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第三章 基因工程
3.1 重组DNA技术的基本工具
基因的结构和功能
1.基因与DNA的关系？
2.基因的基本单位是什么？
3.基因的功能？
基因是有遗传效应的DNA片段
CH2
H
OH
H
H
H
H
碱基
磷酸
5’
4’
3’
2’
1’
脱氧核苷酸
挖掘记忆
储存、传递、表达遗传信息
复制
转录
翻译
DNA
RNA
逆转录
复制
蛋白质
　　指按照 ,进行严格的设计并通过 DNA重组和 等技术，赋予生物以新的遗传特性,创造出更符合人们需要的 。由于基因工程是在 上进行设计和施工的，因此又叫作 。
人们的愿望
体外
转基因
新的生物类型和生物产品
DNA分子水平
DNA重组技术
基因工程 P67
练.下列关于基因工程的叙述，不正确的是（ ）
A．基因工程的原理主要是基因重组
B．运用基因工程技术，可使生物发生定向变异
C．一种生物的基因转接到另一种生物的DNA分子上，
属于基因工程的内容
D．是非同源染色体上非等位基因的自由组合
D
创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品
操作对象：
操作环境：
操作水平：
原理：
特点：
基本过程：
基因(DNA)
DNA 分子水平
基因重组
生物体外
剪切→拼接→导入→表达
定向改造生物性状，彻底打破生殖隔离
水母的绿色荧光蛋白基因
表达的基础
重组DNA
RNA
蛋白质
性状
复制
转录
翻译
翻译
拼接的基础
1. DNA的基本组成单位 。
2. 都遵循 原则
3. DNA分子的空间结构都是规则的 结构
相同（四种脱氧核苷酸）
碱基互补配对
双螺旋
1. 基因是控制生物 的结构与功能单位
2. 遗传信息的传递都遵循 法则
3. 生物界共用 。（相同的遗传信息在不同的生物体内表达出相同的蛋白质）。
中心
一套遗传密码
性状
到社会中去
番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵袭，当番木瓜被这种病毒感染后，产量会大大下降。科学家通过精心设计，用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。
DNA双螺旋的直径只有2nm，对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。那么，科学家究竟用到了哪些“分子工具”？这些 “分子工具”各具有什么特征呢？
环斑病毒的
非转基因木瓜
转基因木瓜
“分子手术刀”
准确切割DNA分子
“分子缝合针”
“分子运输车”
将DNA片段连接起来
将体外重组好的DNA分子导入受体细胞
一、基因工程的理论基础
①
②
二、限制性内切核酸酶（限制酶）
1. 定义：
2. 来源：
（限制酶不是一种酶，而是一类酶）
3. 种类：
识别双链 DNA 分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
数千种
4. 作用：
切割DNA分子的工具是限制性内切核酸酶，又称限制酶。
主要是原核生物，可人工合成
（蛋白质）
根据你所掌握的知识你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么？
？旁栏思考
主要起到切割外源DNA使之失效，从而达到保护自身的目的
为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？
提示：原核细胞内DNA分子不具备这种限制酶的识别序列，或者甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。
二、限制性内切核酸酶（限制酶）
5. 限制酶的识别序列
思考：四种限制酶识别的特定序列有何特点？
大多数限制酶的识别序列由 组成，也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。
6个核苷酸
特点1：都可以找到一条中心轴线；
特点2：中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向、对称、重复排列的，称为回文序列。
总结：能被限制酶所识别的序列一般都有回文序列
拓展——限制酶的命名：
阅读72页资料卡“限制酶的命名”，说说EcoRⅠ各个字母的代表含义。
EcoRⅠ
属名Escherichia首字母
种名coli前两个字母
R型菌株
从中分离的第一个限制酶
二、限制性内切核酸酶（限制酶）
（1）实例1——EcoRⅠ限制酶切割
*EcoRⅠ识别序列为GAATTC
*EcoRⅠ切割部位为GA之间的磷酸二酯键
黏性末端
黏性末端
（2）实例2——SmaⅠ限制酶切割
*SmaⅠ识别序列为CCCGGG
*SmaⅠ切割部位为CG之间的磷酸二酯键
平末端
6.切割结果 :
二、限制性内切核酸酶（限制酶）
