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(共32张PPT)
3.2基因工程的基本操作程序
第2课时 将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定
基因工程的基本操作程序（4个步骤）
目的基因的筛选与获取
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
目的基因的检测与鉴定
旧知回顾
目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，称为转化。
实质：将目的基因整合到受体细胞基因组中。
将目的基因导入受体细胞的方法：
导入植物细胞
导入动物细胞
导入微生物细胞
农杆菌转化法
花粉管通道法
显微注射法
Ca2+转化法
（我国科学家独创）
（常用）
转化的概念：
将目的基因导入受体细胞
方法一：用微量注射器将含目的基因的DNA 溶液直接注入子房中
含目的基因的DNA 溶液
花粉管通道法（我国科学家独创）
将目的基因导入受体细胞—植物细胞
方法二：在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。
花粉管通道法
将目的基因导入受体细胞—植物细胞
农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。
农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞时，Ti质粒的 T-DNA可转移至被侵染的细胞，并整合到该细胞的染色体DNA上。
（可转移的DNA）
1.农杆菌的特点：
农杆菌转化法
任务：分析将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定
1.在用农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞的过程中，一定要将目的基因插入到Ti质粒的T－DNA(可转移的DNA)上，原因是农杆菌中的Ti质粒上的T－DNA_________________________________________________
__________。
可转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上
[思考]构建基因表达载体时，目的基因该插到Ti质粒哪里？
探究—学习笔记P64
将新鲜的从叶片上取下的圆形小片与农杆菌共培养，然后筛选转化细胞，并再生成植株
将花序直接浸没在含有农杆菌的溶液中一段时间，然后培养植株并获得种子，再进行筛选、鉴定等
导入体细胞
导入受精卵
2.操作方法：
农杆菌转化法
随着转化方法的突破，用农杆菌侵染水稻、玉米等多种单子叶植物也取得了成功。
第一次拼接
第二次拼接
第一次导入
第二次导入
(2)两次导入：
1.农杆菌转化法中两次拼接、两次导入的辨析
(1)两次拼接：
第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T－DNA上；第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基因的T－DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上。
第一次导入是将含目的基因的重组Ti质粒导入农杆菌；第二次导入(非人工操作)是将含目的基因的T－DNA导入受体细胞。
核心归纳—学习笔记P65
目的基因的表达载体提纯
取卵
（受精卵）
显微注射
早期胚胎培养
获得具有新性状的动物
①个体大，易操作。
②受精卵全能性高，易培养成完整个体。
显微注射法
1.操作方法：
2.过程：
将目的基因导入受体细胞—动物细胞
胚胎移植
注射器
固定吸管
【补充】病毒侵染法
科学家用病毒DNA与目的基因一起构建的载体，去感染受体动物细胞，也能使目的基因导入动物细胞内，如腺病毒载体等。
感受态细胞
Ca2+处理细胞
重组基因表达载体与感受态细胞混合
感受态细胞吸收重组DNA分子
42℃,1min
冰上3min
Ca2＋处理
1.操作方法：
2.过程：
将目的基因导入受体细胞—微生物细胞
常用原核生物作为受体细胞，其中以大肠杆菌应用最为广泛，一般先用Ca2＋处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后再将重组的基因表达载体导入其中。
