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(共101张PPT)
专题五　生物技术与工程
微专题12　发酵工程
考点1　传统发酵技术和发酵工程的应用
　　　　　　
1．三种传统食品的制作技术
18～30
30～35
无氧，常温
2．啤酒的工业化生产流程
糖化
大部分糖的分解
低温
密闭
3．发酵过程中控制杂菌的“四大措施”
(1)通过发酵条件控制杂菌：
①无氧发酵时的无氧环境可以抑制好氧细菌。
②乳酸菌发酵、酒精发酵形成的酸性环境可以抑制杂菌繁殖。
(2)利用盐控制杂菌：如腐乳的制作。
(3)利用酒精控制杂菌：如果酒、腐乳的制作。
(4)利用香辛料控制杂菌：如腐乳、泡菜的制作。
4．发酵过程的影响因素
(1)温度：温度能影响酶的活性，也能影响生物合成的途径。温度还会影响发酵液的物理性质，以及菌种对营养物质的分解吸收等。
(2)pH：pH能够影响酶的活性，以及细胞膜的带电荷状况。还会影响培养基中营养物质的分解等。
(3)溶解氧：在发酵过程中，菌种只能利用发酵液中的溶解氧。因此，必须向发酵液中连续补充大量的氧，并要不断地进行搅拌，以提高氧在发酵液中的溶解度。
(4)泡沫：发酵过程中，通气、搅拌、微生物的代谢过程及培养基中某些成分的分解等，都有可能产生泡沫。过多的持久性泡沫对发酵是不利的。
(5)营养物质的浓度：发酵液中各种营养物质的浓度，特别是碳氮比、无机盐和维生素的浓度，会直接影响菌体的生长和代谢物的积累。
1．(2024·江西卷)井冈霉素是我国科学家发现的一种氨基寡糖类抗生素，它由吸水链霉菌井冈变种(JGs，一种放线菌，菌体呈丝状生长)发酵而来，在水稻病害防治等领域中得到广泛应用。下列关于JGs发酵生产井冈霉素的叙述，正确的是(　　)
A．JGs可发酵生产井冈霉素，因为它含有能够编码井冈霉素的基因
B．JGs接入发酵罐前需要扩大培养，该过程不影响井冈霉素的产量
C．提高JGs发酵培养基中营养物质的浓度，会提高井冈霉素的产量
D．稀释涂布平板法不宜用于监控JGs发酵过程中活细胞数量的变化
√
D　[基因表达的产物是蛋白质，而井冈霉素是JGs发酵生产的一种氨基寡糖类抗生素，A错误；JGs接入发酵罐前需要扩大培养，该过程会影响JGs的数量，进而影响井冈霉素的产量，B错误；在一定范围内提高JGs发酵培养基中营养物质的浓度，会提高井冈霉素的产量，但若浓度过大，反而会降低井冈霉素的产量，C错误；JGs是一种放线菌，菌体呈丝状生长，形成的菌落难以区分，因此稀释涂布平板法不宜用于监控JGs发酵过程中活细胞数量的变化，D正确。]
2．(不定项)(2024·河北卷)中国传统白酒多以泥窖为发酵基础，素有“千年老窖万年糟”“以窖养糟，以糟养泥”之说。多年反复利用的老窖池内壁窖泥中含有大量与酿酒相关的微生物。下列叙述正确的是(　　)
A．传统白酒的酿造是在以酿酒酵母为主的多种微生物共同作用下完成的
B．窖池内各种微生物形成了相对稳定的体系，使酿造过程不易污染杂菌
C．从窖泥中分离的酿酒酵母扩大培养时，需在CO2或N2环境中进行
D．从谷物原料发酵形成的酒糟中，可分离出产淀粉酶的微生物
√
√
√
ABD　[白酒的酿造主要依靠酿酒酵母，由于窖泥中含有大量与酿酒相关的微生物，故传统白酒的酿造是在以酿酒酵母为主的多种微生物共同作用下完成的，A正确；窖池内各种微生物形成了相对稳定的体系，使酿造过程不易污染杂菌，B正确；酵母菌是兼性厌氧菌，与无氧呼吸相比，细胞有氧呼吸产生的能量更多，更能满足酵母菌大量繁殖时的需求，因此，对分离的酿酒酵母扩大培养时需要在有氧的条件下进行，C错误；谷物原料如高粱、玉米、大米等富含淀粉，因此从谷物原料发酵形成的酒糟中可分离出产淀粉酶的微生物，D正确。]
判断与填空
1．向泡菜坛盖边沿的水槽中注满水形成内部无菌环境。(2023·北京卷T13) (　　)
提示：向泡菜坛盖边沿的水槽中注满水形成内部无氧环境，不能创造无菌环境。
2．在白酒、啤酒和果酒的发酵初期需要提供一定的氧气。(2022·湖北卷T11) (　　)
×
√
3．乙酸发酵过程中经常翻动发酵物，可控制发酵温度和改善通气状况。(2023·江苏卷T16) (　　)
提示：乙酸发酵过程中利用了醋酸菌的有氧呼吸，在发酵过程中经常翻动发酵物，有利于散热，但不能控制发酵温度。
4．在制作发酵食品的学生实践中，控制发酵条件至关重要。葡萄果皮上有酵母菌和醋酸菌，制作好葡萄酒后，可直接通入无菌空气制作葡萄醋。(2022·江苏卷T16) (　　)
提示：醋酸菌为好氧细菌，且发酵温度高于果酒的发酵温度，因此制作好葡萄酒后，需通入无菌空气，且适当提高发酵装置的温度。
×
×
5．青霉菌处在葡萄糖浓度不足的环境中时，会通过分泌青霉素杀死细菌，以保证自身生存所需的能量供应。目前已实现青霉素的工业化生产，选育出的高产菌株经扩大培养后才可接种到发酵罐中。(2022·山东卷T14) (　　)
6．啤酒的工业化生产中，大麦经发芽、焙烤、碾磨、糖化、蒸煮、发酵、消毒等工序后，最终过滤、调节、分装。糖浆经蒸煮、冷却后需接种酵母菌进行发酵。(2022·山东卷T20) (　　)
√
√
7．米曲霉发酵过程的主要目的是使米曲霉充分生长繁殖，大量分泌制作酱油过程所需的酶类，这些酶中的________、________能分别将发酵池中的蛋白质和脂肪分解成易于吸收、风味独特的成分，如将蛋白质分解为小分子的肽和________。(2021·全国乙卷T37)
提示：蛋白酶　脂肪酶　氨基酸
8．获得的果汁(如苹果汁)可以用来制作果酒或者果醋，制作果酒需要________菌，这一过程中也需要O2，O2的作用是__________________________________。
制作果醋需要醋酸菌，醋酸菌属于________(填“好氧”或“厌氧”)细菌。(2020·全国卷ⅢT37)
提示：酵母　促进有氧呼吸，使酵母菌大量繁殖　好氧
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4
1
3
题号
题组1 传统发酵技术的应用
1．(2024·山东淄博一模)王村醋属于“山东省非物质文化遗产”，它以小米为主要原料， 经酵母菌、醋酸菌等微生物发酵而成。明嘉靖二十五年王村就有“春分酿酒拌醋”之说，有经验的酿醋师可通过附耳听瓮判断发酵的程度。王村醋传统酿造工艺如下表，下列说法错误的是(　　)
步骤 操作过程
①糊茬 将浸泡好的小米放入锅内， 温火煮米， 米煮到开花， 成黏糊状即可
步骤 操作过程
②大曲酒酵 将煮好的米摊开散热， 待温凉至38 ℃时加曲抖匀放入缸内发酵
③汾醋 将发酵好的醪液拌谷糠倒入瓮内自然发酵，进入七天的发酵阶段
④抄缸 用手抄醅， 有利于醋醅的空气流通， 该发酵过程需要两个月
⑤拨缸 从一个缸内倒入另一个缸内，使发酵彻底
⑥存醅 为保证小米醋的口感，用油布盖住并用泥密封， 存醅三个月
2
4
1
3
题号
A．“春分酿酒拌醋”说明温度影响乙酸发酵
B．“听瓮”是通过醋酸菌产生CO2的状况推测发酵程度
C．拌曲时温度过高可导致曲中的微生物死亡
D．若不“手抄醅”，则醋酸菌的呼吸强度下降
B　[“春分酿酒拌醋”说明温度影响乙酸发酵，A正确；“听瓮”是通过缸内细微的气泡声，判断酒曲发酵的程度，B错误；拌曲时将煮好的米摊开散热， 待温凉至38 ℃时加曲抖匀，是因为温度过高可导致曲中的微生物死亡，C正确；醋酸菌是好氧细菌，用手抄醅，有利于醋醅的空气流通，若不“手抄醅”，则醋酸菌的呼吸强度下降，D正确。]
√
2
4
1
3
题号
2．(2024·广东广州一模)传统豆瓣酱的制作流程如下图。下列说法正确的是(　　)
A．霉豆瓣制作过程中，酵母菌、毛霉、
乳酸菌等都发挥了重要作用
B．霉豆瓣发酵过程中产生的蛋白酶能把
蛋白质分解成易吸收的小分子的肽和脂肪酸
C．制作辣椒胚时加入白酒的目的主要是利用酒精作为碳源，同时增加风味
D．混合装坛后要“翻、晒、露”的目的是让微生物充分进行有氧呼吸
√
2
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3
题号
D　[霉豆瓣制作过程中，酵母菌、毛霉、曲霉等主要通过有氧呼吸起作用，乳酸菌必须进行无氧发酵，A错误；霉豆瓣发酵过程中产生的蛋白酶能把蛋白质分解成易吸收的小分子的肽和氨基酸，B错误；制作辣椒胚时加入白酒的目的主要是利用白酒杀菌，同时增加风味，C错误；混合装坛后要“翻、晒、露”的目的是让微生物和空气充分接触，充分进行有氧呼吸，D正确。]
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题号
题组2 发酵工程及其应用
3．(2024·山东青岛一模)黄桃精酿啤酒的制作工艺与普通啤酒有所不同，生产工艺流程为：麦芽→粉碎→糖化→过滤→煮沸→主发酵→后发酵(添加黄桃汁)→低温冷藏→成品→罐装。下列说法正确的是(　　)
A．利用大麦作原料时，淀粉是酵母菌的直接碳源
B．啤酒发酵过程中大部分糖的分解和代谢物的生成都在后发酵阶段完成
C．糖化是让麦芽糖分解形成糖浆，煮沸能够使酶失活及对糖浆灭菌
D．“精酿”啤酒发酵完成后，通常不需要进行过滤和消毒处理
√
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1
3
题号
D　[利用大麦作原料时，葡萄糖是酵母菌的直接碳源，A错误；啤酒发酵过程分为主发酵和后发酵，大部分糖的分解和代谢物的生成都在主发酵阶段完成，B错误；糖化是让淀粉分解形成糖浆，C错误；题干信息可知，“精酿”啤酒发酵完成后，通常不需要进行过滤和消毒处理，D正确。]
2
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1
3
题号
4．(2024·江苏南通二模)黑曲霉是一种丝状真菌，其代谢物广泛应用于食品加工等领域。食品工业以红薯粉为原料经黑曲霉发酵获得柠檬酸，下图为生产柠檬酸的简要流程图。下列叙述正确的是(　　)
A．黑曲霉与生产果醋时所用主要微生物的代谢类型相同
B．将菌种接种至A培养基时，浸泡在酒精中的涂布器使用前需在火焰上灼烧
C．若发酵罐C中的原料为大豆粉，可
利用黑曲霉水解大豆中的淀粉制成酱油
D．分离、提纯获得微生物细胞本身或
其代谢物是发酵工程的中心环节
√
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4
1
3
题号
A　[黑曲霉的代谢类型为异养需氧型，制作果醋所用的主要微生物是醋酸菌，它的代谢类型也为异养需氧型，A正确；由图分析可知，A培养基中是平板划线法得到的菌落，将菌种接种至A培养基时，应将接种环放在火焰上灼烧，而不是涂布器，B错误；以大豆为主要原料，利用产生蛋白酶的霉菌(如黑曲霉)，将原料中的蛋白质水解成小分子的肽和氨基酸，然后经淋洗、调制可以制成酱油产品，C错误；发酵工程的中心环节是发酵罐内发酵，不是分离、提纯获得微生物细胞本身或其代谢物，D错误。]
2
4
1
3
题号
考点2　微生物的培养及分离计数
1．微生物培养中的无菌操作技术
化学药物
湿热灭菌
培养基
2．制备培养基与微生物纯化技术
称量
灭菌
接种环
梯度稀释
3．微生物分离与计数的实例
酚红
变红
4．平板划线法、稀释涂布平板法及显微镜直接计数法的区别
(1)平板划线法适用于微生物的纯化，但不能用于微生物的计数。
(2)稀释涂布平板法常用于活菌计数，而显微镜直接计数法不能区分菌体的死活。
(3)用稀释涂布平板法进行计数时，为了保证结果准确，一般选择菌落数为30～300的平板进行计数。
1．(不定项)(2024·黑、吉、辽卷)某些香蕉植株组织中存在的内生菌可防治香蕉枯萎病，其筛选流程及抗性检测如图。下列操作正确的是(　　)
A．在大量感染香蕉枯萎病的香蕉
种植园内，从感病植株上采集样品
B．将采集的样品充分消毒后，用蒸馏水冲洗，收集冲洗液进行无菌检测
C．将无菌检测合格的样品研磨，经稀释涂布平板法分离得到内生菌的单菌落
D．判断内生菌的抗性效果需比较有无接种内生菌的平板上的病原菌菌斑大小
√
√
CD　[据题干信息可知，某些香蕉植株组织中存在的内生菌可防治香蕉枯萎病，故在大量感染香蕉枯萎病的香蕉种植园内，从未感病植株上采集样品，A错误；获得纯净的微生物培养物的关键是防止杂菌污染，将采集的样品充分消毒后，用无菌水冲洗，收集冲洗液进行无菌检测，B错误；据题图可知，样品研磨后进行了稀释涂布，可见将无菌检测合格的样品研磨，经稀释涂布平板法分离得到内生菌的单菌落，C正确；据题图可知，判断内生菌的抗性效果需设置对照组和实验组，对照组不接种内生菌得到病原菌菌斑，实验组接种内生菌得到病原菌菌斑，然后比较对照组和实验组的菌斑大小，实验组病原菌菌斑越小表明内生菌抗性效果越好，D正确。]
2．(2024·全国甲卷)合理使用消毒液有助于减少传染病的传播。某同学比较了3款消毒液A、B、C杀灭细菌的效果，结果如图所示。回答下列问题。
(1)该同学采用显微镜直接计数法和菌落计数法分别测定同一样品的细菌数量，发现测得的细菌数量前者大于后者，其原因是________
___________________________________________________________
_____________________。
前者微生
物分散的活菌和死菌一起计数，后者存在多个活菌形成一个菌落的
情况且只计数活菌
(2)该同学从100 mL细菌原液中取1 mL加入无菌水中得到10 mL稀释菌液，再从稀释菌液中取200 μL涂布平板，菌落计数的结果为100，据此推算细菌原液中细菌浓度为________个/mL。
(3)菌落计数过程中，涂布器应先在酒精灯上灼烧，冷却后再涂布。灼烧的目的是_______________________________________________
__________________，冷却的目的是________________________。
5 000
杀死涂布器上可能存在的微生物，防止涂布器上可能
存在的微生物污染
防止温度过高杀死菌种
(4)据图可知杀菌效果最好的消毒液是___，判断依据是__________
____________________________________________。(答出两点即可)
(5)鉴别培养基可用于反映消毒液杀灭大肠杆菌的效果。大肠杆菌在伊红美蓝培养基上生长的菌落呈________色。
A
A消毒液活
菌数减少量最多，且杀菌时间较短，效率最高
黑
