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第1节 重组DNA技术的基本工具
【本节聚焦】
1.重组DNA技术所需的三种基本工具是你什么？他们的作用分别是什么？
2.基因工程载体需要具备什么条件？
第三章 基因工程
复习提问
DNA分子的中文名，组成元素，基本单位，分子结构？
DNA平面结构
我国是棉花的生产和消费大国，棉花在种植过程中常常会受到棉铃虫的侵袭，这会使棉花大量减产。大量施用农药不仅提高了生产成本，还可能造成农产品和环境的污染。普通棉花不抗虫，苏云金杆菌有一种“抗虫基因”，能表达出抗虫蛋白来杀死棉铃虫。
棉铃
棉铃虫
杂交育种？诱变育种等技术能否实现？为什么？
培育出自身能抵抗虫害的棉花新品种？
杂交育种：同种生物之间进行；
诱变育种：在原有基因基础上发生基因突变，结果产生新的等位基因（不定向）
普通棉花
转基因抗虫棉
苏云金杆菌
Bt蛋白基因
Bt蛋白
杀死害虫
01 基因工程的理论基础（1）棉花和苏云金杆菌的遗传物质都是_________。（2）不同生物的DNA分子能够拼接在一起，是因为___________________________________________________________。（3）同一种基因在不同生物体内表达出来的蛋白质相同，因为_________________________________________________________。（4）遗传信息的传递都遵循________法则。DNADNA的组成单位、空间结构和碱基互补配对方式相同所有生物共用一套遗传密码中心P67
◎ 基因工程
按照人们的愿望，通过转基因等技术赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在 DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做重组 DNA 技术。
①操作对象：
②操作水平：
③原理：
④结果：
⑤优点：
基因（DNA），体外
DNA 分子水平
基因重组
创造出人类需要的新的生物类型和生物产品
定向改造生物遗传特性；克服远缘杂交不亲和障碍
水母的绿色荧光蛋白基因
“分子手术刀”
“分子缝合针”
“分子运输车”
抗虫基因与运载体DNA“缝合”
抗虫基因(目的基因)提取出来
抗虫基因进入棉花（受体细胞）
模拟从DNA分子中剪取所需的目的基因
思考1：1.剪刀代表哪种“分子工具”
2.剪刀破坏的是DNA的什么结构？
3.使用DNA水解酶可以吗？
T
G
C
C
G
T
A
A
5'
3'
5'
3'
磷酸二酯键
基因工程的分子工具 （一）
限制性内切核酸酶 ——“分子手术刀”
1、别称：
2、来源：
（一）限制性内切核酸酶 ——“分子手术刀”
主要来自原核生物
限制酶
3、种类：
4、化学本质 :
5、作用 :
6、识别序列：
P71
数千种
限制酶不是一种酶，而是一类酶
7、结果：
原核生物容易受到自然界外源 DNA 的入侵，所以它在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制。限制酶是细胞的一种防御性工具。当原核细胞遭到外源DNA入侵时，它会利用限制酶来切割外源DNA，使之失效。
P71
【思考】为什么限制酶不切割自身的DNA分子？ P74课后题
①其DNA分子中不具备这种限制酶的识别切割序列，
②通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。
简记为：原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已被修饰
简记为：切割外源DNA、使之失效，以保证自身安全
例、EcoRI 酶切示意图
限制酶的识别序列具有180°旋转对称的回文结构
G
C
T
T
A
A
G
5‘
3‘
3‘
5‘
A
A
T
T
C
识别双链DNA分子的特定核苷酸序列特征：两条链从5`→3`的碱基顺序相同。
回文诗《万柳堤即景》
春城一色柳垂新，色柳垂新自爱人。
人爱自新垂柳色，新垂柳色一城春。
回文结构
识别双链DNA分子的特定核苷酸序列特征：两条链从5`→3`的碱基顺序相同。
例、EcoRI 酶切示意图
中轴线
假想的对称轴（对称面）
例、SmaⅠ酶切示意图
情况1：当限制酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA的两条链分别切开时，产生的是黏性末端；
情况2：当限制酶在它识别序列的中心轴线处切开时，产生的则是平末端。
例1、据下图分别写出Bgl Ⅱ与BamHⅠ酶切后形成的黏性末端为 、 。
给分细节：
1、正确写出单链突出部分 + 双链部分
2、可以标注方向
例2、判断两个黏性末端是否为同一种限制酶切割产生
① —A
—TGATC
④ CTAGA—
T—
② CTAGT—
A—
③ —T
—AGATC
①②
③④
方法：辨别两个黏性末端是否为同一种限制酶切割的关键是看识别序列是否完全一致，
