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命题点专训(十四)
1．(1)PCR　②　(2)固体　含重组质粒(抗潮霉素)的菌株　目的基因成功导入烟草细胞　(3)用一系列浓度的镉处理CK植株、6号植株和7号植株，检测并比较各种处理下3株植物的NtNRAMP表达量
2．(1)3′　提高　(2)Ⅰ、Ⅱ的长度之和与Ⅲ基本相等　(3)使融合基因能够在受体细胞中稳定存在，并遗传给下一代，且使融合基因表达和发挥作用　空白滤纸片、含杂合抗菌肽NK-LPd的滤纸片
3．(1)磷酸二酯　①⑤　(2)RNA聚合酶识别和结合的部位(启动转录过程)　相反　(3)BclⅠ和SmaⅠ　防止酶切后的质粒、目的基因自身环化；保证OsMYB56基因和酶切后的质粒定向连接　T4 DNA连接酶　(4)提取细胞的mRNA，逆转录得到cDNA后进行PCR扩增；根据OsMYB56基因设计探针进行核酸分子杂交检测OsMYB56基因是否成功插入水稻染色体DNA中或者其是否转录出mRNA；通过抗原—抗体杂交技术检测OsMYB56基因是否表达出蛋白质(答出1点即可)命题点专训(十四)　生物技术与工程(非选择题)
1．(2024·广东汕头一模)镉(Cd)是重金属污染物，具有极强毒性。烟草作为重要的经济作物，在生长过程中容易富集Cd，Cd通过烟气进入人体，长期积累可能会引发疾病。NtNRAMP3是定位于液泡膜参与Cd转运的蛋白，研究人员以普通烟草为材料，通过转基因技术研究NtNRAMP基因的功能，为研究烟草在Cd胁迫中的适应机制提供理论基础。回答下列问题：
(1)从数据库获得NtNRAMP基因的序列，设计引物F和R后利用____________技术扩增得到NtNRAMP基因的cDNA片段，测序鉴定。使用AscⅠ、SpeⅠ和DNA连接酶等酶将NtNRAMP基因连接到pCambia300-221质粒的T-DNA区域中(图1为该T-DNA的左边界至右边界)，得到重组质粒pCambia300-NtNRAMP。图示使用AscⅠ、SpeⅠ的过程是________(填图中的数字)。
(2)将pCambia300-NtNRAMP转入农杆菌，培养基中添加了琼脂与潮霉素，两者的作用分别是形成________培养基以便得到单菌落、筛选_______________。含pCambia300-NtNRAMP的农杆菌与烟草愈伤组织共培养，培养后得到12株烟草植株。提取烟草细胞的核DNA用引物F和R进行扩增，对转基因烟草进行鉴定。若扩增到特异性DNA片段，则说明____________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________。
(3)上述烟草植株经PCR检测和电泳后，结果如图2所示：
注：CK为阴性对照；1～12为待检测植株；A为空白对照；B为pCambia300-NtNRAMP。
图2
为进一步研究转基因烟草在不同镉浓度胁迫下的NtNRAMP表达量变化，请从上述植株选取适宜的材料，简要写出实验探究思路：______________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
_________________________________________(要求写出所选3株植株的编号)。
2．(2024·山东德州二模)抗菌肽是一类广泛存在于自然界中的多肽，对细菌、真菌、寄生虫和病毒具有广泛的抑制作用。科研人员将抗菌肽Piscidin基因及NK-lysin基因进行融合形成杂合肽NK-LPd基因(部分过程如图1所示)，从而获得具有更高抗菌活性的杂合抗菌肽。
(1)DNA聚合酶能够从引物的____________(填“3′”或“5′”)端开始连接脱氧核苷酸。若设计的引物较长，为提高PCR的准确度需要适当________(填“提高”或“降低”)复性温度。
(2)图2为PCR1扩增产物(Ⅰ、Ⅱ)和PCR2扩增产物(Ⅲ)的凝胶电泳实验结果，根据结果可说明基因融合成功，判断依据是_______________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________。
(3)在转化前，需要先构建含NK-LPd基因的表达载体，其目的是____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________；
在成功转化的酵母菌中提纯得到杂合抗菌肽NK-LPd，为验证NK-LPd对大肠杆菌的抑菌效果，先将大肠杆菌涂布在图3的平板上，再放置滤纸片。根据图示实验结果推测，在A、D区域放置的滤纸片分别为__________________________。
3．(2024·湖南教学联盟联考)土壤盐渍化影响水稻生长发育，将水稻耐盐碱基因OsMYB56导入不耐盐碱水稻品种吉粳88中，培育耐盐碱水稻新品种，其操作流程及可能用到的限制酶如图，其中bar为抗除草剂基因，Tetr为四环素抗性基因，Ampr为氨苄青霉素抗性基因，①～⑦表示操作过程。请据图回答问题。
限制酶 BamHⅠ BclⅠ SmaⅠ Sac3AⅠ
识别位点及切割位点
(1)过程①利用PCR扩增OsMYB56基因时加入的酶催化________键的形成，还需要添加引物，应选用下列引物组合________。