[解析]　(1)显微镜直接计数法把死菌和活菌一起计数。菌落计数法计数只计活菌数，还可能存在多个活菌形成一个菌落的情况，故前者的数量多于后者。(2)从100 mL细菌原液中取1 mL加入无菌水中得到10 mL稀释菌液，即稀释了10倍，1 mL细菌原液中细菌浓度＝(菌落数÷菌液体积)×稀释倍数＝100÷0.2×10＝5 000个/mL。(3)菌落计数过程中，涂布器应先在酒精灯上灼烧，冷却后再涂布。灼烧的目的是杀死涂布器上可能存在的微生物，防止涂布器上可能存在的微生物污染，冷却的目的是防止温度过高杀死菌种。(4)A消毒液活菌数减少量最多，且杀菌时间较短，效率最高，因此A消毒液杀菌效果最好。(5)大肠杆菌在伊红美蓝培养基上生长的菌落呈黑色。
判断与填空
1．某同学想从泡菜汁中筛选耐高盐乳酸菌，进行了如下实验：取泡菜汁样品，划线接种于一定NaCl浓度梯度的培养基，经培养得到了单菌落，培养基pH需偏碱性。(2023·浙江1月卷T19) (　　)
提示：乳酸菌经过无氧呼吸产生乳酸，故其生活的环境偏酸性，培养基pH需偏酸性。
2．利用以尿素为唯一氮源的平板能分离出合成脲酶的微生物。(2023·山东卷T15) (　　)
×
√
3．血细胞计数板既可用于酵母菌的数量测定，也可用于细菌的数量测定。(2023·江苏卷T7) (　　)
提示：血细胞计数板适用于真菌的计数，细菌计数板用于细菌的数量测定等。
×
4．研究者拟从堆肥中取样并筛选能高效降解羽毛、蹄角等废弃物中角蛋白的嗜热菌。根据堆肥温度变化曲线(如图)和选择培养基筛选原理来判断，最可能筛选到目标菌的条件组合是c点时取样、角蛋白氮源培养基。(2023·广东卷T10) (　　)
√
5．某同学进行分离高产脲酶菌的实验设计时，认为可分解酚红指示剂使其褪色的菌株是产脲酶菌。(2022·江苏卷T3) (　　)
提示：产脲酶菌不能分解酚红指示剂。
6．为探究校内植物园土壤中的细菌种类，某兴趣小组采集园内土壤样本并开展相关实验。土壤溶液稀释倍数越低，越容易得到单菌落。(2022·海南卷T12) (　　)
提示：土壤溶液稀释倍数足够高时，才能将聚集的细菌分散开，有助于在培养基表面形成单菌落。
×
×
7．β-苯乙醇是赋予白酒特征风味的物质。从某酒厂采集并筛选到一株产β-苯乙醇的酵母菌应用于白酒生产。通过配制培养基、灭菌、分离和培养能获得该酵母菌。(2022·辽宁卷T18) (　　)
提示：分离纯化酵母菌的操作应为配制培养基→灭菌→接种→培养→挑选菌落。
×
8．解脂菌能利用分泌的脂肪酶将脂肪分解成甘油和脂肪酸并吸收利用。脂肪酸会使醇溶青琼脂平板变为深蓝色。将不能直接吸收脂肪的甲、乙两种菌分别等量接种在醇溶青琼脂平板上培养。甲菌菌落周围呈现深蓝色，乙菌菌落周围不变色，实验中所用培养基以脂肪为唯一碳源。(2021·山东卷T14) (　　)
提示：乙菌落周围没有出现深蓝色，说明乙菌落不能产生脂肪酶，不能利用脂肪为其供能，但乙菌落也可以在培养基上生存，说明实验中所用培养基不是以脂肪为唯一碳源。
×
9．采用液体培养基培养酵母菌，可以用淋洗液为原料制备培养基，培养基中还需要加入氮源等营养成分，氮源的主要作用是______(答出1点即可)。(2023·全国乙卷T37)
提示：为合成微生物细胞结构提供原料(微生物细胞中的含氮物质，如核酸、蛋白质、磷脂等)
10．若从植物根际土壤中筛选分解淀粉的固氮细菌，培养基的主要营养物质包括水和________________。(2023·湖南卷T21)
提示：无机盐、淀粉
11．有些细菌具有溶菌特性，能够破坏其他细菌的结构使细胞内容物释出。科学家试图从某湖泊水样中分离出有溶菌特性的细菌。A菌通常被用作溶菌对象。研究者将含有一定浓度A菌的少量培养基倾倒在固体培养平板上，凝固形成薄层。培养一段时间后，薄层变浑浊(如图)，表明_____________。
(2023·北京卷T16)
提示：A菌能在培养平板中生长繁殖
12．无菌条件下，某兴趣小组制备了两个大肠杆菌平板，用两片大小相同的无菌滤纸分别蘸取某种橘皮的精油(采用水蒸气蒸馏法和压榨法提取了某种橘皮的精油，分别简称为HDO和CPO)贴于含菌平板上，37 ℃培养24 h，抑菌效果见下图。有同学提出该实验存在明显不足：①未设置对照，设置本实验对照的做法是___________，其作用是___________________；
②不足之处还有_______(答两点)。
(2022·重庆卷T25)
提示：用一片大小相同的无菌滤纸蘸取等量的无菌水贴于含菌平板上，相同条件下一起培养　排除无关变量对实验结果的影响，增强实验结果的可信度　违背平行重复原则，每个实验组中的样本太少；实验组精油的含量没有遵循等量原则
13．枯草芽孢杆菌为好氧微生物，液体培养时应采用________(填“静置”或“摇床振荡”)培养。培养过程中抽样检测活菌数量时，应采用__________________(填“稀释涂布平板法”或“显微镜直接计数法”)，其原因是__________________________。(2022·河北卷T23)
提示：摇床振荡　稀释涂布平板法　用稀释涂布平板法在培养基上看到的每一个菌落都来自一个活细胞，而显微镜直接计数法会将死亡的枯草芽孢杆菌也计算在内
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4
1
3
题号
题组1 微生物培养的基本技术
1．(2024·黑龙江哈尔滨模拟)科研人员发现A、B两株可降解石油的细菌，为比较二者的降解能力并分析其他生理功能进行了相关实验：配制液体培养基Ⅰ、Ⅱ(培养基Ⅰ：K2HPO4、MgSO4、NH4NO3、石油；培养基Ⅱ：K2HPO4、MgSO4、石油)，再分别添加琼脂，制成平板Ⅰ、Ⅱ，将等量A、B菌株分别接种到平板Ⅰ的甲、乙两孔处，平板Ⅱ进行同样操作，相同且适宜条件下培养一段时间，比较各孔处透明圈大小，结果如表所示。下列叙述错误的是(　　)
注：“＋”表示有透明圈，“＋”越多表示透明圈越大，“－”表示无透明圈。
菌株 透明圈大小
平板Ⅰ 平板Ⅱ
A ＋＋＋ ＋＋
B ＋＋ －
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题号
A．培养基Ⅰ、Ⅱ均不含碳源，培养基Ⅱ是选择性培养基
B．NH4NO3作为氮源可参与合成RNA、蛋白质等物质
C．添加琼脂的培养基灭菌后，需冷却至50 ℃左右再倒平板
D．A菌株降解石油能力更强，不添加氮源也能生长
A　[在培养基Ⅰ、Ⅱ中，作为碳源的成分均是石油，A错误；RNA和蛋白质的组成元素中都含有氮元素，NH4NO3作为氮源可参与合成RNA、蛋白质等物质，B正确；培养基灭菌后，需冷却至50 ℃左右时再倒平板，C正确；表中的实验结果表明，A菌株降解石油的能力强于B菌株，并且在没有添加氮源的培养基Ⅱ中也能生长，D正确。]
√
2
4
1
3
题号
培养皿甲 培养皿乙
处理 PDA培养基：小孔加入① PDA培养基：小孔加入培养过芽孢杆菌X的无菌培养液
在培养皿右侧相同位置接种等量某种真菌
实验结果


2．(2024·山东日照二模)PDA培养基用于真菌培养，LB培养基用于细菌培养。为探究芽孢杆菌X能否产生抑制真菌生长的物质，研究人员进行了相关实验，如下表。下列叙述正确的是(　　)
2
4
1
3
题号
A．该实验说明芽孢杆菌X产生了抑制真菌生长的物质
B．表格中的①处应是未培养过芽孢杆菌X的PDA无菌培养液
C．制备两种培养基时均需先进行湿热灭菌再调节pH
D．接种时需先用涂布器蘸取菌液再涂布到相应位置
√
2
4
1
3
题号
A　[本实验是探究芽孢杆菌X能否产生抑制真菌生长的物质，因此自变量为是否含有培养过芽孢杆菌X的无菌培养液，据图可知，与培养皿甲相比，培养皿乙中真菌菌落与小孔的距离变大，说明芽孢杆菌X产生了抑制真菌生长的物质，PDA培养基用于真菌培养，LB培养基用于细菌培养，因此培养芽孢杆菌X的应为LB培养基，即表格中的①处应是未培养过芽孢杆菌X的LB无菌培养液，A正确，B错误；培养基制备时应先调pH再进行湿热灭菌，C错误；接种时需先用移液器将菌液移至培养皿，然后再用涂布器涂布到相应位置，D错误。]
2
4
1
3
题号
题组2 微生物的筛选、计数及鉴定
3．(2024·山东德州二模)烟草的多糖含量偏高是造成烟叶原料品质不高的重要因素，微生物在烟叶醇化阶段可有效降低烟草的多糖含量。为提高烟叶质量，科研人员筛选出S1～S5微生物菌株，并测定其相关酶活力，结果如图所示。下列说法正确的是(　　)
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4
1
3
题号
A．筛选获得S1～S5微生物菌株时，应以淀粉为唯一碳源
B．用平板划线法分离单菌落前需对培养液进行稀释
C．用S1单菌落培养获得的纯培养物对烟叶进行醇化效果最好
D．烟叶醇化发酵应在低温下进行，以抑制杂菌繁殖
√
2
4
1
3
题号
C　[据题图信息可知，科研人员筛选出的S1～S5微生物菌株均能降低烟草中的多糖含量，但不能确定该微生物是否利用淀粉为碳源，A错误；用平板划线法分离单菌落直接使用未经稀释的微生物样本进行划线操作即可达到分离的目的，B错误；据图分析可知，科研人员筛选出的S1～S5微生物菌株均能降低烟草中的多糖含量，S1微生物对降低烟草的多糖酶活力比其他四种都强，故用S1单菌落培养获得的纯培养物对烟叶进行醇化效果最好，C正确；酶催化化学反应需要适宜的温度，烟叶醇化发酵应在适宜的温度下进行，D错误。]
2
4
1
3
题号
4．(2024·辽宁沈阳二模)我国科学家发现蜡螟可以吃塑料，并从其肠道内分离出了能够降解聚乙烯(塑料的组成成分，缩写为PE)的细菌。某科研小组计划在实验室分离纯化出能高效降解聚乙烯的细菌(目标菌)，然后获取相关酶，以期实现塑料的生物酶降解。分离纯化目的菌的过程如图1所示。回答下列问题：
2
4
1
3
题号
(1)过程④使用的培养基成分除水、无机盐、氮源外，还应添加的物质有__________________。
(2)若在④的各个平板上统计的菌落数分别为110个、126个和148个，则每克肠道内容物含有的降解菌为__________个。若过程④平板上的菌落难以数清，则很可能与图中过程________(填图中序号)有关。
PE(聚乙烯)、琼脂
1.28×107
③
2
4
1
3
题号
(3)科研人员初步筛选出XJDLM-8、XJDLM-3、XJDLM-12三个菌株，并对这三个菌株降解聚乙烯的能力进行了探究，实验结果如图2所示。由实验结果可知，菌株生长量与聚乙烯失重率的关系为________；其中__________菌株的生长和对聚乙烯的降解效果最佳。
呈正相关
XJDLM-8
2
4
1
3
题号
(4)研究人员欲扩大培养分离的菌株进而发酵获得大量降解PE的酶，大致流程如图3所示。若获得的菌种为原核生物，可采用诱变育种方法培育出适用于生产用的菌种，该方法的缺点是__________
___________________________________。发酵过程中可通过监测____________来了解发酵进程。可采用琼脂糖凝胶电泳法对降解PE的酶进行鉴定，其原理是________________________
________________________________
________________________________。
有利变异少，
需要处理大量实验材料，具有不确定性
PE失重率
相对分子
质量不同的蛋白质在琼脂糖凝胶中移动速度不同
2
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1
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题号
[解析]　(1)通过过程④能筛选出降解聚乙烯的细菌，使用的培养基为固体培养基，因此还应添加的物质有PE(聚乙烯)、琼脂。
(2)每克肠道内容物含有的降解菌为(110＋126＋148)/3×102×103＝1.28×107个；若过程④平板上的菌落难以数清，则很可能是涂布浓度太高导致的，即与图中过程③有关。
(3)由图2可知，随着培养时间的延长，OD值与聚乙烯失重率均有所增加，说明菌株生长量与聚乙烯失重率呈正相关，其中XJDLM-8菌株的生长和对聚乙烯的降解效果最佳。
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题号
(4)由于突变的不定向性和低频性，导致诱变育种过程中有利变异少，需要处理大量实验材料，具有不确定性。发酵过程中可通过监测PE失重率来了解发酵进程。可采用琼脂糖凝胶电泳法对降解PE的酶进行鉴定，其原理是相对分子质量不同的蛋白质在琼脂糖凝胶中移动速度不同。
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题号
课后限时集训(十二)　发酵工程
题号
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(建议用时：30分钟)
一、选择题
1．(2024·湖南长沙二模)某位同学按照果酒制作流程操作后，获得的“葡萄酒”除了有“酒味”，还有“酸味”且有一层白膜。推断出现这种现象的不当操作，最可能的是(　　)
A．发酵瓶、榨汁机等器具没有用酒精消毒
B．清洗葡萄时没有去除枝梗和腐烂的籽粒
C．打开瓶盖后忘记盖上
D．发酵过程中，没有控制温度
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√
题号
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C　[发酵瓶、榨汁机等器具没有用酒精消毒，可能会导致杂菌污染，但不会产生酸味，A错误；清洗葡萄时没有去除枝梗和腐烂的籽粒，可能会导致杂菌污染，但不会产生酸味，B错误；打开瓶盖，可以进行乙酸发酵，产生“酸味”且有一层白膜，C正确；发酵过程中，仅没有控制温度，不会导致醋酸菌繁殖，因为醋酸菌为好氧细菌，D错误。]
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2．(2024·山东滨州二模)绍兴黄酒一般在农历七月制酒药，九月制麦曲，大雪前后正式开始酿酒，到次年立春结束，发酵期长达八十多天。其工艺流程如下表。下列说法错误的是(　　)

① 酿酒所需的糖化微生物
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题号
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A．黄酒是直接利用原材料中的微生物进行发酵酿制的
B．开耙有利于发酵物中的酵母菌大量繁殖
C．发酵过程会因发酵物的pH降低和酒精含量增多而逐渐停止
D．煎酒可以杀死黄酒中的绝大多数微生物且基本不破坏其中的营养成分
② 主要含酵母菌、淀粉、淀粉酶和蛋白酶等
③ 调节发酵物的温度，补充新鲜空气
④ 将生产过滤完成的酒加热至90 ℃左右，杀灭其中的微生物，便于储藏、保管
√