即：①一看裸露碱基是否相互配对；②二看切割位点是否相同。
也可将其中1个黏性末端旋转180°，能完全重合的就是由同一种限制酶切割得到的
例3、下图所示四种限制酶切割得到的粘性末端是否相同？
相同
方法：辨别两个黏性末端是否相同仅看裸露碱基是否相互配对即可，不需要看切割位点。
拓展：不同限制酶识别不同序列，但切割后产生相同的黏性末端，这样的酶被称为：同尾酶。
1、别称：
2、来源：
【笔记整理】限制性内切核酸酶 ——“分子手术刀”
主要来自原核生物
限制酶
3、种类：
数千种
4、化学本质 :
蛋白质
限制酶不是一种酶，而是一类酶
5、作用 :
（1）识别：能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列；
（2）切割：使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
酶的专一性
是回文结构/两条链从5`→3`的碱基顺序相同
（1）大多数限制酶识别序列由6个核苷酸组成，例如EcoRⅠ、SmaⅠ，
（2）少数由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。
6、识别序列：
7、结果：
（1）不同酶可能会产生相同的黏性末端。
（1）当限制酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA的两条链分别切开时，
产生的是黏性末端；
（2）当限制酶在它识别序列的中心轴线处切开时，产生的则是平末端。
8、特点：
（2）同种限制酶切割的黏性末端一定相同。
如：同尾酶
p75
答案（1）Xbal 。因为 Xbal与 Spel切割产生了相同的黏性末端。
答案（2）不同的限制酶切割能产生相同粘性末端的积极意义是：使切割位点的选择范围扩大，增强实验的灵活性。
例如，我们选择了用某种限制酶切割载体，如果目的基因的核苷酸序列中恰好含有该限制梅的识別序列，那么用该限制酶切割含有目的基因的 DNA 片段时，目的基因就很可能被切断；这时可以考虑用合适的同尾酶来获取目的基因（目的基因的核苷放序列中不能有它的识别序列）。
基因工程的分子工具 （二）
DNA连接酶 ——“分子缝合针”
（二）DNA连接酶 ——“分子缝合针”
1、作用：
2、种类：
（二）DNA连接酶 ——“分子缝合针”
P72·原文勾画
（E.coli DNA连接酶）
（ T4 DNA连接酶）
注：
二者均可连接互补黏性末端与平末端。
E.coli DNA连接酶连接平末端的效率远低于T4 DNA连接酶
分析1：黏性末端和平末端的连接效率有差异原因是什么？
笔记：
1、黏性末端因碱基互补配对提高了连接效率；
2、平末端无碱基互补，依赖酶与DNA的随机碰撞，连接概率相对更低；
分析2：如何有效提高平末端的连接效率？
可通过增加DNA浓度、连接酶用量、ATP量，延长反应时间改善这个问题。
p72
【回顾】
2、DNA聚合酶的作用
【比较】DNA聚合酶与DNA连接酶
分析1：DNA复制时，新链的合成需要什么酶？
分析2：而把DNA片段‘粘’在一起又需要什么酶？
分析3：DNA聚合酶和连接酶都能形成磷酸二酯键，但它们作用的化学键位置相同吗？
分析4： 二者在“工作时”都需要模板和引物吗？
DNA聚合酶
DNA连接酶
不同， DNA聚合酶在“延伸新链”， DNA连接酶在“缝合缺口”。
DNA聚合酶需要模板的指导、引物的3‘-OH末端提供“工作”起点， DNA连接酶主要起修复作用，不需要模版与引物
【笔记】DNA聚合酶与DNA连接酶
特性 DNA聚合酶 DNA连接酶
主要功能 合成新DNA链 连接DNA缺口
模板依赖 需要模板 不需要模板
引物需求 需要引物 不需要引物
作用部位 （化学键） 形成磷酸二酯键 形成磷酸二酯键
作用结果 将单个脱氧核苷酸依次 连接到单链末端 将两个DNA片段
连接为一个DNA分子
释疑： DNA聚合酶不能从头启动DNA新链的合成，必须依赖已有的
3‘-OH末端作为起点添加核苷酸，
而引物的作用就是提供3‘-OH末端。
注：DNA连接酶没有识别序列的特异性。
名称 作用部位 作用结果
限制酶 磷酸二酯键 将DNA切成两个片段
DNA连接酶 磷酸二酯键 将两个DNA片段连接为一个DNA分子
DNA聚合酶 磷酸二酯键 将单个脱氧核苷酸依次连接到
单链末端
DNA(水解)酶 磷酸二酯键 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
解旋酶 碱基对之间 的氢键 将双链DNA分子局部解旋为单链，
形成两条长链
【小结】与DNA相关的五种酶
基因工程的分子工具 （三）
基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
为什么需要载体？直接将目的基因导入受体细胞可以吗？
不可以
第一：外源基因不能自己进入细胞，需要载体帮忙。
第二：即便能直接把外源基因导入受体细胞，外源基因在细胞内不能进行复制、转录和稳定存在，需要载体帮忙。
第三：载体带有标记基因（如抗生素抗性基因），可以帮助科学家找到成功接收外源基因的细胞。
