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专题六 胚胎工程
——高二生物学人教版（2019）选择性必修三速练100题
1.2023年，我国某科研团队发表了小鼠桑葚胚样全潜能细胞体外培养的相关研究。该团队通过提高小鼠胚胎干细胞pSTAT3基因的表达水平，体外制备出桑葚胚样全潜能细胞（该细胞在分子水平及发育潜能上具有桑葚胚时期细胞的特性），并在体外成功模拟了小鼠胚胎发育至原肠胚阶段的过程。下列有关叙述错误的是( )
注：pSTAT3是调控胚胎发育的关键基因
A.可诱导桑葚胚样全潜能细胞发育至囊胚期
B.诱导桑葚胚样全潜能细胞分化时，基因的碱基序列和表达情况都会发生改变
C.囊胚期细胞重置至桑葚胚样全潜能细胞的过程类似于脱分化
D.桑葚胚发育成囊胚的过程中，pSTAT3基因的表达量下降
2.下图是科研人员利用白鼠和黑鼠的早期胚胎培育黑白嵌合体小鼠的流程，下列叙述不正确的是( )
A.图中早期胚胎可用冲卵的方法从母鼠输卵管内获得
B.过程①中需利用相关技术去除早期胚胎外的透明带
C.过程②中可利用灭活的病毒诱导卵裂球细胞发生融合
D.嵌合胚胎发育到囊胚期细胞开始出现分化
3.如图表示某哺乳动物胚胎的早期发育过程，a~c表示相关过程，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ表示相关时期。下列相关叙述正确的是( )
A.过程a表示卵裂，该时期细胞数量和体积不断增加
B.过程b细胞逐渐分化，Ⅱ分为内胚层、中胚层和外胚层
C.过程c表示孵化，孵化后发育形成的Ⅲ时期表示原肠胚
D.早期胚胎发育过程中滋养层细胞会发育成胎儿的各种组织
4.澳大利亚出生了一对半同卵双胞胎姐弟，受精卵形成及早期胚胎发育的过程如图所示。图1是异常受精过程，图2中有1个雌原核和2个雄原核，图3中该受精卵进行有丝分裂，姐妹染色单体分离后，分别移向细胞的三个不同方向，从而分裂成A、B、C三个细胞，如图4所示（其中细胞A和B发育成姐弟二人，细胞C只含父系染色体）。下列叙述正确的是( )
A.图1表示该异常胚胎的受精过程，此时的卵子为初级卵母细胞
B.该卵子与2个精子受精，表明透明带和卵细胞膜在阻止多精入卵的过程中不起作用
C.这对姐弟来源于母亲的染色体一般相同，来源于父亲的染色体不同
D.图4中细胞B含有双亲染色体各一组，细胞C的性染色体组成一定是YY
5.胚胎干细胞在无血清培养液中悬浮培养可形成类胚体，类胚体由来自三个胚层（内胚层、中胚层和外胚层）的细胞组成，排列杂乱，哺乳动物的神经细胞由外胚层细胞发育而来。小分子化合物a能阻滞内胚层和中胚层细胞的形成，而有利于外胚层细胞的形成。下列相关叙述错误的是( )
A.外胚层细胞发育成神经细胞的过程中有细胞的增殖和分化
B.胚胎干细胞形成类胚体的过程中，会发生基因的选择性表达
C.向培养液中添加小分子化合物a不利于类胚体细胞分化为神经细胞
D.题中所述的胚胎干细胞和外胚层细胞的遗传物质相同
6.被称为“沙漠之舟”的骆驼只有单峰骆驼和双峰骆驼两种，其中单峰骆驼已经野外灭绝，在我国干燥、缺水的戈壁无人区发现了小规模野化单峰骆驼群,科学家欲通过胚胎移植等方法拯救野化单峰骆驼，进行了如图所示的研究。下列叙述正确的是( )
A.图中C后代体细胞中，核遗传物质的一半来源于A野化单峰骆驼
B.移植重构胚前，需要给受体雌性骆驼注射免疫抑制剂以避免发生免疫排斥
C.对囊胚进行胚胎分割操作，操作过程中必须将滋养层细胞均等分割
D.图示过程涉及动物体细胞核移植、早期胚胎培养和胚胎移植等技术
7.下图表示研究人员利用胚胎工程培育优质奶牛的过程，下列相关说法正确的是( )
A.①代表体外受精，与体内受精不同的是体外受精精子需要获能
B.②代表早期胚胎培养，该过程中细胞进行有丝分裂，无细胞分化
C.③代表胚胎分割，需均等分割桑葚胚的内细胞团，以免影响胚胎发育
D.⑤代表胚胎移植，受体应处于适合的生理状态，可事先用激素对供体和受体进行同期发情处理
8.某科研团队通过孤雌生殖技术、核移植技术获得幼猪的过程如图所示。下列说法错误的是( )
A.获得孤雌生殖猪的过程没有精子参与,但其仍是二倍体生物
B.可用促性腺激素处理良种母猪,使其超数排卵
C.胚胎移植前,需对供体和受体进行免疫检查,避免发生免疫排斥反应
D.核移植中的“去核”是指去除卵母细胞中纺锤体一染色体复合物
9.我国科学家成功地用PS细胞克隆出了活体小鼠,部分流程如图所示,其中Kdm4d为组蛋白去甲基化酶,TSA为组蛋白脱乙酰酶抑制剂.下列说法正确的是( )
A.组蛋白脱乙酰化和去甲基化有利于重构胚后续的胚胎发育过程
B.用电刺激、Ca2+载体等方法激活重构胚,使其完成细胞分裂和发育进程
C.③过程中诱导细胞融合体现了细胞膜的选择透过性
D.图示流程运用了重组DNA、体细胞核移植、胚胎移植等技术
10.子宫内膜异位症患者常伴有不孕症状，患者腹腔液中含有较高浓度的白细胞介素（IL）。为探明腹腔液中存在的IL对生殖活动的影响，科研人员利用重组人IL-1β、IL-5、IL-6对小鼠体外受精及胚胎早期发育的影响进行了研究。回答下列问题：
（1）实验过程中，需要从雌性小鼠体内获得多枚卵母细胞，一般可采取的方法是_____。
（2）将处理后的精子和卵细胞置于HTF基础培养液中进行不同处理，培养适宜时间后，观察受精情况，得到的实验结果如图所示。
实验组的处理方法是_____。分析实验结果，可得出的结论是_____。
（3）若要研究IL对小鼠胚胎早期发育的影响，则需要利用上述培养液培养并观察统计_____。
11.我国中科院的研究团队利用细胞工程和基因编辑技术，成功培育出世界上首例只有双母亲来源的孤雌小鼠和双父亲来源的孤雄小鼠，实现了哺乳动物的同性繁殖。实验流程如图所示，请回答下列问题：
（1）卵细胞转化成phFSC相当于植物组织培养中的____________过程；体外培养动物细胞时，首先应保证其处于____________的环境，除了适宜的营养物质、温度等条件外，还需要控制的气体条件是_____________。
（2）要培育孤雄小鼠需要将精子和具卵细胞细胞核特点的ahESC同时注入去核的卵母细胞形成重构胚，此卵母细胞应体外培养到____________期。在对卵母细胞进行去核时，除了显微操作外还可以采用___________（至少答出两种）等方法处理，得到的重构胚通常需要发育到____________阶段才能进行胚胎移植。
（3）不考虑致死情况，得到的孤雄小鼠性染色体组成为____________。利用胚胎分割的方法对乙进行处理得到了多只孤雄小鼠，在分割囊胚阶段的胚胎时，要注意____________。利用这些孤雄小鼠作为实验材料进行用于医学研究的优点是________________________（从遗传物质角度分析）。
答案以及解析
1.答案：B
解析：A、胚胎发育的过程为受精卵→桑椹胚→囊胚→原肠胚→幼体，因此桑葚胚样细胞可诱导发育至囊胚期，A正确；
B、诱导桑葚胚样细胞时，基因的碱基序列并未发生改变，B错误；
C、胚胎发育至囊胚期即开始了细胞分化，因此囊胚期细胞重置至桑葚样细胞的过程类似于脱分化，C正确；
D、具体分析通过提高小鼠胚胎干细胞pSTAT3基因的表达水平，体外制备出桑葚胚样全潜能细胞，因此推断桑葚胚发育成囊胚的过程中，pSTAT3的表达下降，D正确。
故选B。
2.答案：C
解析：A、图中早期胚胎可用冲卵的方法从母鼠输卵管内获得，A正确；B、过程①中要获得卵裂球，需要利用相关技术去除早期胚胎外的透明带，B正确；C、过程②中是将两个胚胎重组，而不是将卵裂球细胞融合，C错误；D、在囊胚期，嵌合胚胎细胞开始出现分化，D正确；故选C。
3.答案：C
解析：过程a表示卵裂，该时期细胞数目不断增加，但胚胎总体积并不增加，细胞体积变小，A错误；过程b细胞逐渐分化，Ⅱ时期表示囊胚期，没有形成内胚层、中胚层和外胚层，B错误；据图可知，过程c透明带破裂，胚胎从其中伸展出来，表示孵化，孵化后发育形成的Ⅲ时期表示原肠胚，C正确；早期胚胎发育过程中滋养层细胞会发育成胎膜和胎盘，内细胞团发育成胎儿的各种组织，D错误。
4.答案：C
解析：分析题图，图1表示该异常胚胎的受精过程。有2个精子的头部进入了卵子，此时的卵子为MⅡ期的次级卵母细胞，A错误。该卵子与2个精子受精，是异常受精，但不能说明透明带和卵细胞膜在阻止多精入卵的过程中不起作用，B错误。该受精卵含有3个染色体组，有丝分裂前的间期染色体复制，有丝分裂后期着丝粒分裂形成6个染色体组，通过三极纺锤体将6个染色体组拉开，每一极有2个染色体组，其中有两极的染色体来自双亲，有一极的染色体均来自父亲。细胞分裂后，其中两个细胞发育成姐弟，这对姐弟来源于母亲的染色体一般相同；由于该双胞胎性别不同，所以来源于父亲的染色体不同，C正确。由于细胞A和B发育成姐弟，则参与受精的2个精子一个含有的性染色体是X，另一个含有的性染色体是Y，受精卵有丝分裂后期姐妹染色单体分离后，父亲的1个含X和1个含Y的染色体组分别与母亲的两个染色体组结合，从而形成细胞A、B，剩下的2个染色体组结合形成细胞C，细胞C含有的性染色体为XY，不是YY,D错误。
5.答案：C
解析：外胚层细胞发育成神经细胞的过程中有细胞数目和种类的增多，即有细胞的增殖和分化，A正确；胚胎干细胞形成类胚体的过程中，会发生分化，分化过程会发生基因的选择性表达，B正确；分析题意，小分子化合物a能阻滞内胚层和中胚层细胞的形成，有利于外胚层细胞的形成，而哺乳动物的神经细胞由外胚层细胞发育而来，故向培养液中添加小分子化合物有利于类胚体细胞分化为神经细胞，C错误；题中所述的外胚层细胞来源于胚胎干细胞，故遗传物质相同，D正确。
6.答案：D
解析：由C后代的形成过程可知,其为克隆动物,细胞核遗传物质来源于A野化单峰骆驼,A错误;大量的研究已经证明,受体对移入子宫的外来胚胎基本上不发生免疫排斥反应,故通常不需要使用免疫抑制剂对受体进行处理,B错误;囊胚内的内细胞团将来会发育为机体的组织和器官,因此进行胚胎分割应对囊胚的内细胞团进行均等分割,C错误图示过程涉及动物体细胞核移植、早期胚胎培养和胚胎移植等技术,D正确。
7.答案：D
解析：A、①代表体外受精，体外受精前和体内受精前精子均需要获能，A错误；
B、②代表早期胚胎培养，该过程中细胞进行有丝分裂，当胚胎发育至囊胚阶段，会开始进行细胞分化，B错误；
C、③代表胚胎分割，在对囊胚阶段的胚胎进行分割时，要注意将内细胞团均等分裂，以免影响分割后胚胎的恢复和进一步发育，而桑葚胚阶段的胚胎还未形成内细胞团，C错误；
D、⑤代表胚胎移植，胚胎移植能否成功，与供体和受体的生理状态有关，要对供、受体母牛进行同期发情处理，使供体和受体的生理状态相同，D正确。
8.答案：C
解析：由题图可知,孤雌生殖技术通过阻止猪次级卵母细胞释放极体,激活孤雌生殖从而获得早期胚胎,再利用胚胎移植技术将其移植到受体子宫,最后妊振得到幼猪,该过程中没有精子参与,但获得的幼猪仍是二倍体生物,A正确；超数排卵是指应用外源促性腺激素,诱发卵巢排出比自然情况下更多的成熟卵子,即可用促性腺激素处理良种母猪,使其超数排卵,B正确；受体对来自供体的胚胎基本上不会产生免疫排斥反应,即胚胎移植前,不需对供体和受体进行免疫检查,C错误；次级卵母细胞中的“核”其实是纺锤体一染色体复合物,核移植中的“去核”是指去除该复合物,D正确。
9.答案：B