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题号
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A　[黄酒制作过程中②过程加入了酵母菌，因此不是直接利用原材料中的微生物进行发酵酿制的，A错误；“开耙”(搅拌)是为了让酵母菌进行有氧呼吸，增加酵母菌的数量，可缩短发酵所需的时间，B正确；酿酒时糖类未耗尽，酵母菌的发酵过程也会停止，原因可能是pH降低和酒精含量增多，对发酵起抑制作用，从而导致酵母菌发酵停止，C正确；通过煎酒可以杀死黄酒中的绝大多数微生物且基本不破坏其中的营养成分，D正确。]
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3．(2024·黑龙江哈尔滨二模)《齐民要术》关于泡菜制作的记载为“作盐水，令极咸，于盐水中洗菜，即内(纳)瓮中。其洗菜盐水，澄取清者，泻著瓮中，令没菜把即止”，意思是制作极咸的盐水，用盐水洗过的菜放入菜坛中，再把洗过菜的澄清盐水倒入菜坛中，直至淹没菜为止。下列说法错误的是(　　)
A．泡菜发酵液表面有一层白膜是乳酸菌大量繁殖的结果
B．“极咸”盐水可减少杂菌繁殖，降低泡菜中的亚硝酸盐含量
C．再倒入菜坛中的“洗菜盐水”也可能含有泡菜发酵的乳酸菌
D．“令没菜把即止”主要是为泡菜中乳酸菌发酵创设无氧条件
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√
题号
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A　[泡菜发酵液表面有一层白膜主要是产膜酵母大量繁殖形成的菌膜，A错误；温度过高、腌制时间过短、食盐用量过少等均会导致杂菌大量繁殖，亚硝酸盐含量升高，因此“极咸”盐水可减少杂菌繁殖，降低泡菜中的亚硝酸盐含量，B正确；由于蔬菜上原本就有可能附着有乳酸菌，用盐水清洗泡菜时，可以将原来附着在蔬菜上的乳酸菌一并洗到盐水中，故再倒入菜坛中的“洗菜盐水”也可能含有泡菜发酵的乳酸菌，C正确；“令没菜把即止”的意思是将盐水加到淹没蔬菜为止，这是因为乳酸菌是厌氧微生物，这样操作的主要目的是为乳酸菌的发酵提供无氧条件，D正确。]
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4．(2024·山东卷)在发酵过程中，多个黑曲霉菌体常聚集成团形成菌球体，菌球体大小仅由菌体数量决定。黑曲霉利用糖类发酵产生柠檬酸时需要充足的氧。菌体内铵离子浓度升高时，可解除柠檬酸对其合成途径的反馈抑制。下列说法错误的是(　　)
A．相同菌体密度下，菌球体越大柠檬酸产生速率越慢
B．发酵中期添加一定量的硫酸铵可提高柠檬酸产量
C．发酵过程中pH下降可抑制大部分细菌的生长
D．发酵结束后，将过滤所得的固体物质进行干燥即可获得柠檬酸产品
√
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D　[黑曲霉利用糖类发酵产生柠檬酸时需要充足的氧，相同菌体密度下，菌球体越大越不利于菌体与氧气接触，柠檬酸产生速率越慢，A正确；菌体内铵离子浓度升高时，可解除柠檬酸对其合成途径的反馈抑制，可推出发酵中期添加一定量的硫酸铵可提高菌体内铵离子浓度，从而提高柠檬酸产量，B正确；发酵过程中pH下降导致细菌生命活动所必需的酶失活，可抑制大部分细菌的生长，C正确；柠檬酸属于代谢物，可根据产物的性质采取适当的提取、分离和纯化措施来获得产品，D错误。]
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5．(2024·山东潍坊一模)下列有关微生物的分离、培养及计数的相关说法，正确的是(　　)
A．培养霉菌时一般需要将培养基调至中性或弱碱性
B．用平板划线法分离菌种，划线5个区域，接种环需要灼烧灭菌6次
C．用稀释涂布平板法进行微生物计数时，结果往往比实际值偏高
D．接种、分离后使用过的器皿需要先洗涤再彻底灭菌
√
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B　[在培养霉菌时，一般需要将培养基调至酸性，A错误；用平板划线法分离菌种，划线5个区域，每次接种之前需要灼烧接种环灭菌，最后划线完成也需要灼烧灭菌，共需要灼烧灭菌6次，B正确；用稀释涂布平板法进行微生物计数时，统计的菌落数往往比活菌的实际数目少，这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，C错误；微生物实验完成后需要先灭菌后再对相关工具进行洗涤，以免造成环境污染，D错误。]
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6．(2024·河北邯郸一模)热环境主要包括陆地热泉和深海热液喷口，高温是限制生命存在的主要因素之一，该环境中同时生存着好氧菌和厌氧菌。下列关于分离高温环境中微生物的操作过程的叙述，正确的是(　　)
A．为增加热泉样品中耐热微生物的数量可在振荡条件下进行培养
B．宜利用琼脂固体培养基分离耐热微生物，分离过程中逐渐提高分离温度
C．热泉样品经过低温保存后，生物多样性可能下降，分离的类群可能减少
D．利用单一培养基和单一培养条件即可分离出热泉样品中的所有菌群
√
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C　[在热泉生活的微生物有好氧菌和厌氧菌两种类型，为增加热泉样品中耐热微生物的数量，可在不同的环境条件下进行培养，以使好氧菌和厌氧菌的数量均有所增加，A错误；琼脂在一定温度下会融化为液体，所以不宜利用琼脂固体培养基分离耐热微生物，B错误；热泉中的微生物具有耐热的特性，某些微生物可能不适应低温的环境条件，样品经过低温保存后，可能会导致部分微生物死亡，从而使生物多样性下降，分离的类群减少，C正确；热泉中的菌群生活条件不一，因此必须用不同的条件进行微生物的分离，利用单一培养基和单一培养条件不能分离出热泉样品中的所有菌群，D错误。]
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7．(2024·湖南永州二模)地膜的主要成分是聚乙烯，化学式是(C2H4)n。残留在土壤中的地膜难以被降解，为筛选出高效降解地膜的细菌，研究人员进行了如图所示操作。下列叙述错误的是(　　)
A．富集培养过程中摇床振荡便于微生物
获取营养和氧气
B．富集培养后，利用平板划线法将微生物接种于X培养基
C．应挑选降解地膜最高效的细菌⑤接种到Y培养基
D．若要研究目的菌的生长规律，可用细菌计数板计数方法进行计数
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题号
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B　[富集培养过程中摇床振荡便于微生物与营养物质充分接触，并增加溶氧量，所以摇床振荡便于微生物获取营养和氧气，A正确；富集培养后，利用稀释涂布平板法将微生物接种于X培养基，B错误；抑菌圈越大，说明降解地膜的效果越好，故应挑选⑤中的单菌落接种到Y培养基上，C正确；若要研究目的菌的生长规律，可用细菌计数板计数方法进行计数，D正确。]
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题号
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8．(2024·山东滨州二模)研究人员拟从新鲜蚯蚓粪中分离筛选出对番茄枯萎病有良好抑制效果的拮抗细菌。将蚯蚓粪加入无菌水中制成悬浮液，利用甲培养基进行筛选纯化后，将获得的不同菌株分别接种至乙培养基扩大培养，48 h后进行“平板对峙实验”：在丙培养基的空白平板一侧放置一直径为5 mm的番茄枯萎病菌菌块，在平行另一侧放置相同大小的滤纸片，实验流程如下图。下列说法错误的是(　　)
13
14
A．Ⅰ过程使用的接种方法是平板
划线法，Ⅰ～Ⅲ过程均需要无菌操作
B．对照组滤纸片用无菌水处理，实验组滤纸片用拮抗细菌菌液处理
C．应培养至对照组番茄枯萎病菌菌落长满丙培养基时开始测量并计算抑制率
D．选择丙培养基上直径大的番茄枯萎病菌菌落对应的拮抗细菌作为目的菌
题号
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D　[据图可知，Ⅰ过程使用的接种方法是平板划线法；微生物分离和培养的关键就是防止杂菌污染，故Ⅰ～Ⅲ过程均需要无菌操作，A正确。本实验的目的是探究拮抗细菌是否对番茄枯萎病有良好抑制效果，故实验组滤纸片用拮抗细菌菌液处理，对照组滤纸片用无菌水处理，B正确。由于对照组没有用拮抗细菌菌液处理，故培养至对照组番茄枯萎病菌菌落长满时，通过对滴加拮抗细菌菌液处理组的统计后，开始测量并计算抑制率，C正确。为达到实验目的，应选择“平板对峙实验”培养后，丙培养基上直径小的番茄枯萎病菌菌落，因为番茄枯萎病菌菌落直径越小，说明拮抗细菌的抑制效果越好，D错误。]
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题号
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9．(2024·江苏苏州模拟)木质素是植物某些次生细胞壁中的有机物，能被间苯三酚染红。要想获得具有木质素分解能力的大肠杆菌，需要将木质素酶导入受体菌，并用选择培养基筛选所需菌株，下列说法正确的是
(　　)
A．可以将目的基因插到T2噬菌体的DNA上，再使其侵染细菌，从而得到目的菌株
B．筛选时培养基中应选择木质素作为唯一碳源，并用间苯三酚染色
C．筛选目的菌株时，透明圈的直径越大，菌株的木质素分解能力越强
D．培养目的菌株时，为防止杂菌污染，可向培养基中加入少量抗生素
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题号
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B　[T2噬菌体侵染导致细菌裂解，不能得到目的菌株，A错误；木质素是植物某些次生细胞壁中的有机物，能被间苯三酚染红，要想获得具有木质素分解能力的大肠杆菌，筛选时培养基中应选择木质素作为唯一碳源，并用间苯三酚染色，B正确；菌株的木质素分解能力强弱与透明圈直径以及菌落半径有关，故筛选目的菌株时，透明圈直径与菌落半径的比值越大，菌株的木质素分解能力越强，C错误；抗生素会杀死目的菌株(细菌)，所以不能加入抗生素，D错误。]
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题号
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10．(2024·江苏泰州一模)某种物质A(一种含有C、H、N的有机物)难以降解，会对环境造成污染，只有某些细菌能降解A。研究人员按照如图所示流程从淤泥中分离得到能高效降解A的细菌菌株。图中③将M中的菌液稀释一定倍数后，取0.1 mL涂布到平板上，初步估测摇瓶M中1 mL菌液中细菌数为2.4×108个。下列相关叙述正确的是(　　)
13
14
A．实验时，淤泥及盛有培养基的摇瓶通常采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌
B．乙中需要加琼脂和物质A等，实验需设平行重复实验，无需另外设置空白对照
C．③接种方法为稀释涂布平板法，涂布时用涂布器蘸取菌液均匀涂布于平板上
D．若乙平板上菌落数平均为240个，则接种的菌液的稀释倍数为105
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题号
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D　[淤泥中含有菌种，因此不能进行灭菌处理，盛有培养基的摇瓶通常采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌，A错误；据图分析可知，③是稀释涂布平板法接种到以物质A为唯一碳源和氮源的选择培养基上，因此乙为固体培养基，需要加琼脂和物质A等，为了提高准确度，实验需设平行重复实验，且需要另外设置空白对照，检测培养基配制是否合格，B错误；③接种方法为稀释涂布平板法，涂布时应该将菌液用微量移液管加入培养基中，然后再用涂布器进行均匀涂布，C错误；若乙平板上长出的菌落数平均为240个，假设稀释倍数为a，根据摇瓶M中1 mL菌液中细菌数为2.4×108个，在每个平板上涂布0.1 mL稀释后的菌液，则有240×a÷0.1＝2.4×108，则稀释倍数a＝105，D正确。]
题号
1
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11．(不定项)(2024·湖南师大附中高三模拟)田间常施用的草铵膦(含碳有机物)农药，在环境中难以降解。科学家通过图1所示方法筛选出了可降解草铵膦的植物乳杆菌(ST-3)，并研究了固定态(固定在多孔载体上)和培养液中游离态的ST-3的降解效果，结果如图2所示。下列相关叙述错误的是(　　)
13
14
A．图1中②过程可使用无菌水，③④⑤过程应用以草铵膦为唯一碳源的培养基
B．图1中配制好的培养基可放入干热灭菌箱内进行灭菌处理
C．由图2可知，固定态ST-3对土壤中草铵膦的降解效果优于游离态ST-3
D．固定态ST-3降解率高可能是因为载体避免ST-3直接接触高浓度草铵膦
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题号
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BD　[图1中②过程进行梯度稀释时要使用无菌水，防止引入杂菌，实验目的是筛选出可降解草铵膦的植物乳杆菌，所以③④⑤过程应用以草铵膦为唯一碳源的培养基，A正确；培养基常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌法，B错误；相同时间条件下，固定态ST-3对土壤中草铵膦农药的降解率均高于游离态ST-3，说明固定态ST-3对土壤中草铵膦的降解效果优于游离态ST-3，C正确；固定态ST-3降解率高可能是因为固定化载体可为微生物提供大量的有效接触和附着的表面积，有利于营养物质吸收及代谢废物运输，D错误。]