DNA两条单链的切口处，伸出几个核苷酸，刚好能互补配对，这样的切口叫黏性末端。
切口处是平整的，这样的切口叫平末端。
【练习1】：写出下列限制酶切割形成的黏性末端
BamHⅠ________ EcoRⅠ________ HindⅢ________ BglⅡ________
GATC
AATT
AGCT
GATC
思考：同种限制酶切割的黏性末端一定相同吗？不同种限制酶切出的黏性末端一定不同吗？
二、限制性内切核酸酶（限制酶）
①不同DNA分子用同一种限制酶切割形成的黏性末端都相同。
【解析：酶具有专一性，识别的序列相同】
②不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端。（比如BamHⅠ、BglⅡ）
【练习2】下面哪项不具有限制酶识别序列的特征（ ）
A．GAATTC
CTTAAG
B．GGGGCCCC
CCCCGGGG
C．CTGCAG
GACGTC
D．CTAAATC
GATTTAG
D
【练习3】右侧黏性末端是由______种限制酶作用产生的。
3
二、限制性内切核酸酶（限制酶）
不能，限制酶只能识别并切开双链DNA分子。
（2）限制酶切一次可断开 个磷酸二酯键，产生 个游离的磷酸基团，产生 个黏性末端。要想获得某个特定性状的目的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性(平)末端？
2
2
2
（1）限制酶能切开RNA分子的磷酸二酯键吗？
【练习4】请结合限制酶的作用特点，回答以下问题：
二、限制性内切核酸酶（限制酶）
要切2个切口，产生4个黏性(平)末端。
【练习5】把两种来源不同的DNA分子进行拼接，应该怎样处理呢？
用同种限制酶切割(EcoRⅠ)
T G A A T T C G
A C T T A A G C
A G A A T T C T
T C T T A A G A
缺口怎么办
只能用同种酶切割吗？
二、限制性内切核酸酶（限制酶）
完全互补的黏性末端能通过氢键暂时连接在一起，但并不稳定。
DNA连接酶 — “分子缝合针”
恢复被限制酶切开的磷酸二酯键
二
DNA连接酶 ——“分子缝合针”
2. 作用：
将两个DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
5′
3′
T
A
C
G
T
A
C
T
G
A
A
T
5′
3′
5′
3′
C
G
C
G
C
G
5′
3′
C
G
C
G
C
G
切口
切口
切口
C
T
5′
3′
5′
3′
T
A
G
C
A
G
A
T
T
A
5′
3′
5′
3′
C
G
C
G
C
G
C
G
C
G
C
G
三、DNA连接酶
将两个双链DNA片段“连接”起来的酶
1. 概念：
注意：
1、DNA连接酶可连接双链DNA中的两条单链缺口，但不能连接单链DNA!
2、DNA连接酶作用没有特异性。
5′
5′
5′
5′
3′
3′
5′
5′
3′
3′
5′
5′
5′
5′
5′
5′
T4 DNA
连接酶
T4 DNA连接酶和E.coli DNA连接酶
E.coli DNA连接酶
3. 种类：
思考：E.coli DNA连接酶只能连接互补黏性末端的DNA片段？
两种连接酶都可连接互补黏性末端与平末端，
但E.coli DNA连接酶连接平末端效率远低于T4 DNA连接酶
三、DNA连接酶
【新旧衔接】DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？为什么？
思考：T4 DNA连接酶只能连接平末端的DNA片段？
T4 DNA
连接酶
E.coli DNA连接酶
DNA连接酶 DNA聚合酶
相同点 作用实质 化学本质 不 同 点 模板
作用对象
作用结果
用途
都能催化形成磷酸二酯键
都是蛋白质
不需要
需要DNA的一条链作模板
形成完整的重组DNA分子
形成DNA的一条链
基因工程
DNA复制
在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键
只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键
三、DNA连接酶
【新旧衔接】DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？为什么？
三、DNA连接酶
拓展：几种相关酶的比较
名称 作用部位 作用结果
限制酶
DNA连接酶
DNA聚合酶
DNA(水解)酶
解旋酶
磷酸二酯键
碱基对之间
的氢键
将DNA切成两个片段
磷酸二酯键
将两个DNA片段连接为一个DNA分子
磷酸二酯键
将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端
磷酸二酯键
将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
将双链DNA分子局部解旋为单链
