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3.2.2 基因工程的基本操作程序
本节聚焦：
1.基因工程的基本操作程序主要包括哪几个步骤？
2.基因工程操作的每一步涉及的技术和方法
旧知识回顾
00
获取目的基因的方法：
① 目的基因；
②通过构建 来获取目的基因；
③常用 特异性地快速扩增目的基因。
人工合成
基因文库
PCR
获得了目的基因后能不能直接将目的基因导入受体细胞，为什么？
思考
提示：不能，原因：①游离的DNA进入细胞后，一般会 ；
②即使可以进行转录和翻译，游离的DNA也无法跟着 进行复制，
导致子代细胞中 。
直接被分解
细胞分裂
不再含有目的基因
基因工程的基本操作程序
00
重组DNA分子
①目的基因的筛选与获取
②基因表达载体的构建
③将目的基因导入受体细胞
④目的基因的检测和鉴定
★核心工作
基因1 基因2 基因3
知识扩展：原核细胞基因的结构
02
DNA分子
基因通常是有遗传效应的DNA片段，一个DNA上有多个基因。
原核生物
的基因
↓放大
① 编码区： 转录相应的mRNA， 编码(翻译)出蛋白质的DNA区段。
②非编码区： 转录相应的mRNA， 编码(翻译)出蛋白质的DNA区段。
注：非编码区含有能调控遗传信息表达的DNA序列。
能
能
不能
不能
知识扩展：原核细胞基因的结构
02
启动子
终止子
①启动子：
本质：一段有特殊序列结构的DNA片段；
位置：位于基因的 ；
作用： 酶识别并结合的部位，能驱动基因转录出mRNA；
②终止子：
本质：一段有特殊序列结构的DNA片段；
位置：位于基因的 ；
作用： ；
上游
RNA聚合
下游
终止转录
注：根据启动子的转录模式，有三种类型；
知识扩展：原核细胞基因的结构
02
启动子
终止子
【拓展延伸】根据启动子的转录模式，可分为：
① 启动子：其调控作用使得基因在不同部位或组织中的表达水平相当。
这类启动子一般来自管家基因，可连续不断地启动基因的表达。
② 启动子：其调控作用使得基因往往只在某些特定器官或组织中表达。这类启动子一般来自奢侈基因，其启动的外源基因在仅在特定的部位特异表达。
③ 启动子：当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达。
组成型
组织特异性
诱导型
知识扩展：原核细胞基因的表达
02
启动子
终止子
转 录
mRNA
翻 译
多肽链
终止密码子不编码
氨基酸
基因1 基因2 基因3
知识扩展：真核细胞基因的结构
02
DNA分子
基因通常是有遗传效应的DNA片段，一个DNA上有多个基因。
↓放大
【注意】不同于原核生物的基因，真核生物的编码区是 。
又可分为：①外显子： 转录相应的mRNA， 编码蛋白质的DNA序列。
②内含子： 转录相应的mRNA， 编码蛋白质的DNA序列。
真核生物
的基因
能
能
能
不能
不连续，有间隔的
数量关系：外显子=内含子+1
知识扩展：真核细胞基因的表达
02
启动子
终止子
转 录
前体mRNA
翻 译
多肽链
加 工
成熟mRNA
终止密码子不编码
氨基酸
基因表达载体的构建（基因工程的核心工作）
02
1.基因表达载体构建的目的：
①让目的基因在受体细胞中 ，并且可以遗传给下一代。
②同时使目的基因能够 和 。
2.基因表达载体的组成：
稳定存在
表达
发挥作用
呆得住
能表达：转录、翻译
:便于重组DNA分子的筛选；
:
位置：位于基因的上游；
作用：RNA聚合酶识别并结合的位点，驱动转录；
:
:主要是指编码特定蛋白质的基因；
位置：位于基因的下游；
作用：终止转录；
终止子
启动子
标记基因
目的基因
复制原点：能够完成自主复制；
基因表达载体的构建（基因工程的核心工作）
02
目的基因插入位点是随意的吗？应注意什么？
思考
提示： 随意的；
目的基因的表达需要 与 的调控，
所以目的基因应插入到启动子和终止子 的部位。
不是
启动子
终止子
之间
基因表达载体的构建（基因工程的核心工作）
02
3.基因表达载体的构建过程:
①用一定的 切割载体(质粒)，使它出现 个切口。
②用 限制酶或能产生 末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。