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12．(不定项)(2024·山东聊城一模)黄曲霉毒素是由黄曲霉产生的代谢物，具有极强的毒性和致癌性。科研人员用黄曲霉毒素B(AFB1)的结构类似物——豆香素(C9H6O2)筛选出能高效降解AFB1的菌株，实验过程如下图中的①～④。已知菌体对有机物的降解途径有胞外分泌物降解和菌体吸附降解两种。对降解菌的培养液进行离心，发现上清液中AFB1的残留率明显低于菌悬液中的残留率。检测发现上清液中含有蛋白质K，为验证蛋白质K是降解AFB1的有效成分，进行了实验⑤：在A中加入水解蛋白质K的酶、B中加等量的蒸馏水，充分反应后在两试管中均加入等量的豆香素(C9H6O2)。下列说法错误的是(　　)
13
14
A．1号培养基属于选择性培养基，通
常需要提前在121 ℃下进行湿热灭菌
B．步骤③使用稀释涂布平板法，目
的是筛选出能降解黄曲霉毒素的单菌落
C．实验⑤的结果是A试管中豆香素含量基本不变，B试管中豆香素含量减少
D．蛋白质K属于降解菌产生的胞外分泌物，可以降解培养液中的蛋白质
√
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题号
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BD　[1号培养基属于选择性培养基，培养基需要提前在121 ℃下进行湿热灭菌，A正确。结合题图信息分析可知，步骤③接种的培养基中菌落均匀分布，使用的接种方法是稀释涂布平板法，目的是筛选出能降解豆香素的单菌落，B错误。由题干信息可知，A中加入水解蛋白质K的酶，因此A中蛋白质K被分解，不能分解豆香素，豆香素含量基本不变；B中加等量的蒸馏水，B中有蛋白质K，豆香素被分解，含量减少，C正确。上清液中含有蛋白质K，且上清液中AFB1的残留率明显低于菌悬液中的残留率，据此推测蛋白质K属于降解菌产生的胞外分泌物，可以降解培养液中的AFB1，D错误。]
题号
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二、非选择题
13．(2024·辽宁名校联盟模考)部分白酒厂的常见白酒酿造工艺流程可简化为图1。浓发酵是指在高浓度的原料中发酵，在规模化生产中，发酵原料浓度的提高能增加生产能力，并具有降低能耗、节约水资源等优点。研究者不断探索能进一步提高发酵原料浓度的发酵工艺，以实现真正意义上的“浓”发酵。回答下列问题：
题号
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(1)玉米是东北地区酿制白酒的常用原料，作为培养基的主料主要提供酵母菌所需的碳源。玉米经碾磨后，在“拌料”环节中，除加水外，还应加入其他类型的营养物质如________、________以满足酵母菌的代谢需求，提高发酵效率。
(2)“蒸煮”可以改变淀粉分子结构，有利于淀粉的分解，此外，蒸煮还具有_____________________的作用。
(3)“糖化”环节可以加入黑曲霉菌等菌种，也可以直接加入酶，该环节的目的是____________________________________________。
题号
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氮源
无机盐
使原料在高温下灭菌
使淀粉水解成葡萄糖，为酵母菌发酵提供底物
(4)发酵原料浓度升高，提高了发酵难度，常导致酒精转化效率降低，研究者对此展开了模拟实验：对照组一次性添加27 g/mL浓度的葡萄糖，实验组在酒精发酵的前24 h内分批次每3 h添加3 g/mL浓度的葡萄糖，最终保持两组添加的葡萄糖量相等，定期抽样检测，测定各组葡萄糖、酒精浓度。
实验数据如图2所示。
题号
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①结果表明，在葡萄糖供应量相等的条件下，分批次添加能提高发酵效率，使酒精产量提高，从培养基理化性质的角度分析，一次性添加过多葡萄糖不利于酒精发酵的原因可能与__________________
__________有关。
②为实现浓发酵并提高产量，研究者提出了优化发酵工艺环节的建议：将玉米粒研磨颗粒适当增大、将糖化环节与发酵环节合并为一个环节。根据上述实验结果分析，这些措施能__________________
___________________________________________________________
__________________，从而在原料浓度高的情况下提高酒精产量。
题号
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液体培养基渗透压
过高
降低淀粉的水解速
度，边糖化边发酵，相当于分批补料，使培养液的渗透压不至于太
高，有利于发酵
[解析]　(1)酵母菌代谢时需要水、碳源、氮源及无机盐，因此，酿制白酒时，除了玉米提供碳源及添加了水外，还要添加氮源和无机盐，以满足酵母菌的代谢需求，提高发酵效率。
(2)蒸煮可以改变淀粉分子结构，有利于淀粉的分解，由于此过程利用了高温，因此蒸煮还具有灭菌的作用。
(3)“糖化”是指淀粉水解成葡萄糖的过程，黑曲霉菌在生活过程中会分泌淀粉酶，因此，“糖化”环节加入黑曲霉菌等菌种，或直接加入酶，都是为了把原料中的淀粉水解成葡萄糖，为酵母菌发酵提供底物。
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(4)①酿酒时使用的培养基是液体培养基，据图2可知，一次性添加过多葡萄糖时，培养基中葡萄糖浓度很高，使培养基的渗透压也高，这会导致酵母菌吸水减少而影响代谢过程，或者会导致部分酵母菌失水死亡，进而不利于酒精发酵。②将玉米粒研磨颗粒适当增大，则玉米中淀粉与淀粉酶接触概率减小，降低淀粉的水解速度，进而降低发酵液中葡萄糖浓度。将糖化环节与发酵环节合并为一个环节，边糖化边发酵相当于分批补料，使培养液的渗透压不至于太高，有利于发酵。
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14．(2024·湖北武汉二模)沙门氏菌是影响畜产品品质的重要病原菌之一。若使用庆大霉素(GM)等抗生素治疗，会有细菌耐药性和抗生素残留等问题。如使用植物乳杆菌等益生菌(可分泌抗菌物质)替代治疗，可有效解决上述问题。已知MRS培养基常用于培养植物乳杆菌。回答下列问题：
(1)为探究LPC(用MRS培养植物乳杆菌后获得的上清液)对沙门氏菌生长的影响，研究人员进行了相关实验，测得不同处理下沙门氏菌的生长曲线如图1所示。需选用物理状态为________(填“液体”或“固体”)的培养基，才能用抽样检测的方法估算沙门氏菌的种群数
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液体
量。据图1分析，该实验结论为______________________________
___________________________。
若不改变现有条件，沙门氏菌组继续培养72 h后，种群数量不再增加，限制其种群增长的生物因素是_________________。
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LPC抑制沙门氏菌的生长(答出
“抑制生长”的意思即可)
种内竞争(加剧)
(2)为进一步研究LPC对沙门氏菌的作用机制，对实验组的LPC进行了如下处理：NaOH-LPC(加入NaOH调节pH至近中性)、Heat-LPC(用100 ℃处理15 min)，再采用_________________(方法)接种沙门氏菌进行抑菌圈实验，结果如图2所示。分析设置MRS组的目的是____________________________________________________。
根据实验结果分析，LPC的热稳定性_______(填“强”或“弱”)，LPC对沙门氏菌发挥作用的机制：____________________________
______________________________________________。
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稀释涂布平板法
为排除植物乳杆菌培养液(MRS培养基)对实验结果的影响
强
可能是因为LPC中含有酸性物质
(pH为酸性)，可以起到抑制沙门氏菌生长的作用
[解析]　(1)需选用物理状态为液体的培养基，才能用抽样检测的方法估算沙门氏菌的种群数量，而且液体培养基有利于菌种与营养物质充分结合，利于其繁殖。据图1分析，与对照组相比，LPC组沙门氏菌的数量显著降低，说明LPC抑制沙门氏菌的生长。若不改变现有条件，沙门氏菌组继续培养72 h后，种群数量不再增加，限制其种群增长的生物因素是空间和资源是有限的，种群数量增多，种内竞争加剧。
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(2)据图2菌落分布状态可知，采用稀释涂布平板法接种沙门氏菌进行抑菌圈实验。设置MRS组的目的是为排除植物乳杆菌培养液(MRS培养基)对实验结果的影响，使实验结果更加准确。根据实验结果分析，Heat-LPC组与LPC组的抑菌圈大小一致，说明LPC的热稳定强，NaOH-LPC组没有出现抑菌圈，说明近中性条件下LPC没有发挥作用，故推测LPC对沙门氏菌发挥作用的机制可能是因为LPC中含有酸性物质(pH为酸性)，可以起到抑制沙门氏菌生长的作用。
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14考点1　传统发酵技术和发酵工程的应用
1．三种传统食品的制作技术
2．啤酒的工业化生产流程
3．发酵过程中控制杂菌的“四大措施”
(1)通过发酵条件控制杂菌：
①无氧发酵时的无氧环境可以抑制好氧细菌。
②乳酸菌发酵、酒精发酵形成的酸性环境可以抑制杂菌繁殖。
(2)利用盐控制杂菌：如腐乳的制作。
(3)利用酒精控制杂菌：如果酒、腐乳的制作。
(4)利用香辛料控制杂菌：如腐乳、泡菜的制作。
4．发酵过程的影响因素
(1)温度：温度能影响酶的活性，也能影响生物合成的途径。温度还会影响发酵液的物理性质，以及菌种对营养物质的分解吸收等。
(2)pH：pH能够影响酶的活性，以及细胞膜的带电荷状况。还会影响培养基中营养物质的分解等。
(3)溶解氧：在发酵过程中，菌种只能利用发酵液中的溶解氧。因此，必须向发酵液中连续补充大量的氧，并要不断地进行搅拌，以提高氧在发酵液中的溶解度。
(4)泡沫：发酵过程中，通气、搅拌、微生物的代谢过程及培养基中某些成分的分解等，都有可能产生泡沫。过多的持久性泡沫对发酵是不利的。
(5)营养物质的浓度：发酵液中各种营养物质的浓度，特别是碳氮比、无机盐和维生素的浓度，会直接影响菌体的生长和代谢物的积累。
1．(2024·江西卷)井冈霉素是我国科学家发现的一种氨基寡糖类抗生素，它由吸水链霉菌井冈变种(JGs，一种放线菌，菌体呈丝状生长)发酵而来，在水稻病害防治等领域中得到广泛应用。下列关于JGs发酵生产井冈霉素的叙述，正确的是(　　)
A．JGs可发酵生产井冈霉素，因为它含有能够编码井冈霉素的基因
B．JGs接入发酵罐前需要扩大培养，该过程不影响井冈霉素的产量
C．提高JGs发酵培养基中营养物质的浓度，会提高井冈霉素的产量
D．稀释涂布平板法不宜用于监控JGs发酵过程中活细胞数量的变化
2．(不定项)(2024·河北卷)中国传统白酒多以泥窖为发酵基础，素有“千年老窖万年糟”“以窖养糟，以糟养泥”之说。多年反复利用的老窖池内壁窖泥中含有大量与酿酒相关的微生物。下列叙述正确的是(　　)
A．传统白酒的酿造是在以酿酒酵母为主的多种微生物共同作用下完成的
B．窖池内各种微生物形成了相对稳定的体系，使酿造过程不易污染杂菌
C．从窖泥中分离的酿酒酵母扩大培养时，需在CO2或N2环境中进行
D．从谷物原料发酵形成的酒糟中，可分离出产淀粉酶的微生物
判断与填空
1．向泡菜坛盖边沿的水槽中注满水形成内部无菌环境。(2023·北京卷T13) (　　)
2．在白酒、啤酒和果酒的发酵初期需要提供一定的氧气。(2022·湖北卷T11) (　　)
3．乙酸发酵过程中经常翻动发酵物，可控制发酵温度和改善通气状况。(2023·江苏卷T16) (　　)
4．在制作发酵食品的学生实践中，控制发酵条件至关重要。葡萄果皮上有酵母菌和醋酸菌，制作好葡萄酒后，可直接通入无菌空气制作葡萄醋。(2022·江苏卷T16) (　　)
5．青霉菌处在葡萄糖浓度不足的环境中时，会通过分泌青霉素杀死细菌，以保证自身生存所需的能量供应。目前已实现青霉素的工业化生产，选育出的高产菌株经扩大培养后才可接种到发酵罐中。(2022·山东卷T14) (　　)
6．啤酒的工业化生产中，大麦经发芽、焙烤、碾磨、糖化、蒸煮、发酵、消毒等工序后，最终过滤、调节、分装。糖浆经蒸煮、冷却后需接种酵母菌进行发酵。(2022·山东卷T20) (　　)
7．米曲霉发酵过程的主要目的是使米曲霉充分生长繁殖，大量分泌制作酱油过程所需的酶类，这些酶中的________、________能分别将发酵池中的蛋白质和脂肪分解成易于吸收、风味独特的成分，如将蛋白质分解为小分子的肽和________。(2021·全国乙卷T37)
8．获得的果汁(如苹果汁)可以用来制作果酒或者果醋，制作果酒需要________菌，这一过程中也需要O2，O2的作用是______________________________。制作果醋需要醋酸菌，醋酸菌属于______(填“好氧”或“厌氧”)细菌。(2020·全国卷ⅢT37)
传统发酵技术的应用
1．(2024·山东淄博一模)王村醋属于“山东省非物质文化遗产”，它以小米为主要原料， 经酵母菌、醋酸菌等微生物发酵而成。明嘉靖二十五年王村就有“春分酿酒拌醋”之说，有经验的酿醋师可通过附耳听瓮判断发酵的程度。王村醋传统酿造工艺如下表，下列说法错误的是(　　)
步骤 操作过程
①糊茬 将浸泡好的小米放入锅内， 温火煮米， 米煮到开花， 成黏糊状即可
②大曲酒酵 将煮好的米摊开散热， 待温凉至38 ℃时加曲抖匀放入缸内发酵
③汾醋 将发酵好的醪液拌谷糠倒入瓮内自然发酵，进入七天的发酵阶段
④抄缸 用手抄醅， 有利于醋醅的空气流通， 该发酵过程需要两个月
⑤拨缸 从一个缸内倒入另一个缸内，使发酵彻底
⑥存醅 为保证小米醋的口感，用油布盖住并用泥密封， 存醅三个月
A．“春分酿酒拌醋”说明温度影响乙酸发酵
B．“听瓮”是通过醋酸菌产生CO2的状况推测发酵程度
