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第1节重组DNA技术
的基本工具
从社会中来
番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵袭，当番木瓜被这种病毒感染后，产量会大大下降。科学家通过精心设计，用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒DNA双螺旋的直径只有2 nm，对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。
转基因木瓜
环斑病毒的
非转基因木瓜
限制性内切核酸酶、DNA连接酶，载体。
限制性内切核酸酶：
DNA连接酶：
载体：
这些 “分子工具”各具有什么特征呢？
那么，科学家究竟用到了哪些“分子工具”？
准确切割DNA分子，得到所需要的目的基因。
能将目的基因连接到载体上。
能将目的基因导入受体细胞中。
一、限制性内切核酸酶--“分子手术刀”
1、来源：
主要从原核生物中分离纯化出来
2、种类：
迄今分离的限制酶有数千种
3、作用特点：
具有专一性。具体表现如下
4、作用部位:
特定切点上的磷酸二酯键
5'
3'
5'
3'
T
A
G
G
T
A
T
C
C
A
磷酸二酯键
①能够识别双链DNA分子中特定的核苷酸序列。
②使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
5、两种常用的限制酶：
限制酶的命名是根据细菌种类而定，以EcoRI为例:
E：Escherichia (属)
co：coli (种)
R：RY13 (品系)
I：首先发现 在此类细菌中发现的顺序
EcoRⅠ：大肠杆菌（Escherichia coli）R型菌株中分离出的第一个限制酶；
SmaⅠ：粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）中分离出的第一个限制酶。
EcoRⅠ和SmaⅠ
黏性末端
黏性末端
（1）EcoRI限制酶的切割:
当限制酶在它识别序列得中轴线两侧将DNA分子的两条链分别切开时，产生的是黏性末端。
只能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。
中轴线
中轴线
（2）SmaI限制酶的作用
只能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切开。
当限制酶在它识别序列中轴线处切开时，产生的是平末端。
在C和G之间切开
6、结果：
产生黏性末端或平末端
7、限制酶的识别序列的特点
(1)大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成。例如：EcoRⅠ、SmaⅠ
(2)少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成
(3)限制酶特异性识别和切割的部位具有回文序列
1.你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？
破坏外源DNA，保护自我
2.为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？
缺乏特定的核苷酸序列
思考·讨论
3．请写出下列限制酶切割形成的黏性末端，并思考同种限制酶切割产生的黏性末端是否相同？不同限制酶切割产生的黏性末端是否一定不同？
同种限制酶产生的黏性末端相同，
不同的限制酶可能会形成相同的黏性末端。
4．请结合下图，推断限制酶切一次可断开几个磷酸二酯键？产生多少游离的磷酸基团？产生几个黏性末端？消耗几分子水？
断开两个磷酸二酯键；产生2个游离的磷酸基团；
产生2个黏性末端；消耗两分子水。
EcoRⅠ
黏性末端
……CTACGATGAATTCCGTAGAATTCCCTAA……
……GATGCTACTTAAGGCATCTTAAGGGATT……
……CTACGATG
……GATGCTACTTAA
AATTCCCTAA……
GGGATT……
AATTCCGTAG
GGCATCTTAA
黏性
末端
目的基因
练习：使用EcoRI剪切目的基因
G A A T T C
C T T A A G
G A A T T C
C T T A A G
G
C T T A A
A A T T C
G
G
C T T A A
A A T T C
G
用同种限制酶切割(EcoRⅠ)
把两种来源不同的DNA进行重组，应该怎样处理？
缺口怎么办？
G
C T T A A
A A T T C
G
G
C T T A A
A A T T C
G
二、DNA连接酶--“分子缝合针”
把切下来的DNA片段拼接成新的DNA分子，是靠DNA连接酶来完成的。即将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的 。
DNA连接酶主要有两类 ：
、 。
2.