③利用 将含目的基因的DNA片段拼接到载体的切口处，
这样就形成了 （即： ）。
限制酶
同种
相同
DNA连接酶
一
一个重组DNA分子
基因表达载体
提示： ；
原因：用SmaⅠ会破坏质粒的 ，
不利于 。
重难点：限制酶的选择原则
02
１．构建基因表达载体时，能否用SmaⅠ限制酶切割质粒？为什么？
不能
抗生素抗性基因（标记基因）
进一步筛选重组DNA分子
提示： ；
弊端：① ；
② ；
③ ；
重难点：限制酶的选择原则
02
相同的黏性末端，可以相互连接！
2.只使用EcoRⅠ分别切割质粒和外源DNA，能否构建基因表达载体？
能
质粒、目的基因会发生自身环化连接
质粒与目的基因会发生反向连接
会发生两两自身连接
注：用同种限制酶或
同尾酶处理，产生的
都是相同的黏性末端，均会出现以上弊端。
单酶切法
提示： ；
优点：① ；
② ；
重难点：限制酶的选择原则
02
3.使用Bam HⅠ和Hind Ⅲ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA，
能否构建基因表达载体？
可以防止质粒、目的基因的自身环化连接
还可以防止目的基因与载体的反向连接
注：不能防止
两两自身连接。
相同的黏性末端，可以相互连接！
能
双酶切法
重难点：限制酶的选择原则
02
【小结】选择限制酶的基本原则:
①切割目的基因时: ；
②切割质粒时:至少保留一个完整的 ,便于筛选；
除此之外还需保留 、 、 。
③确保目的基因和载体上有 黏性末端
(补充说明：平末端也可以，但连接平末端效率低）。
能切下目的基因且不破坏目的基因
相同
标记基因
复制原点
启动子
终止子
基因表达载体的构建
02
3．某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是(　　)
A．质粒和目的基因都用酶3切割，常用E.coli DNA连接酶连接
B．质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接
C．质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接
D．质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coli DNA连接酶连接
C
酶3切割后得到的是平末端，E.coli DNA连接酶连接平末端效率极低，×；
酶3切割后得到的是平末端，酶1切割后得到的是黏性末端，不能连接，×；
双酶切法，合理且效率高，，√；
酶4会破坏质粒上的抗生素抗性基因，无法进行后续的筛选 ，×；
基因表达载体的构建
02
4．用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体(重组质粒)，并转化到受体菌中。下列叙述错误的是(　　)
A．若用Hind Ⅲ酶切，目的基因转录的产物可能不同
B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因
C．若用ScaⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Tet(四环素)的培养基中能形成菌落
D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp和Tet的培养基中能形成菌落
D
若用Hind Ⅲ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，√；
重组质粒和普通质粒中都有TetR(四)，不一定有目的基因，√；
(氨AmpR)被破坏，(四TetR)作为标记基因，√；
(四TetR)被破坏，(氨AmpR)作为标记基因，仅在含Amp的培养基中能形成菌落，×；
基因表达载体的构建
02
9．当目的基因和质粒都用Hind Ⅲ处理、连接后，目的基因可能正向插入载体，也可能反向插入载体，为判断目的基因的插入方向，可使用限制酶处理，并进行电泳检测(如图)。下列选项中能判断目的基因插入方向的限制酶是(　　)
A．Hind Ⅲ B．EcoRⅠ
