资源简介

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基因工程发展历程
1944年艾弗里等人通过肺炎链球菌的转化实验，不仅证明了遗传物质是DNA，还证明了DNA可以在同种生物个体间转移。
1961年尼伦伯格和马太破译了第一个编码氨基酸的密码子。截至19666年，64个密码子均被破译成功。
1970年科学家在细菌中发现了第一个限制性核酸内切酶（简称限制酶）
1972年，伯格首先在体外进行了DNA的改造，成功构建了第一个体外重组DNA分子。
1982年，第一个基因工程药物-重组人胰岛素被批准上市。基因工程药物成为世界各国研究和投资开发的热点。
1953年沃森和克里克建立了DNA双螺旋结构模型并提出了遗传物质自我复制的假说。
1967年，科学家发现，在细菌拟核DNA之外的质粒有自我复制能力，并可以在细菌细胞间转移。
20世纪70年代初，多种限制酶、DNA连接酶和逆转录酶被相继发现。这些发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。
1973年，科学家证明了质粒可以作为基因工程的载体，构建重组DNA，导入受体细胞，使外源基因在原核细胞中成功表达，并实现了物种间的基因交流。至此，基因工程正式问世。
1985年，穆里斯等人发明PCR,为获取目的基因提供了有效手段。
我国是棉花的生产和消费大国，以新疆棉最为著名。在棉花种植过程中，常常会受到棉铃虫的侵袭，这会使棉花大量减产。
苏云金杆菌
杂交育种？
同种生物之间进行
诱变育种？
不定向
思考：能否培育出自身就能抵抗虫害的棉花呢
苏云金杆菌有一种抗虫基因（Bt毒蛋白基因），它能通过编码产生抗虫蛋白来杀死棉铃虫。
大量施用农药不仅提高了生产成本，还可能造成农产品和环境的污染。
基因工程
第3章 基因工程
按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品，从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做重组DNA技术。
基因（具有遗传效应的DNA片段）
DNA分子水平
赋予生物新的遗传特性，创造出人类需要的新的生物类型和生物产品
基因重组
定向改造生物遗传特性；彻底打破种间界限
操作对象：
操作水平：
结果：
意义：
原理：
有性生殖中的基因重组是随机的，并且只能在同一物种间进行重组！
我国是棉花的生产和消费大国，以新疆棉最为著名。在棉花种植过程中，常常会受到棉铃虫的侵袭，这会使棉花大量减产。大量施用农药不仅提高了生产成本，还可能造成农产品和环境的污染。
苏云金杆菌有一种抗虫基因（Bt毒蛋白基因），它能通过编码产生抗虫蛋白来杀死棉铃虫。
DNA双螺旋的直径只有2nm。
科学家用到了哪些“分子工具”？
这些“分子工具”各具有什么特征呢？
准确切割DNA分子
将DNA片段连接起来
将体外重组好的DNA分子导入受体细胞
本节聚焦:
1、重组DNA技术所需的三种基本工具是什么？它们的作用分别是什么？
2、基因工程载体需要具备什么条件？
3.1 重组DNA技术的基本工具
DNA的基本单位：
脱氧核苷酸
A
腺嘌呤
G
鸟嘌呤
C
胞嘧啶
T
胸腺嘧啶
O
P
CH2
OH
O
OH
H
OH
H
H
H
H
碱基
磷酸
脱氧核糖
DNA的结构
C
T
T
G
A
C
A
G
5’
5’
3’
3’
（1）由 条单链按_________方式盘旋成_______结构
反向平行
双螺旋
2
3',5'-磷酸二酯键
CH2
H
OH
H
H
H
H
碱基
磷酸
5’
4’
3’
2’
1’
DNA的结构
A
T
A
T
T
A
G
G
G
C
C
A
T
C
脱氧核糖和碱基交替连接，
构成基本骨架
(2) 外侧：
碱基
内侧:
(3)
两条链上的碱基通过氢键连接形成碱基对，且A只和T配对、G只和C配对，碱基之间的一一对应的关系，就叫作碱基互补配对原则。
氢键
碱基对
DNA的结构
一、限制性内切核酸酶（限制酶）——“分子手术刀”
1、来源：
主要从原核生物中分离纯化出来，也有少部分来自真核生物
2、种类：
数千种
（限制酶不是一种酶，而是一类酶）
生物属名的头一个字母与种加词的头两个字母，组成了3个字母的略语，以此来表示这个酶是从哪种生物中分离出来的。例如，一种限制酶是从大肠杆菌（ Escherichia coli）的R型菌株分离来的，就用字母EcoR表示；如果它是从大肠杆菌R型菌株中分离出来的第一种限制酶，则进一步表示成EcoR I。
