资源简介

(共24张PPT)
3.2 基因工程的基本操作程序
Bt基因
Bt抗虫蛋白
表达
与表面受体结合
细胞膜穿孔
破坏细胞渗透平衡
最终导致昆虫停止取食而死亡
昆虫肠上皮细胞
传统的杂交育种方法可以培养出抗虫棉吗？
×
导入
棉花细胞
培育
抗虫棉
基因工程
培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤
苏云金杆菌
与载体拼接
普通棉花
（无抗虫特性）
棉花细胞
抗虫棉
提取
表达Bt基因
导入
Bt基因
重组DNA分子
培育转基因抗虫棉的简要过程
1.目的基因的筛选与获取
2.基因表达载体的构建
3.将目的基因导入受体细胞
4.目的基因的 检测与鉴定
定义：
在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状的或获得预期表达产物的基因。
目的基因
受体细胞
目的基因主要是指编码蛋白质的基因
抗逆性基因
生产药物基因
毒物降解基因
工业用酶基因
一、目的基因的筛选与获取
（一）目的基因
筛选方法：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选
（二）目的基因的筛选
①序列数据库，如美国国家生物信息中心GenBank
②序列对比工具（如BLAST)
（三）目的基因的获取
2.人工合成目的基因
3.利用PCR获取和扩增目的基因
1.从基因文库中获取
2.利用PCR获取和扩增目的基因
PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
（1）PCR的概念：
中文全称
聚合酶链式反应
DNA半保留复制
体外（PCR扩增仪/PCR仪）
对目的基因的核苷酸序列进行大量复制
原理
操作环境
目的
PCR扩增仪
体内DNA复制条件 在DNA复制中的作用 PCR反应条件
提供DNA复制的模板
合成DNA子链的原料
打开DNA双链
催化合成DNA子链
使DNA聚合酶能够从引物3′端连接脱氧核苷酸
两条DNA母链
4种脱氧核苷酸
解旋酶
DNA聚合酶
小段单链RNA分子（引物）
两条DNA母链
4种脱氧核苷酸
高温条件（90℃以上）
耐高温的DNA聚合酶
人工合成的小段单链DNA分子（引物）
稳定的缓冲溶液（一般添加Mg2+）真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。
（2）PCR反应条件：
（2）PCR反应过程：
1）变性：
当温度上升到_______以上时， 断裂，双链DNA解聚为两条 。
氢键
单链DNA
待扩增的DNA片段
第一步：变性
3’
3’
5’
5’
3’
5’
3’
5’
变性
90℃
思考：变性的温度为何是90℃以上的一个温度范围，而不是95℃？
因为变性的温度与氢键的数量有关。当氢键数量越多时，所需温度就越高；反之，当氢键数量越少时，所需温度也就越低。
2）复性：
当温度下降到50℃左右时，两种引物通 过 与两条单链DNA结合。
第二步：复性
引物1
引物2
DNA引物
3’
5’
3’
5’
碱基互补配对
5’
5’
思考：什么是引物？为什么需要引物？引物结合在模板链的什么位置？
①引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。
②因为Taq酶不能从0开始添加核苷酸。
③引物结合在DNA模板链 3'端位置，引导子链从 5'端→3'端方向复制。
3’
3’
活动1. 根据查询的Bt基因编码链序列，尝试设计引物。小组内合作讨论完成
要求：1.写出互补链的碱基序列，并注明方向。
2.从①－④中选择2个合适的位置设计引物，写出引物的部分序列，并注明方向。
5’ATG …… ATC GAG ACC GGT …… TAA 3’
3’TAC …… TAG CTC TGG CCA …… ATT 5’
①
②