E.coli DNA连接酶
T4 DNA连接酶
磷酸二酯键
1.DNA连接酶的作用
A
G
T
C
A
T
T
C
G
A
T
A
可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来；
（1）E.coli DNA连接酶
两DNA片段要具有互补的黏性末端才能拼起来。
注意：DNA连接酶可连接双链DNA中的DNA单链缺口，但不能将单个脱氧核苷酸连接到DNA链上！
（2）T4 DNA连接酶
还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率较低
C
C
C
G
G
G
G
G
G
C
C
C
DNA连接酶--“分子缝合针”
2
类型
来源
功能
相同点
差别
E·coli DNA连接酶
T4DNA连接酶
大肠杆菌
T4噬菌体
恢复磷酸二酯键
只能连接黏性末端
能连接黏性末端和
平末端(效率较低)
DNA连接酶
DNA连接酶
A
T
A
G
T
C
C
G
A
A
T
T
连接两个DNA片段
与DNA聚合酶区别：
C
A
A
T
T
DNA聚合酶
G
A
G
T
A
T
C
DNA聚合酶
连接单个脱氧核苷酸形成单链
DNA连接酶
DNA聚合酶
相同点
作用实质
化学本质
不
同
点
模板
作用对象
作用结果
用途
都能催化形成磷酸二酯键
都是蛋白质
不需要
需要
形成完整的重组DNA分子
形成DNA的一条链
基因工程
DNA复制
3 DNA连接酶与DNA聚合酶的比较
只能将单个脱氧核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键
在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键
名称
作用部位
作用结果
限制酶
磷酸二酯键
将DNA切成两个片段
DNA连接酶
磷酸二酯键
将两个DNA片段连接为一个DNA分子
DNA聚合酶
磷酸二酯键
将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端
DNA(水解)酶
磷酸二酯键
将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
解旋酶
碱基对之间
的氢键
将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链
归纳总结
与DNA相关的五种酶的比较
根据所学知识，完成以下填空：
①限制酶 ②解旋酶 ③DNA连接酶 ④DNA聚合酶 ⑤RNA聚合酶
b
a
A.切断a处的酶为_______
B.连接a处的酶为_______
C.切断b处的酶为_______
①
③④⑤
②
a：磷酸二酯键；b：氢键
练习：
工具
分子手术刀
分子缝合针
分子运输车
限制性内切核酸酶：
DNA连接酶：
载体：
准确切割DNA分子
得到所需要的目的基因
将DNA片段连接起来
即能将目的基因连接到载体上
将体外重组好的DNA分子导入受体细胞（即能将目的基因导入受体细胞中）
质粒（最常用）
作为载体，将外源基因送入受体细胞。
1.作用：
动植物病毒
噬菌体
2.种类：
三、基因进入受体细胞的载体——分子运输车
质粒是一种裸露的、结构简单的、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。
3、载体需具备的条件
（1）有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA插入其中。
（2）能在细胞中进行自我复制，
或整合到受体DNA上随DNA同步复制
（3）有特殊的标记基因，便于重组DNA的筛选。
如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因。
（4）对受体细胞无毒害作用，避免受体细胞受到损伤
实际上自然存在的质粒DNA分子并不完全具备上述条件，都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。
标记基因的筛选原理
载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了载体的受体细胞。如图所示：
…ATAGCATGCTATCCATG
AATTCGGCATAC…
…TATCGTACGATAGGTACTTAA
GCCGTATG…
目的基因
… TCCTAG
… AGGATCTTAA
AATTCCATAC …
GAGCCATACTTAA
AATTCTCGGTATG
GGTATG …
实例：重组DNA分子的模拟操作
AATTCGGCATAC…
…TATCGTACGATAGGTACTTAA
…ATAGCATGCTATCCATG
目的基因
… TCCTAG
… AGGATCTTAA
AATTCCATAC …
GAGCCATACTTAA
AATTCTCGGTATG
GGTATG …
GCCGTATG…
{5C22544A-7EE6-4342-B048-85BDC9FD1C3A}
载体的作用
载体的
必要条件
载体的种类
①具一个或多个限制酶切点，以便与外源基因连接。
②能在宿主细胞中自我复制
或整合到受体DNA上随受体DNA复制
③具有某些标记基因，便于重组DNA的筛选。