粘质沙雷氏杆菌（Serratia marcesens）中分离的第一种限制酶即_______；
Sma Ⅰ
流感嗜血杆菌的d菌株（Haemophilus influenzaed）中先后分离到3种限制酶，则分别命名为:____________________________。
Hind Ⅰ、Hind Ⅱ、 Hind Ⅲ
一、限制性内切核酸酶（限制酶）——“分子手术刀”
※命名（P72资料卡）
　
一、限制性内切核酸酶（限制酶）——“分子手术刀”
实例1——EcoR I 限制酶
A
G
T
C
A
T
T
C
G
A
T
A
G
5'
5'
G
A
T
3'
C
A
T
C
3'
A
T
A
T
大肠杆菌( E.coli )的EcoRⅠ限制酶能特异性识别 _________序列，并切割___和___之间的____________。
切割后产生__________。
GAATTC
G
A
磷酸二酯键
黏性末端
限制酶
DNA两条单链的切口处，伸出几个核苷酸，刚好能互补配对，这样的切口叫黏性末端。
实例2——Sma I 限制酶
一、限制性内切核酸酶（限制酶）——“分子手术刀”
C
C
C
G
G
G
G
G
G
C
C
C
G
3'
G
G
C
5'
C
C
C
C
5’
C
G
G
G
3'
Sma I 限制酶只能识别 序列，切割 和 之
间的 切开，切割后产生 。
CCCGGG
C
G
磷酸二酯键
平末端
Sma I
识别序列：
大多数由6个核苷酸组成；少数由4个、8个或其他数量组成。
1.都可以找到一条中（心）轴线；
特点：
2.识别序列中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的 。
一、限制性内切核酸酶（限制酶）——“分子手术刀”
一、限制性内切核酸酶（限制酶）——“分子手术刀”
1、来源：
主要从原核生物中分离纯化出来，也有少部分来自真核生物
2、种类：
数千种
（限制酶不是一种酶，而是一类酶）
3、特点 :
能够识别 的特定脱氧核苷酸序列，并使每一条链中特定
部位的 断开。
双链DNA分子
磷酸二酯键
4、结果
产生黏性末端或平末端
1.写出下列限制酶切割形成的末端序列
BamHⅠ EcoRⅠ__________________________
Hind Ⅲ Bgl Ⅱ _________________________
-A
-TTCGA
-A
-TCTAG
AGCTT-
A-
GATCT-
A-
（1）同种限制酶切割产生的黏性末端是否相同？
（2）不同限制酶切割产生的黏性末端是否一定不同？
（3）哪种限制酶切割产生的DNA片段能与BamHⅠ切割产生的DNA片段相连接？为什么？
（4）上述片段连接完成后，该重组DNA分子的新连接处能否再被所用的限制酶识别？
相同。
可能相同
5'
3'
5'
3'
5'
3'
5'
3'
3'
5'
5'
3'
5'
5'
3'
3'
-G
-CCTAG
-G
-CTTAA
or
GATCC-
G-
or
AATTC-
G-
or
or
学习评价一
2. 请判断：以下黏性末端是由 种限制酶作用产生的。
3
3、请结合图示，推断限制酶切割一次可断开几个磷酸二酯键？
产生多少个游离的磷酸基团？产生几个黏性末端？消耗几分子水？
T T A A
G
C
T T A A
C
G
A A T T
G
C
推断限制酶切一次：
断开 个磷酸二酯键，产生 个游离的磷酸基团，产生 个黏性/平末端，
消耗 分子水。
两
2
2
两
--ATGCATGCAT……CCAGAATTCCCA ……TCCCTAAGAATTC CCATCCCAGATG …… CATGCATCCATGC---
--TACGTACGTA……GGTCTTAAGGGT……AGGGATTCTTAAGGGTAGGGTCTAC …… GTACGTAGGTACG---
Bt蛋白基因
3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
Bt蛋白基因
5’
3’
3’
5’
EcoRⅠ识别 5'-GAATTC-3' 序列，并在G与A之间切割。
苏云金芽孢杆菌DNA片段中的部分基因
4、要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？ 可产生几个末端？
P71思考：你能根据所掌握的知识，推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么吗？