（三）基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
1、作用：
（1）将外源基因送入受体细胞，
（2）在受体细胞内对目的基因进行大量复制。
（三）基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
在细胞中自主复制
整合至受体DNA上，随受体DNA同步复制。
笔记：直接把外源基因导入受体细胞，外源基因在细胞内不能进行复制、转录和稳定存在。
（1）常用载体：质粒
2、类型：
（2）其他载体：噬菌体、动植物病毒等
它们来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小上也有很大的差别。
（1）常用载体：质粒
①来源：主要是原核生物
②结构：裸露的、结构简单的环状双链DNA分子。
质粒
②结构：裸露的、结构简单的环状双链DNA分子。
用于筛选成功转入的细胞
有1个至多个限制酶切位点，供插入外源基因
可通过人工改造，得到多克隆位点（MCS）
增强了实验的灵活性
【注意】抗生素抗性基因≠抗生素基因
保证载体能在宿主细胞内复制
注：基因工程操作中被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。
质粒
含目的基因的DNA片段
重组质粒
受体细胞
导入
目的基因
【模拟】载体将外源基因送入受体细胞的过程
分析1：质粒一定能成功导入受体细胞吗？
答案：不一定能成功导入，因为载体携带目的基因导入受体细胞的成功率不高。因此需要筛选出导入目的基因的受体细胞。
分析2：如何筛选？
氨苄青霉素抗性基因
导入
未导入
未导入
含氨苄青霉素的培养基
存活并增殖
死亡
目的基因
载体携带目的基因导入受体细胞的成功率不高，需要筛选出导入目的基因的受体细胞。
【小结】载体需要具备的条件（以质粒为例）
条件1：载体DNA必须是安全的，不会对受体细胞有害，
不会影响受体细胞正常的生命活动。
条件2： DNA分子上有一个至多个限制酶切割位点，
供外源DNA片段（基因）插入其中。
条件3：携带外源DNA片段的质粒进入受体细胞后，能在细胞中进行
自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。
条件4：人工改造的质粒上常有特殊的标记基因，便于重组DNA分子
的筛选。
注意：标记基因不都是抗生素的抗性基因，常见的标记基因有
①抗生素的抗性基因，②荧光蛋白基因
深度思考：使用DNA连接酶后是否一定能将目的基因与载体成功连接？尝试分析影响连接的因素。
反向拼接的重组质粒
环化
的质粒
环化
目的基因
笔记：连接失败的原因：
①末端不匹配、②酶失活、③温度不当（通常需16°C）、
④载体环化、⑤质粒环化、
⑥目的基因与质粒反向连接，造成目的基因不能正确表达。
分析：如何有效避免环化现象？
双酶切
用两种限制酶切割质粒和含有目的基因的DNA片段
构建基因表达载体
限制酶a切割
限制酶b切割
限制酶a切割
限制酶b切割
DNA连接酶连接
a
b
a
b
黏性末端a与b不同，可避免上述问题；
笔记：连接失败的原因：
①末端不匹配、
②酶失活、
③温度不当（通常需16°C）、
④载体环化、
⑤质粒环化、
⑥目的基因与质粒反向连接，
造成目的基因不能正确表达。
笔记：双酶切的优点：
①质粒不会环化/自连；
②目的基因不会环化/自连；
③目的基因与质粒不会反向连接
解决办法：双酶切
指：用两种限制酶切割质粒和含有目的基因的DNA片段
P73
根据图中的相关信息找到两条片段上EcoR I 的识别序列和切割位点。 然后，用剪刀进行“切割”。待切割位点全部切开后，将从下面那条DNA链上切下的片段重组到上面那条DNA链的切口处，并用透明胶条将切口粘连起来。
3' -TATCGTACGATAGGTACTTAA
5' -ATAGCATGCTATCCATG
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5' -TCCTAG
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讨论2：你制作的黏性末端的碱基能不能互补配对？如果不能，可能是
什么原因造成的？
讨论1：剪刀和透明胶条分别代表哪种“分子工具”？
剪刀代表限制酶；透明胶条代表DNA连接酶。
可能是剪切位点或连接位点的选择不对（也可能是其他原因）。比如在书写将要重组的两个DNA分子时，一般要求有同一种限制酶的识别和切割位点，这样切割后才会露出相同的黏性末端，否则黏性末端不同，碱基就无法配对。
讨论3：你插入的DNA片段能称得上一个基因吗？
不能。真正的基因是有遗传效应的DNA片段，且含有几百至几千个不等的碱基对。
【小结】基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
【总结】

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