①作为运载工具，将目的基因导入受体细胞中
②在受体细胞内对目的基因进行大量复制
①质粒
②病毒：噬菌体、动植物病毒等。
三、基因进入受体细胞的载体--“分子运输车”
本节小结
基因工程
的工具
限制酶
主要存在于原核生物中
具有专一性(识别序列)
切开DNA分子的磷酸二酯键
产生黏性末端或平末端
DNA连接酶
连接磷酸二酯键
种类
E.coli DNA连接酶
T4 DNA连接酶
质粒、噬菌体、动植物病毒
载体
具备的
条件
具一种至多种限制酶切点
具标记基因
能在宿主细胞中自我复制
或整合到受体DNA上随受体DNA复制
【典例】1.图甲是含有目的基因的外源DNA片段，图乙是用于将目的基因导入受体细胞的质粒（阴影部分表示抗生素抗性基因），相关限制酶的作用部位如图所示，现欲培养转基因抗病植株，回答下列问题。
（1）上述操作中不宜选用Sma I，原因是Sma I会破坏__________和
__________________。
（2）在基因工程的操作中，不宜选用EcoR I，原因是用EcoR I切割外源DNA片段后，_____________________________________________________。
抗病基因
抗生素抗性基因
目的基因只有一侧含有黏性末端，不能插入到质粒中
2.用限制酶切割时需注意的事项
(1)获取目的基因和切割载体时, 通常使用同种限制酶,目的是 。但是使用该法缺点是容易发生 ，为了避免上述情况发生，可采取的措施是 。
(2)获取一个目的基因需限制酶切割 次,共产生 个游离的磷酸基团。
(3)选择限制酶切割位点的基本原则：
①切割目的基因时： 。
②切割质粒时： 。
为了产生相同的黏性末端，便于连接
两
4
分别使用两种限制酶去切割目的基因和运载体
目的基因、质粒的自身环化以及目的基因与质粒反向连接
能切下目的基因且不破坏目的基因
至少保留一个完整的标记基因，便于筛选
练习与应用
3.如图是培育表达人乳铁蛋白的乳腺生物反应器的技术路线
用图2中的人乳铁蛋白目的基因和图1所示的质粒构建重组质粒时，选用的限制酶是
　 （从“EcoRⅠ”“BamHⅠ/HindⅢ”“SmaⅠ/HindⅢ”中选择）．不能选择其他限制酶的理由分别是：
。
BamHⅠ/HindⅢ
若选EcoRⅠ会破坏质粒的复制原点；若选SmaⅠ/HindⅢ，则构建的重组质粒没有标记基因或复制原点
(1)限制性内切核酸酶均能特异性地识别6个核苷酸序列( )
(2)DNA连接酶能将两碱基间通过氢键连接起来( )
(3)E.coliDNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端( )
(4)限制酶和解旋酶的作用部位相同( )
(5)质粒是双链环状DNA分子，是基因工程常用的载体。( )
×
×
×
×
√
【基础过关】
2.实验原理：
探究·实践·DNA的粗提取与鉴定
（1）DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精。
（2）DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2mol/L NaCl溶液。
（3）在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。
0
0.14
NaCI浓度（mol/L）
DNA溶解度
1.实验设计思路：
四
DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法去除其他成分，对DNA进行提取。
探究·实践·DNA的粗提取与鉴定
四
DNA含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等。
不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA。
3.选材：
注意：
4.试剂：
①研磨液
②体积分数为95%的酒精
③2mol/L的NaCl溶液
④二苯胺试剂
⑤蒸馏水
——含有NaCl、EDTA、SDS、Tris和HCl
——析出DNA
——溶解DNA
——鉴定DNA，要现配现用
5.方法步骤
探究·实践·DNA的粗提取与鉴定
四
析出DNA
DNA的鉴定
研磨
称取约30g洋葱切碎，放入研钵中，倒入10mL研磨液，充分研磨。
过滤取上清液
在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。
在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液(体积分数为95%)，静置2～3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分；
取两支试管，各加入2mol/L的NaCl溶液5mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCl溶液中。然后，向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。
方法步骤 （视频）
探究·实践·DNA的粗提取与鉴定
四
注意事项
1．以血液为实验材料时，每100 mL血液中需要加入3 g柠檬酸钠，防止血液凝固。