解析：结合题图,在重构胚中加入Kdm4d的mRNA和TSA后,发育成克隆鼠,而Kdm4d的mRNA翻译产物为组蛋白去甲基化酶,可以使组蛋白去甲基化,TSA为组蛋白脱乙酰酶抑制剂,抑制组蛋白脱乙酰酶的作用,保持组蛋白乙酰化,即组蛋白乙酰化和去甲基化有利于重构胚后续的胚胎发育过程,A错误；在体细胞核移植过程中,用物理或化学方法(如电刺激、Ca2+载体、乙醇、蛋白酶合成抑制剂等)激活重构胚,使其完成细胞分裂和发育进程,B正确；③为动物细胞融合过程,体现了细胞膜具有一定的流动性,C错误；图示流程运用了体细胞核移植、胚胎移植等技术,并未运用重组DNA技术,D错误。
10、（1）答案：给雌性小鼠注射一定量的促性腺激素
解析：促性腺激素能促进超数排卵。为获得更多的卵母细胞，可给雌性小鼠注射一定量的促性腺激素。
（2）答案：向每组HTF基础培养液中分别添加IL-1β、IL-5、IL-6，且控制白细胞介素的浓度分别为0.05ng·mL-1、0.5ng·mL-1、5ng·mL-1、30ng·mL-1IL能抑制小鼠受精，且随着浓度的升高，抑制作用增强
解析：据实验目的和结果可知，对照组在HTF基础培养液中不添加白细胞介素，实验组的处理方法是向每组HTF基础培养液中分别添加IL-1β、IL-5、IL-6，且控制白细胞介素的浓度分别为0.05ng·mL-1、0.5ng·mL-1、5ng·mL-1、30ng·mL-1。分析题图可知，与对照组相比，实验组小鼠受精率降低，且随着IL浓度升高，受精率下降，表明IL能抑制小鼠受精，且随IL浓度的升高，抑制作用增强。
（3）答案：不同发育时期胚胎的发育情况（成活率）
11.答案：（1）脱分化；无菌、无毒；5%的空气和5%的CO2的混合气体
（2）MⅡ（减数第二次分裂中期）梯度离心、紫外线短时间照射、化学物质处理；桑葚胚或囊胚
（3）XX，XY或YY；将内细胞团均等分割；遗传物质相同，可以基本排除由基因不同造成的个体差异
解析：(1)卵细胞激活转化成phFSC,通过基因编辑技术获得具精子细胞核特点的phESC,获得甲,从而得到孤雌小鼠。精子激活转化成ahFSC,通过基因编辑技术获得具卵细胞细胞核特点的ahESC,获得乙,从而得到孤雄小鼠。卵细胞是高度分化的细胞,转化为孤雌胚胎干细胞phFSC相当于植物组织培养中的脱分化阶段。体外培养时,首先应保证其处于无菌、无毒的环境,除了适宜的营养物质、温度等条件外,还需要控制气体条件是95%空气与5%二氧化碳的混合气体,二氧化碳的主要作用是维持培养液的pH值。故答案为:脱分化,无菌、无毒,95%的空气和5%的CO2的混合气体。
(2)重组细胞时,需将去核卵母细胞培养至减数第二次分裂中期。要培育孤雄小鼠需要将精子和具卵细胞细胞核特点的ahESC同时注入去核的卵母细胞形成重构胚,在对卵母细胞进行去核时,除了显微操作外,还可以采用梯度离心、紫外线短时间照射、化学物质处理等方法处理,得到的重构胚通常需要发育到桑葚胚或囊胚阶段才能进行胚胎移植,因为此时的胚胎易操作,且处于游离状态。故答案为:MII(减数第二次分裂中);梯度离心、紫外线短时间照射、化学物质处理;桑葚胚或囊胚。
(3)不考虑致死,孤雌小鼠具有双母亲来源,因此其染色体组成为XX,而孤雄小鼠的染色体来源于两只雄鼠产生的精子,精子的性染色体为X或Y,所以其性染色体可能是XX、XY或YY。在分割囊胚阶段的胚胎时,要注意将内细胞团均等分割,否则会影响胚胎的进一步恢复和发育。利用胚胎分割的方法对乙进行处理得到了多只孤雄小鼠,这些小鼠遗传物质相同,所以作为实验材料可以排除由基因的差异造成的个体差异,进而可以通过这些遗传背景相同的个体进行对比来分析致病原因。故答案为:XX,XY或YY;将内细胞团均等分割;遗传物质相同,可以基本排除由基因不同造成的个体差异专题二 微生物的培养技术及应用
——高二生物学人教版（2019）选择性必修三速练100题
1.图中甲是稀释涂布平板法中的部分操作，乙是平板划线法操作结果。下列叙述中，错误的是( )
A.甲图中的涂布前要将沾有少量酒精的涂布器引燃，冷却后才能涂布菌液
B.稀释涂布平板法是将不同稀释度的菌液倒入液体培养基中进行培养
C.乙中培养皿中所得的菌落不都符合要求
D.乙中的连续划线的起点是上一次划线的末端
2.获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的污染。下列有关无菌技术的叙述，正确的是( )
A.操作者的双手清洁后，用无水乙醇擦拭消毒
B.经巴氏消毒法处理的食品不含微生物，可长期保存
C.接种室、接种箱使用前可用紫外线照射进行消毒
D.接种环、培养基、培养皿等均须采用干热灭菌法灭菌
3.下表为某培养基的配方，下列叙述正确的有( )项
成分 蛋白胨 葡萄糖 K2HPO4 伊红 美蓝 蒸馏水 琼脂
含量 10g 10g 2g 0.4g 0.065g 1000mL 20g
①物理性质看该培养基属于固体培养基，从用途看该培养基属于鉴别培养基
②培养基中属于碳源的物质主要是葡萄糖，属于氮源的物质是蛋白胨
③该培养基调节合适的pH和消毒后就可以接种使用
④该培养基可以用于培养HIV病毒
A.1项 B.2项 C.3项 D.4项
4.下图①~④表示采用不同方法分离和纯化大肠杆菌的部分操作。下列叙述错误的是( )
A.①属于倒平板操作，盖上培养皿的皿盖后应立即将平板倒置
B.②中在火焰上灼烧过的接种环需冷却后才能伸入菌液中蘸取菌液
C.③属于涂布平板操作，涂布时可转动培养皿使菌液分布均匀
D.④属于平板划线操作，注意不要将最后一次的划线与第一次的划线相连
5.中草药在加工过程中会产生大量的废渣,废渣中含有多种营养物质。为了减轻废渣对环境的污染以及重复利用其中的纤维素,某大学研究团队拟从土壤中筛选高产纤维素酶的真菌。在土壤取样后需先进行富集培养（培养基配方的一部分如下表），增大目的菌的浓度。下列叙述错误的是( )
KH2PO4 MgSO4 蛋白胨 X H2O
1.00g 0.50g 2.00g 10.00g 加至1L
A.对从土壤中筛选出的高产纤维素酶的真菌的计数通常采用稀释涂布平板法
B.为达到富集培养增加目的菌浓度的目的，表中X是葡萄糖
C.在富集培养基的基础上配制对菌株初筛的培养基，至少还应添加琼脂和刚果红
D.在筛选得到纤维素分解菌后应向培养基中加入抗生素，使获得的菌落都是真菌
6.牛奶中富含多种营养物质，但牛奶也是多种病原体的传播载体，比如牛奶中可能存在金黄色葡萄球菌，该菌是一种高度耐盐的兼性厌氧微生物，可引起人类肺炎和肠炎等疾病。金黄色葡萄球菌在血平板（培养基中添加适量血液）上生长时，可破坏菌落周围的红细胞，使其褪色。为定性检测鲜牛奶中是否存在金黄色葡萄球菌，操作流程如图所示。下列说法错误的是( )
A.配制好的肉汤培养基应采用湿热灭菌法进行灭菌
B.振荡培养有利于微生物的生长繁殖
C.在血平板上的接种方法是稀释涂布平板法
D.用7.5%NaCl进行培养可增加金黄色葡萄球菌的数量
7.土壤中95%以上的磷为植物很难利用的无效磷。解磷菌能够将磷矿粉等无效磷转化为植物易利用的速效磷。为研究解磷菌的解磷机理，科研人员将磷矿粉制成培养液，培养从土壤中分离出的2种解磷菌（M－3－01、B3－5－6），测定培养液的上清液pH及其中的速效磷含量，结果如图，下列叙述错误的是( )
A.由图可知，168h以内M－3－01解磷能力较强
B.2种解磷菌是用只含磷矿粉的培养基分离出来的
C.B3－5－6转化无效磷的能力与培养溶液pH显著相关
D.据图推测B3－5－6可能借助分泌酸性物质溶解磷矿粉
8.抗生素可由微生物产生，具有抑菌作用，能在琼脂培养基中扩散。在筛选产生抗生素的菌种时，先在琼脂培养基平板上划线接种一种从土壤中获得的甲菌，在27℃下培养3天，形成菌落。然后接种乙、丙、丁三种致病菌（图A），继续在同样条件下培养3天，结果如图B。分析结果，得出的结论是( )
①甲菌产生了抗生素
②丁菌的生长被丙菌产生的抗生素抑制
③乙菌的生长被甲菌产生的抗生素抑制
④丙菌产生的抗生素抑制了乙菌生长
A.①③ B.①④ C.②③ D.②④
9.兔子的盲肠占整个消化道的一半，其中含有大量的微生物帮助兔子消化，这可能是兔子能从富含纤维素的食物中获得营养物质的关键。为了分离出兔子盲肠中分解纤维素能力最强的菌种，下列相关操作正确的是( )
A.为缩小选择范围可用只含纤维素粉的溶液淘汰部分菌种
B.在营养物质充足的有氧环境中更有利于分离得到目标菌种
C.相同条件下用无菌水模拟接种操作来判断培养基是否符合无菌要求
D.在含有土豆汁的培养基中加入纤维素粉和刚果红可制备鉴别培养基
10.炭疽是一种由炭疽芽孢杆菌引起的人兽共患性传染病，也是我国规定的乙类传染病。回答下列有关问题：
（1）人通常是通过接触患炭疽的动物或动物制品被感染，皮肤炭疽病在人类炭疽病中最为常见，这类患者的皮肤渗出物中含有炭疽芽孢杆菌。皮肤炭疽病疑似患者就医时，医生先要取患者的皮肤渗出物稀释后涂布到固体培养基上，经过一段时间的培养获得的平板可能是_____（多选）。
（2）挑取上述培养基上的菌落进行如图所示实验（注：实验组中的噬菌体能特异性地侵染炭疽芽孢杆菌）。
①该实验的目的是_____。
②对照组试管中应加入_____，实验过程中为避免杂菌污染进行的操作包括_____（至少写出两点）。
③实验结果为_____时，表明该疑似患者被炭疽芽孢杆菌感染。
④实验过程中需将锥形瓶固定在摇床上，在35℃下振荡培养24h，直至液体培养基变浑浊。振荡培养说明炭疽芽孢杆菌的代谢类型是_____，振荡培养的目的是_____。液体培养基变浑浊的原因是_____。
（3）对炭疽芽孢杆菌进行计数时，选用10-4、10-5、10-6三个稀释度的菌液，各取0.2mL涂布，每个稀释度做三次重复，经24h恒温培养后结果如表。
稀释度 10-4 10-5 10-6
平板编号 A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
菌落数 315 298 302 45 53 51 12 9 11
由表可知，最适合计数的稀释度为_____。
11.土壤中的有些细菌可以利用石油中的多环芳烃，据此研究人员通过实验从土壤中分离得到了能降解石油的细菌菌株M和N，实验所用的培养基成分如表1所示。下图为从某植物根际土壤中筛选出高效降解石油菌的部分流程示意图，请据表1和图回答下列问题：
表1
成分
培养基Ⅰ K2HPO4、MgSO4、NH4NO3、石油
培养基Ⅱ K2HPO4、MgSO4、石油
（1）实验时，培养基通常采用_____的方法进行灭菌。培养基中提供碳源的是_____，表1中培养基Ⅰ和培养基Ⅱ均属于______培养基。
（2）由图可知，在操作Ⅱ、Ⅲ中，采用的接种方法分别是____、______。
（3）研究人员通常根据菌落的______等特征来初步区分不同种的微生物，统计菌落种类和数量时要每隔24h观察统计一次，直到_____。
（4）为进一步探究并比较M和N两个菌株在不同条件下降解石油的能力，科研人员继续进行了如下实验。
步骤一:将M、N两个菌株分别接种到两个液体培养基Ⅰ中，得到M、N菌液。
步骤二:另取培养基Ⅰ、Ⅱ,添加琼脂分别制成平板Ⅰ、Ⅱ,在平板Ⅰ上制作两个直径相等的孔标号为ⅠA、ⅠB,平板Ⅱ重复以上的操作，两个孔分别标号为ⅡA、ⅡB。
步骤三:将等量等浓度的M菌液和N菌液分别接种到平板Ⅰ的ⅠA和ⅠB,平板Ⅱ也进行同样的操作。
步骤四:在相同且适宜的条件下培养一段时间后，记录平板Ⅰ、Ⅱ的透明圈大小如下表2所示。
表2
菌株 平板Ⅰ 平板Ⅱ
ⅠA ⅠB ⅡA ⅡB
透明圈大小 +++ ++ ++ -
