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第二节 基因工程的基本操作程序
第一课时
人教版高中生物学教材《生物技术与工程》（选择性必修三）第三章
与载体拼接
普通棉花
（无抗虫特性）
棉花细胞
抗虫棉
（有抗虫特性）
导入
抗虫基因
重组DNA分子
培育转基因抗虫棉的简要过程
1.目的基因的筛选与获取
2.基因表达载体的构建
3.将目的基因导入受体细胞
4.目的基因的 检测与鉴定
苏云金杆菌
基因工程的基本操作程序（4个步骤）
1
2
3
4
目的基因的筛选与获取
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
目的基因的检测与鉴定
目的基因的筛选与获取
一、目的基因
（1）概念：
用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因；
与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。（Bt抗虫蛋白基因：转基因抗虫棉）。
主要是编码特定蛋白质的基因，也可以是具有调控作用的因子
（2）实例：
目的基因的筛选与获取
二、筛选合适的目的基因
方法：从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选。
DNA测序仪
核苷酸序列比对
氨基酸序列比对
美国国家生物信息中心
越来越多基因的功能和结构被分析。
一、目的基因的获取
目的基因：主要指编码蛋白质的基因
一、目的基因的获取
一、目的基因的获取—从基因文库中获取目的基因
基因文库：
将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。
重难点解析
基因文库
将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。
① 概念
② 分类:按外源DNA片段的来源分类
种类
部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因，
如：cDNA文库
基因组文库： 含有一种生物的全部基因
选修3
P10
考
点
1.建立基因文库
（1）建立基因组文库
某生物所有的DNA
基因组所有基因
每个基因和运载体结合形成重组DNA分子
导入受体菌
基因组文库
特定的限制性内切核酸酶
一、从基因文库中获取目的基因
1.建立基因文库
（1）建立基因组文库
缺点：工作量大，盲目性强
适用：原核生物、病毒等
一、从基因文库中获取目的基因
1.建立基因文库
（2）建立cDNA文库
请写出由mRNA反转录形成的cDNA的过程
成熟的mRNA
单链DNA
双链DNA分子（cDNA）
一、从基因文库中获取目的基因
逆转录酶
DNA聚合酶
一、从基因文库中获取目的基因
1.建立基因文库
（2）建立cDNA文库
某种生物的单链mRNA
单链互补DNA
双链cDNA片段
导入受体菌株中储存
逆转录酶
DNA聚合酶
逆转录酶
与载体连接
cDNA文库
特点：cDNA是不含内含子和非编码区
基因组文库
cDNA文库
基因组文库 VS cDNA文库
归纳对比
{5C22544A-7EE6-4342-B048-85BDC9FD1C3A}文库类型
cDNA文库
基因组文库
文库大小
小
大
启动子
无
有
内含子
无
有
基因多少
某种生物部分基因
某种生物全部基因
物种间的
基因交流
可以
部分基因可以
为什么要构建基因文库？
寻根问底
提示：构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并不是唯一的方式。
如果所需要的目的基因序列已知，就可以通过PCR方式从含有该基因的生物的DNA中，直接获得，也可以通过反转录，用PCR方式从mRNA中获得，不一定要构建基因文库。但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想从一种生物体内获得许多基因，或者想知道这种生物与另一种生物之间有多少基因不同，或者想知道一种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同，或者想得到一种生物的全基因组序列，往往就需要构建基因文库。
1
怎么获取？怎么扩增？
寻根问底
2
1. 怎样从基因文库中得到我们所需要的目的基因呢？
一般是根据目的基因的有关信息，如基因的核苷酸序列、基因的功能、 基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA，以及基因的表达产物蛋白质等特性来获取目的基因。
2. 怎样大量扩增我们所得到的目的基因呢？
利用PCR技术扩增目的基因
选修3
P9
利用PCR技术扩增目的基因
获取目的基因
2
① 概念：PCR是在生物______复制__________________的
核酸合成技术（又称为多聚合酶链式反应）
② 原理：____________________
③ 前提：________________________________
④ 条件： ___________、______________________、
___________ 、_____________________。
体外
特定DNA片段
DNA双链复制原理
模板DNA
四种脱氧核苷酸
引物
热稳定DNA聚合酶
一段已知目的基因的核苷酸序列
引物：是指能与DNA母链一段碱基序列互补配对的一小段DNA或RNA。
使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸。
利用PCR技术扩增目的基因
获取目的基因
2
⑤过程：
DNA聚合酶特性：不能从头合成DNA，只能从DNA的3′端开始延伸DNA链，
因此，需要引物。
引物：是指能与DNA母链一段碱基序列互补配对的一小段DNA或RNA。使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸。
变性：90度以上加热至90～95℃
复性：50度左右冷却至55～60℃
延伸：加热至72℃左右 70～75℃
靶序列
靶序列
目的基因的双链模板在热力作用下， 断裂，形成单链DNA;
氢键
（加热至90～95℃）
PCR 循环第一步：高温变性
靶序列
靶序列
引物 Ⅰ
引物 Ⅱ
5’
3’
5’
5’
3’
5’
3’
3’
与单链模板相应互补序列结合
引物
（冷却至55～60℃）
PCR 循环第二步 ：引物与靶序列复性
靶序列
靶序列
引物Ⅰ
引物Ⅱ
5’
3’
5’
5’
3’
5’
3’
3’
Taq DNA
聚合酶
在 作用下进行延伸。
DNA聚合酶（Taq酶）
（加热至70～75℃）
PCR 循环第三步 ：引物延伸
PCR技术 VS DNA复制
归纳对比
{5C22544A-7EE6-4342-B048-85BDC9FD1C3A}
PCR技术
DNA复制
相同点
原 理
碱基互补配对
原 料
四种脱氧核苷酸
条 件
模板、能量、酶
不同点
解旋方式
DNA在高温下变性解旋
解旋酶催化
场 所
体外复制
细胞核内
酶
热稳定的DNA聚合酶
细胞内的DNA聚合酶
结 果
大量的DNA片段
形成2个完整的DNA分子
目的基因以指数形式在短时间内大量扩增。
1. 如果基因比较小，核苷酸序列又已知，可以通过
什么方法获取目的基因？
深入思考：
可以通过DNA合成仪用
化学方法直接人工合成。
用化学方法人工合成
获取目的基因
3
逆转录法
目的基因的mRNA
双链DNA
（目的基因)
化学合成法
蛋白质的氨基酸序列
mRNA序列
基因的核苷酸序列
目的基因
人工合成
逆转录酶
推测
推测
单链DNA
DNA聚合酶
对点练：利用PCR获得和扩增目的基因
01
【素养提升③】引物的设计：
1．PCR扩增的 (填“是”或“不是”)
完整的模板DNA分子，
理由是 。
2．如果已知某目的基因的序列和结构，利用PCR筛选和扩增出该目的基因的关键是 。
3.要保证目的基因能与载体相连接，要在两种引物的 分别
添加上 。
不是
PCR扩增的仅仅是两种引物之间所对应的特定DNA片段
根据目的基因两端（ ′端）的核苷酸序列设计引物
5′端
限制酶的识别序列
3
对点练：利用PCR获得和扩增目的基因
01
【素养提升③】引物的设计：
4.图2是某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理，
第1组不合理的原因： 。
第2组不合理的原因： 。
引物Ⅰ和引物Ⅱ会因局部发生碱基互补配对而失效
引物Ⅰ′自身折叠后会因出现局部碱基互补配对而失效
设计引物的原则：
①两种引物之间:
；
②每种引物内部:
；
不能在局部发生碱基互补配对
不能在局部发生碱基互补配对

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