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(共29张PPT)
3.2.1 基因工程的基本操作程序
本节聚焦：
1.基因工程的基本操作程序主要包括哪几个步骤？
2.基因工程操作的每一步涉及的技术和方法
从社会中来
【资料1】我国是棉花的生产和消费大国。棉花在种植过程中，常常会受到一些害虫的侵袭，其中以棉铃虫最为常见。
【资料2】苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴孢晶体蛋白(Bt抗虫蛋白)，破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫,用苏云金杆菌制成的生物杀虫剂广泛用于防治棉花虫害。
我们能否培育出自身就能抵抗虫害的棉花新品种呢？
思考
00
从社会中来
【资料3】科学家通过实验，将苏云金杆菌的Bt抗虫基因(杀虫基因)转到棉花里，让棉花也能产生Bt抗虫蛋白抵抗虫害。1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。
请结合我们学习过的内容思考，
培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？
思考
00
从社会中来
苏云金杆菌
普通棉花
（无抗虫特性）
棉花细胞
抗虫棉
提取
表达Bt基因
导入
与载体拼接
Bt基因
重组DNA分子
④目的基因的检测与鉴定
①目的基因的
筛选与获取
②基因表达
载体的构建
③将目的基因导入受体细胞
00
基因工程的基本操作程序（4个步骤）
1
2
3
4
目的基因的筛选与获取
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
目的基因的检测与鉴定
目的基因的筛选与获取
一、目的基因
（1）概念：
用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因；
与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。（Bt抗虫蛋白基因：转基因抗虫棉）。
主要是编码特定蛋白质的基因，也可以是具有调控作用的因子
（2）实例：
目的基因的筛选与获取
二、筛选合适的目的基因
方法：从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选。
DNA测序仪
核苷酸序列比对
氨基酸序列比对
美国国家生物信息中心
越来越多基因的功能和结构被分析。
目的基因的筛选与获取
三、目的基因的获取
方法：利用PCR获取和扩增目的基因
聚合酶链式反应，根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
概念
获取目的基因的三种方法：
①人工合成获取
②从基因文库获取
③通过PCR技术获取
体内DNA复制参与的组分 在DNA复制中的作用 PCR中参与的组分
打开DNA双链
提供DNA复制的模板
合成DNA子链的原料
催化合成DNA子链
使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸
解旋酶
DNA母链
4种脱氧核苷酸
DNA聚合酶
引物（通常为小的单链RNA）
无需解旋酶，用高温代替
DNA（目的基因）模板
4种脱氧核苷酸(dNTP)
耐高温的DNA聚合酶(Taq酶）
引物（通常为小的单链DNA）
反应还需要其它条件，如缓冲液（一般添加Mg2+）、和控温设备
目的基因的筛选与获取
目的基因的筛选与获取
三、目的基因的获取
过程
模板DNA
变性 复性 延伸
方法：利用PCR获取和扩增目的基因
5’
5’
3’
3’
95℃
目的基因的筛选与获取
过程
95℃
1.变性：加热至90～95℃，双链DNA间的氢键断裂，解旋为单链。
变性 复性 延伸
三、目的基因的获取
三、目的基因的获取
—利用PCR获取和扩增目的基因
5’
3’
5’
3’
使用耐高温的Taq酶保证高温条件下仍具有活性。
目的基因的筛选与获取
50℃
引物1
引物2
DNA引物
2.复性：冷却至55～60℃，两条引物与单链DNA结合
过程
三、目的基因的获取
三、目的基因的获取
—利用PCR获取和扩增目的基因
变性 复性 延伸
5’
3’
5’
3’
引物结合在模板DNA链的3’端，新合成的子链方向为5’到3’。
目的基因的筛选与获取
过程
引物1
引物2
72℃
Taq酶
Taq酶
变性 复性 延伸
3.延伸：加热至70～75℃，以目的基因为模板，合成互补的新DNA链。
三、目的基因的获取
三、目的基因的获取
—利用PCR获取和扩增目的基因
5’
3’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
目的基因的筛选与获取
第1轮结束
第2轮开始
第一轮结束：此时目的基因的量是原始的2倍。
三、目的基因的获取
过程
变性 复性 延伸
三、目的基因的获取
—利用PCR获取和扩增目的基因
5’
3’
5’
3’
3’
5’
3’
5’
目的基因的筛选与获取
三、目的基因的获取
过程
95℃
50℃
72℃
Taq
Taq
Taq
Taq
变性 复性 延伸
三、目的基因的获取
—利用PCR获取和扩增目的基因
目的基因的筛选与获取
三、目的基因的获取
过程
95℃
50℃