原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，所以它在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制。限制酶就是它的一种防御性工具。当外源DNA入侵时，它会利用限制酶来切割外源DNA，使之失效，以保证自身的安全。
细菌
细菌
细菌
限制酶
思维拓展
P74拓展：为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA
1、通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。
2、通过长期的进化，细菌DNA分子中不具备这种限制酶的识别切割序列
思维拓展
G A A T T C
C T T A A G
G A A T T C
C T T A A G
G
C T T A A
A A T T C
G
G
C T T A A
A A T T C
G
用同种限制酶切割(EcoR Ⅰ)
把两种来源不同的DNA进行重组，应该怎样处理？
缺口怎么办？
G
C T T A A
A A T T C
G
G
C T T A A
A A T T C
G
1. 作用：
将两个 连接起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的 。
二、DNA连接酶——“分子缝合针”
注意：不是连接氢键！（氢键的形成不需要酶的催化）
DNA片段
磷酸二酯键
两DNA片段要具有相同的(互补的)黏性末端才能拼起来
连接黏性末端
二、DNA连接酶——“分子缝合针”
连接平末端
二、DNA连接酶——“分子缝合针”
1. 作用：
将两个 连接起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的 。
二、DNA连接酶——“分子缝合针”
注意：不是连接氢键！（氢键的形成不需要酶的催化）
E·coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶
来源
连接的 末端类型
相同点 大肠杆菌
T4 噬菌体
黏性末端和平末端
（连接平末端效率远低于T4 DNA连接酶）
黏性末端
和平末端
2. 种类：
恢复被限制酶切开的磷酸二酯键
DNA片段
磷酸二酯键
A A T T G
C
A
A
T
T
A
A
T
T
DNA
聚合酶
DNA
聚合酶
DNA
聚合酶
DNA
聚合酶
DNA
聚合酶
DNA聚合酶将脱氧核苷酸（底物）连接到单链末端
DNA连接酶 DNA聚合酶
相同点 作用实质 化学本质 不 同 点 模板
作用对象
作用结果
都能催化形成磷酸二酯键
都是蛋白质
不需要
需要DNA的一条链作模板
形成完整的重组DNA分子
形成DNA的一条链
在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键
1、DNA连接酶与DNA聚合酶的比较
只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键
学习评价二
2、与DNA相关的五种酶的比较
名称 作用部位 作用结果
限制酶
DNA连接酶
DNA聚合酶
DNA(水解)酶
解旋酶
磷酸二酯键
将DNA切成两个片段
磷酸二酯键
将两个DNA片段连接为一个DNA分子
磷酸二酯键
将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端
磷酸二酯键
将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
碱基对之间
的氢键
将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链
学习评价一
我们每天吃很多动植物食材，也摄入了它们的DNA，但是我们并没有因此就被这些DNA操控。
这是因为外源DNA片段难以进入细胞内，即使进入也很难稳定存在并表达。如何将目的基因运送到特定细胞呢？
思考：
1.载体的种类？
2.载体应该具备哪些特点？
“分子运输车”---载体
将外源基因送入受体细胞，在受体细胞内对目的基因进行大量复制。
1.作用：
三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小也有很大差别。
2.种类：
质粒（最常用）
动植物病毒
噬菌体
质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
3、运载体需具备的条件
条件②：能在细胞中进行自我复制或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制