①5′-CTTGGATGAT-3′
②5′-TAAGTTGTCT-3′
③5′-TAGTAGGTTC-3′
④5′-ATTCAACAGA-3′
⑤5′-TCTGTTGAAT-3′
⑥5′-ATCATCCAAG-3′
(2)根据基因表达载体的结构组成分析，Ti质粒中的CaMV35S的功能是_______________。基因表达载体中，OsMYB56基因和bar基因编码链的方向________(填“相同”或“相反”)。
(3)过程③应选用限制酶______________切割质粒，利用所选限制酶进行操作的优势是______________________________________________________________
_____________________________________________________(答两点)，
切割后需要用________________(写具体名称)进行连接才能获得重组质粒。
(4)若要鉴定OsMYB56基因是否表达，从分子水平上检测的方法有____________________________________________________________________
________________________________________________(答出一种即可)。
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命题点专训(十四)　
生物技术与工程(非选择题)
1．(2024·广东汕头一模)镉(Cd)是重金属污染物，具有极强毒性。烟草作为重要的经济作物，在生长过程中容易富集Cd，Cd通过烟气进入人体，长期积累可能会引发疾病。NtNRAMP3是定位于液泡膜参与Cd转运的蛋白，研究人员以普通烟草为材料，通过转基因技术研究NtNRAMP基因的功能，为研究烟草在Cd胁迫中的适应机制提供理论基础。回答下列问题：
(1)从数据库获得NtNRAMP基因的序列，设计引物F和R后利用_______技术扩增得到NtNRAMP基因的cDNA片段，测序鉴定。使用AscⅠ、SpeⅠ和DNA连接酶等酶将NtNRAMP基因连接到pCambia300-221质粒的T-DNA区域中(图1为该T-DNA的左边界至右边界)，得到重组质粒pCambia300-NtNRAMP。图示使用AscⅠ、SpeⅠ的过程是________(填图中的数字)。
PCR
②
(2)将pCambia300-NtNRAMP转入农杆菌，培养基中添加了琼脂与潮霉素，两者的作用分别是形成________培养基以便得到单菌落、筛选____________________________。含pCambia300-NtNRAMP的农杆菌与烟草愈伤组织共培养，培养后得到12株烟草植株。提取烟草细胞的核DNA用引物F和R进行扩增，对转基因烟草进行鉴定。若扩增到特异性DNA片段，则说明_________________________。
固体
含重组质粒(抗潮霉素)的菌株
目的基因成功导入烟草细胞
(3)上述烟草植株经PCR检测和电泳后，结果如图2所示：
注：CK为阴性对照；1～12为待检测植株；A为空白对照；B为pCambia300-NtNRAMP。
图2
为进一步研究转基因烟草在不同镉浓度胁迫下的NtNRAMP表达量变化，请从上述植株选取适宜的材料，简要写出实验探究思路：___________________________________________________________
_____________________________________(要求写出所选3株植株的编号)。
用一系列浓度的镉处理CK植株、6号植株和7号植株，检测并比较各种处理下3株植物的NtNRAMP表达量
[解析]　(1)扩增DNA片段的方法是PCR技术；基因工程的工具酶有限制酶和DNA连接酶，因此推测AscⅠ、SpeⅠ是限制酶，图中②过程是构建重组质粒的过程，因此②过程用到了AscⅠ、SpeⅠ对目的基因和质粒进行切割。
(2)琼脂的作用是配制固体培养基，便于得到单菌落，根据题意可知，含重组质粒的农杆菌中有潮霉素抗性基因，可在含潮霉素的培养基上生长，因此培养基中加潮霉素的作用是筛选含重组质粒(抗潮霉素)的菌株。提取烟草细胞的核DNA用引物F和R进行扩增，对转基因烟草进行鉴定，可通过对DNA扩增后进行鉴定，若扩增到特异性DNA片段则说明目的基因成功导入烟草细胞。
(3)要研究转基因烟草在不同镉浓度胁迫下的NtNRAMP表达量，需配制一系列浓度的镉溶液，选取图2中的阴性对照植株(CK)作为对照，还需选取具有重组质粒的植株，也就是图中与B条带宽度接近的植株，即6号和7号植株，探究思路为用一系列浓度的镉处理CK植株、6号植株和7号植株，检测并比较各种处理下3株植物的NtNRAMP表达量。
2．(2024·山东德州二模)抗菌肽是一类广泛存在于自然界中的多肽，对细菌、真菌、寄生虫和病毒具有广泛的抑制作用。科研人员将抗菌肽Piscidin基因及NK-lysin基因进行融合形成杂合肽NK-LPd基因(部分过程如图1所示)，从而获得具有更高抗菌活性的杂合抗菌肽。