C．BamHⅠ D．EcoRⅠ和HindⅢ
注：EcoRⅠ、BamHⅠ和Hind Ⅲ的识别序列、切割位点均不同，
数字表示相邻两个限制酶切点之间的碱基对数(bp)，质粒全长20 000 bp。
B
基因表达载体的构建
02
15.某质粒上有SalⅠ、HindⅢ、BamHⅠ三种限制酶切割位点，同时还含有四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因。利用此质粒获得转基因抗盐烟草的过程如图1所示。
(3)在构建重组质粒时，应选用 两种酶对质粒和含抗盐基因的DNA进行切割，以保证重组DNA序列的唯一性。
SalⅠ和HindⅢ
基因表达载体的构建·
02
(4)如图2表示运用影印培养法(使一系列培养皿的相同位置上能出现相同菌落的一种接种培养方法)检测基因表达载体是否导入了农杆菌。
培养基除了含有细菌生长繁殖必需的成分外，培养基A和培养基B分别还含有
、 。
从检测筛选的结果分析，含有目的基因的是 (填图2中的数字)菌落中的细菌。
氨苄青霉素
四环素(或氨苄青霉素和四环素)
4和6
普通质粒：氨苄+四环
重组质粒：氨苄
基因工程的基本操作程序
①目的基因的筛选与获取
②基因表达载体的构建
③将目的基因导入受体细胞
④目的基因的检测和鉴定
00
重组DNA分子
③将目的基因导入受体细胞
常用方法
将目的基因导入
植物细胞
将目的基因导入
动物细胞
将目的基因导入
微生物细胞
将目的基因导入受体细胞
03
Ga2+处理法
（感受态细胞法）
农杆菌转化法
花粉管通道法
显微注射法
将目的基因导入受体细胞·植物细胞
03
1.花粉管通道法：(我国科学家独创)
①方法一：用微量注射器将含目的基因的
DNA溶液直接注入 中。
②方法二：在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，
将DNA溶液滴加在花柱切面上，
使目的基因借助 进入胚囊。
子房
花粉管通道
受体细胞：
受精卵
将目的基因导入受体细胞·植物细胞
03
【资料】我国科学家独创的花粉管通道法，是利用植物授粉后形成的天然花粉管通道，将外源基因携带进入胚囊，此时的受精卵未形成细胞壁，且正在进行活跃的DNA复制，容易将外源DNA片段整合到受体基因组中。
我国科学家独创的花粉管通道法有什么优点？
思考
操作简单、技术成本低，免去了组织培养
以及诱导再生植株的全套人工培养过程。
将目的基因导入受体细胞·植物细胞
03
2.农杆菌转化法：(常用)
【资料】转化：
是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内 和 的过程。
【资料】农杆菌的特点：
农杆菌细胞内含有 质粒，
当它侵染植物细胞后，
能将Ti质粒上的 (可转移的DNA)
转移到被侵染的细胞内，
并且将其整合到该细胞的 上。
维持稳定
表达
注：农杆菌能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力；
随着转化方法的突破，用农杆菌侵染水稻、玉米等多种单子叶植物也取得了成功。
Ti
T-DNA
染色体DNA
将目的基因导入受体细胞·植物细胞
03
请根据农杆菌的特点，写出利用农杆菌进行转化的思路。
思考
Ti质粒
目的基因
植物细胞
植物
细胞
染色体DNA
农杆菌
基因表达载体
导入
插入
表达
新
性状
植株
转入
构建
两次拼接
①第一次拼接：
将 拼接到 上；
②第二次拼接（非人工操作）：
将 拼接到 上。
将目的基因导入受体细胞·植物细胞
03
农杆菌转化法中进行了两次拼接，有什么区别？
思考
目的基因
Ti质粒的T－DNA
被插入目的基因的T－DNA
受体细胞染色体的DNA
两次导入
①第一次导入：
将 导入到 上；
②第二次导入（非人工操作）：
将 导入到 上。
将目的基因导入受体细胞·植物细胞
03
农杆菌转化法中进行了两次导入，有什么区别？
思考
含目的基因的重组Ti质粒
农杆菌
含目的基因的T－DNA
受体细胞
将目的基因导入受体细胞·植物细胞
03
2.农杆菌转化法：
①方法一：
可以将新鲜的从叶片上取下的圆形小片 ，
然后 ，并 ；
②方法二：
可以将 直接浸没在 中一段时间，
然后培养植株并获得 ，