1.(2022·天津耀华中学高二期中)以下是几种不同限制酶切割DNA分子后形成的部分片段。下列叙述正确的是（ ）
考点突破
A.以上DNA片段是由4种限制酶切割后产生的
B.②片段是在识别序列为 的限制酶作用下形成的
C.①和④两个片段在DNA聚合酶的作用下可形成重组DNA分子
D.限制酶和DNA连接酶作用的部位都是磷酸二酯键
如何将外源基因运入细胞呢？
三、DNA连接酶
①④是由同一种限制酶切割而成的
C
G
DNA连接酶
D
质粒:
将外源基因送入受体细胞, 在受体细胞内对目的基因进行大量复制。
1.作用：
动植物病毒:
噬菌体:
2.种类：
将外源基因导入大肠杆菌等受体细胞
将外源基因导入植物细胞
将外源基因导入动物细胞
动物病毒
噬菌体
四、基因进入受体细胞的载体
是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我 能力的环状双链DNA分子。
复制
问题1：载体要与外源基因连接，需要具备什么条件？
问题2：要使携带的外源基因在受体细胞中稳定存在，载体需要具备什么条件？
问题3：我们用肉眼看不到载体是否进入受体细胞，为了便于筛选重组DNA分子，载体需要具备什么条件？
条件①：具有一个或多个限制酶切割位点；
条件②：能在受体细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制；
条件③：具有标记基因，便于重组DNA分子的筛选。
条件④：载体DNA必须是安全的，不会对受体细胞有害。
【探究】分析归纳载体需要具备的条件
四、基因进入受体细胞的载体
有标记基因的存在，可用含青霉素的培养基鉴别。
不能被酶切破坏
便于重组DNA筛选与鉴定
DNA复制的起始位点，并带着插入的目的基因一起复制
有切割位点（酶切位点）
4、最常用的载体——质粒：
真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过 改造的。
人工
四、基因进入受体细胞的载体
终止子: 转录的终点，在转录过程中起调控作用。
终止子: 转录的终点，在转录过程中起调控作用。
质粒DNA分子质量一般为拟核的0.5%~3%
请你根据图3-3中的相关信息找到两条片段上EcoRI 的识别序列和切割位点。 然后，用剪刀进行“切割”。待切割位点全部切开后，将从下面那条DNA链上切下的片段重组到上面那条DNA链的切口处，并用透明胶条将切口粘连起来。
…TATCGTACGATAGGTACTTAA
…ATAGCATGCTATCCATG
AATTCGGCATAC…
GCCGTATG…
…TCCTAG
…AGGATCTTAA
GAGCCATACTTAA
AATTCTCGGTATG
AATTCCATAC…
GGTATG…
GAGCCATACTTAA
AATTCTCGGTATG
探究 活动二、P73思考讨论 重组DNA分子的模拟操作
四、基因进入受体细胞的载体
Hind III 和 BamH I
1.用图中外源DNA和质粒构建重组质粒，不能使用Sma Ⅰ切割，
原因是 。
2.使用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ两种限制酶切割，而不用EcoR Ⅰ一种限制酶切割，是为了防止 。
Sma Ⅰ会破坏抗性基因和外源DNA中的目的基因
目的基因、质粒自身环化及反向连接
5、下列操作中选用哪种限制酶切割来构建重组质粒？
a、选目的基因两端和运载体都有的酶切位点；
b、所选酶切位点不能破坏目的基因以及标记基因
选择酶切位点的原则：
四、基因进入受体细胞的载体
图1
图2
6、标记基因的筛选原理：载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。（据图请尝试描述筛选的过程）关键点拨培养基中有几种类型的大肠杆菌？什么样的大肠杆菌能够在该培养基上存活并繁殖？四、基因进入受体细胞的载体
抗虫棉
Bt抗虫蛋白
苏云金杆菌
取出
转移
思考：通过本节的学习，现在你能描述如何使用这三种工具来获得抗虫棉吗？
四、基因进入受体细胞的载体
2.某实验小组利用下图所示质粒和目的基因来构建基因表达载体,将目的基因导入大肠杆菌细胞并表达。下列叙述正确的是( )
A. 图中的质粒用酶A切割后,会产生8个游离的磷酸基团
B. 在构建重组质粒时,可用酶A和酶C切割质粒和目的基因
C. 成功导入目的基因的大肠杆菌可在含四环素的培养基中生长
D. 若用酶B和酶C切割,可以避免质粒的自身环化
D
趁热打铁
限制酶
DNA连接酶
载体
①能自我复制或能整合到宿主DNA上
②有一个至多个限制酶切割位点
③有特殊的标记基因
④对受体细胞无害
质粒、 噬菌体 、动植物病毒
基因工程的基本工具
作为载体的条件
种类:
磷酸二酯键
来源：
主要来源于原核生物
特点：
作用部位：
具有专一性
结果：
形成黏性末端或平末端
连接部位：磷酸二酯键
种类： E.coli DNA连接酶、T4 DNA连接酶
作用： 把两条双链DNA片段拼接起来