③
④
3’… ATT 5’
5’ATG… 3’
【例1】下图是某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)，都不合理，请分别说明理由。
第1组： ；
第2组： 。
引物Ⅰ和引物Ⅱ会因局部发生碱基互补配对而失效
引物Ⅰ′自身折叠后会因出现局部碱基互补配对而失效
思考：引物设计的原则有哪些？
Ⅰ.引物长度要适宜：
一般在20-30碱基之间。过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq 酶进行反应；过短特异性差。
Ⅱ.G-C含量要适宜：
一般在40%~60%之间，G-C含量过高或过低都不利于引发反应。
碱基要随机分布，且引物自身和引物之间不能有连续4个碱基的互补，否则引物自身会折叠成发夹结构或引物之间配对结合，从而影响引物与模板的复性结合。
Ⅲ.引物自身及引物之间不应存在互补序列：
思考：要保证目的基因能与载体相连接，还要对引物进行什么操作？
要在两种引物的5′端分别添加上限制酶的识别序列。
思考：引物设计的原则有哪些？
Ⅰ.引物长度要适宜：
一般在20-30碱基之间。过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq 酶进行反应；过短特异性差。
Ⅱ.G-C含量要适宜：
一般在40%~60%之间，G-C含量过高或过低都不利于引发反应。
碱基要随机分布，且引物自身和引物之间不能有连续4个碱基的互补，否则引物自身会折叠成发夹结构或引物之间配对结合，从而影响引物与模板的复性结合。
Ⅲ.引物自身及引物之间不应存在互补序列：
Ⅳ.引物5'端可以修饰，3'端不可修饰：
3）延伸：
当温度上升到______左右时，溶液中的4种____________在耐高温的____________的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
第三步：延伸
引物1
引物2
Taq酶
Taq酶
3’
5’
3’
5’
脱氧核苷酸
5’
5’
DNA聚合酶
72℃
3’
3’
3’
3’
思考1：为什么温度要上升至72℃？
思考2：Taq酶结合在引物的3’还是5’端？
72℃是Taq酶的最适温度
Taq酶结合在引物的3’端
PCR相关计算
长链-中长链DNA____个
含有引物A的DNA____个
含有引物B的DNA____个
2
1
1
引物A
引物B
扩增一次
中长链-短链DNA____个
2
长链-中长链DNA____个
含有引物A的DNA____个
含有引物B的DNA____个
2
3
3
扩增两次
PCR相关计算
中长链-短链DNA____个
4
长链-中长链DNA____个
含有引物A的DNA____个
含有引物B的DNA____个
2
7
7
短链-短链DNA______个
2
出现完整的目的基因
扩增三次
PCR相关计算
中长链-短链DNA____个
长链-中长链DNA____个
含有引物A的DNA____个
含有引物B的DNA____个
短链-短链DNA______个
扩增四次
2
8
15
15
6
PCR相关计算
扩增次数 1次 2次 3次 4次 n次
DNA总数 21 22 23 24 2n
长链-中长链DNA
中长链-短链DNA
短链-短链DNA
含引物A(或B) 的DNA
2
0
0
2
2
2
4
0
2
2
6
8
2
2n-2
2n-2n
1
3
7
15
2n-1
PCR相关计算
长链条数：始终是最初DNA分子的两条链。
中链条数：始终是最初DNA分子的两条长链为模板形成的，并且每复制一次，新形成的中链增加两条。
短链条数：所有的DNA分子中，除长链和中链外，余下的即为短链。
复制过程中共需引物_______对
2n-1
一个DNA，一对引物（A与B），通过PCR扩增n次：
①子代DNA分子中等长链DNA分子数为：______个
②子代DNA分子中不等长链DNA分子数为：_______个
③子代DNA分子中含模板链DNA分子数为：_______个
④子代DNA分子中含引物A（或B）的DNA分子数为：______个
⑤复制过程中共需引物________个
⑥第n次复制需要引物_________个
2n-2n
2n
2
2n-1
2n＋1 - 2
2n
PCR扩增DNA规律
深入思考：用PCR可以扩增mRNA吗？
mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA在进行扩增。
由mRNA逆转录形成cDNA的过程是：
第一步，逆转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA链，形成RNA-DNA杂交分子；
第二步，核酸酶H降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链，使之变成单链DNA；
第三步，以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子。
(1)PCR反应中温度的周期性改变是为了DNA聚合酶催化不同的反应 （　 　）
(2)PCR扩增技术中，需用解旋酶使双链DNA解聚 （　 　）
(3)PCR过程使用的DNA聚合酶的特点是耐高温 （　 　）
(4)PCR技术中，DNA模板链上碱基G和C的比例越高，DNA变性的温度就越高 （　 ）
(5)PCR扩增过程中，需要添加ATP为新链合成提供能量（ ）
(6)PCR扩增过程中，通过温度变化的控制为变性、复性和延伸等过程提供能量（ ）
1.判断常考语句，澄清易混易错
温度不能为变性、复性和延伸等过程提供能量
PCR技术扩增时需要能量，所需要的能量可由dNTP提供
【现学现用】

展开更多......

收起↑