(1)DNA聚合酶能够从引物的________(填“3′”或“5′”)端开始连接脱氧核苷酸。若设计的引物较长，为提高PCR的准确度需要适当________(填“提高”或“降低”)复性温度。
3′
提高
(2)图2为PCR1扩增产物(Ⅰ、Ⅱ)和PCR2扩增产物(Ⅲ)的凝胶电泳实验结果，根据结果可说明基因融合成功，判断依据是__________________________________。
Ⅰ、Ⅱ的长度之和与Ⅲ基本相等
(3)在转化前，需要先构建含NK-LPd基因的表达载体，其目的是___________________________________________________________
______________________；在成功转化的酵母菌中提纯得到杂合抗菌肽NK-LPd，为验证NK-LPd对大肠杆菌的抑菌效果，先将大肠杆菌涂布在图3的平板上，再放置滤纸片。根据图示实验结果推测，在A、D区域放置的滤纸片分别为
_________________________
_____________________。
使融合基因能够在受体细胞中稳定存在，并遗传给下一代，且使融
合基因表达和发挥作用
空白滤纸片、含杂合抗菌肽
NK-LPd的滤纸片
[解析]　(1)DNA聚合酶在DNA复制过程中，从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸，因为DNA聚合酶只能催化脱氧核苷酸连接到已有的核苷酸片段的3′端上。如果设计的引物较长，那么引物与模板之间的结合会更加稳定，因此需要适当提高复性温度，以确保引物与模板之间的特异性结合。
(2)图2为PCR1扩增产物(Ⅰ、Ⅱ)和PCR2扩增产物(Ⅲ)的凝胶电泳实验结果，根据结果可说明基因融合成功，判断依据是Ⅰ、Ⅱ的长度之和与Ⅲ基本相等。
(3)在转化前，需要先构建含NK-LPd基因的表达载体，其目的是使融合基因能够在受体细胞中稳定存在，并遗传给下一代，且使融合基因表达和发挥作用；在成功转化的酵母菌中提纯得到杂合抗菌肽NK-LPd，为验证NK-LPd对大肠杆菌的抑菌效果，先将大肠杆菌涂布在图3的平板上，再放置滤纸片，根据抑菌圈直径可以判断抑菌效果的强弱，在图3中A区域未出现抑菌圈，推测放置的滤纸片为空白滤纸片，D区域抑菌圈最大，根据题干信息可知，将抗菌肽Piscidin基因及NK-lysin基因进行融合形成杂合肽NK-LPd基因，从而获得具有更高抗菌活性的杂合抗菌肽，所以推测D区域放置的滤纸片为含杂合抗菌肽NK-LPd的滤纸片。
3．(2024·湖南教学联盟联考)土壤盐渍化影响水稻生长发育，将水稻耐盐碱基因OsMYB56导入不耐盐碱水稻品种吉粳88中，培育耐盐碱水稻新品种，其操作流程及可能用到的限制酶如图，其中bar为抗除草剂基因，Tetr为四环素抗性基因，
Ampr为氨苄青霉素抗性基因，①～⑦
表示操作过程。请据图回答问题。
限制酶 BamHⅠ BclⅠ SmaⅠ Sac3AⅠ
识别位点及切割位点
(1)过程①利用PCR扩增OsMYB56基因时加入的酶催化________键的形成，还需要添加引物，应选用下列引物组合________。
①5′-CTTGGATGAT-3′
②5′-TAAGTTGTCT-3′
③5′-TAGTAGGTTC-3′
磷酸二酯
①⑤
④5′-ATTCAACAGA-3′
⑤5′-TCTGTTGAAT-3′
⑥5′-ATCATCCAAG-3′
(2)根据基因表达载体的结构组成分析，Ti质粒中的CaMV35S的功能是___________________________________________。基因表达载体中，OsMYB56基因和bar基因编码链的方向________(填“相同”或“相反”)。
RNA聚合酶识别和结合的部位(启动转录过程)
相反
(3)过程③应选用限制酶______________切割质粒，利用所选限制酶进行操作的优势是__________________________________________
______________________________________(答两点)，切割后需要用________________(写具体名称)进行连接才能获得重组质粒。
BclⅠ和SmaⅠ
防止酶切后的质粒、目的基因自身环化；保证
OsMYB56基因和酶切后的质粒定向连接
T4 DNA连接酶
(4)若要鉴定OsMYB56基因是否表达，从分子水平上检测的方法有___________________________________________________________
___________________________________________________________
___________________________________________________________
___________________________________________________________
(答出一种即可)。
提取细胞的mRNA，逆转录得到cDNA后进行PCR扩增；根据OsMYB56基因设计探针进行核酸分子杂交检测OsMYB56基因是否成功插入水稻染色体DNA中或者其是否转录出mRNA；通过抗原—抗体杂交技术检测OsMYB56基因是否表达出蛋白质(答出1点即可)