2.利用动物细胞提取DNA破碎细胞的方法：动物细胞无细胞壁，可直接吸水涨破。
3．加入研磨液后，必须充分研磨，否则细胞核不会充分破碎，释放出的DNA量就会减少。
4．加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。
5．预冷的酒精具有以下优点：①可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解；②抑制分子运动，使DNA易形成沉淀析出；③低温有利于增加DNA分子的柔韧性，减少其断裂。
探究·实践·DNA的粗提取与鉴定
四
1.你提取出白色丝状物或沉淀物了吗？用二苯胺试剂鉴定的结果如何？
2.你能分析出粗提取的DNA中可能含有哪些杂质吗？
结果分析与评价
观察提取的DNA的颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多。二苯胺试剂鉴定呈现蓝色说明实验基本成功；如果不呈现蓝色，可能的原因有所提取的DNA含量低，或者在实验操作过程中出现了失误等。
本实验粗提取的DNA可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质。
探究·实践·DNA的粗提取与鉴定
四
进一步探究
实验室提取纯度较高的DNA的方法有不少。例如，可以先添加质量分数为25%的SDS溶液，使蛋白质变性后与DNA分开；随后，加入氯仿—异丙醇混合液(体积比为24：1)，通过离心将蛋白质及其他杂质除去，取上清液；可重复上述操作几次，直至上清液变成透明的黏稠液体。此外由于苯酚可以迅速使蛋白质变性，抑制核酸酶的活性，因此还可以先用苯酚处理，然后离心分层，这时DNA溶于上层水相，蛋白质变性后存在于酚层中，用吸管、微量移液器等实验用具就可以将两者分开。
探究·实践·DNA的粗提取与鉴定
四
3.与其他同学提取的DNA进行比较，看看实验结果有何不同，分析产生差异的原因。
刑侦破案
拓展：DNA提取的应用
基因组测序
插入人胰岛素基因的大肠杆菌
基因工程
亲子鉴定
探究·实践·DNA的粗提取与鉴定
四
练习与应用
一、概念检测
1.DNA连接酶是重组DNA技术常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是
A.能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键
B.能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键
C.能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键
D.只能连接双链DNA片段互补的黏性末端，不能连接双链DNA片段的平末端
2.在重组DNA技术中，将外源基因送入受体细胞的载体可以是
A.大肠杆菌的质粒 B.切割DNA分子的酶
C.DNA片段的黏性末端 D. 用来识别特定基因的DNA探针
C
A
二、拓展应用
1.想一想，为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子?
提示：细菌中限制酶之所以不切割自身的DNA，是因为含有某种限制酶的细胞的DNA分子不具备这种限制酶的识别序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶，也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA入侵。
2.有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶SpeI进行切割，B片段分别用限制酶HindⅢ、XbaI、EcoRV和XhoI进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如下。
（1）哪种限制酶切割B片段产生的DNA片段能与限制酶SpeI切割A片段产生的DNA片段相连接?为什么?
XbaⅠ。因为XbaI与SpeI切割产生了相同的黏性末端。
2.有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶SpeI进行切割，B片段分别用限制酶HindⅢ、XbaI、EcoRV和XhoI进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如下。
（2）不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端，这在基因工程操作中有什么意义?
提示：识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。同尾酶使构建载体时，切割位点的选择范围扩大。例如，我们选择了用某种限制酶切割载体，如果目的基因的核苷酸序列中恰好含有该限制酶的识别序列，那么用该限制酶切割含有目的基因的DNA片段时，目的基因就很可能被切断；这时可以考虑用合适的同尾酶（目的基因的核苷酸序列中不能有它的识别序列）来获取目的基因。

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