的值比实际值小，原因是当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落；显微计数法计数的结果比实际值大，原因是显微镜下无法区分细胞的死活，计数时包括了死细胞。
3．在稀释涂布平板法中，为何需至少涂布3个平板？
提示：作为重复实验，统计时取平均值，以减少偶然因素对实验结果的影响，增强实验结果的说服力。
4．为什么要选取菌落数目稳定时的记录作为结果？
提示：尽量缩小统计的菌落数与实际活菌数的差值，因为繁殖慢的菌体开始看不出明显的菌落。(或：可以防止培养时间不足而导致遗漏菌落。)
课内探究·名师点睛
1．微生物数量测定方法
微生物数量测定的常用方法有稀释涂布平板法、显微镜直接计数法等。二者的比较如下表所示：
项目 显微镜直接计数法 稀释涂布平板法(间接计数法)
原理 利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计数一定容积的样品中微生物的数量 当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约有多少活菌
主要用具 显微镜、细菌计数板(或血细胞计数板) 培养基
项目 显微镜直接计数法 稀释涂布平板法(间接计数法)
计数数据 菌体本身 培养基上的菌落数
优点 计数方便、操作简单 计数的是活菌
缺点 死菌、活菌都计算在内 操作较复杂，有一定误差
计算公式 每毫升原液含菌数＝每小格平均菌体数×400×10 000×稀释倍数 每毫升原液含菌数＝培养基上平均菌落数×稀释倍数 ÷涂布液体积
2.平板划线法与稀释涂布平板法的比较
项目 平板划线法 稀释涂布平板法
工具 接种环 涂布器
分离
单菌
落的
原理 通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。在数次划线后培养，可以分离到由一个细菌细胞繁殖而来的肉眼可见的细胞群体，即菌落 将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细菌细胞，从而能在培养基表面形成单个菌落
特点 可以分离得到单菌落，且操作简单，但不宜计数 可以分离得到单菌落，可以计数，但操作复杂
2.(2024·长春联考)平板划线法和稀释涂布平板法是纯化微生物的两种常用方法，下列描述正确的是(　　 )
A．都要将菌液进行一系列的梯度稀释
B．平板划线法是将不同稀释度的菌液通过接种环在固体培养基表面进行连续划线的操作
C．稀释涂布平板法是将不同稀释度的菌液倒入液体培养基进行培养
D．都是在固体培养基上进行的，都需要在酒精灯火焰旁进行接种
答案：D
解析：平板划线法不需要进行梯度稀释，A、B均错误；稀释涂布平板法是将不同稀释度的菌液滴加到固体培养基的表面，然后用涂布器将菌液均匀涂布在培养基表面，C错误；稀释涂布平板法和平板划线法都需要形成单菌落，都必须在固体培养基上进行接种，且均需无菌操作，都需要在酒精灯火焰旁进行接种，D正确。
稀释涂布平板法计数的几个注意事项
(1)为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。
(2)要设置对照实验，且一定要涂布至少3个平板作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性。
(3)计数时机：每隔24 h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，这样可以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。
(4)用此种方法统计的菌落数目往往比活菌的实际数目低。这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。
变式训练 下列有关稀释涂布平板法计数和显微镜直接计数法的描述不正确的是(　　 )
A．利用血细胞计数板计数属于显微镜直接计数法，其缺点是不能区分死菌与活菌
B．两种计数方法，其统计值与实际值相比，均有差异，但差异原因不同
C．两种计数方法均能在计数的同时观察到所研究微生物的形态特征
D．当菌落数目稳定时，一般选取菌落在30～300的且差异不大的平板进行计数
答案：C
解析：显微镜直接计数法只能看到细菌，无法区分死菌和活菌，A正确；稀释涂布平板法计数中，当多个细菌连在一起时，平板上观察到的往往是一个菌落，故而统计值比实际值小，显微镜直接计数法不能区分死菌和活菌，故测定的微生物数量往往大于实际的活菌数，因此两种计数方法的统计值与实际值相比均有差异，但差异原因不同，B正确；稀释涂布平板法观察到的是菌落的形态特征，而不是微生物的形态特征，显微镜直接计数法观察到的是微生物的形态特征，C错误；当菌落数目稳定时，一般选取菌落在30～300的且差异不大的平板进行计数，D正确。