[解析]　(1)过程①PCR扩增OsMYB56基因时加入的酶是耐高温的DNA聚合酶，该酶能催化磷酸二酯键的形成。在进行PCR操作时，引物应分别与基因两条链的3′端根据碱基互补配对原则结合，根据图中两端序列，通常选择5′-CTTGGATGAT-3′(上面链的引物)和5′-TCTGTTGAAT-3′(下面链的引物)作为引物对，①⑤正确。
(2)基因表达载体的结构应该包括启动子、终止子、复制原点、限制酶切割位点、标记基因等，由图可知CaMV35S是启动子，功能是RNA聚合酶识别和结合的位点。RNA聚合酶的移动方向是从启动子移向终止子，故两个基因编码链方向相反。
(3)据图可知，质粒中的两个标记基因Tetr和Ampr中都含有限制酶BamHⅠ的识别序列，如果用限制酶BamHⅠ，会破坏质粒中的两个标记基因，为防止质粒自身环化，保证OsMYB56基因和酶切后的质粒定向连接，需要用双酶切，因此过程③可以选择限制酶BclⅠ和SmaⅠ。酶切后的质粒和目的基因片段，通过T4 DNA连接酶作用后获得重组质粒。
(4)分子水平检测OsMYB56基因是否表达，可以检测基因是否转录形成RNA或翻译成蛋白质，因此方法如下：可以提取细胞的mRNA，逆转录得到cDNA后进行PCR扩增；根据OsMYB56基因设计探针进行核酸分子杂交检测OsMYB56基因是否成功插入水稻染色体DNA中或者其转录出mRNA；通过抗原—抗体杂交技术检测OsMYB56基因是否表达出蛋白质。
(教师用书独具)
1．(2024·江苏南通调研)1965年中国科学家人工合成了具有生物活性的结晶牛胰岛素，摘取了人工合成蛋白质的桂冠，下图是利用基因工程生产人胰岛素过程中使用的质粒及目的基因的部分结构。请回答下列问题：
(1)质粒上ori序列的碱基特点是________比值较高，图示胰岛素基因的转录以________链作为模板。
(2)在设计PCR引物时最好在引物的________端添加限制酶______________的识别序列，PCR反应体系中引物的延伸需要Taq DNA聚合酶，此酶需要________(离子)的激活。
A和T
B
5′
XhoⅠ和MunⅠ
Mg2+
(3)科学家运用大引物PCR定点突变技术对胰岛素第28位氨基酸实现了替换，获得了速效胰岛素类似物产品。相关原理如图所示。
①第一次PCR至少需要________个循环才能获得相应的大引物模板，第二次PCR应选用大引物两条链中的________(填“A”或“B”)，若第二次PCR计划循环n次，至少需要大引物________个。
②β-半乳糖苷酶可以分解无色的X-gal产生蓝色物质使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。将转化后的大肠杆菌接种到添加了__________________的培养基上，若观察到菌落呈现白色，则表明______________________________________。
2
B
2n－1
氨苄青霉素和X-gal
该菌落即为含有重组质粒的大肠杆菌菌落
[解析]　(1)复制原点ori处的A和T特别多，相对氢键少，不稳定，DNA容易解旋，因此就容易和引物结合，成为复制的起点。 在转录过程中，DNA模板被转录方向是从3′端向5′端，3′端是—OH端，因此图示胰岛素基因的转录以B链作为模板。
(2)由图可知，对于目的基因，SalⅠ和NheⅠ的作用位点在目的基因的中间，会破坏目的基因，则在引物设计时不能选用这两种限制酶，那么只能在XhoⅠ、MunⅠ和EcoRⅠ中选择；同时质粒上EcoRⅠ的其中一个作用位点是在标记基因上，所以只能选择XhoⅠ和MunⅠ两种限制酶，则需要在设计PCR引物时可添加限制酶XhoⅠ和MunⅠ的识别序列，因为DNA合成时，新链的延伸方向是5′→3′，因此，设计PCR引物时需要在5′端加上酶切位点。PCR反应体系中引物的延伸需要Taq DNA聚合酶，此酶需要Mg2+的激活。
(3)①据图可知，第一次PCR时以突变上游引物进行PCR，循环一次，可得到一个 ，再循环一次，即可得到 ，即第一次PCR至少需要2个循环才能获得相应的大引物模板。DNA聚合酶只能从引物3′端开始延伸DNA链，因此第二次PCR应选用大引物两条链中的B链。若第二次PCR计划循环n次，可得到2n个DNA分子，需要引物2n×2－2个，由于第二次PCR时，需要大引物和常规上游引物，各占一半，因此至少需要大引物(2n×2－2)/2＝2n－1个。
②结合图示可知，目的基因插入的位置是在lacZ基因中，会破坏lacZ基因的结构，不能产生β-半乳糖苷酶，根据题干信息“β-半乳糖苷酶可以分解无色的X-gal产生蓝色物质”可知，目的基因插入破坏了lacZ基因的结构，使其不能正常表达产生β-半乳糖苷酶，底物X-gal不会被分解，所以筛选导入重组质粒的大肠杆菌时，在添加了氨苄青霉素和X-gal的培养基上应选择白色的菌落。
2．(2024·河北邢台模拟)研究低温条件下番茄细胞WHYI基因对光合作用的影响，对于温度敏感型蔬菜作物的栽培具有重要的实践意义。回答下列问题：
(1)研究人员利用重组DNA 技术，将克隆的WHYI基因与外源高效启动子连接，导入番茄基因组中构建WHYI基因的过表达植株(W＋)，如图1所示。启动子是识别、结合______________酶的部位。若限制酶切割WHYI 基因和番茄基因组后形成相同的黏性末端(即图中Ⅰ、Ⅱ处)，则会出现_________________________________