72℃
Taq
Taq
Taq
Taq
变性 复性 延伸
三、目的基因的获取
—利用PCR获取和扩增目的基因
目的基因的筛选与获取
第2轮结束
第二轮结束：此时目的基因的量是原始的22倍。
三、目的基因的获取
过程
变性 复性 延伸
三、目的基因的获取
—利用PCR获取和扩增目的基因
目的基因的筛选与获取
三、目的基因的获取
扩增方式：
—利用PCR获取和扩增目的基因
以指数方式扩增，即____（n为扩增循环的次数）
2n
（1）若开始只有一个DNA提供模板，则循环n次后获得的子代DNA数目为 个。
（2）若开始有N个DNA提供模板，则循环n次后获得的子代DNA数目为 个。
2n
N 2n
琼脂糖凝胶电泳
DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就叫电泳。
思考：2、如何对产物进行鉴定？
目的基因的筛选与获取
思考： PCR技术获取目的基因时至少要经过几次循环才能从DNA分子中分离出目的基因？
5’
3’
5’
5’
第一次循环
第二次循环
3’
5’
第三次循环
3’
3’
PCR扩增“目的基因”的注意事项
1. PCR的原理？
2. PCR的基本条件？
3. PCR的扩增过程？
4. PCR的结果？产物？
5. PCR扩增目的基因需要知道目的基因的全部核苷酸序列吗？
6. PCR过程中设计引物的目的是？引物的碱基能否互补？
7. 引物是单链还是双链？是短DNA链还是短RNA链？引物结合到DNA模板链的3'端还是5'端？子链结合到引物的3'端还是5'端？
DNA半保留复制
高温、DNA模板、2种不同的引物、4种脱氧核苷酸、Taq酶
变性、复性、延伸
每循环一次，目的基因的量可增加一倍，即呈指数型增长
两个引物之间的DNA片段
不需要，只要知道目的基因的两端部分核苷酸序列即可，以便根据这部分序列合成引物
DNA复制不能从头开始复制，DNA聚合酶只能从引物的3'端开始延伸
不能，引物需要与模板链互补。如果引物的碱基序列互补，会影响引物与模板链的结合
3'
3'
5'
5'
目的基因
3'
5'
3'
5'
A
B
得到双链等长的目的基因
片段____个
0
PCR扩增“目的基因”的计算规律
模板DNA：
长链-长链 DNA
本轮需要引物____个
2
第1次扩增
Taq
Taq
5'
3'
5'
3'
(高温)变性→(低温)复性→(中温)延伸
需要引物__________种
2
引物的本质：能与DNA母链的一段碱基序列
互补配对的一小段单链核苷酸
最终目的：获取和扩增一对引物之间的DNA片段
注意引物与模板的结合端和引物的延伸方向
3'
5'
3'
5'
A
B
3'
5'
3'
5'
B
B
A
B
A
本次需要引物________个
4
第2次扩增
前两轮共需引物____________个
6
5'
3'
3'
5'
5'
3'
3'
5'
A
5'
3'
5'
3'
5'
3'
5'
3'
得到双链等长的目的基因
片段____个
0
本次需要引物数= 数
前后共需引物数= 数
模板单链
一共合成的单链总
3'
5'
3'
5'
A
B
B
A
B
A
3'
5'
A
第3次扩增
本次需要引物________个
8
前三轮共需引物____________个
14
B
A
B
A
B
A
B
A
B
A
B
A
B
5'
3'
5'
3'
5'
3'
5'
3'
5'
3'
5'
3'
A
B
A
B
A
B
A
B
5'
3'
5'
3'
5'
3'
5'
3'
5'
3'
5'
3'
3'
5'
得到双链等长的目的基因
片段____个
2
3'
5'
A
第4次扩增
B
A
B
A
B
A
B
A
B
3'
5'
A
B
A
B
本次需要引物____个
16
前四轮共需引物_____个
30
得到双链等长的目的基因片段____个
8
小结：一个含目的基因的DNA,复制n次：
①需要引物______种
②n次复制过程中共需引物___________个
③第n次复制需要引物_____个
④子代DNA中等长链DNA分子数__________个
2
2n＋1-2
2n
2n-2n
PCR扩增在PCR仪中自动完成，完成后用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物
目的基因的筛选与获取·
01
1．下列有关获取目的基因的叙述，错误的是(　　)
A．目的基因就是编码蛋白质的基因
B．获取目的基因是基因工程的第一步
C．来自苏云金杆菌的Bt抗虫蛋白基因可作为转基因抗虫棉的目的基因
D．序列比对工具的应用为科学家找到合适的目的基因提供了更多的机会
A
也可以是一些具有调控作用的因子，×；
目的基因的筛选与获取·
01
2．如图表示利用PCR技术扩增目的基因的部分过程，其原理与细胞内DNA复制类似。
下列有关叙述错误的是(　　)
D
A．耐高温的DNA聚合酶总将游离的脱氧核苷酸连接到3′端
B．在第三轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段
C．引物之间或引物自身发生碱基互补配对，则不能有效扩增目的基因
D．从理论上推测，第三轮循环产物中含有引物A的DNA片段占3/4
第三轮循环共产生8个DNA，其中含有引物A的DNA是7个，即占7/8，×；

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