注:“+”表示有透明圈，“+”越多表示透明圈越大,“-”表示无透明圈。
①能判断出细菌将平板中的石油分解是因为_____。
②本实验可以得出在有氮源的培养基上____，在无氮源的培养基上_____。
答案以及解析
1.答案：B
解析：A、甲图中的涂布前要将涂布器灼烧，冷却后才能取菌液， A正确；
B、稀释涂布平板法使用固体培养基，B错误；
C、乙培养皿中一般在5区域才能得到由单个细菌繁殖而形成的菌落，C正确；
D、乙中的连续划线的起点是上一次划线的末端，这样能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落，D正确。
故选B。
2.答案：C
解析：A、操作者的双手清洁后，用体积分数为75%的酒精擦拭消毒，不能用无水乙醇进行消毒，这是因为过高浓度的酒精会在细菌表面形成一层保护膜，阻止其进入细菌体内，难以将细菌彻底杀死，达不到消毒的目的，A错误；
B、巴氏消毒法处理的食品因微生物未被彻底杀死，仍会有部分较耐热的细菌或细菌芽孢存在，故不能长期保存，B错误；
C、接种室、接种箱使用前用紫外线照射30min，以杀死物体表面或空气中的微生物，是紫外线消毒，C正确；
D、培养皿等玻璃器皿可采用干热灭菌法灭菌，培养基需要用高压蒸汽灭菌法灭菌，D错误。
故选C。
3.答案：B
解析：①该培养基中含有琼脂，说明是固体培养基，含有伊红美蓝指示剂，说明可以鉴定大肠杆菌，①正确；②配方中的葡萄糖是主要的碳源，蛋白胨是主要的氮源，②正确；③该培养基调节合适的pH和灭菌后就可以接种使用，③错误；④病毒只能寄生于活细胞才能生存，该培养基不能用于培养HIV病毒，④错误；综上所述，共有2项正确，即B正确。故选B。
4.答案：A
解析：A、①属于倒平板操作，盖上培养皿的皿盖后需冷却凝固后才能将平板倒置，A错误；B、②中在火焰上灼烧过的接种环需冷却后才能伸入菌液中蘸取菌液，以免杀死菌种，B正确；C、③属于涂布平板操作，涂布时可转动培养皿使菌液分布均匀，C正确；D、④属于平板划线操作，操作时注意不要将最后一次的划线与第一次的划线相连，D正确。故选A。
5.答案：B
解析：稀释涂布平板法除可以用于分离微生物外，也常用来统计样品中微生物的数目，故A正确
为达到富集培养增加目的菌（高产纤维素酶的真菌）浓度的目的，应以纤维素作为唯一碳源，故表中X是纤维素，B错误
对菌株进行初筛时要用固体培养基，所以在富集培养基的基础上要加入凝固剂，常用的凝固剂是琼脂；刚果红能与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖等发生这种反应，当在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红与纤维素形成红色复合物，当纤维素被纤维素分解菌分解后，复合物就无法形成，培养基中会出现以这些菌为中心的透明圈：因此在富集培养基的基础上配制对菌株初筛的培养基，至少还应添加琼脂和刚果红，C正确
抗生素能杀死细菌，不能杀死真菌，在筛选得到纤维素分解菌后，为了使得到的菌落都是真菌，应向培养基中加入抗生素，D正确。
6.答案：C
解析：A、配制好的肉汤培养基应采用湿热灭菌法如高压蒸汽灭菌法进行灭菌，A正确；B、振荡培养有利于微生物与营养物质的接触，也有利于增大溶氧量，促进微生物的生长繁殖，B正确；C、结合图示可知，在血平板上的接种方法是平板划线法，C错误；D、金黄色葡萄球菌是一种高度耐盐的兼性厌氧微生物，用7.5%NaCl进行培养可增加金黄色葡萄球菌的数量，D正确。故选C。
7.答案：B
解析：A、据图可知，168h以内M-3-01解磷菌的速效磷含量高于B3-5-6解磷菌，说明168h以内M-3-01解磷能力较强，A正确；
B、培养基的主要成分是水、碳源、氮源、无机盐，只含磷矿粉的培养基无法满足解磷菌对全部营养物质的需求，2种解磷菌是用只含磷矿粉为唯一磷源的培养基分离出来的，B错误；
C、在培养72h以后B3-5-6解磷菌中的pH下降，速效磷含量也迅速上升，则说明B3-5-6转化无效磷的能力与培养溶液pH显著相关，C正确；
D、当pH下降时B3-5-6培养液上清液中速效磷含量也迅速上升，当pH上升到7.0以上时，速效磷的含量不再上升，推测B3-5-6可能借助分泌酸性物质溶解磷矿粉，D正确。
故选B。
8.答案：A
解析：乙、丙、丁三种致病菌不会产生抗生素，否则靠近乙、丙、丁的甲菌落不能生长。从图B来看，乙菌的生长被抑制，最可能的原因是甲菌产生了抗生素，此种抗生素只能抑制乙菌的生长，而对丙、丁两种细菌没有影响。综上所述，①③正确，②④错误。
故选A。
9.答案：D
解析：A、只含纤维素粉的溶液中缺少氮源、无机盐等，无法培养、保留能分解纤维素的微生物，A错误；B、动物肠道中一般都是缺氧环境，所以缺氧环境应该更有利于分离得到目标菌种，B错误；C、要判断培养基是否符合无菌要求，需将未接种的平板置于适宜条件下培养一段时间，看是否有菌落长出，用无菌水模拟接种操作可用来判断接种过程是否符合无菌要求，C错误；D、刚果红可与纤维素形成红色复合物，但并不和纤维素水解后的纤维二糖和葡萄糖发生颜色反应；当纤维素被纤维素酶水解后，刚果红-纤维素复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，因此可以在含土豆汁的培养基中加入纤维素粉和刚果红来鉴别所培养的菌种是否能分解纤维素，D正确。故选D。
10.答案：（1）ABC
（2）①检验皮肤炭疽病疑似患者的皮肤渗出物中是否含有炭疽芽孢杆菌（答案合理即可）；②与实验组等量的生理盐水；对操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒；将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌；实验操作在酒精灯火焰附近进行；操作过程中避免已经灭菌的材料用具与周围物品相接触（答出任意两点即可）；③实验组液体培养基的浑浊度比对照组低；④（异养）需氧型；增加培养液中的氧气含量，使细菌与营养物质充分接触；炭疽芽孢杆菌大量繁殖
（3）10-5
解析：(1)题干信息表明其接种方法为稀释涂布平板法，图中四个平板上的菌落只有D是通过平板划线法获得的，A、B、C都是通过稀释涂布平板法获得的。
(2)①从整个实验过程可以看出，实验通过对皮肤渗出物稀释培养形成的菌落进行扩大培养后，利用噬菌体的作用检测其中是否含有炭疽芽孢杆菌。②对照组中加入的液体不应含有噬菌体，因此应加入等量的生理盐水；在进行微生物培养时为防止杂菌的混入，消毒和灭菌工作是关键，主要包括对操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒；将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌；实验操作在酒精灯火焰附近进行；操作过程中避免已经灭菌的材料用具与周围物品相接触等。③若实验组液体培养基的浑浊度低于对照组，说明实验组中的炭疽芽孢杆菌被噬菌体侵染与破坏，即该疑似患者感染了炭疽芽孢杆菌。④炭疽芽孢杆菌属于细菌，能寄生在人和动物体内，说明它是异养型生物，培养时需要借助摇床振荡培养，说明它是需氧型生物；振荡培养的目的是增加培养液中的氧气含量，使细菌与营养物质充分接触，有利于炭疽芽孢杆菌的大量繁殖；培养液变浑浊表明炭疽芽孢杆菌大量繁殖。
(3)分析表中数据可知，只有稀释度为10-5时菌落数在30~300之间，适合用于计数。
11.答案：（1）高压蒸汽灭菌；石油；选择
（2）稀释涂布平板法；平板划线法
（3）形状、大小、隆起程度和颜色；各类菌落数目稳定
（4）①平板上出现了透明圈；②M菌株降解石油的能力高于N菌株；N菌株无降解石油的能力，M菌株降解石油的能力减弱
解析：（1）通常采用高压蒸汽灭菌法对培养基进行灭菌。题表1中只有石油含有碳元素，所以提供碳源的是石油，培养基Ⅰ和培养基Ⅱ正中只有石油是碳源，只有能够分解石油的微生物才能生长，所以培养基Ⅰ和培养基Ⅱ均属于选择培养基。
（2）操作Ⅱ可以看到菌落在培养基中均匀分布，接种方法是稀释涂布平板法；操作Ⅲ为挑选菌落进一步纯化，需要用接种环进一步稀释菌体，所以是平板划线法。
（3）不同的微生物要根据菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等方面进行区分；统计菌落种类和数量时，要每隔24h观察统计一次，直到各类菌落数目稳定，防止培养时间不足导致遗漏菌落的种类和数目。
（4）①平板上出现透明圈说明细菌可以将平板中的石油分解。②培养基Ⅰ和培养基Ⅱ的区别就是培养基Ⅰ有氮源，培养基Ⅱ没有氮源，所以根据本实验中透明圈的大小可以判断在有氮源的培养基上，M菌株降解石油的能力高于N菌株；在无氮源的培养基上，N菌株无降解石油的能力，M菌株降解石油的能力减弱。专题三 发酵工程及其应用
——高二生物学人教版（2019）选择性必修三速练100题
1.在发酵过程中，多个黑曲霉菌体常聚集成团形成菌球体，菌球体大小仅由菌体数量决定。黑曲霉利用糖类发酵产生柠檬酸时需要充足的氧。菌体内铵离子浓度升高时，可解除柠檬酸对其合成途径的反馈抑制。下列说法错误的是( )
A.相同菌体密度下，菌球体越大柠檬酸产生速率越慢
B.发酵中期添加一定量的硫酸铵可提高柠檬酸产量
C.发酵过程中pH下降可抑制大部分细菌的生长
D.发酵结束后，将过滤所得的固体物质进行干燥即可获得柠檬酸产品
2.啤酒是以大麦为主要原料，经酿酒酵母发酵制得。啤酒的工业化生产分为主发酵和后发酵两个阶段。精酿啤酒的制作工艺与普通啤酒不同，不添加食品添加剂，不进行过滤消毒处理。下列叙述正确的是( )
A.利用大麦作原料时，淀粉是酵母菌的直接碳源
B.啤酒的工业化生产过程中，酒精的产生积累主要在主发酵阶段完成
C.后发酵阶段会因pH或酒精含量升高而终止发酵
D.精酿啤酒不进行过滤和消毒，故发酵过程不需要在无菌条件下进行
3.东北酸菜是一种传统发酵蔬菜制品，因其独特的风味在我国东北地区深受欢迎。为探究不同发酵时期东北酸菜样品中菌落总数的变化,某科研小组进行如图实验。下列叙述正确的是( )
A.大白菜清洗灭菌后要接种乳酸菌
B.菌种生长所需的碳源来自盐水
C.浸盐水后需要密封
D.发酵后期样品中只有乳酸菌菌落
4.发酵工程的正确操作过程是( )
①发酵
②培养基的配制
③灭菌
④产品的分离与提纯
⑤菌种的选育和扩大培养
⑥接种
A.①③④⑤②⑥ B.⑤②③⑥①④ C.②③①⑥④⑤ D.⑥⑤②④③①
5.黑曲霉是一种丝状真菌，食品工业以红薯粉为原料经黑曲霉发酵获得柠檬酸，如图为生产柠檬酸的简要流程图。下列叙述正确的是( )
A.黑曲霉与生产果醋时所用主要微生物细胞结构相同，代谢类型也相同
B.将菌种接种至A培养基时，每次划线前涂布器都需要灼烧灭菌
C.发酵罐C中的发酵过程是发酵工程的中心环节，该环节直接影响产品的产量和质量
D.黑曲霉发酵适宜温度较高，所以发酵罐C需要不断加热将温度维持在35℃
6.我国科学家利用如图所示的液态厌氧发酵工艺，实现了利用乙醇梭菌高效产出乙醇和乙醇梭菌蛋白。下列叙述错误的是( )
A.乙醇梭菌单细胞蛋白是通过发酵工程而生产的微生物次级代谢产物
B.乙醇梭菌以CO、CO2为主要的碳源，具有较强的固碳能力
C.乙醇梭菌是厌氧型细菌，其发酵前需要进行搅拌
D.通过该工艺高效生产清洁能源乙醇，可降低生态足迹
7.下列关于传统发酵技术的说法中，正确的是( )