_____________________(答出2点)等情
况，从而导致构建过表达植株的成功
率下降。
RNA聚合
WHYI基因自身环化、WHYI基因与番茄基因组反向连接
(2)PCR 的产物一般通过电泳来鉴定，结果如图2所示。1号泳道为标准，2号泳道为阳性对照(提纯的相关蛋白基因片段)，3号泳道为实验组。1 号泳道的条带实质为__________________________，若3号泳道有杂带(非目的 DNA 片段)出现，则原因可能是____________
_______________________________
_____________________(答出2 点)。
不同已知长度的DNA片段
作为模板的
DNA受到污染；引物的特异性不强，
使模板与多个引物结合
(3)小干扰RNA(siRNA)能诱导特定基因转录出的 mRNA降解，导致基因沉默。研究人员据此构建了WHYI基因的沉默植株(W－)，siRNA 因阻断了________过程而关闭了WHYI基因。进一步研究发现，番茄细胞WHYI基因影响光反应阶段 D1 蛋白(可捕捉光能)的含量，且与温度有关。研究人员用特定抗体检测D1蛋白在叶绿体内的含量，结果如表所示。该实验中的自变量为____________________________，对比三种番茄的D1蛋白含量可得到的结论是_____________________________________________
_______________________________________________________________
_____________________________________。
翻译
温度、WHYI基因的表达程度
在25 ℃条件下，WHYI基因对D1蛋白的合成无
影响；在4 ℃条件下，WHYI基因能促进D1蛋白的合成，且D1蛋白
的含量与WHYI基因的表达程度有关
[解析]　(1)启动子是识别、结合RNA聚合酶的部位。若限制酶切割WHYI基因和番茄基因组后形成相同的黏性末端，则会出现WHYI基因自身环化、WHYI基因与番茄基因组反向连接等情况，从而导致构建过表达植株的成功率下降。
(2)电泳鉴定DNA片段的实质是根据不同DNA分子的迁移速率、DNA分子的大小和构象不同而将DNA片段分离开来，因此1号泳道作为电泳道的标准，其本质就是不同已知长度的DNA片段。PCR过程中，作为模板的DNA受到污染，或引物的特异性不强，使模板与多个引物结合，均会扩增出多条不同长度或构象的DNA片段，从而在电泳过程中出现多条电泳带。
(3)由题可知，在25 ℃条件下，W＋、W、W－的D1蛋白含量相同，说明在 25 ℃条件下，WHYI基因对D1蛋白合成无影响。在4 ℃条件下，W＋、W、W－的D1蛋白含量从大到小为W＋>W>W－，说明在4 ℃条件下，WHYI基因能促进D1蛋白的合成，且WHYI基因的表达程度越高，D1蛋白的含量越多。命题点专训(十四)　生物技术与工程(非选择题)
1．(2024·广东汕头一模)镉(Cd)是重金属污染物，具有极强毒性。烟草作为重要的经济作物，在生长过程中容易富集Cd，Cd通过烟气进入人体，长期积累可能会引发疾病。NtNRAMP3是定位于液泡膜参与Cd转运的蛋白，研究人员以普通烟草为材料，通过转基因技术研究NtNRAMP基因的功能，为研究烟草在Cd胁迫中的适应机制提供理论基础。回答下列问题：
(1)从数据库获得NtNRAMP基因的序列，设计引物F和R后利用________________技术扩增得到NtNRAMP基因的cDNA片段，测序鉴定。使用AscⅠ、SpeⅠ和DNA连接酶等酶将NtNRAMP基因连接到pCambia300-221质粒的T-DNA区域中(图1为该T-DNA的左边界至右边界)，得到重组质粒pCambia300-NtNRAMP。图示使用AscⅠ、SpeⅠ的过程是________(填图中的数字)。
(2)将pCambia300-NtNRAMP转入农杆菌，培养基中添加了琼脂与潮霉素，两者的作用分别是形成________培养基以便得到单菌落、筛选____________________________。含pCambia300-NtNRAMP的农杆菌与烟草愈伤组织共培养，培养后得到12株烟草植株。提取烟草细胞的核DNA用引物F和R进行扩增，对转基因烟草进行鉴定。若扩增到特异性DNA片段，则说明____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________。
(3)上述烟草植株经PCR检测和电泳后，结果如图2所示：
注：CK为阴性对照；1～12为待检测植株；A为空白对照；B为pCambia300-NtNRAMP。
图2
为进一步研究转基因烟草在不同镉浓度胁迫下的NtNRAMP表达量变化，请从上述植株选取适宜的材料，简要写出实验探究思路：____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