再进行 、 等；
受体细胞：
与农杆菌共培养
筛选转化细胞
再生成植株
体细胞
花序
含有农杆菌的溶液
种子
筛选
鉴定
受体细胞：
受精卵
将目的基因导入受体细胞·动物细胞
03
3.显微注射法：
显微注射
受精卵
受体细胞：
受精卵
构建基因表达载体并提纯
利用 将基因表达载体注入动物的 中
早期胚胎培养
胚胎移植
获得具有新性状的动物
将目的基因导入受体细胞·微生物细胞
03
单细胞、繁殖快、易于培养、遗传物质相对较少。
在基因工程操作中，常以原核生物作为受体细胞，
其中以大肠杆菌应用最为广泛。有什么优点？
思考
大肠杆菌和酵母菌在基因工程中都可以作为受体细胞，但又有所不同。在生产需要加工和分泌的蛋白质时，谁更有优势？
思考
酵母菌，因为酵母菌是真核细胞，具有多种细胞器，
内质网和高尔基体可以对翻译形成的多肽链进一步加工。
将目的基因导入受体细胞·微生物细胞
03
4.Ga2+处理法（感受态细胞法）：
大肠杆菌
感受态细胞
Ca2+
混合
基因表达载体
缓冲液
吸收DNA
完成转化
Ca2+的作用是什么？
思考
增加细菌细胞壁的通透性。
感受态细胞有什么特点？
思考
细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。
基因工程的基本操作程序
04
重组DNA分子
①目的基因的筛选与获取
②基因表达载体的构建
③将目的基因导入受体细胞
④目的基因的检测和鉴定
④目的基因的检测和鉴定
目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性，
只有通过检测与鉴定才能知道。
目的基因的检测与鉴定
04
类型 检测内容 方法
分子水平的检测 受体细胞的染色体DNA上 是否插入了 .
目的基因是否转录出了 . 目的基因是否翻译成 .
个体生物学水平的鉴定 个体是否具有相应 .
目的基因(DNA)
mRNA
PCR等技术
蛋白质
抗原-抗体杂交技术
性状
抗虫接种实验、
抗病接种实验等
检测内容及方法
逆转录
目的基因的检测与鉴定·①PCR等技术检测
04
提取
待测DNA
转基因
生物
PCR
通过电泳检测是否扩增出目的基因
提取
待测mRNA
转基因
生物
PCR
利用目的基因的核苷酸序列设计引物。
PCR中的引物应该根据什么进行设计？
思考
目的基因的检测与鉴定·②DNA分子杂交技术
04
1.检测工具： 。
带有标记(放射性同位素标记或荧光分子标记等)
的单链核酸片段(DNA或RNA)，
能与目的基因的一条链发生碱基互补配对。
基因探针
利用基因探针检测目的基因是否导入的原理是？
思考
碱基互补配对原则。
目的基因的检测与鉴定·②DNA分子杂交技术
04
2.基本思路：
①制作基因探针,并用 扩增;
②提取受体细胞全部DNA并用 扩增，与基因探针置于同一培养液；
③ 处理，使之全部变为单链，观察是否出现杂交DNA片段。
④如果显示出 ，就表明目的基因已插入染色体DNA中。
PCR
PCR
高温变性
杂交带
目的基因的检测与鉴定·②DNA分子杂交技术
04
3.检测受体细胞是否含目的基因的具体过程：
提取DNA
样本
基因组DNA
酶切
DNA片段
电泳
转膜
硝酸纤维素膜
基因探针通过分子杂交与目的基因结合，产生杂交信号，能从浩瀚的基因组中把目的基因显示出来。
待测DNA
目的基因
目的基因的检测与鉴定·③抗原-抗体杂交技术
04
1.检测对象： ，即检测目的基因是否翻译/成功表达。
2.基本思路：
蛋白质
从转基因生物中提取出 .
用相应的抗体进行 杂交
若出现 ,
则表明目的基因已形成蛋白质产品。
待检测蛋白质
抗原－抗体
杂交带
抗原-抗体技术的原理是？
思考
抗原与抗体的特异性结合。
目的基因的检测与鉴定·个体生物学水平的鉴定实例
04
转基因生物 鉴定方法 成功标志
抗虫植物
抗病毒（菌）植物
抗盐植物
抗除草剂植物
获取目的基因产物的转基因生物
饲喂害虫
害虫死亡
病毒（菌）感染
未染病
盐水浇灌
正常生长
喷洒除草剂
正常生长
提取细胞产物与天然产品进行
功能活性比较
功能、活性正常
目的基因的检测与鉴定
04

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