A.图1能表示在果酒的制作过程中酵母菌产生酒精速率（V1）随时间的变化
B.图2能表示在果醋的制作过程中溶氧量对醋酸菌产生醋酸速率（V2）的影响
C.图3能表示在利用毛霉制作泡菜的过程中乳酸含量的变化趋势
D.图4能表示在密闭锥形瓶中,加入含酵母菌的葡萄糖溶液，溶液的pH随时间的变化
8.酸笋是一种传统的调味佳品，菜肴中加入少量的酸笋，其味浓郁绵长。当竹子出笋后，长出约30厘米高时,便可连根砍下，剥去笋壳，切成块、丝或片，放于陶罐中，清水过面,撒上适量食盐，置于阴凉处一个月左右，酸味即出。下列叙述错误的是( )
A.发酵过程中使用食盐有助于抑制有害微生物的生长
B.酸笋的酸味主要来源于发酵过程中乳酸菌的作用
C.腌制酸笋后期要适时打开盖子以排出容器内的气体
D.在制作酸笋时加入“陈酸笋水”可加速发酵进程
9.用酵母菌酿酒的主要阶段为:加料→接种→通气培养→密封发酵。从接种后到密封前这一阶段，酵母菌种群数量变化的曲线图为( )
A． B．
C． D．
10.燃料乙醇是一种绿色燃料。研究人员利用酵母菌以霉变的木薯和小麦为原料，混合发酵生产燃料乙醇，流程如图。下列叙述错误的是( )
A.I阶段是该发酵生产的中心环节
B.Ⅱ阶段步骤①是接种酵母菌
C.Ⅱ阶段需将pH调至酸性以利于菌种发酵
D.Ⅲ阶段步骤②是产品的分离、提纯
11.阅读资料，完成下面的问题。
资料一：单细胞蛋白是指通过培养大量细菌、酵母、真菌或藻类，从中提取出的蛋白质或生物菌体，可直接作为一种人和动物的蛋白来源添加到人类食品和动物饲料中。
资料二：对柑橘果实加工后剩下的新鲜皮渣的处理成为许多加工厂亟待解决的问题，柑橘皮渣含大量果胶、纤维素和半纤维素，并且可能作为一种发酵基质。
资料三：有科学家设想可以以柑橘皮渣为原料，筛选合适的微生物和提供适宜的发酵条件，生产单细胞蛋白质来作为动物饲料使用。
（1）单细胞蛋白可直接作为蛋白质来源添加到动物饲料中的原因是蛋白质是细胞_____（填“干重”或“鲜重”）中含量最高的物质。
（2）柑橘皮渣中的纤维素可以为微生物的培养提供_____。
（3）分别使用四种类型的酵母进行发酵，并测定发酵前后的粗蛋白和真蛋白含量得到下表：
原料蛋白含量/%（DM） 接入单株酵母发酵后蛋白含量/%（DM）
1254 1745 1315 1807
CP 5.59±0.10 8.53±0.16 5.55±0.12 6.65±0.15 7.86±0.14
TP 4.57±0.06 5.74±0.22 5.28±0.10 4.96±0.09 5.99±0.07
注：CP：粗蛋白，TP：真蛋白。
从表中来看，有3种酵母均可显著提高发酵产物的粗蛋白和真蛋白含量，从粗蛋白提高程度看，以_____（填单株酵母菌株编号）效果最好，但以真蛋白来看，则以_____效果最好。
（4）进一步研究表明，使用酵母和霉菌混合发酵的效果更好，其原因可能是混合发酵时，霉菌产生的_____酶和_____酶可以分解发酵原料中的细胞壁成分，其分解产物除了可以保障自身生长外，还可促进酵母生长。
（5）以下为研究发酵条件的部分实验，在这三组实验中，自变量是_____，无关变量是_____。
发酵条件
A（发酵时间）/d C（接种量）/% D（含水量）/%
3 10 65
4 20 65
5 15 65
答案以及解析
1.答案：D
解析：发酵工程在氧气充足的条件下，黑曲霉可以利用糖类发酵产生柠檬酸，在相同菌体密度下，菌球体越大，越不容易获得氧气，柠檬酸产生速率越慢，A正确；由题目所给信息“菌体内铵离子浓度升高时，可解除柠檬酸对其合成途径的反馈抑制”可推出发酵中期添加一定量的硫酸铵可提高柠檬酸产量，B正确；大部分细菌适合在中性或弱碱性环境中生存，发酵过程中pH下降可抑制大部分细菌的生长，C正确；如果发酵产品是微生物细胞本身，可在发酵结束之后，采用过滤、沉淀等方法将菌体分离和干燥，即可得到产品。如果产品是代谢物，可根据产物的性质采取适当的提取、分离和纯化措施来获得产品。柠檬酸属于代谢物，故D错误。
2.答案：B
解析：A、利用大麦作原料时，淀粉需要分解成葡萄糖才能被酵母菌的利用，A错误；
B、啤酒发酵的过程分为主发酵和后发酵两个阶段，但酵母菌的繁殖、大部分糖的分解和代谢物的生成都在主发酵阶段完成，即酒精的产生积累主要在主发酵阶段完成，B正确；
C、主发酵结束后在低温、密闭环境下储存一段时间属于后发酵，后发酵阶段会因pH降低，且酒精含量升高而终止发酵，C错误；
D、精酿啤酒发酵时间长、产量低、价格高，保质期更短（在发酵工艺上，精酿啤酒发酵完成后，不会过滤和杀菌，保质期只有几十天，但发酵过程必须在无菌条件下进行，防止杂菌繁殖对发酵过程产生影响，D错误。
故选B。
3.答案：C
解析：制作东北酸菜主要是利用大白菜表面的天然乳酸菌进行发酵,故一般情况下无需灭菌和接种乳酸菌,但可以加入“陈泡菜液”来增加菌种含量,A错误；浸盐水以达到杀死杂菌的目的,但无法为菌种的生长提供碳源,碳源主要由大白菜提供,B错误;乳酸菌为厌氧细菌,因此浸盐水后需要进行密封处理,C正确;发酵后期,由于乳酸菌产生的乳酸使环境变酸,大多数不耐酸的微生物会被抑制或死亡,因此乳酸菌的数量会相对增多,成为主导菌群,但是仍可能有一些其他的耐酸微生物存活,如某些耐酸的酵母菌等,D错误。
4.答案：B
解析：发酵工程的基本操作过程为：菌种的选育→培养基的配制→灭菌→扩大培养和接种→发酵过程→产品的分离提纯。因此正确的操作过程是⑤②③⑥①④，B正确，ACD错误。
故选B。
5.答案：C
解析：黑曲霉是真菌，是真核生物，发酵果醋的微生物醋酸杆菌是细菌，属于原核生物，A错误；将菌种接种至A培养基时，平板划线法的接种工具接种环在使用前需在火焰上灼烧灭菌，B错误；C、发酵工程的中心环节是发酵过程，C正确；发酵时，黑曲霉代谢会产生大量热量，通常需要进行降温处理，D错误。
6.答案：A
解析：A、单细胞蛋白是指通过发酵获得的大量微生物菌体，不是微生物的次级代谢产物，A错误；
B、据图可知，乙醇梭菌发酵时，培养基中仅含无机盐，可以以工业尾气中的CO、CO2为碳源合成乙醇及蛋白质，具有较强的固碳能力，B正确；
C、据图可知，乙醇梭菌发酵为厌氧发酵，说明乙醇梭菌为厌氧菌，发酵过程需要进行搅拌，C正确；
D、通过该工艺，可利用乙醇梭菌将工业尾气中的CO、CO2为碳源合成乙醇及蛋白质，既实现高效生产清洁能源乙醇，又能够有效净化工业尾气，减轻环境污染，降低生态足迹，D正确。
故选A。
7.答案：D
解析：果酒制作初期，酵母菌进行有氧呼吸，并随O2的减少，无氧呼吸逐渐增强，产生酒精速率逐渐加快，发酵后期由于产物积累，影响酒精发酵，所以曲线应是先上升再下降，A错误；在果醋的制作过程中，一定范围内，溶氧量越多，醋酸菌产生乙酸的速率（V2）越快，B错误；参与泡菜制作的微生物是乳酸菌，且泡菜制作过程中乳酸含量不会大幅下降，C错误；在一个普通的密闭锥形瓶中，加入含酵母菌的葡萄糖溶液，一定时间内随时间的延长，溶液的pH逐渐降低，最后趋于稳定，D正确。
8.答案：C
解析：适量的食盐可以抑制一些有害微生物的生长,A正确；酸笋的酸味主要来源于乳酸菌在发酵过程中产生的乳酸,B正确；在腌制过程中,通常需要保持环境的无氧状态,打开盖子可能会进入氧气,影响乳酸菌的发酵,C错误;“陈酸笋水”(即已经发酵成功的酸笋的汁液)含有丰富的乳酸菌,在制作酸笋时加入“陈酸笋水”可加速发酵过程,D正确。
9.答案：C
解析：由于酵母菌酿酒的主要阶段为：加料、接种、通气培养、密封发酵，说明营养物质、空间都有限，所以从接种后到密封前这一阶段，酵母菌种群数量变化的曲线为“S”型曲线。
故选C。
10.答案：A
解析：由题图可知，Ⅱ阶段为同步糖化发酵，其是该发酵生产的中心环节，A错误；步骤①是接种酵母菌，B正确；由题图可知，Ⅱ阶段加入了酸性蛋白酶，酸性蛋白酶的适宜pH为酸性，故Ⅱ阶段需将pH调至酸性，以利于菌种发酵，C正确；Ⅲ阶段步骤②是产品的分离、提纯，最终获得燃料乙醇，D正确。
11.答案：（1）干重
（2）碳源
（3）1254；1807
（4）纤维素；果胶
（5）发酵时间、接种量；含水量
解析：（1）单细胞蛋白可直接作为蛋白质来源添加到动物饲料的原因是蛋白质是细胞干重中含量最高的物质，占到微生物干重的一半以上。
（2）柑橘皮渣中的纤维素含有碳，为生物提供碳源。
（3）从表中来看，酵母1254发酵后粗蛋白含量最高，酵母1807发酵后真蛋白含量最高。
（4）细胞壁的成分为纤维素和果胶，分解细胞壁需要霉菌的纤维素酶和果胶酶。
（5）发酵时间、接种量在三组实验中各不相同，应为自变量，而含水量在三组实验中相同，属于无关变量。专题七 基因工程
——高二生物学人教版（2019）选择性必修三速练100题
1.基因工程中需使用多种工具酶，几种限制酶的切割位点如图所示。下列说法正确的是( )
A.限制酶Sma I和EcoR V切割形成的末端，只能通过E.coli DNA连接酶相互连接
B.DNA连接酶、DNA聚合酶和RNA聚合酶均可催化磷酸二酯键的形成
C.限制酶EcoR I进行一次切割，会切断2个磷酸二酯键，形成1个游离的5′末端
D.若两种限制酶的识别序列相同，则形成的末端一定能通过DNA连接酶相互连接
2.研究人员用酶和酶两种限制酶同时处理某DNA分子和质粒，得到的DNA片段如图所示。图中DNA片段只注明了黏性末端处的碱基种类，其他碱基的种类未注明。下列叙述错误的是( )
A.该DNA分子和质粒上均含有酶M的一个切割位点和酶N的一个切割位点
B.根据图示信息不能确定图中形成的不同黏性末端与这两种限制酶的对应关系
C.用T4 DNA连接酶或E.coli DNA连接酶均可以将片段乙和片段丁连接起来
D.片段乙、片段丁、片段戊可依次连接形成一个环状DNA分子
3.基因工程需要多种酶的参与。下列有关叙述正确的是( )
A.限制酶主要存在于原核细胞中,可识别DNA或RNA上的核苷酸序列
B.DNA连接酶不能识别DNA上的核苷酸序列,连接具有黏性末端的DNA片段的过程中会发生碱基互补配对
C.解旋酶可破坏磷酸二酯键和氢键,用于在DNA复制过程中解开DNA双螺旋
D.成熟mRNA经逆转录酶催化形成的DNA能直接转录翻译合成蛋白质
4.荧光定量PCR是一种定量计算待测样品的初始模板量的方法。在PCR反应体系中加入特异性的荧光探针，荧光探针可以掺入新合成的DNA链中，每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，通过对扩增反应中的荧光强度进行实时检测，最后通过标准曲线定量计算初始模板量。如图为某荧光定量PCR的标准曲线。下列说法错误的是( )
A.一定范围内，荧光强度与扩增出的DNA量呈正相关
B.每个反应管内荧光探针的量相同
C.样品甲的初始模板量大于样品乙
D.荧光强度不再变化时PCR反应停止
5.下图为pUC18质粒图谱，已知目的基因两侧的酶切位点为EcoR I和BamH I。现需将目的基因插入质粒的LacZ基因内，形成重组质粒并导入受体细胞。下列限制酶组合选择及后续处理最合适的是( )
（注：图中ampR为氨苄青霉素抗性基因、Ori为复制原点，LacZ表达产物可使X-gal的培养基呈现蓝色）
A.用BamH I酶切质粒和目的基因，将细胞涂布于含氨苄青霉素的培养基
B.用EcoR I酶切质粒和目的基因，将细胞涂布于含氨苄青霉素和X-gal的培养基
C.用EcoR I和BamH I酶切质粒和目的基因，将细胞涂布于含X-gal的培养基
D.用EcoR I和BamH I酶切质粒和目的基因、将细胞涂布于含氨苄青霉素和X-gal的培养基