条件①：有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段（基因）插入
条件③ ：常有特殊的标记基因
三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
【问题1】载体要与外源基因连接，需要具备什么条件？
【问题2】要使携带的外源基因在受体细胞中稳定存在，载体需要具备什么条件？
【问题3】我们用肉眼看不到载体是否进入受体细胞，为了便于筛选重组DNA分子，载体需要具备什么条件？
标记基因对重组DNA的鉴定和选择原理
载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。
在含有该抗生素(如氨苄青霉素)的培养基上，能够生存的是
。
这是因为__________________________________________________
__________________________________________________________。
被导入了载体的受体细胞
含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性存活。
思维拓展
根据标记基因的作用， 有同学认为在含有某种抗生素的培养基中筛选存活的受体细胞不一定是导入目的基因的受体细胞， 这种说法是否合理？ 并说明理由。
合理； 因为仅导入载体的和导入目的基因的受体细胞均能在该培养基中存活。
思维拓展
目的基因是要与运载体结合的，那如何处理质粒？
1、选目的基因两端和运载体有相同的黏性末端；
选择酶切位点的原则：
2、所选酶切位点不能破坏目的基因以及标记基因。
例： 图甲是含有目的基因的外源DNA片段，图乙是用于将目的基因导入受体细胞的质粒（阴影部分表示抗生素抗性基因），相关限制酶的作用部位如图所示，现欲培养转基因抗病植株，回答下列问题。
（1）上述操作中不宜选用Sma I，原因是________________________________________。
（2）在基因工程的操作中，不宜只选用EcoR I，原因是_____________________________________________________________________。
Sma I会破坏目的基因和抗性基因
用EcoR I切割，目的基因只有一侧含有黏性末端，不能插入到质粒中
学习评价
例：选用下图载体将目的基因导入细菌中并将含有目的基因的细菌筛选出来。
（1）在培养细菌的培养基中添加抗生素B，则应该选择的限制酶___________切割质粒插入目的基因。
（2）在培养细菌的培养基中添加抗生素A，则应该选择的限制酶为___________切割质粒插入目的基因。
①或②
①
三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
在基因工程操作中，天然的载体很难满足上述全部要求，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。
大肠杆菌及质粒结构模式图
若用家蚕作为某基因表达载体的受体细胞， 在噬菌体和昆虫病毒两种载体中， 不选用噬菌体作为载体，其原因是什么？
噬菌体的宿主细胞是细菌，不能侵染家蚕细胞，无法将目的基因导入家蚕体细胞中并使其表达； 而昆虫病毒可以特异性地侵染昆虫细胞，能将目的基因导入家蚕细胞并实现基因表达。
思维拓展
…TATCGTACGATAGGTACTTAA
…ATAGCATGCTATCCATG
AATTCGGCATAC…
GCCGTATG…
… TCCTAG
… AGGATCTTAA
GAGCCATACTTAA
AATTCTCGGTATG
AATTCCATAC …
GGTATG …
重组DNA分子的模拟操作
思考讨论
重组DNA分子的模拟操作
思考讨论
1.剪刀和透明胶条分别代表哪种“分子工具”？
剪刀代表限制酶；透明胶条代表DNA连接酶。
2.你制作的黏性末端的碱基能不能互补配对 如果不能，可能是什么
原因造成的？
如果制作的黏性末端的碱基不能互补配对，可能是剪切位点或连接位点选得不对，也可能是其他原因。
3.你插入的DNA片段能称得上一个基因吗？
不能。
因为基因的长度一般在100个碱基对以上。
限制酶
DNA连接酶
载体
①能自我复制或能整合到宿主DNA上
②有一个至多个限制酶切割位点
③有特殊的标记基因
④对受体细胞无害
质粒、 噬菌体 、动植物病毒
基因工程的基本工具
作为载体的条件
种类:
磷酸二酯键
来源：
主要来源于原核生物
特点：
作用部位：
具有专一性
结果：
形成黏性末端或平末端
连接部位：磷酸二酯键
种类： E.coli DNA连接酶、T4 DNA连接酶
作用： 把两条双链DNA片段拼接起来
课堂小结
1.为什么不同生物的DNA分子能拼接起来？
2.为什么一种生物的基因可以在另一种生物细胞内表达？
①DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸；
②都遵循碱基互补配对原则；
③双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构。
①基因是控制生物性状的独立遗传单位；
②遗传信息的传递都遵循中心法则；
③生物界共用一套遗传密码。
思考讨论
基因工程诞生的理论基础
探究.实践---DNA的粗提取与鉴定
一、实验原理
可以利用DNA、RNA、蛋白质和脂质在理化性质方面的差异，
对它们进行提取
DNA不溶于酒精，某些蛋白质溶于酒精
DNA在不同NaCl溶液中的溶解度不同，可溶于2mol/L的NaCl溶液
2. 在一定的温度下（沸水浴），DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色，
因此二苯胺试剂可以作为鉴定DNA的试剂
【自主学习】阅读课本74和75页的探究实践“DNA的粗提取与鉴定”，明确该实验的实验原理及步骤。
二、 材料用具
DNA含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等。
1.选材：
2.试剂：
①研磨液
②体积分数为95%的酒精
③2mol/L 的NaCl溶液
④二苯胺试剂
⑤蒸馏水
——溶解并提取DNA
——析出DNA
——溶解DNA
——鉴定DNA，要现配现用
研磨液成分 作用
SDS 裂解细胞膜，使蛋白质变性
EDTA 抑制DNA酶
Tris-HCl缓冲液 稳定DNA
（注意：不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA。）
鸡血？
1．30g洋葱切碎＋10mL研磨液，充分研磨。
三、 实验步骤
破碎细胞
过滤
目的：裂解细胞，释放DNA
2．在漏斗中垫上纱布过滤研磨液，4℃冰箱中静置后取上清液；或1500r/min离心5min，取上清液。
问题1:过滤能否用滤纸代替纱布？
不可以。因为DNA会被吸附到滤纸上而大量损失，影响最终提取的DNA量。
问题2:此步骤获得的上清液中可能含有哪些细胞成分？
可能含有DNA、RNA以及蛋白质、脂质、糖类等。
三、 实验步骤
破碎细胞
过滤
DNA的析出
问题3:此步骤的目的是？
使蛋白质等溶解在酒精中，DNA不溶于酒精而析出。
问题4：酒精预冷的作用？
①可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解；
②抑制分子运动，使DNA易形成沉淀析出；
③低温有利于增加DNA分子的柔韧性，减少其断裂。
3．在上清液中加入体积相等的预冷的95%酒精溶液, 静置2~3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA 。
三、 实验步骤
破碎细胞
过滤
DNA的析出
4．用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物；或将溶液倒入塑料离心管中离心，取沉淀物晾干。
问题5：搅拌时应轻缓、并沿一个方向目的？
减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子
析出DNA
5．将丝状物或沉淀物溶于 溶液中，加入 试剂，混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min
三、 实验步骤
实验组
对照组
水浴加热
破碎细胞
过滤
DNA的析出
DNA的鉴定
二苯胺
2mol/L的NaCl
（空白）对照：
在等体积的NaCl溶液中加入二苯胺试剂，将试管置于同等沸水浴中加热5min。
鉴定结果不明显的可能原因：
①材料中的核物质没有充分释放出来，如研磨不充分或蒸馏水的量不够。
②加入酒精后摇动或搅拌时过猛，DNA被破坏。
③二苯胺最好现用现配，否则二苯胺变色，影响鉴定效果。
评价结果：
（1）DNA纯度： 看提取物颜色
（2）DNA的量： 看与二苯胺反应颜色的深浅

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