C．拌曲时温度过高可导致曲中的微生物死亡
D．若不“手抄醅”，则醋酸菌的呼吸强度下降
2．(2024·广东广州一模)传统豆瓣酱的制作流程如下图。下列说法正确的是(　　)
A．霉豆瓣制作过程中，酵母菌、毛霉、乳酸菌等都发挥了重要作用
B．霉豆瓣发酵过程中产生的蛋白酶能把蛋白质分解成易吸收的小分子的肽和脂肪酸
C．制作辣椒胚时加入白酒的目的主要是利用酒精作为碳源，同时增加风味
D．混合装坛后要“翻、晒、露”的目的是让微生物充分进行有氧呼吸
发酵工程及其应用
3．(2024·山东青岛一模)黄桃精酿啤酒的制作工艺与普通啤酒有所不同，生产工艺流程为：麦芽→粉碎→糖化→过滤→煮沸→主发酵→后发酵(添加黄桃汁)→低温冷藏→成品→罐装。下列说法正确的是(　　)
A．利用大麦作原料时，淀粉是酵母菌的直接碳源
B．啤酒发酵过程中大部分糖的分解和代谢物的生成都在后发酵阶段完成
C．糖化是让麦芽糖分解形成糖浆，煮沸能够使酶失活及对糖浆灭菌
D．“精酿”啤酒发酵完成后，通常不需要进行过滤和消毒处理
4．(2024·江苏南通二模)黑曲霉是一种丝状真菌，其代谢物广泛应用于食品加工等领域。食品工业以红薯粉为原料经黑曲霉发酵获得柠檬酸，下图为生产柠檬酸的简要流程图。下列叙述正确的是(　　)
A．黑曲霉与生产果醋时所用主要微生物的代谢类型相同
B．将菌种接种至A培养基时，浸泡在酒精中的涂布器使用前需在火焰上灼烧
C．若发酵罐C中的原料为大豆粉，可利用黑曲霉水解大豆中的淀粉制成酱油
D．分离、提纯获得微生物细胞本身或其代谢物是发酵工程的中心环节
考点2　微生物的培养及分离计数
1．微生物培养中的无菌操作技术
2．制备培养基与微生物纯化技术
3．微生物分离与计数的实例
4．平板划线法、稀释涂布平板法及显微镜直接计数法的区别
(1)平板划线法适用于微生物的纯化，但不能用于微生物的计数。
(2)稀释涂布平板法常用于活菌计数，而显微镜直接计数法不能区分菌体的死活。
(3)用稀释涂布平板法进行计数时，为了保证结果准确，一般选择菌落数为30～300的平板进行计数。
1．(不定项)(2024·黑、吉、辽卷)某些香蕉植株组织中存在的内生菌可防治香蕉枯萎病，其筛选流程及抗性检测如图。下列操作正确的是(　　)
A．在大量感染香蕉枯萎病的香蕉种植园内，从感病植株上采集样品
B．将采集的样品充分消毒后，用蒸馏水冲洗，收集冲洗液进行无菌检测
C．将无菌检测合格的样品研磨，经稀释涂布平板法分离得到内生菌的单菌落
D．判断内生菌的抗性效果需比较有无接种内生菌的平板上的病原菌菌斑大小
2．(2024·全国甲卷)合理使用消毒液有助于减少传染病的传播。某同学比较了3款消毒液A、B、C杀灭细菌的效果，结果如图所示。回答下列问题。
(1)该同学采用显微镜直接计数法和菌落计数法分别测定同一样品的细菌数量，发现测得的细菌数量前者大于后者，其原因是______________________
_____________________________________________________________________。
(2)该同学从100 mL细菌原液中取1 mL加入无菌水中得到10 mL稀释菌液，再从稀释菌液中取200 μL涂布平板，菌落计数的结果为100，据此推算细菌原液中细菌浓度为________个/mL。
(3)菌落计数过程中，涂布器应先在酒精灯上灼烧，冷却后再涂布。灼烧的目的是_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________，
冷却的目的是________________________________________________________。
(4)据图可知杀菌效果最好的消毒液是___________________________________
____________，判断依据是____________________________________________
_____________________________________________________________________(答出两点即可)。
(5)鉴别培养基可用于反映消毒液杀灭大肠杆菌的效果。大肠杆菌在伊红美蓝培养基上生长的菌落呈________色。
判断与填空
1．某同学想从泡菜汁中筛选耐高盐乳酸菌，进行了如下实验：取泡菜汁样品，划线接种于一定NaCl浓度梯度的培养基，经培养得到了单菌落，培养基pH需偏碱性。(2023·浙江1月卷T19) (　　)
2．利用以尿素为唯一氮源的平板能分离出合成脲酶的微生物。(2023·山东卷T15) (　　)
3．血细胞计数板既可用于酵母菌的数量测定，也可用于细菌的数量测定。(2023·江苏卷T7) (　　)
4．研究者拟从堆肥中取样并筛选能高效降解羽毛、蹄角等废弃物中角蛋白的嗜热菌。根据堆肥温度变化曲线(如图)和选择培养基筛选原理来判断，最可能筛选到目标菌的条件组合是c点时取样、角蛋白氮源培养基。(2023·广东卷T10) (　　)
5．某同学进行分离高产脲酶菌的实验设计时，认为可分解酚红指示剂使其褪色的菌株是产脲酶菌。(2022·江苏卷T3) (　　)
6．为探究校内植物园土壤中的细菌种类，某兴趣小组采集园内土壤样本并开展相关实验。土壤溶液稀释倍数越低，越容易得到单菌落。(2022·海南卷T12) (　　)
7．β-苯乙醇是赋予白酒特征风味的物质。从某酒厂采集并筛选到一株产β-苯乙醇的酵母菌应用于白酒生产。通过配制培养基、灭菌、分离和培养能获得该酵母菌。(2022·辽宁卷T18) (　　)
8．解脂菌能利用分泌的脂肪酶将脂肪分解成甘油和脂肪酸并吸收利用。脂肪酸会使醇溶青琼脂平板变为深蓝色。将不能直接吸收脂肪的甲、乙两种菌分别等量接种在醇溶青琼脂平板上培养。甲菌菌落周围呈现深蓝色，乙菌菌落周围不变色，实验中所用培养基以脂肪为唯一碳源。(2021·山东卷T14) (　　)
9．采用液体培养基培养酵母菌，可以用淋洗液为原料制备培养基，培养基中还需要加入氮源等营养成分，氮源的主要作用是______________________________
_____________________________________________________________________(答出1点即可)。(2023·全国乙卷T37)
10．若从植物根际土壤中筛选分解淀粉的固氮细菌，培养基的主要营养物质包括水和________________。(2023·湖南卷T21)
11．有些细菌具有溶菌特性，能够破坏其他细菌的结构使细胞内容物释出。科学家试图从某湖泊水样中分离出有溶菌特性的细菌。A菌通常被用作溶菌对象。研究者将含有一定浓度A菌的少量培养基倾倒在固体培养平板上，凝固形成薄层。培养一段时间后，薄层变浑浊(如图)，表明__________________________。(2023·北京卷T16)
12．无菌条件下，某兴趣小组制备了两个大肠杆菌平板，用两片大小相同的无菌滤纸分别蘸取某种橘皮的精油(采用水蒸气蒸馏法和压榨法提取了某种橘皮的精油，分别简称为HDO和CPO)贴于含菌平板上，37 ℃培养24 h，抑菌效果见下图。有同学提出该实验存在明显不足：①未设置对照，设置本实验对照的做法是______________________________________________________________________，其作用是__________________________________________________________；
②不足之处还有_______________________________________________________
_____________________________________________________________________(答两点)。(2022·重庆卷T25)
13．枯草芽孢杆菌为好氧微生物，液体培养时应采用________(填“静置”或“摇床振荡”)培养。培养过程中抽样检测活菌数量时，应采用__________________(填“稀释涂布平板法”或“显微镜直接计数法”)，其原因是___________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。(2022·河北卷T23)
微生物培养的基本技术
1．(2024·黑龙江哈尔滨模拟)科研人员发现A、B两株可降解石油的细菌，为比较二者的降解能力并分析其他生理功能进行了相关实验：配制液体培养基Ⅰ、Ⅱ(培养基Ⅰ：K2HPO4、MgSO4、NH4NO3、石油；培养基Ⅱ：K2HPO4、MgSO4、石油)，再分别添加琼脂，制成平板Ⅰ、Ⅱ，将等量A、B菌株分别接种到平板Ⅰ的甲、乙两孔处，平板Ⅱ进行同样操作，相同且适宜条件下培养一段时间，比较各孔处透明圈大小，结果如表所示。下列叙述错误的是(　　)
菌株 透明圈大小
平板Ⅰ 平板Ⅱ
A ＋＋＋ ＋＋
B ＋＋ －
注：“＋”表示有透明圈，“＋”越多表示透明圈越大，“－”表示无透明圈。
A．培养基Ⅰ、Ⅱ均不含碳源，培养基Ⅱ是选择性培养基
B．NH4NO3作为氮源可参与合成RNA、蛋白质等物质
C．添加琼脂的培养基灭菌后，需冷却至50 ℃左右再倒平板
D．A菌株降解石油能力更强，不添加氮源也能生长
2．(2024·山东日照二模)PDA培养基用于真菌培养，LB培养基用于细菌培养。为探究芽孢杆菌X能否产生抑制真菌生长的物质，研究人员进行了相关实验，如下表。下列叙述正确的是(　　)
培养皿甲 培养皿乙
处理 PDA培养基：小孔加入① PDA培养基：小孔加入培养过芽孢杆菌X的无菌培养液
在培养皿右侧相同位置接种等量某种真菌
实验结果
A．该实验说明芽孢杆菌X产生了抑制真菌生长的物质
B．表格中的①处应是未培养过芽孢杆菌X的PDA无菌培养液
C．制备两种培养基时均需先进行湿热灭菌再调节pH
D．接种时需先用涂布器蘸取菌液再涂布到相应位置
微生物的筛选、计数及鉴定
3．(2024·山东德州二模)烟草的多糖含量偏高是造成烟叶原料品质不高的重要因素，微生物在烟叶醇化阶段可有效降低烟草的多糖含量。为提高烟叶质量，科研人员筛选出S1～S5微生物菌株，并测定其相关酶活力，结果如图所示。下列说法正确的是(　　)
A．筛选获得S1～S5微生物菌株时，应以淀粉为唯一碳源
B．用平板划线法分离单菌落前需对培养液进行稀释
C．用S1单菌落培养获得的纯培养物对烟叶进行醇化效果最好
D．烟叶醇化发酵应在低温下进行，以抑制杂菌繁殖
4．(2024·辽宁沈阳二模)我国科学家发现蜡螟可以吃塑料，并从其肠道内分离出了能够降解聚乙烯(塑料的组成成分，缩写为PE)的细菌。某科研小组计划在实验室分离纯化出能高效降解聚乙烯的细菌(目标菌)，然后获取相关酶，以期实现塑料的生物酶降解。分离纯化目的菌的过程如图1所示。回答下列问题：
(1)过程④使用的培养基成分除水、无机盐、氮源外，还应添加的物质有________________。
(2)若在④的各个平板上统计的菌落数分别为110个、126个和148个，则每克肠道内容物含有的降解菌为__________个。若过程④平板上的菌落难以数清，则很可能与图中过程______(填图中序号)有关。
(3)科研人员初步筛选出XJDLM-8、XJDLM-3、XJDLM-12三个菌株，并对这三个菌株降解聚乙烯的能力进行了探究，实验结果如图2所示。由实验结果可知，菌株生长量与聚乙烯失重率的关系为________；其中__________菌株的生长和对聚乙烯的降解效果最佳。
(4)研究人员欲扩大培养分离的菌株进而发酵获得大量降解PE的酶，大致流程如图3所示。若获得的菌种为原核生物，可采用诱变育种方法培育出适用于生产用的菌种，该方法的缺点是____________________________________。发酵过程中可通过监测________________来了解发酵进程。可采用琼脂糖凝胶电泳法对降解PE的酶进行鉴定，其原理是_________________________________________
_____________________________________________________________________。
21世纪教育网(www.21cnjy.com)考点1　传统发酵技术和发酵工程的应用
1．三种传统食品的制作技术
2．啤酒的工业化生产流程
3．发酵过程中控制杂菌的“四大措施”
(1)通过发酵条件控制杂菌：
①无氧发酵时的无氧环境可以抑制好氧细菌。
②乳酸菌发酵、酒精发酵形成的酸性环境可以抑制杂菌繁殖。
(2)利用盐控制杂菌：如腐乳的制作。
(3)利用酒精控制杂菌：如果酒、腐乳的制作。
(4)利用香辛料控制杂菌：如腐乳、泡菜的制作。
4．发酵过程的影响因素
(1)温度：温度能影响酶的活性，也能影响生物合成的途径。温度还会影响发酵液的物理性质，以及菌种对营养物质的分解吸收等。
(2)pH：pH能够影响酶的活性，以及细胞膜的带电荷状况。还会影响培养基中营养物质的分解等。
(3)溶解氧：在发酵过程中，菌种只能利用发酵液中的溶解氧。因此，必须向发酵液中连续补充大量的氧，并要不断地进行搅拌，以提高氧在发酵液中的溶解度。
(4)泡沫：发酵过程中，通气、搅拌、微生物的代谢过程及培养基中某些成分的分解等，都有可能产生泡沫。过多的持久性泡沫对发酵是不利的。
(5)营养物质的浓度：发酵液中各种营养物质的浓度，特别是碳氮比、无机盐和维生素的浓度，会直接影响菌体的生长和代谢物的积累。
1．(2024·江西卷)井冈霉素是我国科学家发现的一种氨基寡糖类抗生素，它由吸水链霉菌井冈变种(JGs，一种放线菌，菌体呈丝状生长)发酵而来，在水稻病害防治等领域中得到广泛应用。下列关于JGs发酵生产井冈霉素的叙述，正确的是(　　)
A．JGs可发酵生产井冈霉素，因为它含有能够编码井冈霉素的基因
B．JGs接入发酵罐前需要扩大培养，该过程不影响井冈霉素的产量
C．提高JGs发酵培养基中营养物质的浓度，会提高井冈霉素的产量
D．稀释涂布平板法不宜用于监控JGs发酵过程中活细胞数量的变化
D　[基因表达的产物是蛋白质，而井冈霉素是JGs发酵生产的一种氨基寡糖类抗生素，A错误；JGs接入发酵罐前需要扩大培养，该过程会影响JGs的数量，进而影响井冈霉素的产量，B错误；在一定范围内提高JGs发酵培养基中营养物质的浓度，会提高井冈霉素的产量，但若浓度过大，反而会降低井冈霉素的产量，C错误；JGs是一种放线菌，菌体呈丝状生长，形成的菌落难以区分，因此稀释涂布平板法不宜用于监控JGs发酵过程中活细胞数量的变化，D正确。]
2．(不定项)(2024·河北卷)中国传统白酒多以泥窖为发酵基础，素有“千年老窖万年糟”“以窖养糟，以糟养泥”之说。多年反复利用的老窖池内壁窖泥中含有大量与酿酒相关的微生物。下列叙述正确的是(　　)