6.下图是将人的生长激素基因导入细菌B细胞内制“工程菌”的示意图。已知细菌B细胞内不含质粒A，也不含质粒A上的基因。判断下列说法正确的是( )
A.将重组质粒导入细菌B常用的方法是显微注射法
B.将完成导入过程后的细菌涂布在含有氨苄青霉素的培养基上，能生长的只是导入了重组质粒的细菌
C.将完成导入过程后的细菌涂布在含有四环素的培养基上，能生长的就是导入了质粒A的细菌
D.目的基因成功导入的标志是受体细胞能产生出人的生长激素
7.重组新型冠状病毒疫苗的制备原理是将新型冠状病毒S蛋白受体结合区(RBD)基因通过基因工程技术重组到中国仓鼠卵巢(CHO)细胞内，在体外大量表达出RBD二聚体，提取后制备成疫苗。下列叙述正确的是( )
A.CHO细胞作为新型冠状病毒的宿主细胞，提供病毒所需的营养物质
B.新型冠状病毒的RBD基因可以直接重组到CHO细胞的DNA分子上
C.体外培养重组CHO细胞时需添加适量的干扰素防止杂菌污染
D.要检测RBD基因在CHO细胞中成功表达，可用抗原-抗体杂交方法
8.HA蛋白是禽流感病毒的重要抗原。鸡卵清蛋白是由输卵管上皮细胞中卵清蛋白基因特异性表达后分泌至输卵管内,参与构成鸡蛋清的蛋白质。如图是利用基因工程技术制备HA蛋白鸡输卵管生物反应器的过程。几种可供选择的限制酶识别序列如图,下列叙述正确的是( )
A.①为逆转录过程,该过程需要逆转录酶、4种游离的核糖核苷酸等组分
B.目的基因与鸡卵清蛋白基因启动子拼接前应先在目的基因两端分别引入BamH I和Hind Ⅲ的识别序列,拼接前载体用Mfe I和Hind Ⅲ切割
C.利用PCR扩增目的基因时,反应缓冲溶液中一般要加入Mg2+,其目的是维持渗透压稳定
D.基因表达载体导入受精鸡胚的胚盘不可以使用显微注射法
9.反向PCR是一种通过已知序列设计引物对未知序列进行扩增的技术,其过程如图所示。下列叙述正确的是( )
A.环化阶段,可选E.coli DNA连接酶而不能选T4 DNA连接酶
B.图中环状DNA进行PCR的过程中,沿左侧引物延伸子链的方向是逆时针
C.PCR产物是包含所有已知序列和未知序列的环状DNA分子,其中含有EcoR I的酶切位点
D.应选择引物2和引物3进行PCR扩增
10.下图为转基因抗冻植株培育过程的示意图（其中ampr为抗氨苄青霉素基因）。下列叙述错误的是( )
A.过程④中可利用目的基因作为探针对植株进行筛选
B.可同时选用限制酶Pst I、Sma I对含目的基因的DNA进行剪切
C.过程②可采用农杆菌转化法将含目的基因的表达载体导入受体细胞
D.质粒上的抗性基因有利于筛选含目的基因的细胞和促进目的基因的表达
11.农杆菌Ti质粒上的T-DNA可以转移并随机插入到被侵染植物的染色体DNA中。研究者将下图中被侵染植物的DNA片段连接成环，并以此环为模板，利用PCR技术扩增出T-DNA插入位置两侧的未知序列，以此可确定T-DNA插入的具体位置。下列说法正确的是( )
A.进行PCR扩增的依据是DNA分子双链复制的原理
B.进行PCR扩增需要的酶有解旋酶和热稳定DNA聚合酶
C.利用图中的引物②、③组合可扩增出两侧的未知序列
D.通过与受体细胞的基因组序列比对，可确定T-DNA的插入位置
12.下列不属于基因工程成果的是( )
A.乳腺生物反应器生产药用蛋白 B.培育抗除草剂的作物新品种
C.利用微生物生产重组人干扰素 D.用高产青霉菌生产青霉素
13.EGFR是一种表皮生长因子受体，由信号肽区（可保证蛋白质在细胞中的定向运输）、胞外区、跨膜区和胞内区组成。当表皮生长因子与其胞外区结合后，可引起一系列基因活化，进而导致肿瘤细胞增殖，但EGFR缺失胞内区后形成的DNEGFR虽也可与表皮生长因子结合，却不会引起相应的基因活化。图1为EGFRcDNA结构及其对应的蛋白质的功能区,研究人员利用人结肠癌组织、pEGFP-N1质粒、大肠杆菌、cos-7细胞（一种常用的动物细胞系）等做了一系列实验，以探究DNEGFR基因在细胞中的表达和定位情况,基本流程如图2所示。
（1）研究人员从人结肠癌组织中提取总RNA,用______酶处理获得cDNA。图2中过程②应选择图1中的引物______（填数字）进行PCR。为确保过程③中pEGFP-N1质粒与DNEGFR基因的定向连接，常常需要在引物______端加入适用的限制酶的识别序列。
（2）图2中的EGFP是绿色荧光蛋白基因，研究人员使用含有EGFP的质粒来构建重组质粒，以便根据绿色荧光蛋白的位置确定_______。结合EGFR基因指导合成的蛋白质的各部分的功能，推测EGFP序列需在DNEGFR序列的______（填“上游”或“下游”），原因是_______。
（3）过程④中，将Ca2+处理过的大肠杆菌和重组质粒混匀后培养在含有______（填抗生素）的培养基上，进行过程④和过程⑤的目的是______。
（4）过程⑥进行时需要提供的气体环境为_______。若pEGFP-N1-DNEGFR转染cos-7细胞成功，过程⑥检测获得的cos-7细胞时荧光应主要分布在______部位。
14.科研人员将酵母液泡Cd转运蛋白基因(YCF1，1200bp)与质粒P0构建基因表达载体P1用于基因工程实验，过程如下图1所示，其中部分限制酶的识别序列与切割位点如下：
EcoR V：GAT↓ATC，SauA I：↓GATC，BamH I：G↓GATCC。请回答下列问题。
(1)为获取YCF1基因，将酵母细胞的全部DNA提取后通过①过程用EcoR V酶切割_______键，得到含________末端的YCF1基因。
(2)②过程利用PCR技术扩增目的基因时，需要根据目的基因________设计出一对引物，此外还需要在引物的两端加上限制酶识别序列，酶切后形成的黏性末端碱基序列为5’___________。
(3)用_________酶切质粒P0后与②过程产物在_________酶的作用下，形成基因表达载体P1。图中质粒P0除标注元件外，还缺少___________结构。
(4)为了筛选出含P1的受体菌，首先需要在添加_________的平板培养基上进行培养，之后利用影印平板法在含__________的平板培养基上继续培养，观察对比即可得到含P1受体菌。
(5)科研过程中还可以采用PCR技术检测受体菌是否成功转入了P1。提取转染后的四个受体菌S1-S4的总DNA，用目的基因的引物扩增后进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图2所示：
①图2中M泳道为标准对照组(Marker)，其实质为________________。
②图2中样本___________为成功转入了P1的受体菌，S4样本出现的结果可能原因有__________(在下列选项中选择)。
A.模板受到污染
B.引物特异性不强
C.退火温度偏低
D.退火温度偏高
答案以及解析
1.答案：B
解析：A、限制酶EcoR I和Pst I切割形成的是黏性末端，限制酶Sma I和EcoR V切割形成的是平末端，T4DNA连接酶可连接黏性末端和平末端，A错误；
B、DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键；DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸加到已有的核苷酸片段上，形成磷酸二酯键；RNA聚合酶将单个核糖核苷酸加到已有的核苷酸片段上形成磷酸二酯键，B正确；
C、一个限制酶切割一次，使DNA双链断开，会有两个磷酸二酯键断裂，形成2个黏性末端或平末端，形成2个游离的5′末端，C错误；
D、若两种限制酶的识别序列相同，但由于识别的位点不同，切割形成的末端不同，故不一定能通过DNA连接酶相互连接，D错误。
故选B。
2.答案：D
解析：A、该DNA分子经酶M和酶N两种限制酶切割后，产生了三个DNA片段且两个切口形成的黏性末端不同，说明该DNA分子含有酶M的一个切割位点和酶N的一个切割位点；质粒为环状DNA，其经酶M和酶N两种限制酶切割后，产生了两个DNA片段，观察两个切口形成的黏性末端，可推出质粒含有酶M的一个切割位点和酶N的一个切割位点，A正确；B、根据图中黏性末端可知，酶M和酶N识别的序列可能是或，但无法确定其对应关系，B正确；C、图中经酶切后形成的片段均是黏性末端，T4 DNA连接酶既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，也可以“缝合”双链DNA片段的平末端，而E.coli DNA连接酶只能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来，片段乙和片段丁黏性末端互补，C正确；D、根据图中黏性末端可知，片段乙、片段丁、片段戊三个片段不能连接成环状DNA分子，D错误。故选D。
3.答案：B
解析：限制酶主要存在于原核细胞中,只能识别双链DNA分子上的核苷酸序列,A错误;DNA连接酶不能识别DNA上的核苷酸序列,DNA连接酶作用过程中,具有黏性末端的两个DNA片段的黏性末端会自发互补配对,B正确;在DNA复制过程中,解旋酶可破坏氢键,使DNA双螺旋解开,C错误;成熟mRNA经逆转录酶催化形成的DNA缺少启动子和终止子,不能直接转录翻译合成蛋白质,D错误。
4.答案：D
解析：A、在PCR反应体系中加入特异性的荧光探针，荧光探针可以掺入新合成的DNA链中，每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，因此一定范围内，荧光强度与扩增出的DNA量呈正相关，A正确;B、最终各反应管的荧光强度一样，说明每个反应管内添加的荧光探针的量相同，B正确;C、PCR扩增时，相同时间内形成的DNA数量越多，每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，因此DNA数量越多，荧光强度越大，样品甲达到最大荧光强度所用的时间短于乙，因此样品甲的初始模板量大于样品乙，C正确;D、荧光强度不再变化可能是因为荧光探针或原料等消耗尽，若为前者，此后PCR反应仍在进行，D错误。故选D。
5.答案：D
解析：A错误。单酶切可能导致目的基因反向插入或质粒自连，无法确保定向克隆。B错误。同理，单酶切无法避免自连，且LacZ基因未被完全破坏，无法有效选重组体。C错误。缺少氨苄青霉素筛选，无法排除未成功转化的细菌(不含质粒)。D正确。双酶切(EcoR I和BamH I)确保目的基因定向插入LacZ基因内部，破坏其表达。重组质粒在含X-gal的培养基上呈白色，非重组质粒呈蓝色。氨苄青霉素筛选仅保留含质粒的细菌。
6.答案：C
解析：A、将重组质粒导入细菌B常用的方法是感受态细胞法，A错误；B、将完成导入过程后的细菌涂布在含有氨苄青霉素的培养基上，能生长的是导入了质粒A或重组质粒的细菌，B错误；C、将完成导入过程后的细菌涂布在含有四环素的培养基上，能生长的是导入了质粒A的细菌，C正确；D、目的基因成功导入的标志是受体细胞中含有目的基因，能产生出人的生长激素是转基因成功的标志，D错误。故选C。
7.答案：D
解析：A、CHO细胞不是新型冠状病毒的宿主细胞，中国仓鼠卵巢（CHO）细胞是基因工程的受体细胞，A错误； B、新型冠状病毒为RNA病毒，不能直接与CHO中的DNA重组，B错误； C、体外培养重组CHO细胞时需添加适量的抗生素，其目的是防止杂菌污染，C错误； D、可用抗原-抗体杂交技术检测目的基因是否成功表达出蛋白质，D正确。