【注意】原核生物作为受体细胞产生的真核生物的蛋白质通常没有生物活性，需要在体外进行再加工。
（因为没有内质网、高尔基体对蛋白质进一步加工。）
2.受体细胞的选择
(1)对于植物来说，受体细胞可以是受精卵或体细胞，因为植物细胞具有全能性。
(2)对于动物来说，受体细胞一般是受精卵，因为受精卵的全能性高，而高度分化的动物体细胞的全能性受到抑制。
(3)大肠杆菌和酵母菌在基因工程中都可以作为受体细胞，但又有所不同。大肠杆菌为原核细胞，而酵母菌为真核细胞(具有多种细胞器)，所以在生产需要加工和分泌的蛋白质时，酵母菌比大肠杆菌有优势。
核心归纳
生物种类 植物细胞 动物细胞 微生物细胞
常用方法
受体细胞
转化过程
农杆菌转化法
显微注射技术
Ca+处理法
体细胞或受精卵
受精卵
原核细胞
将目的基因插入Ti质粒的T-DNA→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的DNA上→表达
将含有目的基因的表达载体提纯→取受精卵→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物
Ca+处理细胞→微生物细胞膜的通透性增加形成感受态细胞→重组质粒与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子
将目的基因导入不同细胞的方法
将目的基因导入受体细胞
2.基因表达载体中具备标记基因(如抗生素抗性基因)，已经对受体细胞进行了筛选，基因工程的第四步还要对目的基因进行检测和鉴定，原因是：在含抗生素的选择培养基上能生长的可能是_________________________
，因此第四步需要对目的基因是否导入进行进一步的检测。此外，即便在选择培养基上能生长的细胞中导入的是基因表达载体，但是仍然不知道目的基因插入的 等是否正确，能否正确 ，因此也需要在 水平上进行检测和鉴定。
导入了基因表达载体或未插
入目的基因的空载体
位置、方向
表达
转录和翻译以及个体
探究
Bt基因
mRNA
Bt抗虫蛋白
抗虫棉
目的 ：检测目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性
目的基因的检测与鉴定
类型 检测内容
分子水平的检测 检测受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因
检测目的基因是否转录出了mRNA
检测目的基因是否翻译成蛋白质
个体生物学水平的鉴定 个体是否具有相应性状
如：检测棉花的染色体DNA上是否插入了Bt基因或检测Bt基因
—通过PCR等技术检测
转基因生物
提取DNA
PCR操作
是否扩增出目的基因
M：marker；1-阳性质粒；
2：原始品系；3-9转Bt品系；
PCR琼脂糖凝胶电泳检测结果
电泳操作
目的基因的检测与鉴定—分子水平的检测
① 检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因
将受体细胞的所有DNA分子提取出来进行电泳实验，与marker对比判断是否含目的基因。
拓展 基因探针是一段带有检测标记（荧光或同位素标记），且顺序已知的，与目的基因能互补的核酸序列（DNA或RNA）。
检测 将待测DNA与目的基因探针混合，如果发生了核酸杂交，则说明有目的基因
① 检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因
—DNA分子杂交技术
目的基因的检测与鉴定—分子水平的检测
原理：碱基互补配对
1.复制水平的检测(DNA分子杂交技术)
拓展延伸
(1)原理：碱基互补配对原则。
(2)基因探针：用放射性同位素或荧光物质标记的目的基因。
(3)检测受体细胞是否含目的基因的具体过程：
拓展延伸
如：检测Bt基因是否翻译出mRNA
提取棉花细胞mRNA
逆转录
产生DNA
对扩增产物进行检测
用与Bt基因相关的
引物进行PCR扩增
Bt
M3
C0
T-9
T-2
T-51
T-5
T-23
T-11
T-20
T-21
T-34
T-10
10个PCR阳性棉花植株中，有四株Bt基因发生转录
目的基因的检测与鉴定—分子水平的检测
② 检测目的基因是否转录出了mRNA
—通过PCR等技术检测
RNA分子杂交(Northern Blot)流程图
转基因生物
标记的基因探针
—分子杂交技术
② 检测目的基因是否转录出了mRNA
2.表达水平的检测
进行转录水平的检测原理与复制水平的检测原理相似，只是被检测的物质不再是转基因生物的基因组DNA，而是转基因生物细胞内的 mRNA；进行翻译水平的检测则是利用抗原与抗体特异性结合的原理。