A．传统白酒的酿造是在以酿酒酵母为主的多种微生物共同作用下完成的
B．窖池内各种微生物形成了相对稳定的体系，使酿造过程不易污染杂菌
C．从窖泥中分离的酿酒酵母扩大培养时，需在CO2或N2环境中进行
D．从谷物原料发酵形成的酒糟中，可分离出产淀粉酶的微生物
ABD　[白酒的酿造主要依靠酿酒酵母，由于窖泥中含有大量与酿酒相关的微生物，故传统白酒的酿造是在以酿酒酵母为主的多种微生物共同作用下完成的，A正确；窖池内各种微生物形成了相对稳定的体系，使酿造过程不易污染杂菌，B正确；酵母菌是兼性厌氧菌，与无氧呼吸相比，细胞有氧呼吸产生的能量更多，更能满足酵母菌大量繁殖时的需求，因此，对分离的酿酒酵母扩大培养时需要在有氧的条件下进行，C错误；谷物原料如高粱、玉米、大米等富含淀粉，因此从谷物原料发酵形成的酒糟中可分离出产淀粉酶的微生物，D正确。]
判断与填空
1．向泡菜坛盖边沿的水槽中注满水形成内部无菌环境。(2023·北京卷T13) (×)
提示：向泡菜坛盖边沿的水槽中注满水形成内部无氧环境，不能创造无菌环境。
2．在白酒、啤酒和果酒的发酵初期需要提供一定的氧气。(2022·湖北卷T11) (√)
3．乙酸发酵过程中经常翻动发酵物，可控制发酵温度和改善通气状况。(2023·江苏卷T16) (×)
提示：乙酸发酵过程中利用了醋酸菌的有氧呼吸，在发酵过程中经常翻动发酵物，有利于散热，但不能控制发酵温度。
4．在制作发酵食品的学生实践中，控制发酵条件至关重要。葡萄果皮上有酵母菌和醋酸菌，制作好葡萄酒后，可直接通入无菌空气制作葡萄醋。(2022·江苏卷T16) (×)
提示：醋酸菌为好氧细菌，且发酵温度高于果酒的发酵温度，因此制作好葡萄酒后，需通入无菌空气，且适当提高发酵装置的温度。
5．青霉菌处在葡萄糖浓度不足的环境中时，会通过分泌青霉素杀死细菌，以保证自身生存所需的能量供应。目前已实现青霉素的工业化生产，选育出的高产菌株经扩大培养后才可接种到发酵罐中。(2022·山东卷T14) (√)
6．啤酒的工业化生产中，大麦经发芽、焙烤、碾磨、糖化、蒸煮、发酵、消毒等工序后，最终过滤、调节、分装。糖浆经蒸煮、冷却后需接种酵母菌进行发酵。(2022·山东卷T20)(√)
7．米曲霉发酵过程的主要目的是使米曲霉充分生长繁殖，大量分泌制作酱油过程所需的酶类，这些酶中的________、________能分别将发酵池中的蛋白质和脂肪分解成易于吸收、风味独特的成分，如将蛋白质分解为小分子的肽和________。(2021·全国乙卷T37)
提示：蛋白酶　脂肪酶　氨基酸
8．获得的果汁(如苹果汁)可以用来制作果酒或者果醋，制作果酒需要________菌，这一过程中也需要O2，O2的作用是__________________________________。
制作果醋需要醋酸菌，醋酸菌属于________(填“好氧”或“厌氧”)细菌。(2020·全国卷ⅢT37)
提示：酵母　促进有氧呼吸，使酵母菌大量繁殖　好氧
传统发酵技术的应用
1．(2024·山东淄博一模)王村醋属于“山东省非物质文化遗产”，它以小米为主要原料， 经酵母菌、醋酸菌等微生物发酵而成。明嘉靖二十五年王村就有“春分酿酒拌醋”之说，有经验的酿醋师可通过附耳听瓮判断发酵的程度。王村醋传统酿造工艺如下表，下列说法错误的是(　　)
步骤 操作过程
①糊茬 将浸泡好的小米放入锅内， 温火煮米， 米煮到开花， 成黏糊状即可
②大曲酒酵 将煮好的米摊开散热， 待温凉至38 ℃时加曲抖匀放入缸内发酵
③汾醋 将发酵好的醪液拌谷糠倒入瓮内自然发酵，进入七天的发酵阶段
④抄缸 用手抄醅， 有利于醋醅的空气流通， 该发酵过程需要两个月
⑤拨缸 从一个缸内倒入另一个缸内，使发酵彻底
⑥存醅 为保证小米醋的口感，用油布盖住并用泥密封， 存醅三个月
A．“春分酿酒拌醋”说明温度影响乙酸发酵
B．“听瓮”是通过醋酸菌产生CO2的状况推测发酵程度
C．拌曲时温度过高可导致曲中的微生物死亡
D．若不“手抄醅”，则醋酸菌的呼吸强度下降
B　[“春分酿酒拌醋”说明温度影响乙酸发酵，A正确；“听瓮”是通过缸内细微的气泡声，判断酒曲发酵的程度，B错误；拌曲时将煮好的米摊开散热， 待温凉至38 ℃时加曲抖匀，是因为温度过高可导致曲中的微生物死亡，C正确；醋酸菌是好氧细菌，用手抄醅，有利于醋醅的空气流通，若不“手抄醅”，则醋酸菌的呼吸强度下降，D正确。]
2．(2024·广东广州一模)传统豆瓣酱的制作流程如下图。下列说法正确的是(　　)
A．霉豆瓣制作过程中，酵母菌、毛霉、乳酸菌等都发挥了重要作用
B．霉豆瓣发酵过程中产生的蛋白酶能把蛋白质分解成易吸收的小分子的肽和脂肪酸
C．制作辣椒胚时加入白酒的目的主要是利用酒精作为碳源，同时增加风味
D．混合装坛后要“翻、晒、露”的目的是让微生物充分进行有氧呼吸
D　[霉豆瓣制作过程中，酵母菌、毛霉、曲霉等主要通过有氧呼吸起作用，乳酸菌必须进行无氧发酵，A错误；霉豆瓣发酵过程中产生的蛋白酶能把蛋白质分解成易吸收的小分子的肽和氨基酸，B错误；制作辣椒胚时加入白酒的目的主要是利用白酒杀菌，同时增加风味，C错误；混合装坛后要“翻、晒、露”的目的是让微生物和空气充分接触，充分进行有氧呼吸，D正确。]
发酵工程及其应用
3．(2024·山东青岛一模)黄桃精酿啤酒的制作工艺与普通啤酒有所不同，生产工艺流程为：麦芽→粉碎→糖化→过滤→煮沸→主发酵→后发酵(添加黄桃汁)→低温冷藏→成品→罐装。下列说法正确的是(　　)
A．利用大麦作原料时，淀粉是酵母菌的直接碳源
B．啤酒发酵过程中大部分糖的分解和代谢物的生成都在后发酵阶段完成
C．糖化是让麦芽糖分解形成糖浆，煮沸能够使酶失活及对糖浆灭菌
D．“精酿”啤酒发酵完成后，通常不需要进行过滤和消毒处理
D　[利用大麦作原料时，葡萄糖是酵母菌的直接碳源，A错误；啤酒发酵过程分为主发酵和后发酵，大部分糖的分解和代谢物的生成都在主发酵阶段完成，B错误；糖化是让淀粉分解形成糖浆，C错误；题干信息可知，“精酿”啤酒发酵完成后，通常不需要进行过滤和消毒处理，D正确。]
4．(2024·江苏南通二模)黑曲霉是一种丝状真菌，其代谢物广泛应用于食品加工等领域。食品工业以红薯粉为原料经黑曲霉发酵获得柠檬酸，下图为生产柠檬酸的简要流程图。下列叙述正确的是(　　)
A．黑曲霉与生产果醋时所用主要微生物的代谢类型相同
B．将菌种接种至A培养基时，浸泡在酒精中的涂布器使用前需在火焰上灼烧
C．若发酵罐C中的原料为大豆粉，可利用黑曲霉水解大豆中的淀粉制成酱油
D．分离、提纯获得微生物细胞本身或其代谢物是发酵工程的中心环节
A　[黑曲霉的代谢类型为异养需氧型，制作果醋所用的主要微生物是醋酸菌，它的代谢类型也为异养需氧型，A正确；由图分析可知，A培养基中是平板划线法得到的菌落，将菌种接种至A培养基时，应将接种环放在火焰上灼烧，而不是涂布器，B错误；以大豆为主要原料，利用产生蛋白酶的霉菌(如黑曲霉)，将原料中的蛋白质水解成小分子的肽和氨基酸，然后经淋洗、调制可以制成酱油产品，C错误；发酵工程的中心环节是发酵罐内发酵，不是分离、提纯获得微生物细胞本身或其代谢物，D错误。]
考点2　微生物的培养及分离计数
1．微生物培养中的无菌操作技术
2．制备培养基与微生物纯化技术
3．微生物分离与计数的实例
4．平板划线法、稀释涂布平板法及显微镜直接计数法的区别
(1)平板划线法适用于微生物的纯化，但不能用于微生物的计数。
(2)稀释涂布平板法常用于活菌计数，而显微镜直接计数法不能区分菌体的死活。
(3)用稀释涂布平板法进行计数时，为了保证结果准确，一般选择菌落数为30～300的平板进行计数。
1．(不定项)(2024·黑、吉、辽卷)某些香蕉植株组织中存在的内生菌可防治香蕉枯萎病，其筛选流程及抗性检测如图。下列操作正确的是(　　)
A．在大量感染香蕉枯萎病的香蕉种植园内，从感病植株上采集样品
B．将采集的样品充分消毒后，用蒸馏水冲洗，收集冲洗液进行无菌检测
C．将无菌检测合格的样品研磨，经稀释涂布平板法分离得到内生菌的单菌落
D．判断内生菌的抗性效果需比较有无接种内生菌的平板上的病原菌菌斑大小
CD　[据题干信息可知，某些香蕉植株组织中存在的内生菌可防治香蕉枯萎病，故在大量感染香蕉枯萎病的香蕉种植园内，从未感病植株上采集样品，A错误；获得纯净的微生物培养物的关键是防止杂菌污染，将采集的样品充分消毒后，用无菌水冲洗，收集冲洗液进行无菌检测，B错误；据题图可知，样品研磨后进行了稀释涂布，可见将无菌检测合格的样品研磨，经稀释涂布平板法分离得到内生菌的单菌落，C正确；据题图可知，判断内生菌的抗性效果需设置对照组和实验组，对照组不接种内生菌得到病原菌菌斑，实验组接种内生菌得到病原菌菌斑，然后比较对照组和实验组的菌斑大小，实验组病原菌菌斑越小表明内生菌抗性效果越好，D正确。]
2．(2024·全国甲卷)合理使用消毒液有助于减少传染病的传播。某同学比较了3款消毒液A、B、C杀灭细菌的效果，结果如图所示。回答下列问题。
(1)该同学采用显微镜直接计数法和菌落计数法分别测定同一样品的细菌数量，发现测得的细菌数量前者大于后者，其原因是___________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________。
(2)该同学从100 mL细菌原液中取1 mL加入无菌水中得到10 mL稀释菌液，再从稀释菌液中取200 μL涂布平板，菌落计数的结果为100，据此推算细菌原液中细菌浓度为________个/mL。
(3)菌落计数过程中，涂布器应先在酒精灯上灼烧，冷却后再涂布。灼烧的目的是____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________，
冷却的目的是____________________________________。
(4)据图可知杀菌效果最好的消毒液是___________________________________
____________，判断依据是____________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________。(答出两点即可)
(5)鉴别培养基可用于反映消毒液杀灭大肠杆菌的效果。大肠杆菌在伊红美蓝培养基上生长的菌落呈________色。
[解析]　(1)显微镜直接计数法把死菌和活菌一起计数。菌落计数法计数只计活菌数，还可能存在多个活菌形成一个菌落的情况，故前者的数量多于后者。(2)从100 mL细菌原液中取1 mL加入无菌水中得到10 mL稀释菌液，即稀释了10倍，1 mL细菌原液中细菌浓度＝(菌落数÷菌液体积)×稀释倍数＝100÷0.2×10＝5 000个/mL。(3)菌落计数过程中，涂布器应先在酒精灯上灼烧，冷却后再涂布。灼烧的目的是杀死涂布器上可能存在的微生物，防止涂布器上可能存在的微生物污染，冷却的目的是防止温度过高杀死菌种。(4)A消毒液活菌数减少量最多，且杀菌时间较短，效率最高，因此A消毒液杀菌效果最好。(5)大肠杆菌在伊红美蓝培养基上生长的菌落呈黑色。
[答案]　(1)前者微生物分散的活菌和死菌一起计数，后者存在多个活菌形成一个菌落的情况且只计数活菌　(2)5 000　(3)杀死涂布器上可能存在的微生物，防止涂布器上可能存在的微生物污染　防止温度过高杀死菌种　(4)A　A消毒液活菌数减少量最多，且杀菌时间较短，效率最高　(5)黑
判断与填空
1．某同学想从泡菜汁中筛选耐高盐乳酸菌，进行了如下实验：取泡菜汁样品，划线接种于一定NaCl浓度梯度的培养基，经培养得到了单菌落，培养基pH需偏碱性。(2023·浙江1月卷T19) (×)
提示：乳酸菌经过无氧呼吸产生乳酸，故其生活的环境偏酸性，培养基pH需偏酸性。
2．利用以尿素为唯一氮源的平板能分离出合成脲酶的微生物。(2023·山东卷T15) (√)
3．血细胞计数板既可用于酵母菌的数量测定，也可用于细菌的数量测定。(2023·江苏卷T7) (×)
提示：血细胞计数板适用于真菌的计数，细菌计数板用于细菌的数量测定等。
4．研究者拟从堆肥中取样并筛选能高效降解羽毛、蹄角等废弃物中角蛋白的嗜热菌。根据堆肥温度变化曲线(如图)和选择培养基筛选原理来判断，最可能筛选到目标菌的条件组合是c点时取样、角蛋白氮源培养基。(2023·广东卷T10) (√)
5．某同学进行分离高产脲酶菌的实验设计时，认为可分解酚红指示剂使其褪色的菌株是产脲酶菌。(2022·江苏卷T3) (×)
提示：产脲酶菌不能分解酚红指示剂。
6．为探究校内植物园土壤中的细菌种类，某兴趣小组采集园内土壤样本并开展相关实验。土壤溶液稀释倍数越低，越容易得到单菌落。(2022·海南卷T12) (×)
提示：土壤溶液稀释倍数足够高时，才能将聚集的细菌分散开，有助于在培养基表面形成单菌落。
7．β-苯乙醇是赋予白酒特征风味的物质。从某酒厂采集并筛选到一株产β-苯乙醇的酵母菌应用于白酒生产。通过配制培养基、灭菌、分离和培养能获得该酵母菌。(2022·辽宁卷T18) (×)
提示：分离纯化酵母菌的操作应为配制培养基→灭菌→接种→培养→挑选菌落。
8．解脂菌能利用分泌的脂肪酶将脂肪分解成甘油和脂肪酸并吸收利用。脂肪酸会使醇溶青琼脂平板变为深蓝色。将不能直接吸收脂肪的甲、乙两种菌分别等量接种在醇溶青琼脂平板上培养。甲菌菌落周围呈现深蓝色，乙菌菌落周围不变色，实验中所用培养基以脂肪为唯一碳源。(2021·山东卷T14) (×)
提示：乙菌落周围没有出现深蓝色，说明乙菌落不能产生脂肪酶，不能利用脂肪为其供能，但乙菌落也可以在培养基上生存，说明实验中所用培养基不是以脂肪为唯一碳源。
9．采用液体培养基培养酵母菌，可以用淋洗液为原料制备培养基，培养基中还需要加入氮源等营养成分，氮源的主要作用是____________________________
____________________________________________________________________(答出1点即可)。(2023·全国乙卷T37)
提示：为合成微生物细胞结构提供原料(微生物细胞中的含氮物质，如核酸、蛋白质、磷脂等)
10．若从植物根际土壤中筛选分解淀粉的固氮细菌，培养基的主要营养物质包括水和________________。(2023·湖南卷T21)
提示：无机盐、淀粉
11．有些细菌具有溶菌特性，能够破坏其他细菌的结构使细胞内容物释出。科学家试图从某湖泊水样中分离出有溶菌特性的细菌。A菌通常被用作溶菌对象。研究者将含有一定浓度A菌的少量培养基倾倒在固体培养平板上，凝固形成薄层。培养一段时间后，薄层变浑浊(如图)，表明________________________________。(2023·北京卷T16)
提示：A菌能在培养平板中生长繁殖