______________________________________(要求写出所选3株植株的编号)。
[解析]　(1)扩增DNA片段的方法是PCR技术；基因工程的工具酶有限制酶和DNA连接酶，因此推测AscⅠ、SpeⅠ是限制酶，图中②过程是构建重组质粒的过程，因此②过程用到了AscⅠ、SpeⅠ对目的基因和质粒进行切割。(2)琼脂的作用是配制固体培养基，便于得到单菌落，根据题意可知，含重组质粒的农杆菌中有潮霉素抗性基因，可在含潮霉素的培养基上生长，因此培养基中加潮霉素的作用是筛选含重组质粒(抗潮霉素)的菌株。提取烟草细胞的核DNA用引物F和R进行扩增，对转基因烟草进行鉴定，可通过对DNA扩增后进行鉴定，若扩增到特异性DNA片段则说明目的基因成功导入烟草细胞。(3)要研究转基因烟草在不同镉浓度胁迫下的NtNRAMP表达量，需配制一系列浓度的镉溶液，选取图2中的阴性对照植株(CK)作为对照，还需选取具有重组质粒的植株，也就是图中与B条带宽度接近的植株，即6号和7号植株，探究思路为用一系列浓度的镉处理CK植株、6号植株和7号植株，检测并比较各种处理下3株植物的NtNRAMP表达量。
[答案]　(1)PCR　②　(2)固体　含重组质粒(抗潮霉素)的菌株　目的基因成功导入烟草细胞
(3)用一系列浓度的镉处理CK植株、6号植株和7号植株，检测并比较各种处理下3株植物的NtNRAMP表达量
2．(2024·山东德州二模)抗菌肽是一类广泛存在于自然界中的多肽，对细菌、真菌、寄生虫和病毒具有广泛的抑制作用。科研人员将抗菌肽Piscidin基因及NK-lysin基因进行融合形成杂合肽NK-LPd基因(部分过程如图1所示)，从而获得具有更高抗菌活性的杂合抗菌肽。
(1)DNA聚合酶能够从引物的________(填“3′”或“5′”)端开始连接脱氧核苷酸。若设计的引物较长，为提高PCR的准确度需要适当________(填“提高”或“降低”)复性温度。
(2)图2为PCR1扩增产物(Ⅰ、Ⅱ)和PCR2扩增产物(Ⅲ)的凝胶电泳实验结果，根据结果可说明基因融合成功，判断依据是____________________________________________________________________
____________________________________________________________________。
(3)在转化前，需要先构建含NK-LPd基因的表达载体，其目的是____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________；
在成功转化的酵母菌中提纯得到杂合抗菌肽NK-LPd，为验证NK-LPd对大肠杆菌的抑菌效果，先将大肠杆菌涂布在图3的平板上，再放置滤纸片。根据图示实验结果推测，在A、D区域放置的滤纸片分别为____________________________________________________________________
____________________________________________________________________。
[解析]　(1)DNA聚合酶在DNA复制过程中，从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸，因为DNA聚合酶只能催化脱氧核苷酸连接到已有的核苷酸片段的3′端上。如果设计的引物较长，那么引物与模板之间的结合会更加稳定，因此需要适当提高复性温度，以确保引物与模板之间的特异性结合。(2)图2为PCR1扩增产物(Ⅰ、Ⅱ)和PCR2扩增产物(Ⅲ)的凝胶电泳实验结果，根据结果可说明基因融合成功，判断依据是Ⅰ、Ⅱ的长度之和与Ⅲ基本相等。(3)在转化前，需要先构建含NK-LPd基因的表达载体，其目的是使融合基因能够在受体细胞中稳定存在，并遗传给下一代，且使融合基因表达和发挥作用；在成功转化的酵母菌中提纯得到杂合抗菌肽NK-LPd，为验证NK-LPd对大肠杆菌的抑菌效果，先将大肠杆菌涂布在图3的平板上，再放置滤纸片，根据抑菌圈直径可以判断抑菌效果的强弱，在图3中A区域未出现抑菌圈，推测放置的滤纸片为空白滤纸片，D区域抑菌圈最大，根据题干信息可知，将抗菌肽Piscidin基因及NK-lysin基因进行融合形成杂合肽NK-LPd基因，从而获得具有更高抗菌活性的杂合抗菌肽，所以推测D区域放置的滤纸片为含杂合抗菌肽NK-LPd的滤纸片。
[答案]　(1)3′　提高　(2)Ⅰ、Ⅱ的长度之和与Ⅲ基本相等　(3)使融合基因能够在受体细胞中稳定存在，并遗传给下一代，且使融合基因表达和发挥作用　空白滤纸片、含杂合抗菌肽NK-LPd的滤纸片
3．(2024·湖南教学联盟联考)土壤盐渍化影响水稻生长发育，将水稻耐盐碱基因OsMYB56导入不耐盐碱水稻品种吉粳88中，培育耐盐碱水稻新品种，其操作流程及可能用到的限制酶如图，其中bar为抗除草剂基因，Tetr为四环素抗性基因，Ampr为氨苄青霉素抗性基因，①～⑦表示操作过程。请据图回答问题。
限制酶 BamHⅠ BclⅠ SmaⅠ Sac3AⅠ
识别位点及切割位点
(1)过程①利用PCR扩增OsMYB56基因时加入的酶催化________键的形成，还需要添加引物，应选用下列引物组合________。
①5′-CTTGGATGAT-3′
②5′-TAAGTTGTCT-3′
③5′-TAGTAGGTTC-3′