拓展延伸—学习笔记P65
③检测目的基因是否翻译出相应蛋白质
如：检测Bt基因是否翻译成Bt抗虫蛋白
过程：提取转基因植物的蛋白质+相应抗体 → 是否出现杂交带
如：检测Bt基因是否翻译成Bt抗虫蛋白
苏云金芽孢杆菌
提取
Bt抗虫蛋白
注射小鼠体内
抗体
标记抗体
提取蛋白
电泳分离
抗原
抗体
杂交
转基因生物
放射性检测
（杂交带）
抗原与抗体的特异性结合
原理：
目的基因的检测与鉴定—分子水平的检测
抗原—抗体杂交
目的基因是否表现出相应的性状
采摘抗虫棉叶片
饲喂
棉铃虫
观察棉铃虫存活情况
目的基因的检测与鉴定—个体生物学水平鉴定
—检测是否具有抗性以及抗性强度等
方法：抗虫、抗病接种实验
获取质粒、
噬菌体等载体
筛选和获取目的基因
检测和鉴定目的基因是否稳定维持和表达其遗传特性
将含有目的基因的表达载体导入受体细胞
用限制酶切割载体和含有目的基因的DNA片段，然后用DNA连接酶连接，构建基因表达载体
基因工程的基本操作流程图
基因工程的基本操作步骤
1.人工合成目的基因
2.常用PCR特异性地快速扩增目的基因
获取目的基因的方法
目的基因的筛选与获取
3.从基因文库中获取
基因文库
基因组文库
cDNA文库
2.从基因文库中获取
基因文库
cDNA文库
将某种生物体内的DNA全部提取出来，选用适当的限制酶，将DNA切成一定范围大小的DNA片段，然后，将这些DNA片段分别与载体连接起来，导入受体菌的群体中储存，每个受体菌都含有了一段不同的DNA片段。也就是说，这个群体包含了这种生物的所有基因，叫做这种生物的基因组文库。
基因组文库
适当的不同限制酶切割
与质粒连接
每个受体菌都含有了一段不同的DNA片段。这个群体包含了这种生物的所有基因，叫做这种生物的基因组文库。
该受体菌群为基因组文库
基因组文库
某种生物体内的全部DNA
受体菌
如果用某种生物发育的某个时期的mRNA 反转录产生的多种互补DNA(也叫cDNA)片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，那么，这个受体菌群体就叫做这种生物的cDNA文库。
某种生物体内的全部DNA
某个时期
基因选择性表达
转录
转录
转录
转录
mRNA
翻译
翻译
翻译
翻译
蛋白质
cDNA文库
--ATGCATGCAT…… CGATCGTAGCCA …… TCCCTAAGGATAG CCATCCCAGATG …… CATGCATCCATGC---
--TACGTACGTA ……GCTAGCATCGGT…… AGGGATTCCTATC GGTAGGGTCTAC …… GTACGTAGGTACG---
非编码区
非编码区
编码区
(编码mRNA)
启动子
终止子
CA …… UCCCUAAGGAUAG CCAUCCCAGAUG
转录
mRNA
某原核细胞基因
反转录
GT…… AGGGATTCCTATC GGTAGGGTCTAC
CA …… TCCCTAAGGATAG CCATCCCAGATG ……
GT…… AGGGATTCCTATC GGTAGGGTCTAC ……
cDNA
复制
双链DNA
受体菌
无启动子、终止子等非编码区
--ATGCATGCAT…… CGATCGTAGCCA …… TCCCTAAGGATAG CCATCCCAGATG …… CATGCATCCATGC---
--TACGTACGTA ……GCTAGCATCGGT…… AGGGATTCCTATC GGTAGGGTCTAC …… GTACGTAGGTACG---
非编码区
非编码区
编码区
(编码mRNA)
启动子
终止子
CA …… UCCCUAAGGAUAG CCAUCCCAGAUG
转录
某真核细胞基因
外显子
内含子
外显子
内含子
外显子
RNA加工
CA …… UAGGAUCCAGAUG
初始mRNA
成熟mRNA
反转录
GT …… ATCCTAGGTCTAC
GT …… ATCCTAGGTCTAC
CA …… TAGGATCCAGATG
复制
受体菌
无启动子、终止子等非编码区及无内含子
文库类型 cDNA文库 基因组文库
文库大小
基因中启动子（具有启动作用的DNA片段）
基因中内含子（位于编码蛋白质序列内的非编码DNA片段）
基因多少
小
大
无
有
无
有
某种生物的部分基因
某种生物的全部基因
cDNA文库与基因组文库的比较
网络构建

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