故选D。
8.答案：B
解析：图中①以禽流感病毒RNA为模板获得目的基因DNA的过程,为逆转录过程,需要的酶是逆转录酶,逆转录合成的是DNA,需要4种脱氧核苷酸作为原料,A错误;目的基因应连接在启动子下游,并借助启动子启动转录过程,由图中启动子的箭头方向可知,目的基因与鸡卵清蛋白基因启动子右侧拼接,故应在目的基因的左侧引入BamH I的识别序列,分析题图,EcoR I与Hind Ⅲ切割后产生的黏性末端相同,为同尾酶,而质粒上有2个EcoR I的切割位点,且其中一个会破坏标记基因,故应选用Mfe I和Hind Ⅲ切割质粒,而要想将鸡卵清蛋白基因启动子一目的基因导入载体,需要在目的基因右侧引入Hind Ⅲ的识别序列,即需要在目的基因与鸡卵清蛋白基因启动子拼接前先在目的基因两端分别引入BamH I和Hind Ⅲ的识别序列,B正确;利用PCR扩增目的基因时,反应缓冲溶液中一般要加入Mg2+的目的是激活耐高温的DNA聚合酶,C错误;受体细胞为动物细胞时基因表达载体的导入通常采用显微注射法,因此基因表达载体导入受精鸡胚的胚盘可以使用显微注射法,D错误。
9.答案：B
解析：图示末端为黏性末端,所以环化阶段,可选E.coli DNA连接酶也能选T4DNA连接酶,A错误。据图中未知序列的位置可知,图中环状DNA进行PCR的过程中,沿左侧引物延伸子链的方向是逆时针,沿右侧引物延伸子链的方向是顺时针,B正确。根据题意和图示可知,DNA分子被限制酶EcoR I切割后环化,再通过PCR扩增得到包含所有已知序列和未知序列的链状DNA分子;未知序列含有EcoR I的切割位点,故PCR产物含有EcoR I的酶切位点, C错误。DNA子链合成的方向是5'→3',要通过已知序列设计引物,应选择引物1和引物4进行PCR扩增,D错误。
10.答案：D
解析：氨苄青霉素抗性基因是标记基因其作用是选出含有目的基因的细胞,D错误。
11.答案：AD
解析：A、PCR扩增依据的是DNA分子双链复制的原理，A正确；
B、进行PCR扩增需要热稳定DNA聚合酶（Taq DNA聚合酶），但不需要解旋酶，B错误；
C、DNA的两条链反向平行，子链从引物的3′端开始延伸，则利用图中的引物①、④组合可扩增出两侧的未知序列，C错误；
D、通过与受体细胞的基因组序列比对，即可确定T-DNA的插入位置，D正确。
故选AD。
12.答案：D
解析：A、乳腺生物反应器生产药用蛋白属于动物基因工程技术的应用，A不符合题意；B、培育抗除草剂的作物新品种属于植物基因工程技术的应用，B不符合题意；C、利用微生物生产重组人干扰素属于基因工程技术的应用，C不符合题意；D、用高产青霉菌生产青霉素属于诱变育种，不属于基因工程成果，D符合题意。故选D。
13.答案：（1）逆转录；1和3；5'
（2）DNEGFR蛋白在细胞中的位置；下游；若EGFP序列位于DNEGFR序列上游，则信号肽无法发挥作用，不能根据绿色荧光蛋白的位置判断DNEGFR的位置
（3）卡那霉素；获得更多的重组质粒
（4）95%空气和5%的CO2;细胞膜
解析：（1）通过RNA获得cDNA，需用逆转录酶处理。图2中过程②的目的是获得只控制合成信号肽段、胞外区、跨膜区三个部分的DNEGFRcDNA，因此应选择图1中的引物1和引物3进行PCR。为确保过程③中pEGFP-N1质粒与DNEGFR基因的定向连接，常常需要在引物5'端加入适用的限制酶的识别序列。
（2）图2中的EGFP是绿色荧光蛋白基因，研究人员使用含有EGFP的质粒来构建重组质粒，使得EGFP和DNEGFR同时表达，即以绿色荧光蛋白的位置来确定DNEGFR蛋白在细胞中的位置。若EGFP序列在DNEGFR序列的上游，则信号肽无法发挥作用，不能根据绿色荧光蛋白的位置判断DNEGFR的位置。
（3）过程④中，将Ca2+处理过的大肠杆菌与重组质粒混匀，培养在含有卡那霉素的培养基上。由图2可知，进行过程④和过程⑤的目的是获得更多的重组质粒。
（4）过程⑥是对转染后的动物细胞进行培养，此过程通常需要提供的气体环境为95%空气（满足细胞代谢对氧气的需求）和5%的CO2（维持培养液的pH）。若pEGFP-N1-DNEGFR转染cos-7细胞成功，过程⑥检测获得的cos-7细胞时，荧光应主要分布在细胞膜部位。
14.答案：(1)磷酸二酯键；平
(2)两端核苷酸(碱基)序列；GATC
(3)BamH I；DNA连接(酶)；启动子和终止子
(4)四环素；青霉素
(5)已知不同长度的DNA片段混合物；S1、S2、S4；ABC
解析：（1）EcoR V为限制酶，其切割DNA的磷酸二酯键。结合题干信息中EcoR V的识别序列与切割位点可知，该酶切割DNA后产生的是平末端。
（2）引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。利用PCR技术扩增目的基因时，需根据目的基因两端的碱基序列设计出一对引物。由图可知，目的基因两侧都是黏性末端，根据给出的三种限制酶的识别序列与切割位点（用EcoR V酶切后形成的是平末端，用Sau3A I、BamH I酶切后形成的都是黏性末端，且碱基序列均为GATC）可知，在引物的两端加上限制酶识别序列，酶切后形成的黏性末端碱基序列为5'GATC。
（3）分析图1可知，质粒P0的复制原点中有EcoR V的识别序列，故不能选择该限制酶切割质粒P0；切割质粒P0时不能选择Sau3A I，否则会导致青霉素抗性基因、四环素抗性基因都被破坏，因此应选择BamH I切割质粒P0酶切后的质粒P0与过程②产物在DNA连接酶的作用下形成基因表达载体P1。图中质粒P0中有复制原点、标记基因和限制酶酶切位点，还缺少启动子和终止子。
（4）用BamH I切割质粒P0破坏了青霉素抗性基因，故欲筛选出含P1的受体菌，首先需在添加四环素的平板培养基上进行培养，在该平板培养基上能生长的菌为含有质粒P0和含有P1的菌。然后采用影印平板法在含有青霉素的平板培养基上继续培养，在此培养基上能生长的菌为含有质粒0的菌。在含四环素的培养基上能生长而在含青霉素的培养基上不能生长的菌即含P1的受体菌。
（5）②由题干可知，目的基因YCF1的长度为1200bp。分析图2可知，样本S1、S2、S4中含有该长度的DNA片段，故样本S1、S2、S4为成功转入了P1的受体菌。样本S4出现题图中结果的可能原因有模板受到污染、引物的特异性不强或退火温度偏低，导致有其他长度的DNA片段出现。专题四 植物细胞工程
——高二生物学人教版（2019）选择性必修三速练100题
1.图示植物原生质体制备、分离和检测的流程。下列相关叙述正确的是( )
A.步骤①添加盐酸以去除细胞壁
B.步骤②吸取原生质体放入无菌水中清洗
C.原生质体密度介于图中甘露醇和蔗糖溶液密度之间
D.台盼蓝检测后应选择蓝色的原生质体继续培养
2.青蒿素是从黄花蒿中提取的，研究人员欲运用植物组织培养技术获得黄花蒿，培养过程中发现其愈伤组织中没有青蒿素，由愈伤组织再分化形成的芽和苗中均有青蒿素。下列分析正确的是( )
A.愈伤组织细胞中缺乏控制合成青蒿素的相关基因
B.取黄花蒿的茎尖分生区组织进行培养可获得抗病毒植株
C.脱分化形成愈伤组织的过程中需要给予适当的光照
D.再分化时降低培养基中生长素和细胞分裂素含量的比值，有利于生产青蒿素
3.白藜芦醇（Res）是葡萄、花生、藜芦等植物受到病原菌刺激后产生的一种抗毒素，具有抗炎、抗癌等多种功效，如图是NAA对藜芦悬浮培养细胞的生长速率及单位质量细胞中的Res产量影响曲线。下列相关叙述正确的是( )
A.Res是植物的初生代谢物
B.用胰蛋白酶处理愈伤组织可获得单个细胞
C.在培养愈伤组织过程中施加诱变处理，可获得较高Res产量的细胞
D.为获得较大Res总产量，培养液中NAA浓度应为2.0mg·L-1生物
4.束顶病毒是引起香蕉束顶病的病原体。农业上，常用感病植株的茎尖作外植体以获得脱毒苗，科研人员进行了相关实验，结果如表所示。下列叙述错误的是( )
处理方法 茎尖数量 成活茎尖数 成活率（%） 脱毒茎尖数 脱毒率（%）
未低温保存 32 30 93.755 8 26.67
超低温保存 60 33 55 20 60.61
A.感病植株的茎尖病毒极少，甚至无病毒，可被用作外植体
B.表中的茎尖脱毒率可采用接种病毒的方法来进行检测
C.由表可知，超低温保存茎尖可提高其脱毒率，但会降低成活率
D.脱毒苗培养过程中要适时调整生长素与细胞分裂素的用量比值
5.植物细胞悬浮培养技术在生产中已得到应用。某兴趣小组尝试利用该技术培养胡萝卜细胞并获取番茄红素，设计了以下实验流程和培养装置（如图），请同学们进行评议。下列评议不合理的是( )
A.实验流程中应该用果胶酶等处理愈伤组织，制备悬浮细胞
B.装置中的充气管应置于液面上方，该管可同时作为排气管
C.装置充气口需要增设无菌滤器，用于防止杂菌污染培养液
D.细胞培养需要适宜的温度，装置需增设温度监测和控制设备
6.植物甲抗旱、抗病性强，植物乙分蘖能力强、结实性好。科研人员通过植物体细胞杂交技术培育出兼有甲、乙优良性状的植物丙，过程如下图所示。下列叙述错误的是( )
A.过程①中酶处理的时间差异，原因可能是两种亲本的细胞壁结构有差异
B.过程②中常采用灭活的仙台病毒或PEG诱导原生质体融合
C.过程④和⑤的培养基中均需要添加生长素和细胞分裂素
D.可通过分析植物丙的染色体，来鉴定其是否为杂种植株
7.花青素是一类广泛存在于植物细胞中的水溶性天然色素，具有较强的抗氧化、抗辐射、抗衰老、清除自由基等能力,某科研团队利用植物细胞工程技术在离体条件下对单个紫薯细胞或细胞团进行培养使其增殖,通过细胞培养获得了比原植株含量高很多倍的花青素。下列叙述错误的是( )
A.利用该技术获得花青素时需要培养大量植株
B.生产过程可采用液体悬浮培养，增加其产量
C.花青素属于植物细胞的次生代谢产物
D.工业化生产关键是要提高培养物产量和花青素含量
8.科研人员利用野生型马铃薯（用图中甲表示）和抗青枯病的茄子（用图中乙表示）进行体细胞杂交，培育抗青枯病马铃薯,实验流程如图所示。已知图中处理1用到了蜗牛消化道提取液。下列叙述错误的是( )
A.蜗牛消化道提取液中可能含有纤维素酶和果胶酶-
B.图中的①②分别表小杂种细胞、愈伤组织
C.为确定杂种植株是不是所需要的目的植株，还需要对其进行青枯病抗性检测
D.图中诱导选择过程不需要更换培养基，但需要增加光照
9.从古至今，兰花都是高洁、典雅的象征，很多人喜欢养兰花，但兰花在自然条件下萌发率极低。目前，我国已将组织培养技术广泛应用于兰花种苗的规模化繁殖，让名贵的兰花也“走入”了寻常百姓家。下列相关叙述错误的是( )
A.利用植物组织培养技术快速繁殖兰花种苗利用了植物细胞的全能性
B.生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键激素
C.组织培养过程中，脱分化和再分化过程均需要保持恒温、避光的环境条件
D.幼苗移栽前需要先将其移植到消过毒的蛭石或珍珠岩中，待长壮后再移栽入土
10.同源四倍体的紫花苜蓿被誉为“牧草之王”，但易造成家畜鼓胀病；二倍体的百脉根因富含缩合单宁，饲喂时可防止家畜鼓胀病的发生。研究人员设计了下列技术路线，以期获得抗鼓胀病的新型苜蓿。
（注：R-6G可阻止线粒体的呼吸作用，IOA可抑制植物细胞呼吸第一阶段，二者有效抑制不同植物细胞正常代谢的临界浓度不同）