12．无菌条件下，某兴趣小组制备了两个大肠杆菌平板，用两片大小相同的无菌滤纸分别蘸取某种橘皮的精油(采用水蒸气蒸馏法和压榨法提取了某种橘皮的精油，分别简称为HDO和CPO)贴于含菌平板上，37 ℃培养24 h，抑菌效果见下图。有同学提出该实验存在明显不足：①未设置对照，设置本实验对照的做法是__________________________________________________________________，其作用是______________________________________________________________
____________________________________________________________________；②不足之处还有______________________________________________________
____________________________________________________________________(答两点)。(2022·重庆卷T25)
提示：用一片大小相同的无菌滤纸蘸取等量的无菌水贴于含菌平板上，相同条件下一起培养　排除无关变量对实验结果的影响，增强实验结果的可信度　违背平行重复原则，每个实验组中的样本太少；实验组精油的含量没有遵循等量原则
13．枯草芽孢杆菌为好氧微生物，液体培养时应采用________(填“静置”或“摇床振荡”)培养。培养过程中抽样检测活菌数量时，应采用__________________(填“稀释涂布平板法”或“显微镜直接计数法”)，其原因是__________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________。(2022·河北卷T23)
提示：摇床振荡　稀释涂布平板法　用稀释涂布平板法在培养基上看到的每一个菌落都来自一个活细胞，而显微镜直接计数法会将死亡的枯草芽孢杆菌也计算在内
微生物培养的基本技术
1．(2024·黑龙江哈尔滨模拟)科研人员发现A、B两株可降解石油的细菌，为比较二者的降解能力并分析其他生理功能进行了相关实验：配制液体培养基Ⅰ、Ⅱ(培养基Ⅰ：K2HPO4、MgSO4、NH4NO3、石油；培养基Ⅱ：K2HPO4、MgSO4、石油)，再分别添加琼脂，制成平板Ⅰ、Ⅱ，将等量A、B菌株分别接种到平板Ⅰ的甲、乙两孔处，平板Ⅱ进行同样操作，相同且适宜条件下培养一段时间，比较各孔处透明圈大小，结果如表所示。下列叙述错误的是(　　)
菌株 透明圈大小
平板Ⅰ 平板Ⅱ
A ＋＋＋ ＋＋
B ＋＋ －
注：“＋”表示有透明圈，“＋”越多表示透明圈越大，“－”表示无透明圈。
A．培养基Ⅰ、Ⅱ均不含碳源，培养基Ⅱ是选择性培养基
B．NH4NO3作为氮源可参与合成RNA、蛋白质等物质
C．添加琼脂的培养基灭菌后，需冷却至50 ℃左右再倒平板
D．A菌株降解石油能力更强，不添加氮源也能生长
A　[在培养基Ⅰ、Ⅱ中，作为碳源的成分均是石油，A错误；RNA和蛋白质的组成元素中都含有氮元素，NH4NO3作为氮源可参与合成RNA、蛋白质等物质，B正确；培养基灭菌后，需冷却至50 ℃左右时再倒平板，C正确；表中的实验结果表明，A菌株降解石油的能力强于B菌株，并且在没有添加氮源的培养基Ⅱ中也能生长，D正确。]
2．(2024·山东日照二模)PDA培养基用于真菌培养，LB培养基用于细菌培养。为探究芽孢杆菌X能否产生抑制真菌生长的物质，研究人员进行了相关实验，如下表。下列叙述正确的是(　　)
培养皿甲 培养皿乙
处理 PDA培养基：小孔加入① PDA培养基：小孔加入培养过芽孢杆菌X的无菌培养液
在培养皿右侧相同位置接种等量某种真菌
实验结果
A．该实验说明芽孢杆菌X产生了抑制真菌生长的物质
B．表格中的①处应是未培养过芽孢杆菌X的PDA无菌培养液
C．制备两种培养基时均需先进行湿热灭菌再调节pH
D．接种时需先用涂布器蘸取菌液再涂布到相应位置
A　[本实验是探究芽孢杆菌X能否产生抑制真菌生长的物质，因此自变量为是否含有培养过芽孢杆菌X的无菌培养液，据图可知，与培养皿甲相比，培养皿乙中真菌菌落与小孔的距离变大，说明芽孢杆菌X产生了抑制真菌生长的物质，PDA培养基用于真菌培养，LB培养基用于细菌培养，因此培养芽孢杆菌X的应为LB培养基，即表格中的①处应是未培养过芽孢杆菌X的LB无菌培养液，A正确，B错误；培养基制备时应先调pH再进行湿热灭菌，C错误；接种时需先用移液器将菌液移至培养皿，然后再用涂布器涂布到相应位置，D错误。]
微生物的筛选、计数及鉴定
3．(2024·山东德州二模)烟草的多糖含量偏高是造成烟叶原料品质不高的重要因素，微生物在烟叶醇化阶段可有效降低烟草的多糖含量。为提高烟叶质量，科研人员筛选出S1～S5微生物菌株，并测定其相关酶活力，结果如图所示。下列说法正确的是(　　)
A．筛选获得S1～S5微生物菌株时，应以淀粉为唯一碳源
B．用平板划线法分离单菌落前需对培养液进行稀释
C．用S1单菌落培养获得的纯培养物对烟叶进行醇化效果最好
D．烟叶醇化发酵应在低温下进行，以抑制杂菌繁殖
C　[据题图信息可知，科研人员筛选出的S1～S5微生物菌株均能降低烟草中的多糖含量，但不能确定该微生物是否利用淀粉为碳源，A错误；用平板划线法分离单菌落直接使用未经稀释的微生物样本进行划线操作即可达到分离的目的，B错误；据图分析可知，科研人员筛选出的S1～S5微生物菌株均能降低烟草中的多糖含量，S1微生物对降低烟草的多糖酶活力比其他四种都强，故用S1单菌落培养获得的纯培养物对烟叶进行醇化效果最好，C正确；酶催化化学反应需要适宜的温度，烟叶醇化发酵应在适宜的温度下进行，D错误。]
4．(2024·辽宁沈阳二模)我国科学家发现蜡螟可以吃塑料，并从其肠道内分离出了能够降解聚乙烯(塑料的组成成分，缩写为PE)的细菌。某科研小组计划在实验室分离纯化出能高效降解聚乙烯的细菌(目标菌)，然后获取相关酶，以期实现塑料的生物酶降解。分离纯化目的菌的过程如图1所示。回答下列问题：
(1)过程④使用的培养基成分除水、无机盐、氮源外，还应添加的物质有________________。
(2)若在④的各个平板上统计的菌落数分别为110个、126个和148个，则每克肠道内容物含有的降解菌为__________个。若过程④平板上的菌落难以数清，则很可能与图中过程________(填图中序号)有关。
(3)科研人员初步筛选出XJDLM-8、XJDLM-3、XJDLM-12三个菌株，并对这三个菌株降解聚乙烯的能力进行了探究，实验结果如图2所示。由实验结果可知，菌株生长量与聚乙烯失重率的关系为________；其中__________菌株的生长和对聚乙烯的降解效果最佳。
(4)研究人员欲扩大培养分离的菌株进而发酵获得大量降解PE的酶，大致流程如图3所示。若获得的菌种为原核生物，可采用诱变育种方法培育出适用于生产用的菌种，该方法的缺点是________________________________________________
________________________________________。发酵过程中可通过监测________________来了解发酵进程。可采用琼脂糖凝胶电泳法对降解PE的酶进行鉴定，其原理是____________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________。
[解析]　(1)通过过程④能筛选出降解聚乙烯的细菌，使用的培养基为固体培养基，因此还应添加的物质有PE(聚乙烯)、琼脂。(2)每克肠道内容物含有的降解菌为(110＋126＋148)/3×102×103＝1.28×107个；若过程④平板上的菌落难以数清，则很可能是涂布浓度太高导致的，即与图中过程③有关。(3)由图2可知，随着培养时间的延长，OD值与聚乙烯失重率均有所增加，说明菌株生长量与聚乙烯失重率呈正相关，其中XJDLM-8菌株的生长和对聚乙烯的降解效果最佳。(4)由于突变的不定向性和低频性，导致诱变育种过程中有利变异少，需要处理大量实验材料，具有不确定性。发酵过程中可通过监测PE失重率来了解发酵进程。可采用琼脂糖凝胶电泳法对降解PE的酶进行鉴定，其原理是相对分子质量不同的蛋白质在琼脂糖凝胶中移动速度不同。
[答案]　(1)PE(聚乙烯)、琼脂　(2)1.28×107　③　(3)呈正相关　XJDLM-8　(4)有利变异少，需要处理大量实验材料，具有不确定性　PE失重率　相对分子质量不同的蛋白质在琼脂糖凝胶中移动速度不同
课后限时集训(十二)　发酵工程
(建议用时：30分钟)
一、选择题
1．(2024·湖南长沙二模)某位同学按照果酒制作流程操作后，获得的“葡萄酒”除了有“酒味”，还有“酸味”且有一层白膜。推断出现这种现象的不当操作，最可能的是(　　)
A．发酵瓶、榨汁机等器具没有用酒精消毒
B．清洗葡萄时没有去除枝梗和腐烂的籽粒
C．打开瓶盖后忘记盖上
D．发酵过程中，没有控制温度
C　[发酵瓶、榨汁机等器具没有用酒精消毒，可能会导致杂菌污染，但不会产生酸味，A错误；清洗葡萄时没有去除枝梗和腐烂的籽粒，可能会导致杂菌污染，但不会产生酸味，B错误；打开瓶盖，可以进行乙酸发酵，产生“酸味”且有一层白膜，C正确；发酵过程中，仅没有控制温度，不会导致醋酸菌繁殖，因为醋酸菌为好氧细菌，D错误。]
2．(2024·山东滨州二模)绍兴黄酒一般在农历七月制酒药，九月制麦曲，大雪前后正式开始酿酒，到次年立春结束，发酵期长达八十多天。其工艺流程如下表。下列说法错误的是(　　)
① 酿酒所需的糖化微生物
② 主要含酵母菌、淀粉、淀粉酶和蛋白酶等
③ 调节发酵物的温度，补充新鲜空气
④ 将生产过滤完成的酒加热至90 ℃左右，杀灭其中的微生物，便于储藏、保管
A．黄酒是直接利用原材料中的微生物进行发酵酿制的
B．开耙有利于发酵物中的酵母菌大量繁殖
C．发酵过程会因发酵物的pH降低和酒精含量增多而逐渐停止
D．煎酒可以杀死黄酒中的绝大多数微生物且基本不破坏其中的营养成分
A　[黄酒制作过程中②过程加入了酵母菌，因此不是直接利用原材料中的微生物进行发酵酿制的，A错误；“开耙”(搅拌)是为了让酵母菌进行有氧呼吸，增加酵母菌的数量，可缩短发酵所需的时间，B正确；酿酒时糖类未耗尽，酵母菌的发酵过程也会停止，原因可能是pH降低和酒精含量增多，对发酵起抑制作用，从而导致酵母菌发酵停止，C正确；通过煎酒可以杀死黄酒中的绝大多数微生物且基本不破坏其中的营养成分，D正确。]
3．(2024·黑龙江哈尔滨二模)《齐民要术》关于泡菜制作的记载为“作盐水，令极咸，于盐水中洗菜，即内(纳)瓮中。其洗菜盐水，澄取清者，泻著瓮中，令没菜把即止”，意思是制作极咸的盐水，用盐水洗过的菜放入菜坛中，再把洗过菜的澄清盐水倒入菜坛中，直至淹没菜为止。下列说法错误的是(　　)
A．泡菜发酵液表面有一层白膜是乳酸菌大量繁殖的结果
B．“极咸”盐水可减少杂菌繁殖，降低泡菜中的亚硝酸盐含量
C．再倒入菜坛中的“洗菜盐水”也可能含有泡菜发酵的乳酸菌
D．“令没菜把即止”主要是为泡菜中乳酸菌发酵创设无氧条件
A　[泡菜发酵液表面有一层白膜主要是产膜酵母大量繁殖形成的菌膜，A错误；温度过高、腌制时间过短、食盐用量过少等均会导致杂菌大量繁殖，亚硝酸盐含量升高，因此“极咸”盐水可减少杂菌繁殖，降低泡菜中的亚硝酸盐含量，B正确；由于蔬菜上原本就有可能附着有乳酸菌，用盐水清洗泡菜时，可以将原来附着在蔬菜上的乳酸菌一并洗到盐水中，故再倒入菜坛中的“洗菜盐水”也可能含有泡菜发酵的乳酸菌，C正确；“令没菜把即止”的意思是将盐水加到淹没蔬菜为止，这是因为乳酸菌是厌氧微生物，这样操作的主要目的是为乳酸菌的发酵提供无氧条件，D正确。]
4．(2024·山东卷)在发酵过程中，多个黑曲霉菌体常聚集成团形成菌球体，菌球体大小仅由菌体数量决定。黑曲霉利用糖类发酵产生柠檬酸时需要充足的氧。菌体内铵离子浓度升高时，可解除柠檬酸对其合成途径的反馈抑制。下列说法错误的是(　　)
A．相同菌体密度下，菌球体越大柠檬酸产生速率越慢
B．发酵中期添加一定量的硫酸铵可提高柠檬酸产量
C．发酵过程中pH下降可抑制大部分细菌的生长
D．发酵结束后，将过滤所得的固体物质进行干燥即可获得柠檬酸产品
D　[黑曲霉利用糖类发酵产生柠檬酸时需要充足的氧，相同菌体密度下，菌球体越大越不利于菌体与氧气接触，柠檬酸产生速率越慢，A正确；菌体内铵离子浓度升高时，可解除柠檬酸对其合成途径的反馈抑制，可推出发酵中期添加一定量的硫酸铵可提高菌体内铵离子浓度，从而提高柠檬酸产量，B正确；发酵过程中pH下降导致细菌生命活动所必需的酶失活，可抑制大部分细菌的生长，C正确；柠檬酸属于代谢物，可根据产物的性质采取适当的提取、分离和纯化措施来获得产品，D错误。]
5．(2024·山东潍坊一模)下列有关微生物的分离、培养及计数的相关说法，正确的是(　　)
A．培养霉菌时一般需要将培养基调至中性或弱碱性
B．用平板划线法分离菌种，划线5个区域，接种环需要灼烧灭菌6次
C．用稀释涂布平板法进行微生物计数时，结果往往比实际值偏高
D．接种、分离后使用过的器皿需要先洗涤再彻底灭菌
B　[在培养霉菌时，一般需要将培养基调至酸性，A错误；用平板划线法分离菌种，划线5个区域，每次接种之前需要灼烧接种环灭菌，最后划线完成也需要灼烧灭菌，共需要灼烧灭菌6次，B正确；用稀释涂布平板法进行微生物计数时，统计的菌落数往往比活菌的实际数目少，这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，C错误；微生物实验完成后需要先灭菌后再对相关工具进行洗涤，以免造成环境污染，D错误。]
6．(2024·河北邯郸一模)热环境主要包括陆地热泉和深海热液喷口，高温是限制生命存在的主要因素之一，该环境中同时生存着好氧菌和厌氧菌。下列关于分离高温环境中微生物的操作过程的叙述，正确的是(　　)
A．为增加热泉样品中耐热微生物的数量可在振荡条件下进行培养
B．宜利用琼脂固体培养基分离耐热微生物，分离过程中逐渐提高分离温度
C．热泉样品经过低温保存后，生物多样性可能下降，分离的类群可能减少
D．利用单一培养基和单一培养条件即可分离出热泉样品中的所有菌群
C　[在热泉生活的微生物有好氧菌和厌氧菌两种类型，为增加热泉样品中耐热微生物的数量，可在不同的环境条件下进行培养，以使好氧菌和厌氧菌的数量均有所增加，A错误；琼脂在一定温度下会融化为液体，所以不宜利用琼脂固体培养基分离耐热微生物，B错误；热泉中的微生物具有耐热的特性，某些微生物可能不适应低温的环境条件，样品经过低温保存后，可能会导致部分微生物死亡，从而使生物多样性下降，分离的类群减少，C正确；热泉中的菌群生活条件不一，因此必须用不同的条件进行微生物的分离，利用单一培养基和单一培养条件不能分离出热泉样品中的所有菌群，D错误。]