知识点三　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数的实验操作
基础知识·双基夯实
1．分离原理：土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成_______。利用尿素作为唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。
脲酶
2．操作步骤
(1)土壤取样
土壤中的微生物主要分布在距地表3～8 cm的土壤层(酸碱度接近中性)，取样时用的铁铲和取样袋使用前都需要灭菌。
(2)样品的稀释
为保证获得菌落数为30～300的平板进行计数，可将稀释倍数为1×103～1×107的稀释液分别涂布到平板上培养。
(3)微生物的培养与观察
不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌一般在30～37 ℃的温度下培养1～2 d(放线菌一般在25～28 ℃的温度下培养5～7 d；霉菌一般在25～28 ℃的温度下培养3～4 d)。在菌落计数时，每隔24 h统计一次菌落数目，选取_______________时的记录作为结果。
菌落数目稳定
1．分解尿素的细菌在分解尿素时，可以将尿素转化为氨，使得培养基的pH降低。(　　 )
2．在用涂布器涂布平板时，为了操作方便可完全打开培养皿的皿盖。(　　 )
3．利用稀释涂布平板法和平板划线法均可实现细菌的分离和计数。(　　 )
×
×
×
甲、乙两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。
(1)甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230，该同学的统计结果是否真实可靠？为什么？
(2)乙同学在该浓度下涂布了3个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学将21舍去，然后取平均值。该同学对实验结果的处理是否合理？为什么？
(3)某同学在三种稀释度下吸取0.1 mL的菌液涂布平板，统计菌落数，得到了以下的数据，试计算1 g样品的活菌数。
平板
菌落
稀释度 平板1 平板2 平板3
104 320 360 356
105 212 234 287
106 21 23 18
提示：(1)不可靠。为增强实验的说服力与准确性，应设置重复实验，在同一稀释度下涂布至少3个平板，统计结果后计算平均值。
(2)不合理。微生物计数时，如果实验中出现重复实验结果不一致的情况，应分析实验过程中可能的影响因素，找出差异的原因，需重新实验，而不能简单地舍弃。
(3)105的稀释度下取0.1 mL涂布的三个平板上的菌落数在30～300，计算其平均值为(212＋234＋287)/3≈244。进一步可以换算出1 g样品中活菌数为(244÷0.1)×105＝2.44×108。
课内探究·名师点睛
1．实验设计流程
2．结果分析与评价
内容 现象 结论
有无杂菌污
染的判断 对照的培养皿中无菌落生长 未被杂菌污染
选择培养基中菌落数偏高 被杂菌污染
菌落形态多样，菌落数偏高 培养基中混入其他氮源
选择培养基的筛选作用 牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目大于选择培养基上的数目 选择培养基具有筛选作用
样品的稀释操作 得到2个或2个以上菌落数目在30～300的平板 操作成功
重复组的结果 若选取同一种土样，统计结果应接近
3.如图为土壤中分解尿素的细菌的分离与计数实验中样品稀释示意图。据图分析，下列叙述正确的是(　　 )
A．3号试管的稀释倍数为103倍
B．4号试管中稀释液进行平板培养得到的菌落平均数恰好为5号试管的10倍
C．5号试管的结果表明每克土壤中的菌株数为1.7×109个
D．该实验方法统计得到的结果往往会比实际活菌数目要多
答案：C
解析：分析题图可知，3号试管的稀释倍数为104倍，A错误；4号试管中稀释液进行平板培养得到的菌落平均数不一定恰好为5号试管的10倍，B错误；5号试管的结果表明每克土壤中的菌株数为(168＋175＋167)÷3÷0.1×106＝1.7×109(个)，C正确；在固体培养基上可能存在两个或多个菌体形成一个菌落的情况，因此用稀释涂布平板法得到的结果往往会比实际活菌数目少，D错误。
变式训练 分解尿素的微生物广泛存在于农田等土壤中，下列关于对分解尿素的微生物进行分离和计数的操作正确的是(　　 )
A．分解尿素的微生物含有脲酶，因此配制培养基时应选择包括尿素在内的多种物质作为氮源
B．培养基中添加酚红作为指示剂，培养后，培养基pH会降低，可使指示剂变红色
C．在接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先培养一段时间，目的是检测培养基平板灭菌是否合格