④5′-ATTCAACAGA-3′
⑤5′-TCTGTTGAAT-3′
⑥5′-ATCATCCAAG-3′
(2)根据基因表达载体的结构组成分析，Ti质粒中的CaMV35S的功能是_____________________。基因表达载体中，OsMYB56基因和bar基因编码链的方向________(填“相同”或“相反”)。
(3)过程③应选用限制酶______________切割质粒，利用所选限制酶进行操作的优势是______________________________________________________________
____________________________________________________________________
__________________________________________________________(答两点)，切割后需要用________________(写具体名称)进行连接才能获得重组质粒。
(4)若要鉴定OsMYB56基因是否表达，从分子水平上检测的方法有____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
__________________________________________________(答出一种即可)。
[解析]　(1)过程①PCR扩增OsMYB56基因时加入的酶是耐高温的DNA聚合酶，该酶能催化磷酸二酯键的形成。在进行PCR操作时，引物应分别与基因两条链的3′端根据碱基互补配对原则结合，根据图中两端序列，通常选择5′-CTTGGATGAT-3′(上面链的引物)和5′-TCTGTTGAAT-3′(下面链的引物)作为引物对，①⑤正确。(2)基因表达载体的结构应该包括启动子、终止子、复制原点、限制酶切割位点、标记基因等，由图可知CaMV35S是启动子，功能是RNA聚合酶识别和结合的位点。RNA聚合酶的移动方向是从启动子移向终止子，故两个基因编码链方向相反。(3)据图可知，质粒中的两个标记基因Tetr和Ampr中都含有限制酶BamHⅠ的识别序列，如果用限制酶BamHⅠ，会破坏质粒中的两个标记基因，为防止质粒自身环化，保证OsMYB56基因和酶切后的质粒定向连接，需要用双酶切，因此过程③可以选择限制酶BclⅠ和SmaⅠ。酶切后的质粒和目的基因片段，通过T4 DNA连接酶作用后获得重组质粒。(4)分子水平检测OsMYB56基因是否表达，可以检测基因是否转录形成RNA或翻译成蛋白质，因此方法如下：可以提取细胞的mRNA，逆转录得到cDNA后进行PCR扩增；根据OsMYB56基因设计探针进行核酸分子杂交检测OsMYB56基因是否成功插入水稻染色体DNA中或者其转录出mRNA；通过抗原—抗体杂交技术检测OsMYB56基因是否表达出蛋白质。
[答案]　(1)磷酸二酯　①⑤　(2)RNA聚合酶识别和结合的部位(启动转录过程)　相反
(3)BclⅠ和SmaⅠ　防止酶切后的质粒、目的基因自身环化；保证OsMYB56基因和酶切后的质粒定向连接　T4 DNA连接酶　(4)提取细胞的mRNA，逆转录得到cDNA后进行PCR扩增；根据OsMYB56基因设计探针进行核酸分子杂交检测OsMYB56基因是否成功插入水稻染色体DNA中或者其是否转录出mRNA；通过抗原—抗体杂交技术检测OsMYB56基因是否表达出蛋白质(答出1点即可)
(教师用书独具)
1．(2024·江苏南通调研)1965年中国科学家人工合成了具有生物活性的结晶牛胰岛素，摘取了人工合成蛋白质的桂冠，下图是利用基因工程生产人胰岛素过程中使用的质粒及目的基因的部分结构。请回答下列问题：
(1)质粒上ori序列的碱基特点是________比值较高，图示胰岛素基因的转录以________链作为模板。
(2)在设计PCR引物时最好在引物的________端添加限制酶______________的识别序列，PCR反应体系中引物的延伸需要Taq DNA聚合酶，此酶需要________(离子)的激活。
(3)科学家运用大引物PCR定点突变技术对胰岛素第28位氨基酸实现了替换，获得了速效胰岛素类似物产品。相关原理如图所示。
①第一次PCR至少需要________个循环才能获得相应的大引物模板，第二次PCR应选用大引物两条链中的________(填“A”或“B”)，若第二次PCR计划循环n次，至少需要大引物________个。
②β-半乳糖苷酶可以分解无色的X-gal产生蓝色物质使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。将转化后的大肠杆菌接种到添加了__________________的培养基上，若观察到菌落呈现白色，则表明____________________________。