7．(2024·湖南永州二模)地膜的主要成分是聚乙烯，化学式是(C2H4)n。残留在土壤中的地膜难以被降解，为筛选出高效降解地膜的细菌，研究人员进行了如图所示操作。下列叙述错误的是(　　)
A．富集培养过程中摇床振荡便于微生物获取营养和氧气
B．富集培养后，利用平板划线法将微生物接种于X培养基
C．应挑选降解地膜最高效的细菌⑤接种到Y培养基
D．若要研究目的菌的生长规律，可用细菌计数板计数方法进行计数
B　[富集培养过程中摇床振荡便于微生物与营养物质充分接触，并增加溶氧量，所以摇床振荡便于微生物获取营养和氧气，A正确；富集培养后，利用稀释涂布平板法将微生物接种于X培养基，B错误；抑菌圈越大，说明降解地膜的效果越好，故应挑选⑤中的单菌落接种到Y培养基上，C正确；若要研究目的菌的生长规律，可用细菌计数板计数方法进行计数，D正确。]
8．(2024·山东滨州二模)研究人员拟从新鲜蚯蚓粪中分离筛选出对番茄枯萎病有良好抑制效果的拮抗细菌。将蚯蚓粪加入无菌水中制成悬浮液，利用甲培养基进行筛选纯化后，将获得的不同菌株分别接种至乙培养基扩大培养，48 h后进行“平板对峙实验”：在丙培养基的空白平板一侧放置一直径为5 mm的番茄枯萎病菌菌块，在平行另一侧放置相同大小的滤纸片，实验流程如下图。下列说法错误的是(　　)
A．Ⅰ过程使用的接种方法是平板划线法，Ⅰ～Ⅲ过程均需要无菌操作
B．对照组滤纸片用无菌水处理，实验组滤纸片用拮抗细菌菌液处理
C．应培养至对照组番茄枯萎病菌菌落长满丙培养基时开始测量并计算抑制率
D．选择丙培养基上直径大的番茄枯萎病菌菌落对应的拮抗细菌作为目的菌
D　[据图可知，Ⅰ过程使用的接种方法是平板划线法；微生物分离和培养的关键就是防止杂菌污染，故Ⅰ～Ⅲ过程均需要无菌操作，A正确。本实验的目的是探究拮抗细菌是否对番茄枯萎病有良好抑制效果，故实验组滤纸片用拮抗细菌菌液处理，对照组滤纸片用无菌水处理，B正确。由于对照组没有用拮抗细菌菌液处理，故培养至对照组番茄枯萎病菌菌落长满时，通过对滴加拮抗细菌菌液处理组的统计后，开始测量并计算抑制率，C正确。为达到实验目的，应选择“平板对峙实验”培养后，丙培养基上直径小的番茄枯萎病菌菌落，因为番茄枯萎病菌菌落直径越小，说明拮抗细菌的抑制效果越好，D错误。]
9．(2024·江苏苏州模拟)木质素是植物某些次生细胞壁中的有机物，能被间苯三酚染红。要想获得具有木质素分解能力的大肠杆菌，需要将木质素酶导入受体菌，并用选择培养基筛选所需菌株，下列说法正确的是(　　)
A．可以将目的基因插到T2噬菌体的DNA上，再使其侵染细菌，从而得到目的菌株
B．筛选时培养基中应选择木质素作为唯一碳源，并用间苯三酚染色
C．筛选目的菌株时，透明圈的直径越大，菌株的木质素分解能力越强
D．培养目的菌株时，为防止杂菌污染，可向培养基中加入少量抗生素
B　[T2噬菌体侵染导致细菌裂解，不能得到目的菌株，A错误；木质素是植物某些次生细胞壁中的有机物，能被间苯三酚染红，要想获得具有木质素分解能力的大肠杆菌，筛选时培养基中应选择木质素作为唯一碳源，并用间苯三酚染色，B正确；菌株的木质素分解能力强弱与透明圈直径以及菌落半径有关，故筛选目的菌株时，透明圈直径与菌落半径的比值越大，菌株的木质素分解能力越强，C错误；抗生素会杀死目的菌株(细菌)，所以不能加入抗生素，D错误。]
10．(2024·江苏泰州一模)某种物质A(一种含有C、H、N的有机物)难以降解，会对环境造成污染，只有某些细菌能降解A。研究人员按照如图所示流程从淤泥中分离得到能高效降解A的细菌菌株。图中③将M中的菌液稀释一定倍数后，取0.1 mL涂布到平板上，初步估测摇瓶M中1 mL菌液中细菌数为2.4×108个。下列相关叙述正确的是(　　)
A．实验时，淤泥及盛有培养基的摇瓶通常采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌
B．乙中需要加琼脂和物质A等，实验需设平行重复实验，无需另外设置空白对照
C．③接种方法为稀释涂布平板法，涂布时用涂布器蘸取菌液均匀涂布于平板上
D．若乙平板上菌落数平均为240个，则接种的菌液的稀释倍数为105
D　[淤泥中含有菌种，因此不能进行灭菌处理，盛有培养基的摇瓶通常采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌，A错误；据图分析可知，③是稀释涂布平板法接种到以物质A为唯一碳源和氮源的选择培养基上，因此乙为固体培养基，需要加琼脂和物质A等，为了提高准确度，实验需设平行重复实验，且需要另外设置空白对照，检测培养基配制是否合格，B错误；③接种方法为稀释涂布平板法，涂布时应该将菌液用微量移液管加入培养基中，然后再用涂布器进行均匀涂布，C错误；若乙平板上长出的菌落数平均为240个，假设稀释倍数为a，根据摇瓶M中1 mL菌液中细菌数为2.4×108个，在每个平板上涂布0.1 mL稀释后的菌液，则有240×a÷0.1＝2.4×108，则稀释倍数a＝105，D正确。]
11．(不定项)(2024·湖南师大附中高三模拟)田间常施用的草铵膦(含碳有机物)农药，在环境中难以降解。科学家通过图1所示方法筛选出了可降解草铵膦的植物乳杆菌(ST-3)，并研究了固定态(固定在多孔载体上)和培养液中游离态的ST-3的降解效果，结果如图2所示。下列相关叙述错误的是(　　)
A．图1中②过程可使用无菌水，③④⑤过程应用以草铵膦为唯一碳源的培养基
B．图1中配制好的培养基可放入干热灭菌箱内进行灭菌处理
C．由图2可知，固定态ST-3对土壤中草铵膦的降解效果优于游离态ST-3
D．固定态ST-3降解率高可能是因为载体避免ST-3直接接触高浓度草铵膦
BD　[图1中②过程进行梯度稀释时要使用无菌水，防止引入杂菌，实验目的是筛选出可降解草铵膦的植物乳杆菌，所以③④⑤过程应用以草铵膦为唯一碳源的培养基，A正确；培养基常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌法，B错误；相同时间条件下，固定态ST-3对土壤中草铵膦农药的降解率均高于游离态ST-3，说明固定态ST-3对土壤中草铵膦的降解效果优于游离态ST-3，C正确；固定态ST-3降解率高可能是因为固定化载体可为微生物提供大量的有效接触和附着的表面积，有利于营养物质吸收及代谢废物运输，D错误。]
12．(不定项)(2024·山东聊城一模)黄曲霉毒素是由黄曲霉产生的代谢物，具有极强的毒性和致癌性。科研人员用黄曲霉毒素B(AFB1)的结构类似物——豆香素(C9H6O2)筛选出能高效降解AFB1的菌株，实验过程如下图中的①～④。已知菌体对有机物的降解途径有胞外分泌物降解和菌体吸附降解两种。对降解菌的培养液进行离心，发现上清液中AFB1的残留率明显低于菌悬液中的残留率。检测发现上清液中含有蛋白质K，为验证蛋白质K是降解AFB1的有效成分，进行了实验⑤：在A中加入水解蛋白质K的酶、B中加等量的蒸馏水，充分反应后在两试管中均加入等量的豆香素(C9H6O2)。下列说法错误的是(　　)
A．1号培养基属于选择性培养基，通常需要提前在121 ℃下进行湿热灭菌
B．步骤③使用稀释涂布平板法，目的是筛选出能降解黄曲霉毒素的单菌落
C．实验⑤的结果是A试管中豆香素含量基本不变，B试管中豆香素含量减少
D．蛋白质K属于降解菌产生的胞外分泌物，可以降解培养液中的蛋白质
BD　[1号培养基属于选择性培养基，培养基需要提前在121 ℃下进行湿热灭菌，A正确。结合题图信息分析可知，步骤③接种的培养基中菌落均匀分布，使用的接种方法是稀释涂布平板法，目的是筛选出能降解豆香素的单菌落，B错误。由题干信息可知，A中加入水解蛋白质K的酶，因此A中蛋白质K被分解，不能分解豆香素，豆香素含量基本不变；B中加等量的蒸馏水，B中有蛋白质K，豆香素被分解，含量减少，C正确。上清液中含有蛋白质K，且上清液中AFB1的残留率明显低于菌悬液中的残留率，据此推测蛋白质K属于降解菌产生的胞外分泌物，可以降解培养液中的AFB1，D错误。]
二、非选择题
13．(2024·辽宁名校联盟模考)部分白酒厂的常见白酒酿造工艺流程可简化为图1。浓发酵是指在高浓度的原料中发酵，在规模化生产中，发酵原料浓度的提高能增加生产能力，并具有降低能耗、节约水资源等优点。研究者不断探索能进一步提高发酵原料浓度的发酵工艺，以实现真正意义上的“浓”发酵。回答下列问题：
(1)玉米是东北地区酿制白酒的常用原料，作为培养基的主料主要提供酵母菌所需的碳源。玉米经碾磨后，在“拌料”环节中，除加水外，还应加入其他类型的营养物质如________、________以满足酵母菌的代谢需求，提高发酵效率。
(2)“蒸煮”可以改变淀粉分子结构，有利于淀粉的分解，此外，蒸煮还具有_____________________的作用。
(3)“糖化”环节可以加入黑曲霉菌等菌种，也可以直接加入酶，该环节的目的是____________________________________________。
(4)发酵原料浓度升高，提高了发酵难度，常导致酒精转化效率降低，研究者对此展开了模拟实验：对照组一次性添加27 g/mL浓度的葡萄糖，实验组在酒精发酵的前24 h内分批次每3 h添加3 g/mL浓度的葡萄糖，最终保持两组添加的葡萄糖量相等，定期抽样检测，测定各组葡萄糖、酒精浓度。实验数据如图2所示。
①结果表明，在葡萄糖供应量相等的条件下，分批次添加能提高发酵效率，使酒精产量提高，从培养基理化性质的角度分析，一次性添加过多葡萄糖不利于酒精发酵的原因可能与___________________________________________________
有关。
②为实现浓发酵并提高产量，研究者提出了优化发酵工艺环节的建议：将玉米粒研磨颗粒适当增大、将糖化环节与发酵环节合并为一个环节。根据上述实验结果分析，这些措施能____________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________，
从而在原料浓度高的情况下提高酒精产量。
[解析]　(1)酵母菌代谢时需要水、碳源、氮源及无机盐，因此，酿制白酒时，除了玉米提供碳源及添加了水外，还要添加氮源和无机盐，以满足酵母菌的代谢需求，提高发酵效率。(2)蒸煮可以改变淀粉分子结构，有利于淀粉的分解，由于此过程利用了高温，因此蒸煮还具有灭菌的作用。(3)“糖化”是指淀粉水解成葡萄糖的过程，黑曲霉菌在生活过程中会分泌淀粉酶，因此，“糖化”环节加入黑曲霉菌等菌种，或直接加入酶，都是为了把原料中的淀粉水解成葡萄糖，为酵母菌发酵提供底物。(4)①酿酒时使用的培养基是液体培养基，据图2可知，一次性添加过多葡萄糖时，培养基中葡萄糖浓度很高，使培养基的渗透压也高，这会导致酵母菌吸水减少而影响代谢过程，或者会导致部分酵母菌失水死亡，进而不利于酒精发酵。②将玉米粒研磨颗粒适当增大，则玉米中淀粉与淀粉酶接触概率减小，降低淀粉的水解速度，进而降低发酵液中葡萄糖浓度。将糖化环节与发酵环节合并为一个环节，边糖化边发酵相当于分批补料，使培养液的渗透压不至于太高，有利于发酵。
[答案]　(1)氮源　无机盐　(2)使原料在高温下灭菌　(3)使淀粉水解成葡萄糖，为酵母菌发酵提供底物　(4)①液体培养基渗透压过高
②降低淀粉的水解速度，边糖化边发酵，相当于分批补料，使培养液的渗透压不至于太高，有利于发酵
14．(2024·湖北武汉二模)沙门氏菌是影响畜产品品质的重要病原菌之一。若使用庆大霉素(GM)等抗生素治疗，会有细菌耐药性和抗生素残留等问题。如使用植物乳杆菌等益生菌(可分泌抗菌物质)替代治疗，可有效解决上述问题。已知MRS培养基常用于培养植物乳杆菌。回答下列问题：
(1)为探究LPC(用MRS培养植物乳杆菌后获得的上清液)对沙门氏菌生长的影响，研究人员进行了相关实验，测得不同处理下沙门氏菌的生长曲线如图1所示。需选用物理状态为________(填“液体”或“固体”)的培养基，才能用抽样检测的方法估算沙门氏菌的种群数量。据图1分析，该实验结论为____________________________________________________________________
____________________________________________________________________。
若不改变现有条件，沙门氏菌组继续培养72 h后，种群数量不再增加，限制其种群增长的生物因素是________。
(2)为进一步研究LPC对沙门氏菌的作用机制，对实验组的LPC进行了如下处理：NaOH-LPC(加入NaOH调节pH至近中性)、Heat-LPC(用100 ℃处理15 min)，再采用____________________(方法)接种沙门氏菌进行抑菌圈实验，结果如图2所示。分析设置MRS组的目的是_________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________。
根据实验结果分析，LPC的热稳定性________(填“强”或“弱”)，LPC对沙门氏菌发挥作用的机制：______________________________________________
____________________________________________________________________。
[解析]　(1)需选用物理状态为液体的培养基，才能用抽样检测的方法估算沙门氏菌的种群数量，而且液体培养基有利于菌种与营养物质充分结合，利于其繁殖。据图1分析，与对照组相比，LPC组沙门氏菌的数量显著降低，说明LPC抑制沙门氏菌的生长。若不改变现有条件，沙门氏菌组继续培养72 h后，种群数量不再增加，限制其种群增长的生物因素是空间和资源是有限的，种群数量增多，种内竞争加剧。(2)据图2菌落分布状态可知，采用稀释涂布平板法接种沙门氏菌进行抑菌圈实验。设置MRS组的目的是为排除植物乳杆菌培养液(MRS培养基)对实验结果的影响，使实验结果更加准确。根据实验结果分析，Heat-LPC组与LPC组的抑菌圈大小一致，说明LPC的热稳定强，NaOH-LPC组没有出现抑菌圈，说明近中性条件下LPC没有发挥作用，故推测LPC对沙门氏菌发挥作用的机制可能是因为LPC中含有酸性物质(pH为酸性)，可以起到抑制沙门氏菌生长的作用。
[答案]　(1)液体　LPC抑制沙门氏菌的生长(答出“抑制生长”的意思即可)　种内竞争(加剧)　(2)稀释涂布平板法　为排除植物乳杆菌培养液(MRS培养基)对实验结果的影响　强　可能是因为LPC中含有酸性物质(pH为酸性)，可以起到抑制沙门氏菌生长的作用
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