D．计数时，在同一稀释度下，任取3个平板对其中的菌落数进行统计，取其均值即可
答案：C
解析：分解尿素的微生物含有脲酶，配制分解尿素的培养基时应以尿素作为唯一氮源；培养基中添加酚红作为指示剂，培养后，细菌合成的脲酶将尿素分解为氨，培养基的碱性增强，pH升高，可使指示剂变红色；为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。
指点迷津·拨云见日
不能理解“多次划线”与“逐步稀释分散成单菌落”的关系
平板划线法中通过“多次划线”操作，达到“逐步稀释分散成单个菌落”的结果。具体分析如下：
(1)通过每次划线稀释菌种，线条末端菌体数少于线条首端。
(2)每次划线前灼烧接种环，杀死接种环上的微生物，保证下一次划线的菌种来自上一次划线的末端。再次通过划线稀释菌种，依次类推，得到单个菌落。
4.下图中甲是稀释涂布平板法中的部分操作，乙是平板划线法的划线操作。下列叙述中错误的是(　　 )
A．甲图中涂布前要将涂布器灼烧，冷却后才能涂菌液
B．甲、乙两图的操作中只有甲可以用于微生物的计数
C．乙图中接种环需要灼烧5次
D．乙图中连续划线的起点是上一次划线的末端
答案： D
解析：甲图中采用了稀释涂布平板法，涂布前要将涂布器灼烧，冷却后才能涂菌液，A项正确；乙图的操作对应平板划线法，无法用于微生物的计数，B项正确；乙图平板中划了5个区域，因此操作过程中接种环需要灼烧6次，C项错误；乙图中每次划线的起点是上一次划线的末端，D项正确。
1.选择培养基是指允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。
2．只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，因此可用尿素为唯一氮源的选择培养基分离能分解尿素的细菌。
3．为确保结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。
4．当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。
5．稀释涂布平板法统计的菌落数往往比活菌的实际数目少，这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
课堂达标·巩固训练
1．分离土壤中分解尿素的细菌，对培养基的要求是(　　 )
①加尿素　②不加尿素　③加琼脂　④不加琼脂　⑤加葡萄糖　⑥不加葡萄糖　⑦加硝酸盐　⑧不加硝酸盐
A．①③⑤⑧
B．②④⑥⑧
C．①③⑤⑦
D．①④⑥⑦
答案：A
解析：要分离分解尿素的细菌应以尿素为唯一氮源，①正确、 ②错误；分离土壤中分解尿素的细菌用固体培养基，需加入琼脂，③正确，④错误；培养基中需要加碳源即葡萄糖，⑤正确，⑥错误；不需要其他氮源，故不加硝酸盐，⑦错误，⑧正确。故符合题意的有①③⑤⑧，A正确。
2．用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数时，通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中的活菌数。原因是(　　 )
A．平板上的一个菌落就是一个细菌
B．菌落中的细菌数是固定的
C．此时的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌
D．此方法统计的菌落数一定与实际的活菌数相同
答案：C
解析：用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数时，平板上的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌，偶尔会来自两个或更多个活菌。
3．请分析以下材料，并回答问题：
材料一：硝化细菌是一类能进行化能合成作用的细菌，包括亚硝酸细菌和硝酸细菌两个菌群，这两个菌群通常生活在一起。亚硝酸细菌可将氨氧化成亚硝酸，硝酸细菌可将亚硝酸氧化成硝酸，氨和亚硝酸分别是亚硝酸细菌和硝酸细菌的唯一能源。
材料二：可利用以下两种选择培养基，通过振荡培养从土壤中分离得到较纯净的硝酸细菌和亚硝酸细菌。
1号选择培养基 2号选择培养基
(NH4)2SO4 NaNO2
NaCl MnSO4
FeSO4 Na2CO3
K2HPO4 K2HPO4
MgSO4 MgSO4
CaCO3 NaH2PO4
蒸馏水 蒸馏水
答案：(1)NaNO2　缺乏亚硝酸细菌生长繁殖所需的唯一能源物质氨
(2)好氧
(3)琼脂　(NH4)2SO4(或NH)　稀释涂布平板　菌落
解析：材料一是回答(1)(2)(3)的依据；对材料二的分析应从表中成分的分析着手。

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