（1）培育抗鼓胀病的新型苜蓿依据的生物学原理有____________。培养原生质体时，需要加入适宜浓度的甘露醇以保持一定的渗透压，其作用是____________。
（2）在实验前需通过预实验来探究R-6G或IOA使原生质体失去再生愈伤组织能力的临界浓度，设计思路是____________。
（3）步骤②到步骤③需要更换新的培养基，原因之一是培养基中____________是影响植物细胞分裂、脱分化和再分化的关键因素。
（4）科研人员研究了不同浓度的聚乙二醇（PEG）对紫花苜蓿和百脉根原生质体融合率的影响，实验结果如下图。异源融合率是指不同种的原生质体发生融合的概率，已知PEG浓度较高时对细胞具有毒害作用。
①诱导原生质体融合的方法除了使用聚乙二醇外，还可以利用的化学方法是____________。
②实验结果表明诱导苜蓿与百脉根原生质体融合的最佳PEG浓度为____________，理由是____________。
11.中国科学家屠呦呦因在抗疟疾药物青蒿素的提取方面做出了突出贡献而获2015年诺贝尔生理学或医学奖。如图为借助植物组织培养技术获得青蒿素含量较高的黄花蒿（又称青蒿）的基本流程。回答下列问题。
（1）对外植体进行消毒时，需要用到___________的酒精溶液，幼嫩的材料易在酒精溶液中失绿，所以浸泡时间要短，而且酒精处理后马上要用___________冲洗。
（2）愈伤组织是一团______________________。愈伤组织中提取不到青蒿素的根本原因是______________________。步骤③向培养基中加入抗生素的作用是______________________。
（3）某小组对④过程得到的青蒿根继续进行组织培养得到了黄花蒿幼苗，但是幼苗叶片颜色为黄色，可能的原因是培养基中___________元素不足。
答案以及解析
1.答案：C
解析：A、步骤①添加纤维素酶或果胶酶去除细胞，其原理是酶的专一性，A错误；
B、步骤②吸取原生质体放入等渗液中清洗，否则会导致原生质体吸水涨破，B错误；
C、结合图示可知原生质体处于甘露醇和蔗糖溶液之间，因而可推测原生质体的密度介于图中甘露醇和蔗糖溶液密度之间，C正确；
D、台盼蓝检测后应选择无色的原生质体继续培养，染成蓝色的原生质体活性差或死亡，D错误。
故选C。
2.答案：D
解析：愈伤组织中没有青蒿素,但愈伤组织细胞中含有控制合成青蒿素的相关基因,只是该基因在该细胞中没有表达, A错误；茎尖等分生区组织病毒少,甚至没有病毒,取黄花蒿植物的茎尖等分生区组织进行培养可获得脱毒植株而不是抗毒植株,B错误；诱导愈伤组织形成期间一般不需要光照,C错误；再分化时接养基中生长素和细胞分裂素含量的比值低时,利于芽的形成,利于从中提取青蒿素,D正确。
3.答案：C
解析：次生代谢物不是生物生长所必需的,一般在一定的累考点环境和时间条件下产生,Res是植物受病原菌刺激后产生的,属于次生代谢物,A错误;愈伤组织可利用纤维素酶和果胶酶分散成单个细胞,胰蛋白酶通常用于分散动物细胞,B错误;培养愈伤组织过程中由于细胞处于不断增殖状态,因此容易受到诱变因素的影响而产生突变,可能会获得较高Res产量的细胞,C正确;结合题图生长速率和单位质量细胞中Res含量可知,NAA浓度为1.0mg·L-1时Res总产量高于NAA浓度为2.0mg·L-1时,故为获得较大Res总产量,培养液中最适合的NAA浓度不应为2.0mg·L-1,D错误。
4.答案：B
解析：茎尖、根尖病毒极少，甚至无病毒，一般选取茎尖、根尖作为外植体，A正确；为检测脱毒苗的质量，可采用抗原—抗体杂交的方法检测病毒的蛋白质，也可采用核酸分子杂交的方法检测病毒的基因，B错误；由题表可知，超低温保存的茎尖脱毒率远高于未低温保存的，而成活率远低于末低温保存的，C正确；在植物组织培养过程中生长素与细胞分裂素的用量比值不同，诱导结果不同，比值低时有利于生芽，比值高时有利于生根，D正确。
5.答案：B
解析：A、植物细胞壁的主要成分是纤维素和果胶，欲利用愈伤组织制备悬浮细胞，可用纤维素酶和果胶酶进行处理愈伤组织，A正确；
B、装置中的充气管应置于液面下方，以利于培养液中的溶氧量的增加，该管不能同时作为排气管，B错误；
C、为了防止杂菌污染培养液，装置充气口需要增设无菌滤器，C正确；
D、细胞培养时需要保证适宜的温度，因此装置需增设温度监测和控制设备，D正确。
故选B。
6.答案：B
解析：酶解是为了去除植物细胞的细胞壁，过程①中酶处理的时间不同，说明两种亲本的细胞壁结构有差异，A正确；过程②为原生质体的融合，常用PEG诱导原生质体融合，灭活的仙台病毒可诱导动物细胞融合，不能用于植物，B错误；过程④脱分化和⑤再分化的培养基中均需要添加生长素和细胞分裂素，但在两个过程中比例不同，C正确；植物丙是植物甲和植物乙体细胞杂交形成的个体，应具备两者的遗传物质，因此可通过分析植物丙的染色体，来鉴定其是否为杂种植株，D正确。
7.答案：A
解析：花青素是植物细胞中的水溶性天然色素,利用植物细胞工程技术获得花青素时,只需培养大量紫薯细胞,A错误；生产过程可采用液体悬浮培养,有利于细胞与培养液的充分接触,增加其产量,B正确；花青素不是植物生长发育必需的小分子有机物,属于植物的次生代谢产物,C正确；工业化生产关键是要提高培养物产量和花青素含量,D正确。
8.答案：D
解析：该技术的目的是培养抗青枯病马铃薯,为确定杂种植株是不是目的植株,还需要进行个体生物学水平的检测,即需要对其进行青枯病抗性检测,C正确;诱导愈伤组织的形成(①→②)和诱导愈伤组织分化形成试管苗(②→试管苗)所需的生长素和细胞分裂素的比例不同,因此需要更换培养基,D错误。
9.答案：C
解析：利用植物组织培养技术快速繁殖兰花种苗利用了植物细胞的全能性，原因是植物细胞具有本物种生长发育所需的全部遗传信息，A正确；生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键激素，两者的比例会影响细胞分化方向，B正确；植物组织培养过程中，脱分化通常需要避光，而再分化过程需要有光，C错误；移栽前应将幼苗移植到消过毒的蛭石或珍珠岩等环境下生活一段时间再移栽入土，目的是使幼苗适应环境，利于移栽成活，D正确。
10.答案：（1）细胞膜的流动性和植物细胞的全能性；保持原生质体的完整性
（2）将获取的原生质体分别放置在不同浓度的R-6G或IOA溶液中，培养一段时间后，观察原生质体再生情况
（3）细胞分裂素和生长素的浓度和比例
（4）高Ca2+—高pH融合；35%；该浓度下异源融合率最高，同时PEG浓度相对较低对细胞的毒害作用较小
解析：（1）由图可知，培育抗鼓胀病的新型苜蓿采用的是植物体细胞杂交技术，该生物技术的原理是细胞膜的流动性和植物细胞的全能性。将植物细胞的细胞壁去除即可获得原生质体。培养原生质体时，为了防止原生质体吸水涨破，需要加入适宜浓度的甘露醇以保持一定的渗透压，其作用是保持原生质体的完整性。
（2）在实验前需通过预实验来探究R-6G或IOA使原生质体失去再生愈伤组织能力的临界浓度，由于需要获得具体的浓度，因此需要将获取的原生质体分别放置在不同浓度的R-6G或IOA溶液中，培养一段时间后，观察原生质体再生情况，根据再生情况获得各自的临界值。
（3）步骤②是脱分化，步骤③是再分化。步骤②到步骤③需要更换新的培养基，原因之一是培养基中细胞分裂素和生长素的浓度和比例是影响植物细胞分裂、脱分化和再分化的关键因素。
（4）①诱导原生质体融合的化学法包括聚乙二醇（PEG）融合法、高Ca2+—高pH融合法等。
②已知PEG浓度较高时对细胞具有毒害作用。分析柱形图可知：当PEG浓度为35%时，异源融合率最高，同时PEG浓度相对较低，对细胞的毒害作用较小，因此诱导苜蓿与百脉根原生质体融合的最佳PEG浓度为35%。
11.答案：（1）体积分数为70%；无菌水
（2）没有特定形态、结构和功能的薄壁细胞；相关基因没有在愈伤组织细胞中表达；杀菌（杀死发根农杆菌及其他细菌）
（3）镁（或氮）
解析：（1）在植物组织培养过程中，需要用到体积分数为70%的酒精溶液对外植体进行消毒，用酒精处理后要马上用无菌水冲洗。
（2）愈伤组织是一团没有特定形态、结构和功能的薄壁细胞。愈伤组织中提取不到青蒿素的根本原因是相关基因没有在愈伤组织细胞中表达。根据题意可知，步骤③向培养基中加入抗生素的作用是杀死发根农杆菌及其他细菌。
（3）某小组得到的黄花蒿幼苗叶片颜色为黄色，即缺少叶绿素，可能的原因是培养基中镁元素或氮元素不足。专题八 蛋白质工程
——高二生物学人教版（2019）选择性必修三速练100题
1.从某海洋动物中获得一基因，其表达产物为一种抗菌体和溶血性均较强的多肽P1。目前在P1的基础上研发抗菌性强但溶血性弱的多肽药物，首先要做的是( )
A.合成编码目的肽的DNA片段
B.构建含目的肽DNA片段的表达载体
C.依据P1氨基酸序列设计多条模拟肽
D.筛选出具有优良活性的模拟肽作为目的肽
2.T4溶菌酶耐热性差，若将该酶的第3位氨基酸进行改造（如图所示），并使第3位氨基酸和第97位氨基酸之间形成1个二硫键，可以大大提高其耐热性。下列叙述错误的是( )
A.根据T4溶菌酶的氨基酸序列可推测出多种脱氧核苷酸序列
B.T4溶菌酶耐热性提高的原因是其氨基酸的种类和数量均发生改变
C.改造T4溶菌酶可利用基因定点突变技术，对相关基因进行改造
D.改造后的T4溶菌酶需要进行功能鉴定才能应用于生产实践
3.人的T细胞可以产生某种具有临床价值的蛋白质(Y), 天然的Y通常需要在低温下保存,若将Y的第6位氨基酸甲改变为氨基酸乙,可提高其热稳定性。下列说法错误的是( )
A.蛋白质工程的目标是根据人们对蛋白质功能的需求,对其结构进行设计改造
B.蛋白质工程中的操作对象是蛋白质或控制蛋白质合成的基因
C.若要获得编码Y的基因,可从人的T细胞中提取RNA,逆转录合成DNA
D.经改造后的Y的热稳定性提高这一性状可遗传
4.天然胰岛素制剂容易形成二聚体或六聚体，皮下注射后往往要逐渐解离为单体，才能发挥作用，在一定程度上延缓了疗效。科学家利用蛋白质工程(基本思路如图)研发出速效胰岛素，已在临床上广泛应用。下列有关叙述正确的是( )
A.当前限制蛋白质工程发展的关键因素是基因工程技术还不成熟
B.从六聚体胰岛素解离为单体形式是将胰岛素水解为氨基酸
C.利用基因工程和蛋白质工程生产胰岛素都经历①②过程
D.利用蛋白质工程生产速效胰岛素要从推测b入手
5.科学家将葡萄糖异构酶的第138位甘氨酸用脯氨酸替代，结果它的最适反应温度提高了10~12℃。据分析，脯氨酸替代甘氨酸后，由于引入了一个吡咯环侧链，该侧链刚好填充于第138位甘氨酸附近的空洞，使蛋白质的空间结构更具刚性，从而提高了酶的热稳定性。下列说法正确的是( )
A.蛋白质工程和基因工程的根本区别是操作对象的差异
B.对葡萄糖异构酶的改造需要以基因工程为基础
C.蛋白质工程操作过程中，不需要酶和载体作为工具
D.经改造后的葡萄糖异构酶热稳定性提高这一性状不可遗传
6.已经能够预测人类98.5%的蛋白质结构,有科学家认为,AlphaFold2对蛋白质结构的精准预测,是人工智能对科学领域最大的一次贡献,也是人类在21世纪取得的最重要的科学突破之一。下列相关叙述错误的是( )
A.预测蛋白质结构,设计并制造出新的蛋白质属于第二代基因工程
B.蛋白质工程通过改造现有蛋白质或制造一种新的蛋白质来满足人类需求
C.蛋白质工程的操作摆脱了自然界关于遗传信息在生物大分子上传递的规律
D.科学家通过对控制干扰素合成的基因直接进行操作,从而提高了干扰素的稳定性