（能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列）
课堂小结
实验：DNA的粗提取与鉴定
1、实验原理
DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，
可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法对它们进行提取。
DNA不溶于酒精溶液
但某些蛋白质溶于酒精
DNA能溶于物质的量浓度为2mol/L的NaCl溶液
在一定温度下（沸水浴），DNA被二苯胺试剂染成蓝色
初步分离DNA和蛋白质
溶解DNA
鉴定DNA
DNA含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菜花和猪肝等。
（注意：不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA。）
(1)选材：
(2)试剂：
①研磨液
②体积分数为95%的酒精
③2mol/L 的NaCl溶液
④二苯胺试剂
⑤蒸馏水
——溶解并提取DNA
——析出DNA
——溶解DNA
——鉴定DNA，要现配现用
2、材料用具
实验：DNA的粗提取与鉴定
实验：DNA的粗提取与鉴定
称取洋葱，切碎，放入研钵，倒入研磨液，充分研磨。
破碎细胞
目的：裂解细胞，释放DNA
过滤
在漏斗中垫上纱布过滤研磨液，4℃冰箱中静置后取上清液；或将研磨液倒入塑料离心管中离心，取上清液。
问题1:过滤能否用滤纸代替纱布？
不可以。因为DNA会被吸附到滤纸上而大量损失，影响最终提取的DNA量。
问题2:此步骤获得的上清液中可能含有哪些细胞成分？
可能含有DNA、RNA以及蛋白质、脂质、糖类等。
3、实验步骤
破碎细胞
过滤
DNA的析出
在上清液中加入体积相等的预冷的酒精溶液, 静置2~3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA 。
问题3:此步骤的目的是？
使蛋白质等溶解在酒精中，DNA不溶于酒精而析出。
问题4：酒精预冷的作用？
①可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解；
②抑制分子运动，使DNA易形成沉淀析出；
③低温有利于增加DNA分子的柔韧性，减少其断裂。
实验：DNA的粗提取与鉴定
3、实验步骤
破碎细胞
过滤
DNA的析出
用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物；或将溶液倒入塑料离心管中离心，取沉淀物晾干。
问题5：搅拌时应轻缓、并沿一个方向目的？
减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子
析出DNA
实验：DNA的粗提取与鉴定
3、实验步骤
实验组
对照组
水浴加热
破碎细胞
过滤
DNA的析出
DNA的鉴定
将丝状物或沉淀物溶于 溶液中，加入
试剂，混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min
二苯胺
2mol/L的NaCl
空白对照：
在等体积的NaCl溶液中加入二苯胺试剂，将试管置于同等沸水浴中加热5min。
评价结果：
（1）DNA纯度
看提取物颜色
（2）DNA的量
看与二苯胺反应颜色的深浅
现配现用！
实验：DNA的粗提取与鉴定
3、实验步骤
（1）你提取出白色丝状物或沉淀物了吗？用二苯胺试剂鉴定的结果如何？
观察提取的DNA的颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多。二苯胺试剂鉴定呈现蓝色说明实验基本成功；如果不呈现蓝色，可能的原因有所提取的DNA含量低，或者在实验操作过程中出现了失误等。
本实验粗提取的DNA可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质。
（2）你能分析出粗提取的DNA中可能含有哪些杂质吗？
4、结果分析与评价
实验：DNA的粗提取与鉴定
实验组
水浴加热5min，冷却后
对照组
蓝色
练习
1．下列有关限制酶和DNA连接酶的叙述正确的是(　　)
A．用限制酶剪切获得一个目的基因时产生两个切口，有四个磷酸二酯键被断开
B．在使用限制酶的同时，必须用解旋酶解开DNA的双螺旋结构
C．DNA连接酶可以连接两个肽链片段
D．T4 DNA连接酶和E.coli DNA连接酶都能催化平末端和黏性末端的连接
　
A
练习
2．质粒是基因工程中最常用的载体，它的主要特点是(　　)
①能自主复制　②不能自主复制　③结构很小 ④成分为蛋白质　⑤环状RNA　⑥环状DNA ⑦能“友好”地“借居”
A．①③⑤⑦ B．②④⑥
C．①③⑥⑦ D．②③⑥⑦
C

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