[解析]　(1)复制原点ori处的A和T特别多，相对氢键少，不稳定，DNA容易解旋，因此就容易和引物结合，成为复制的起点。 在转录过程中，DNA模板被转录方向是从3′端向5′端，3′端是—OH端，因此图示胰岛素基因的转录以B链作为模板。(2)由图可知，对于目的基因，SalⅠ和NheⅠ的作用位点在目的基因的中间，会破坏目的基因，则在引物设计时不能选用这两种限制酶，那么只能在XhoⅠ、MunⅠ和EcoRⅠ中选择；同时质粒上EcoRⅠ的其中一个作用位点是在标记基因上，所以只能选择XhoⅠ和MunⅠ两种限制酶，则需要在设计PCR引物时可添加限制酶XhoⅠ和MunⅠ的识别序列，因为DNA合成时，新链的延伸方向是5′→3′，因此，设计PCR引物时需要在5′端加上酶切位点。PCR反应体系中引物的延伸需要Taq DNA聚合酶，此酶需要Mg2+的激活。(3)①据图可知，第一次PCR时以突变上游引物进行PCR，循环一次，可得到一个，再循环一次，即可得到，即第一次PCR至少需要2个循环才能获得相应的大引物模板。DNA聚合酶只能从引物3′端开始延伸DNA链，因此第二次PCR应选用大引物两条链中的B链。若第二次PCR计划循环n次，可得到2n个DNA分子，需要引物2n×2－2个，由于第二次PCR时，需要大引物和常规上游引物，各占一半，因此至少需要大引物(2n×2－2)/2＝2n－1个。②结合图示可知，目的基因插入的位置是在lacZ基因中，会破坏lacZ基因的结构，不能产生β-半乳糖苷酶，根据题干信息“β-半乳糖苷酶可以分解无色的X-gal产生蓝色物质”可知，目的基因插入破坏了lacZ基因的结构，使其不能正常表达产生β-半乳糖苷酶，底物X-gal不会被分解，所以筛选导入重组质粒的大肠杆菌时，在添加了氨苄青霉素和X-gal的培养基上应选择白色的菌落。
[答案]　(1)A和T　B　(2)5′　XhoⅠ和MunⅠ　Mg2+　(3)①2　B　2n－1　②氨苄青霉素和X-gal　该菌落即为含有重组质粒的大肠杆菌菌落
2．(2024·河北邢台模拟)研究低温条件下番茄细胞WHYI基因对光合作用的影响，对于温度敏感型蔬菜作物的栽培具有重要的实践意义。回答下列问题：
(1)研究人员利用重组DNA 技术，将克隆的WHYI基因与外源高效启动子连接，导入番茄基因组中构建WHYI基因的过表达植株(W＋)，如图1所示。启动子是识别、结合___________________酶的部位。若限制酶切割WHYI 基因和番茄基因组后形成相同的黏性末端(即图中Ⅰ、Ⅱ处)，则会出现____________________________________________________________________
___________________________________________________________(答出2点)
等情况，从而导致构建过表达植株的成功率下降。
(2)PCR 的产物一般通过电泳来鉴定，结果如图2所示。1号泳道为标准，2号泳道为阳性对照(提纯的相关蛋白基因片段)，3号泳道为实验组。1 号泳道的条带实质为__________________________，若3号泳道有杂带(非目的 DNA 片段)出现，则原因可能是_________________________________________________
________________________________________________________(答出2 点)。
(3)小干扰RNA(siRNA)能诱导特定基因转录出的 mRNA降解，导致基因沉默。研究人员据此构建了WHYI基因的沉默植株(W－)，siRNA 因阻断了________过程而关闭了WHYI基因。进一步研究发现，番茄细胞WHYI基因影响光反应阶段 D1 蛋白(可捕捉光能)的含量，且与温度有关。研究人员用特定抗体检测D1蛋白在叶绿体内的含量，结果如表所示。该实验中的自变量为____________________________，对比三种番茄的D1蛋白含量可得到的结论是____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________。
[解析]　(1)启动子是识别、结合RNA聚合酶的部位。若限制酶切割WHYI基因和番茄基因组后形成相同的黏性末端，则会出现WHYI基因自身环化、WHYI基因与番茄基因组反向连接等情况，从而导致构建过表达植株的成功率下降。(2)电泳鉴定DNA片段的实质是根据不同DNA分子的迁移速率、DNA分子的大小和构象不同而将DNA片段分离开来，因此1号泳道作为电泳道的标准，其本质就是不同已知长度的DNA片段。PCR过程中，作为模板的DNA受到污染，或引物的特异性不强，使模板与多个引物结合，均会扩增出多条不同长度或构象的DNA片段，从而在电泳过程中出现多条电泳带。(3)由题可知，在25 ℃条件下，W＋、W、W－的D1蛋白含量相同，说明在 25 ℃条件下，WHYI基因对D1蛋白合成无影响。在4 ℃条件下，W＋、W、W－的D1蛋白含量从大到小为W＋>W>W－，说明在4 ℃条件下，WHYI基因能促进D1蛋白的合成，且WHYI基因的表达程度越高，D1蛋白的含量越多。
[答案]　(1)RNA聚合　WHYI基因自身环化、WHYI基因与番茄基因组反向连接　(2)不同已知长度的DNA片段　作为模板的DNA受到污染；引物的特异性不强，使模板与多个引物结合　(3)翻译　温度、WHYI基因的表达程度　在25 ℃条件下，WHYI基因对D1蛋白的合成无影响；在4 ℃条件下，WHYI基因能促进D1蛋白的合成，且D1蛋白的含量与WHYI基因的表达程度有关
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