7.研究者计划将绿色荧光蛋白第203位的苏氨酸替换为酪氨酸，以获得黄色荧光蛋白。下列方案可行的是( )
A.使用蛋白酶水解第203位氨基酸前后的肽键实现氨基酸替换
B.在mRNA中直接替换第609~611位三个碱基
C.根据新的氨基酸序列推测并合成相应的DNA序列
D.将改造后的黄色荧光蛋白基因直接注入大肠杆菌获得转基因菌株
8.β-防御素是由pBD-2基因编码的抗菌肽,可构建重组毕赤酵母并通过其发酵作用实现量产。但重组毕赤酵母合成的β-防御素与人β-防御素的结构存在差异,因此β-防御素具有潜在的抗原性,如果用作防腐剂添加到食品中可能会使人体发生过敏反应。蛋白质工程可改造β-防御素,减轻其引起的过敏反应。下列有关叙述正确的是( )
A.为减轻过敏反应,可改造pBD-2基因以去掉β-防御素中抗原性较强的部分
B.将改造后的pBD-2基因与启动子连接后直接导入毕赤酵母,就可以使其完成表达
C.通过蛋白质工程获得的新型β-防御素与天然β-防御素属于同一种蛋白质
D.改造β-防御素需使用工具酶,如限制酶、DNA聚合酶等
9.胰岛素用于治疗糖尿病，但胰岛素注射后易在皮下堆积，需较长时间才能进入血液，进入血液后又易被分解，因此治疗效果受到影响。科研人员研制了速效胰岛素，其生产过程如图所示。下列说法错误的是( )
A.速效胰岛素的生产需要用到蛋白质工程和发酵工程
B.大肠杆菌合成的新的胰岛素不能正常发挥作用
C.除人工合成DNA外，还可以通过定点突变技术获得目的基因
D.可以用Ca2+处理的方法直接将新的胰岛素基因导入大肠杆菌细胞中
10.人体内的t-PA蛋白能高效降解血栓，是心梗和脑血栓的急救药。然而，为心梗患者注射大剂量的基因工程t-PA会诱发颅内出血。研究证实，将t-PA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，能显著降低出血副作用。据此，先对天然的t-PA基因进行序列改造，然后再采取传统的基因工程方法表达该突变基因，可制造出性能优异的t-PA突变蛋白。下图是通过重叠延伸PCR技术获取t-PA改良基因和利用质粒pCLYII构建含t-PA改良基因的重组质粒示意图(图中重叠延伸PCR过程中引物a、b用来扩增突变位点的上游DNA序列，引物c、d用来扩增突变位点的下游DNA序列)。请回答下列问题。
(1)科学家将t-PA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，生产出性能优良的t-PA突变蛋白的生物技术手段属于______范畴。
(2)获得性能优良的t-PA突变蛋白的正确顺序是_____________(选择正确编号并排序)。
①t-PA蛋白功能分析和结构设计
②借助定点突变改造t-PA基因序列
③检验t-PA蛋白的结构和功能
④设计t-PA蛋白氨基酸序列和基因序列
⑤利用工程菌发酵合成t-PA蛋白
(3)已知t-PA蛋白第84位是半胱氨酸，相应的基因模板链(图中t-PA基因的上链)上的碱基序列是ACA，丝氨酸的密码子是UCU。重叠延申PCR示意图中的黑点便是突变部位的碱基，引物b中该突变位点的碱基是_______，引物c中该突变位点的碱基是_______。
(4)据图可知，重叠延伸时，需要的引物是______，引物的作用是______。若扩增图中序列时引物选择正确，PCR操作过程没有问题，但对产物进行电泳时，发现除了目标序列外还有很多非特异性条带，请分析出现此情况的原因____。
(5)若获得的t-PA突变基因如图所示，那么质粒pCLY11需用限制酶_______切开，才能与t-PA突变基因高效连接。
答案以及解析
1.答案：C
解析：该题目属于蛋白质工程，已经获得该目的基因片段，不需要合成编码目的肽的DNA片段，故A错误；是需要构建含目的肽DNA片段的表达载体，但这不是第一步，故B错误；蛋白质工程的第一步是根据蛋白质的功能，设计P1氨基酸序列，从而推出其基因序列，故C正确；该基因表达产物为一种抗菌体和溶血性均较强的多肽P1，目前在P1的基础上研发抗菌性强但溶血性弱的多肽药物，而目的多肽是抗菌性强但溶血性弱，所以必须对其改造，保持其抗菌性强，抑制其溶血性，故D错误。
2.答案：B
解析：A、由于一种氨基酸可能对应多种密码子，因此根据设计的T4溶菌酶的氨基酸序列可能推测出多种脱氧核苷酸序列，A正确；B、根据题意“科学家通过相关研究，最终使T4溶菌酶的第3位异亮氨酸变为半胱氨酸”可知，T4溶菌酶耐热性提高的原因是组成该酶的氨基酸种类和排列顺序发生了改变，而氨基酸的数量没变，B错误；C、根据题意，改造T4溶菌酶可以从合成蛋白质的基因进行改造，因此可利用基因定点突变技术，对相关基因进行改造，C正确；D、该实例将蛋白质进行了改造，属于蛋白质工程的范畴，T4溶菌酶本质为蛋白质，可利用抗原—抗体特异性结合的特点对该酶进行检测，D正确。故选B。
3.答案：B
解析：蛋白质工程的目标是根据人们对蛋白质功能的特定需求,对蛋白质的结构进行设计改造,A正确;蛋白质工程中的操作对象是基因,B错误;由于人的T细胞可以产生Y,故可以从人的T细胞中提取mRNA,经过逆转录合成cDNA,来获取编码Y的基因,C正确；因为蛋白质工程本质上改造的是基因,故经改造后的Y的热稳定性提高这一性状可遗传,D正确。
4.答案：C
解析：A、当前限制蛋白质工程发展的关键因素是蛋白质发挥功能必须依赖于正确的高级结构，而这种高级结构往往很复杂，人们对蛋白质的高级结构了解太少，A错误；B、由题干信息可知，经过蛋白质工程改造后，发挥作用的仍是胰岛素分子，所以从六聚体胰岛素解离为单体形式是将六个胰岛素形成的六聚体水解为单个胰岛素的过程，B错误；C、利用基因工程和蛋白质工程生产胰岛素都经历找到对应的脱氧核苷酸序列（基因）→转录（①）形成mRNA(c)→翻译（②）获得所需要的蛋白质过程，C正确；D、蛋白质工程中，首先根据预期的蛋白质功能设计预期的蛋白质结构，因此利用蛋白质工程生产速效胰岛素要从设计预期的蛋白质结构（a）入手，D错误。故选C。
5.答案：B
解析：蛋白质工程中对蛋白质的改造必须通过改造或合成基因来完成。葡萄糖异构酶的改造过程中涉及基因的改造，其遗传物质会发生改变，因此属于可遗传变异，D错误。
6.答案：C
解析：通过改造或合成基因,来改造现有蛋白质,或制造一种新的蛋白质属于蛋白质工程,它是在基因工程的基础上,延伸出来的第二代基因工程,A正确；蛋白质工程最终的目的是通过改造或合成基因,来改造现有蛋白质,或制造一种新的蛋白质,以满足人类生产和生活的需求, B正确；蛋白质工程的操作仍然遵循中心法则,因此并未摆脱自然界关于遗传信息在生物大分子上传递的规律,C错误；科学家通过对干扰素合成的基因进行操作,使干扰素分子上的一个半胱氨酸变成丝氨酸,从而提高了干扰素的稳定性,D正确。
7.答案：C
解析：A、用蛋白酶直接处理绿色荧光蛋白得到的是各种氨基酸，而不是第203位苏氨酸替换为酪氨酸的黄色荧光蛋白，A错误；B、任何一种天然蛋白质都是由基因编码的，改造了基因即对蛋白质进行了改造，而且可以遗传下去，如果对mRNA直接改即使改造成功，被改造的蛋白质也是无法遗传的，B错误；C、蛋白质工程的操作思路：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列（基因），然后还要合成或改造DNA、构建基因表达载体，即按照基因工程的操作，最后获得所需要的目的蛋白质，C正确；D、改造后的黄色荧光蛋白基因必须与载体构建形成重组载体才能注入大肠杆菌获得转基因菌株，如果直接导入基因，基因在受体细胞里容易被降解不能稳定遗传，D错误；故选C。
8.答案：A
解析：蛋白质工程通过改造或合成基因来改造蛋白质或制造新的蛋白质,本题中为减轻过敏反应,可通过改造pBD-2基因,使β-防御素结构改变,从而去掉β-防御素中抗原性较强的部分,A正确;将改造后的pBD-2基因与载体连接,构建基因表达载体,再导入毕赤酵母,才能使其完成表达,B错误;通过蛋白质工程获得的新型β-防御素在结构上与天然β-防御素不同,不属于同一种蛋白质,C错误；改造β-防御素需使用多种工具酶,如限制酶、DNA连接酶,不使用DNA聚合酶,D错误。
9.答案：D
解析：A、图示的前半部分是利用蛋白质工程设计速效胰岛素的生产过程，后半部分是利用发酵工程生产速效胰岛素的过程，A正确；B、大肠杆菌是原核生物，没有内质网和高尔基体对胰岛素原进行加工，因此大肠杆菌合成的新的胰岛素不能正常发挥作用，B正确；C、基因定点突变是指按照特定的要求，使基因的特定序列发生插入、删除、置换、重排等变异，除人工合成DNA外，还可以通过定点突变技术获得目的基因，C正确；D、可以用Ca2+处理的方法可以将含有新的胰岛素基因的基因表达载体导入大肠杆菌细胞中，D错误。故选D。
10.答案：(1)蛋白质工程
(2)①④②⑤③
(3)G；C
(4)引物a和引物d；使DNA聚合酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸退火(复性)温度过低、引物特异性不高
(5)Xma I、Bg1 II
解析：(1)由题干信息可知，上述生产改良t-PA蛋白的技术是先对天然的t-PA基因进行序列改造，然后在大肠杆菌中表达改造后的基因，可得到性能优异的改良t-PA蛋白，因此属于蛋白质工程。
(2)蛋白质工程的一般过程是:根据新蛋白质预期功能设计相关蛋白质结构一设计对应的氨基酸序列→合成可产生新蛋白质的相关脱氧核苷酸序列→利用基因工程技术合成新的蛋白质，获得性能优良的t-PA突变蛋白的正确顺序是①t-PA蛋白功能分析和结构设计→④设计t-PA蛋白氨基酸序列和基因序列→②借助定点突变改造t-PA基因序列→⑤利用工程菌发酵合成t-PA蛋白→③检验t-PA蛋白的结构和功能。
(3)已知t-PA蛋白第84位是半胱氨酸，相应的基因模板链(图中t-PA基因的上链)上的碱基序列是ACA，则半胱氨酸的密码子为UGU，而丝氨酸的密码子是UCU，由此可知，若要将t-PA蛋白第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，则t-PA基因上链第84位发生碱基替换为ACA→AGA，图中显示引物b与t-PA基因的下链互补，故其中相应部位的碱基与上链相同，即该部位的碱基是G，引物c与t-PA基因的上链互补，故其中相应部位的碱基与下链相同，即该部位的碱基是C.
(4)由于DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3端延伸DNA链，因此PCR中需要加入合适的引物来完成子链的延伸，引物需要与模板的3端结合，故据图可知，重叠延伸时，需要的引物是引物x和引物b;DNA聚合酶不能从头合成DNA，只能从引物的3端开始廷伸DN人链，因此引物的作用是使DNA聚合酶从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸;出现非目的序列产物的原因有:引物设计太短(或引物特异性不强，即与非目的序列有同源性)、两引物之间碱基互补配对(形成引物二聚体)、复性温度过低、Mg2+浓度过高、DNA模板出现污染等。
(5)根据图中目的基因两端的黏性末端以及各种限制酶的切割位点可知，在构建重组质粒时。选用限制醇Xma I和Bg1 II切割质粒，才能与目的基因t-PA改良基因高效连接。

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